JP2023523573A - 酸性セラミダーゼ欠乏症を処置するためのベクター - Google Patents

酸性セラミダーゼ欠乏症を処置するためのベクター Download PDF

Info

Publication number
JP2023523573A
JP2023523573A JP2022562547A JP2022562547A JP2023523573A JP 2023523573 A JP2023523573 A JP 2023523573A JP 2022562547 A JP2022562547 A JP 2022562547A JP 2022562547 A JP2022562547 A JP 2022562547A JP 2023523573 A JP2023523573 A JP 2023523573A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
raav vector
seq
promoter
aav
vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022562547A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021209521A5 (ja
Inventor
アナ・ビュジ・ベロ
ジェローム・ディナール
マルティナ・マリネッロ
Original Assignee
ジェネトン
アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
ユニヴェルシテ・デヴリ・ヴァル・デソンヌ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェネトン, アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）, ユニヴェルシテ・デヴリ・ヴァル・デソンヌ filed Critical ジェネトン
Publication of JP2023523573A publication Critical patent/JP2023523573A/ja
Publication of JPWO2021209521A5 publication Critical patent/JPWO2021209521A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01023—Ceramidase (3.5.1.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Abstract

本発明は、酸性セラミダーゼ欠乏症の処置に使用するためのASAH1オープンリーディングフレームを含むベクターに関する。

Description

本発明は、酸性セラミダーゼ欠乏症、例えば進行性ミオクロニーてんかんに関連する脊髄性筋萎縮症又はファーバー病の処置に使用するための、ASAH1オープンリーディングフレームを含むベクターに関する。
酸性セラミダーゼ欠乏症は、ファーバー病(FD)と呼ばれる希なライソゾーム蓄積障害及び進行性ミオクロニーてんかんを伴う脊髄性筋萎縮症(SMA-PME)と呼ばれる希なてんかん障害を含む障害スペクトルである。FD及びSMA-PMEはいずれも、酸性セラミダーゼ(ASAH1)遺伝子の変異によって引き起こされ、これによって酸性セラミダーゼ活性が減少し、次いでセラミドの蓄積及び様々な病的症状が起こる。FDは、10%未満の酸性セラミダーゼ活性に起因する早期発症疾患であるが、より多くの活性が残っている場合は、SMA-PMEの原因となり、これはCNSに限定され、下位運動ニューロン疾患と共に始まる後期発症表現型を有する。FDは、皮下脂肪肉芽腫、関節痛、及びしわがれ声と共に始まる。神経及び内臓への罹患もまた観察され、それぞれ精神運動遅滞及び肝脾腫をもたらす。ほとんどのFD患者は、成長及び発達障害を示し、2歳より長く生きられない。泡状組織球及びマクロファージで構成される結節並びに炎症が、典型的に骨髄を含む罹患組織に存在し、疾患における造血系の潜在的役割を強調する。加えて、ファーバー病では、白血球が主に調節不全であるように思われる。SMA-PMEは、筋力低下、歩行困難、及び振せんを伴う下位運動ニューロン疾患として幼児期に臨床的に現れる。ミオクロニー発作を伴うてんかんは通常、後期小児期に発生し、認知力の低下、側湾症、及び聴力損失等の他の臨床症状もまた、疾患の進行と共に現れ得る。一般的に、患者は呼吸不全により10代の間に死亡する。
現在、酸性セラミダーゼ欠乏症の治癒はない(Yuら、2018年; Orphanet Journal or Rare Diseases; 13: 121頁)。したがって、現在の処置戦略は、症状の管理及び支持的ケアに限定される。造血幹細胞移植(HSCT)は、何らかの有望な結果を示し、CNSに罹患していない一定数のFD患者において運動及び疼痛の実質的な改善を示した。しかし、CNSの合併症を伴う古典的FD患者ではHSCTを実施しても、神経表現型を逆転させず、患者は時間と共に悪化した。Ex vivoでの遺伝子治療もまた提唱されたが、この場合、造血幹細胞(HSC)を患者又はドナーから単離し、レンチウイルスベクターを使用する遺伝子修正によって改変した後、それを必要とする患者に移植する。しかし、レンチウイルスベクター/酸性セラミダーゼを形質導入した造血細胞を与えた非ヒト霊長類の脳において有意な変化が観察されなかったことから、このアプローチは、ASAH1欠乏症の神経学的表現型の解決には有効ではないであろう(Waliaら2011年; Hum Gene Ther; 22、679～687頁)。酵素補充療法(ERT)もまた、開発中であり、これはそれを必要とする患者への組換え酸性セラミダーゼの注射を伴う。しかし、酵素が血液脳関門を通過する能力が不良であるために、ERT戦略は、神経学的表現型に関して限界に面している。
したがって、依然として、酸性セラミダーゼ欠乏症、例えばSMA-PME及びファーバー病に対して有効な治療が緊急に必要である。
WO 2019/207132号 WO 01/83692号 米国特許第5,173,414号 WO 95/13365号及び対応する米国特許第5,658,776号 WO 95/13392号 WO 96/17947号 PCT/US98/18600号 WO 97/09441号(PCT/US96/14423号) WO 97/08298号(PCT/US96/13872号) WO 97/21825号(PCT/US96/20777号) WO 97/06243号(PCT/FR96/01064号) WO 99/11764号 米国特許第5,786,211号 米国特許第5,871,982号 米国特許第6,258,595号 米国特許第6,566,118号 WO 98/09657号
