JP2022501039A - 核酸を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)生物学的試料を、(i)Cas12bタンパク質、(ii)標的核酸分子中の標的配列に対するgRNA、及び(iii)切断された後に検出可能なシグナルを生成する一本鎖DNAレポーター分子と接触させ、それにより反応混合物を生成するステップ、
(b)反応混合物において生成した検出可能なシグナルの存在及び/又はレベルを検出するステップ
を含み、検出可能なシグナルの存在及び/又はレベルが標的核酸分子の存在及び/又は量に相当する方法を提供する。
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’;
5’-AACTGTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’;
5’-CTGTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’;
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’;
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’;
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’;
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAGCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’;
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAACTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’;
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAGCGAGAAGTGGCAC-Nx-3’;
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTAAGCAGAAGTGGCAC-Nx-3’;及び
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’
(NxはX個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表し、NはA、G、C及びTから独立に選択され、Xは18≦X≦35の整数である)。好ましくはX=20である。いくつかの実施形態において、Nxは、標的配列(標的核酸分子はdsDNAである)の相補鎖に特異的にハイブリダイズすることができるスペーサー配列である。いくつかの実施形態において、Nxは、標的配列(標的核酸分子は一本鎖DNAである)の相補鎖に特異的にハイブリダイズすることができるスペーサー配列である。いくつかの実施形態において、sgRNAは、配列番号11〜21のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされるスキャホールド配列を含む。
5’-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’(AasgRNA);
5’-tcgtctataGGACGGCGAGGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGGCTTCAAGATGACCGCTCGCTCAGCGATCTGACAACGGATCGCTGAGCGAGCGGTCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’(AksgRNA1);
5’-ggaattgccgatctaTAGGACGGCAGATTCAACGGGATGTGCCAATGCACTCTTTCCAGGAGTGAACACCCCGTTGGCTTCAACATGATCGCCCGCTCAACGGTCCGATGTCGGATCGTTGAGCGGGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3’ (AmsgRNA1);
5’-GAGGTTCTGTCTTTTGGTCAGGACAACCGTCTAGCTATAAGTGCTGCAGGGTGTGAGAAACTCCTATTGCTGGACGATGTCTCTTTTATTTCTTTTTTCTTGGATGTCCAAGAAAAAAGAAATGATACGAGGCATTAGCAC-Nx-3’(BhsgRNA);
5’-CCATAAGTCGACTTACATATCCGTGCGTGTGCATTATGGGCCCATCCACAGGTCTATTCCCACGGATAATCACGACTTTCCACTAAGCTTTCGAATGTTCGAAAGCTTAGTGGAAAGCTTCGTGGTTAGCAC-Nx-3’ (BssgRNA);
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGGATTATCTTATTTCTGCTAAGTGTTTAGTTGCCTGAATACTTAGCAGAAATAATGATGATTGGCAC-Nx-3’ (Bs3sgRNA);
5’-GGCAAAGAATACTGTGCGTGTGCTAAGGATGGAAAAAATCCATTCAACCACAGGATTACATTATTTATCTAATCACTTAAATCTTTAAGTGATTAGATGAATTAAATGTGATTAGCAC-Nx-3’ (LssgRNA);又は
5’-GTCTTAGGGTATATCCCAAATTTGTCTTAGTATGTGCATTGCTTACAGCGACAACTAAGGTTTGTTTATCTTTTTTTTACATTGTAAGATGTTTTACATTATAAAAAGAAGATAATCTTATTGCAC-Nx-3’ (SbsgRNA)
(Nxは、X個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列(スペーサー配列)を表し、NはA、G、C及びTから独立に選択され、Xは18≦X≦35の整数である)。好ましくはX=20である。いくつかの実施形態において、配列Nx(スペーサー配列)は、標的配列の相補鎖に特異的にハイブリダイズすることができる。sgRNAにおけるNx以外の配列はsgRNAのスキャホールド配列である。いくつかの実施形態において、sgRNAは、配列番号22〜29のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされるスキャホールド配列を含む。
5’-GGTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA1) ;
5’-GGTCTAAAGGACAGAAGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA2) ;
5’-GGTCTAAAGGACAGAAAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA3) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGTTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA4) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA5) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA6) ;
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGTTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA7) ;
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA8) ;
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA9) ;
5’-GGTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA10) ;
5’-GGTCTAAAGGACAGAAGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA11) ;
5’-GGTCTAAAGGACAGAAAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA12) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGTTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA13) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA14) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA15) ;
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGTTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA16) ;
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA17) ;
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA18) ;
5’-GGTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGATTATCTATGATGATTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA19) ;
5’-GGTCTAAAGGACAGAAGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGGATTATCTATGATGATTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA20) ;
5’-GGTCTAAAGGACAGAAAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGGATTATCTATGATGATTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA21) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGTTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGATTATCTATGATGATTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA22) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGGATTATCTATGATGATTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA23) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGGATTATCTATGATGATTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA24) ;
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGTTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGATTATCTATGATGATTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA25) ;
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGGATTATCTATGATGATTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA26) ;