Yuら、2018年; Orphanet Journal or Rare Diseases; 13: 121頁 Waliaら2011年; Hum Gene Ther; 22、679～687頁 Sharp及びLi、1987年、Nucleic Acids Research 15: 1281～1295頁 Kimら、Gene. 1997年、199:293～301頁 zur Megedeら、Journal of Virology、2000年、74: 2628～2635頁 Boshartら、Cell、41:521～530頁(1985年) Strayerら、2002年、Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol、282(3): L394～404頁 Chowら、1997年、PNAS、94(26)、14695頁 Zhuoら、2006年、Transgenic Research、15、543頁 Zhouら、2004年、Am J Respir Cell Mol Biol 30(1)、61頁 Lingら2016年7月18日、Hum Gene Ther Methods. [印刷前の電子出版] Vercauterenら、2016年、Mol. Ther. Vol. 24(6)、1042頁 Rosarioら、2016年、Mol Ther Methods Clin Dev. 3、16026頁 Kunzeら、2018年、Glia、66(2): 413頁; Weinmannら、2020年、Nature Communications、11(1):5432頁 Samulskiら、1982年、Proc. Natl. Acad. S6. USA、79:2077～2081頁 Laughlinら、1983年、Gene、23:65～73頁 Senapathy及びCarter、1984年、J. Biol. Chem.、259:4661～4666頁 Carter、1992年、Current Opinions in Biotechnology、1533～539頁 Muzyczka、1992年、Curr. Topics in Microbial、and Immunol.、158:97～129頁 Ratschinら、Mol. Cell. Biol. 4:2072頁(1984年) Hermonatら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:6466頁(1984年) Tratschinら、Mol. Cell. Biol. 5:3251頁(1985年) McLaughlinら、J. Virol.、62: 1963頁(1988年) Lebkowskiら、1988 Mol. Cell. Biol.、7:349頁(1988年) Samulskiら、(1989年、J. Virol.、63:3822～3828頁) Perrinら(1995年) Vaccine 13: 1244～1250頁 Paulら(1993年) Human Gene Therapy 4:609～615頁 Clarkら(1996年) Gene Therapy 3: 1124～1132頁 Clarkら、Hum. Gene Ther.、10(6): 1031～1039頁(1999年) Schenpp及びClark、Methods Mol. Med.、69: 427～443頁(2002年) Alayoubiら2013年; EMBO Mol Med; 5; 827頁
本発明は、ASAH1オープンリーディングフレーム(ORF)を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが、FD及びSMA-PMEの処置のための有効な遺伝子治療ベクターであるという驚くべき発見に由来する。特に、本発明によりCNS及び末梢の変化の両方が修正されることが本明細書において示される。今日まで、他の処置は両方の変化を修正することができないことから、本発明は、現在までに開発された治療と比べて大きい改善である。
第1の態様では、本発明は、ASAH1 ORFを含む組換えAAV(rAAV)ベクターに関する。このベクターは、酸性セラミダーゼ欠乏症を処置する方法に使用することができる。特に、rAAVベクターは、ファーバー病(FD)及び進行性ミオクロニーてんかんに関連する脊髄性筋萎縮症(SMA-PME)から選択される障害を処置する方法に使用することができる。特定の実施形態では、AAVベクターは、嚢胞性線維症を処置する方法に使用するためである。特定の実施形態では、ベクターは、血液脳関門を通過することができるAAVベクターである。血液脳関門を通過する能力を有する例示的なAAVベクターとしては、AAV9カプシド、AAV9P1カプシド、AAVpo1A1カプシド、AAV10カプシド、例えばAAVrh.10又はAAVcy.10カプシド、AAVrh.39カプシド、又はクレードF AAVHSCカプシドを含むベクターが挙げられるがこれらに限定されない。更なる実施形態では、AAVベクターは、AAV9カプシド、AAV10カプシド、例えばAAVrh.10、又はAAVcy.10カプシド、AAVrh.39カプシド、又はクレードF AAVHSCカプシドを含む。別の実施形態では、AAVベクターは、AAV9又はAAV10カプシドを含む。なお別の実施形態では、AAVベクターは、AAV9カプシドを含む。