5’-GGTGACCTATAGGGTCAATGAATCTGTGCGTGTGCCATAAGTAATTAAAAATTACCCACCACAGGATTATCTATGATGATTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA27) ;
5’-GGTCTAAAGGACAGAACAACGGGATGTGCCAATGCACTCTTTCCAGGAGTGAACACCCCGTTGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA28) ;
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGCAACGGGATGTGCCAATGCACTCTTTCCAGGAGTGAACACCCCGTTGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA29) ;
5’-GGAATTGCCGATCTATAGGACGGCAGATTTTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA30) ;
5’-GGAATTGCCGATCTATAGGACGGCAGATTGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA31);
5’-GGAATTGCCGATCTATAGGACGGCAGATTCAACGGGATGTGCCAATGCACTCTTTCCAGGAGTGAACACCCCGTTGACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA32);
5’-GGTCTAAAGGACAGAACAACGGGATGTGCCAATGCACTCTTTCCAGGAGTGAACACCCCGTTGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA33);
5’-GGTCGTCTATAGGACGGCGAGCAACGGGATGTGCCAATGCACTCTTTCCAGGAGTGAACACCCCGTTGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA34);
5’-GGAATTGCCGATCTATAGGACGGCAGATTTTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA35);
5’-GGAATTGCCGATCTATAGGACGGCAGATTGACAACGGGAAGTGCCAATGTGCTCTTTCCAAGAGCAAACACCCCGTTGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRN36A);又は
5’-GGAATTGCCGATCTATAGGACGGCAGATTCAACGGGATGTGCCAATGCACTCTTTCCAGGAGTGAACACCCCGTTGGCTTCAAAGAAGTGGCAC-Nx-3’(artsgRNA37)
(Nxは、X個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列(スペーサー配列)を表し、NはA、G、C及びTから独立に選択され、Xは18≦X≦35の整数であり、好ましくはX=20である)。いくつかの実施形態において、配列Nx(スペーサー配列)は、標的配列の相補鎖に特異的にハイブリダイズすることができる。sgRNAにおけるNx以外の配列はsgRNAのスキャホールド配列である。
材料及び方法
タンパク質発現及び精製
SpCas9及びLbCas12aタンパク質は市販品を購入した(New England Biolabs)。AaCas12b、ArCas12a、HkCas12a及びPrCas12aタンパク質は以前の報告に従って精製した。手短に述べると、BPK2014-Cas12-His10タンパク質を大腸菌(E.coli)株BL21(λDE3)において発現させ、16℃で16時間にわたって0.5mMのIPTGで発現を誘導した。細胞ペレットを回収及び溶解し、続いてHis60 Ni Superflow Resin(Takara Bio Inc.)を用いて洗浄及び溶出した。精製したCas12タンパク質を透析し、濃縮し、最後にBCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)を使用して定量した。
DNAオリゴは市販品を購入した(Genscript)。二本鎖DNAアクチベーターをPCR反応によって得、Oligo Clean & Concentrator Kit(ZYMO Research Corporation)を使用して精製した。ガイドRNAはHiScribe(商標)T7 High Yield RNA Synthesis Kit(New England Biolabs)を使用してインビトロで転写し、MicroElute RNA Clean Up Kit(Omega Bio-tek, Inc.)を使用して精製した。
30nMのCas12、36nMのgRNA、40ngのバックグラウンドゲノムDNA(示されている反応において)中に混合した40nMのアクチベーター(特に明記されない限り)、200nMのカスタム合成されたホモ多量体ssDNA FQレポーター(表1)及びNEBuffer(商標)2(特に明記されない限り)を用いて、Corning 384ウェルPolystyrene NBS Microplateにおいて20μlの反応液中で検出アッセイを行った。蛍光プレートリーダー(BioTek Synergy 4)において37℃で示されている時間にわたって反応液をインキュベートし、蛍光動態を5分ごとに測定した(λex=485nm;λem=528nm、透過ゲイン(transmission gain)=61)。蛍光の結果をSigmaPlotソフトウェアによって分析した。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)反応は、製造業者のプロトコールに従ってTwistAmp Basic(TwistDx Inc.)を使用して進めた。様々な投入量のDNAを含有する50μlのRPA反応系を37℃で10分間インキュベートした。16μlのRPA産物を20μlの前述の検出アッセイに直接移した。
Cas12bのトランスssDNA切断活性の特徴付け
アリシクロバチルス・アシディフィラスNBRC 100859由来のCRISPR-Cas12bヌクレアーゼ(AaCas12b、配列番号1に示すアミノ酸配列)は最近、そのカノニカルdsDNAを標的とした切断能力に関して哺乳動物のゲノム編集に利用されている(図1a)。Cas12bの非カノニカルなトランス切断活性を特徴付けるために、本発明者らは、それらの同族ガイドRNA(gRNA)と別個に組み合わせたCas12b、Cas12a及びCas9を使用してインビトロでのssDNA切断アッセイを行った。結果が示唆するように、AaCas12b及びCas12a(LbCas12a、ArCas12a、HkCas12a及びPrCas12a)は一本鎖M13 DNAファージの急速な分解を誘導することができたが、SpCas9は誘導できなかった(図1b)。同様に、AaCas12b及びCas12aはまた、ノンターゲットgRNA及びM13ファージゲノムと配列相同性を有さないその相補的ssDNA「アクチベーター」の存在下でM13分解を達成する(図1c)。非カノニカルなコラテラルssDNA切断活性は触媒活性のないバリアント(R785A及びD977A)では消失しており、RuvCドメイン依存的な機序を示唆した(図2)。これらの結果により、AaCas12b-sgRNA複合体が、ガイド相補的ssDNAにより誘発されると、非特異的ssDNAトランス切断活性を獲得できることが明らかである。
Cas12bが媒介するDNA検出系の開発
Cas12bが媒介するDNA検出系を開発するために、本発明者らはまず、フルオロフォアクエンチャー(FQ)標識されたホモ多量体レポーターに対するAaCas12b-sgRNA複合体の切断選択性のプロファイルを調べ、AaCas12bはチミン多量体(ポリT)並びにポリA及びポリCに対する選択性を有し、一方でポリGには全く選択性を有さないことを見出した(図3a)。同時に、切断効率を最適化し、NEBuffer(商標)2において最大値に達することができる(図3b)。その後本発明者らは、NEBuffer(商標)2においてポリTレポーターを使用してAaCas12bが媒介する切断アッセイを行った。sgRNA相補的なOT-ssDNA及びOT-dsDNA(OTはオンターゲットを表す)又はsgRNA非相補的なNT-ssDNA及びNT-dsDNA(NTはノンターゲットを表す)をアクチベーターとして使用して、本発明者らは、OT-ssDNA及びOT-dsDNAがAaCas12bを誘発してFQレポーターを切断することができたが、OT-dsDNAアクチベーターは効率が低かったことを見出した(図3c)。
強化されたCas12bが媒介するDNA検出系の開発
分子診断への利用においてCDetectionの利用を拡大及び模倣するために、本発明者らは合成HPV dsDNAをヒトゲノムDNA中に希釈した。結果により、CDetectionがアトモル濃度以下の規模(0.1aM)で感染性ウイルス標的を特定できることが示された(図6a)。
別のCas12bタンパク質の特定
6つの代表的なCas12bタンパク質を選択し、多様な細菌からデノボ合成して、ヒト胎児腎293T細胞並びに4つの以前に報告されているCas12bオルソログにおいてゲノム編集を行った(図11、12、及び配列番号1〜10)。これら10個のCas12bオルソログのうち、D.イノピナタス(DiCas12b)及びT.カリダス(TcCas12b)由来のCas12bは予測可能なプレカーサーCRISPR RNA(プレ-crRNA)もアンチリピートトランス活性化crRNA(tracrRNA)も有さず(図11b)、これら2つのCas12bタンパク質はゲノム編集への利用に適さない可能性があることを示唆する。
異なるCas12bとデュアルRNAとの間の交換可能性
デュアルRNA(crRNA及びtracRRNA)とCas12b系中のタンパク質成分との互換性を調べるために、本発明者らはまず、Cas12bタンパク質及びデュアルRNA両方の保存性を分析した。Cas12bオルソログの保存されたアミノ酸配列(図14a及び図12)のほかに、プレ-crRNA:tracrRNA二重鎖のDNA配列及びそれらの二次構造もまた高い保存性を示した(図11b及び15)。次に、本発明者らは、8つのCas12b系のそれぞれのsgRNAと別個に複合体形成した8つのCas12bオルソログを用いて293T細胞においてゲノム編集を行った。T7EIアッセイの結果が示したように、AaCas12b、AkCas12b、AmCas12b、Bs3Cas12b及びLsCas12b遺伝子座由来のsgRNAは、それらの活性は異なるCas12bオルソログ間及びsgRNA間で異なるものの、哺乳動物のゲノム編集に関して元のsgRNAを置換することができた(図14c、d及び図16)。これらの結果は、異なるCas12b遺伝子座由来のCas12bとデュアルRNAとの交換可能性を示した。
ゲノム編集のための、天然の遺伝子座においてCRISPRアレイを有さないCas12bオルソログの使用
本発明者らの仮説をさらに実証するために、本発明者らはその遺伝子座がCRISPRアレイを有さない2つのCas12bオルソログ(DiCas12b及びTcCas12b)を選択し(図17a)、それらのcrRNA:tracrRNA二重鎖の配列を予測不能にしてその後の実験を行った。本発明者らは、DiCas12b及びTcCas12b並びに293T細胞における異なるゲノム部位を標的化する別の8つのCas12bオルソログの遺伝子座由来のsgRNAと組み合わせたAaCas12bをコトランスフェクトした。T7EIアッセイ結果は、AaCas12b、AkCas12b、AmCas12b、Bs3Cas12b及びLsCas12b由来のsgRNAによりTcCas12bはヒトゲノムを強力に編集することが可能となることを示した(図17b、c及び図18)。さらに、TcCas12bはAasgRNA又はAksgRNAのいずれかが同時に対象とする多重ゲノム編集を容易にすることができた(図17d及び図19)。これらの上記の結果により、異なる系由来のCas12bとデュアルRNAとの互換性は、天然の遺伝子座においてCRISPRアレイを有さないCas12bオルソログに、哺乳動物ゲノムを改変する能力を与えることができた。
Cas12bが媒介するゲノム編集のための人工sgRNAの設計
異なるCas12b系におけるCas12b及びデュアルRNAとの交換可能性から勢いを得て、本発明者らはさらに、Cas12bが媒介するゲノム編集を容易にするための新規な人工sgRNA(artsgRNA)スキャホールドを設計した。Cas12bオルソログ間でのDNA配列及び二次構造の保存性を考慮して(図11b及び13)、本発明者らはヒトCCR5遺伝子座を標的化する37個のsgRNAスキャホールドを設計及びデノボ合成した(図17e及び20a)。T7EIアッセイの結果により、22個のartsgRNAスキャホールドが有効に機能できることが示唆された(図20b)。本発明者らのartsgRNAの一般化を検証するために、本発明者らはartsgRNA13が対象とするTcCas12b又はAaCas12bを使用した多重ゲノム編集を活用した(図20a)。T7EIアッセイ結果により、artsgRNA13は、TcCas12b及びAaCas12b両方を用いた多重ゲノムエンジニアリングを同時に促進することができることが示された(図17f及び図20c)。結果は、Cas12bが媒介する多重ゲノム編集を容易にするためのartsgRNAを設計及び合成することが可能であることを示唆した。
Claims (19)
- 生物学的試料中の標的核酸分子の存在及び/又は量を検出する方法であって、
(a)生物学的試料を、(i)Cas12bタンパク質、(ii)標的核酸分子中の標的配列を対象とするgRNA、及び(iii)切断された後に検出可能なシグナルを生成する一本鎖DNAレポーター分子と接触させ、それにより反応混合物を生成するステップ、
(b)反応混合物において生成した検出可能なシグナルの存在及び/又はレベルを検出するステップ
を含み、検出可能なシグナルの存在及び/又はレベルが標的核酸分子の存在及び/又は量に相当する、方法。 - 標的核酸分子が二本鎖DNA分子又は一本鎖DNA分子である、請求項1に記載の方法。
- Cas12bタンパク質が、アリシクロバチルス・アシディフィラス由来のAaCas12b、アリシクロバチルス・カケガウェンシス由来のAkCas12b、アリシクロバチルス・マクロスポランジーダス由来のAmCas12b、バチルス・ヒサシイ由来のBhCas12b、バチルス属由来のBsCas12b、バチルス属由来のBs3Cas12b、デスルフォビブリオ・イノピナタス由来のDiCas12b、レイシーラ・セディミニス由来のLsCas12b、スピロヘータ・バクテリウム由来のSbCas12b、ツベリバチルス・カリダス由来のTcCas12bであり、好ましくはCas12bタンパク質がアリシクロバチルス・アシディフィラス由来のAaCas12bである、請求項1又は2に記載の方法。
- Cas12bタンパク質が、
(1)配列番号1〜10のいずれか1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
(2)配列番号1〜10のいずれか1つと比べて1つ以上のアミノ酸残基が置換されている、欠失している又は付加されているアミノ酸配列、又は
(3)配列番号1〜10のいずれか1つに記載のアミノ酸配列
を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - ガイドRNAがsgRNAである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- sgRNAが、配列番号11〜66のうちの1つから選択される核酸配列によってコードされるスキャホールド配列を含む、請求項5に記載の方法。
- sgRNAが、標的配列又は標的配列の相補鎖に特異的にハイブリダイズするスペーサー配列をスキャホールド配列の3'末端に含む、請求項5又は6に記載の方法。
- スペーサー配列が、標的配列との少なくとも1つのヌクレオチドミスマッチを有する、請求項7に記載の方法。
- 一本鎖DNAレポーター分子が、一本鎖DNAの両末端にフルオロフォア及び対応する消光基をそれぞれ含み、例えばフルオロフォアは、FAM、TEX、HEX、Cy3又はCy5から選択され、消光基はBHQ1、BHQ2、BHQ3又はTAMRAから選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 一本鎖DNAレポーター分子が約2〜約100ヌクレオチド長であり得る、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 一本鎖DNAレポーター分子がポリA、ポリC、又はポリTである、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)の前に生物学的試料中の核酸分子を増幅するステップをさらに含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が、PCR増幅又はリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)を含むがこれらに限定されず、好ましくは前記増幅がリコンビナーゼポリメラーゼ増幅である、請求項12に記載の方法。
- リコンビナーゼポリメラーゼ増幅が約10分間〜約60分間行われる、請求項13に記載の方法。
- 生物学的試料との前記接触の前に、Cas12bタンパク質をgRNAと事前に合わせてCas12b-gRNA複合体を形成させている、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)の前記反応が、約20分〜約180分、例えば約20分、約30分、約40分、約50分、約60分、約90分、約120分、又はそれらの間の任意の時間にわたって行われる、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)が、NEBuffer(商標)2、NEBuffer(商標)2.1又はCutsmart(登録商標)バッファーのバッファー中で行われる、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 生物学的試料が全血、血漿、血清、髄液、尿、便、細胞又は組織抽出物から選択され、例えば生物学的試料が細胞又は組織から抽出された核酸試料である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。
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