発現に関して、ASAH1 ORFは、制御配列に作動可能に連結されて発現カセットに含まれる。そのような制御配列としては、これらに限定されないが、プロモーター、イントロン、エンハンサー、及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。特定の実施形態では、ASAH1 ORFは、ユビキタスプロモーターの制御下にある。別の実施形態では、ユビキタスプロモーターは、CAGプロモーター、PGKプロモーター、又はベータ-グルクロニダーゼプロモーターから選択される。更なる実施形態では、ASAH1 ORFは、CAGプロモーター又はPGKプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、プロモーターは、CAGプロモーターである。特定の実施形態では、CAGプロモーターは、配列番号9に示される配列を有するか、又は前記プロモーターは、配列番号9と少なくとも80%同一である、特に配列番号9と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を有する前記プロモーターの機能的バリアントである。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号9と少なくとも99%同一である核酸配列からなるか、又は配列番号9に示される核酸配列からなる。特定の実施形態では、PGKプロモーターは、配列番号3に示される配列を有するか、又は前記プロモーターは、配列番号3と少なくとも80%同一である、特に配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を有する前記プロモーターの機能的バリアントである。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号3と少なくとも99%同一である核酸配列からなるか、又は配列番号3に示される核酸配列からなる。
別の実施形態では、発現カセットに含まれるプロモーターに応じて、前記カセットは、イントロンを更に含み得る。例えば、カセットは、ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列を更に含み得る。特定の実施形態では、プロモーターがPGKプロモーターである場合、カセットは、イントロン、例えばヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列を更に含み得る。特定の実施形態では、ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列は、配列番号4に示される配列を有するか、又は配列番号4と少なくとも80%同一性を有する、特に配列番号4と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%同一性を有する、配列番号4に示される配列の機能的バリアントである。特定の実施形態では、カセットに含まれるイントロンは、配列番号4と少なくとも99%同一である核酸配列からなるか、又は配列番号4に示される核酸配列からなる。
なお別の実施形態では、発現カセットは、ASAH1遺伝子のポリアデニル化シグナル、ヒトβグロビン遺伝子のポリアデニル化シグナル(HBB pA)、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、SV40ポリアデニル化シグナル、及び合成ポリA、例えば配列番号1の合成ポリアデニル化シグナルからなる群から選択されるポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、HBBポリアデニル化シグナル、例えば配列番号2からなる配列、又は配列番号2に示される配列と少なくとも80%同一である、特に配列番号2と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を有するその機能的バリアントを有するHBBポリアデニル化シグナルである。
特定の実施形態では、ASAH1 ORFは、ASAH1野生型遺伝子に由来するヒトASAH1 ORFである。特定の実施形態では、ASAH1 ORFの核酸配列は、野生型配列又は最適化配列である。
ゲノムに導入される発現カセットは、前記発現カセットをAAVウイルスベクターにパッケージングするために適した、AAV末端逆位反復(ITR)配列と呼ばれる配列をその両端に有する。したがって、発現カセットは、AAVベクターへのそれの更なるパッケージングのためにAAV 5'-ITR及びAAV 3'-ITRを両端に有する。特定の実施形態では、発現カセットは、AAV2 5'-ITR及びAAV2 3'-ITRを両端に有する。
rAAVベクターのゲノムは、一本鎖ゲノム又は自己相補的ゲノムであり得る。特定の実施形態では、AAVベクターのゲノムは一本鎖である。
特定の実施形態では、本発明のrAAVベクターは、以下の順に:
- CAGプロモーター;
- ASAH1 ORF;及び
- ポリアデニル化シグナル配列、例えばHBBポリアデニル化シグナル
を含む発現カセットを含む。
特定の実施形態では、CAGプロモーターは、配列番号9に示される配列を有するか、又は前記プロモーターは、配列番号9と少なくとも80%同一である、特に配列番号9と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を有する前記プロモーターの機能的バリアントである。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号9と少なくとも99%同一である核酸配列からなるか、又は配列番号9に示される核酸配列からなる。
なお別の実施形態では、本発明のrAAVベクターは、以下の順に:
- PGKプロモーター;
- ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列;
- ASAH1 ORF;及び
- ポリアデニル化シグナル、例えばHBBポリアデニル化シグナル
を含む発現カセットを含む。
特定の実施形態では、PGKプロモーターは、配列番号3に示される配列を有するか、又は前記プロモーターは、配列番号3と少なくとも80%同一である、特に配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を有する前記プロモーターの機能的バリアントである。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号3と少なくとも99%同一である核酸配列からなるか、又は配列番号3に示される核酸配列からなる。
特定の実施形態では、ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列は、配列番号4に示される配列を有するか、又は配列番号4と少なくとも80%同一性を有する、特に配列番号4と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%同一性を有する、配列番号4に示される配列の機能的バリアントである。特定の実施形態では、カセットに含まれるイントロンは、配列番号4と少なくとも99%同一である核酸配列からなるか、又は配列番号4に示される核酸配列からなる。
第2の態様では、本発明は、遺伝子治療により疾患を処置する方法における使用のための、本発明のrAAVベクターに関する。特定の実施形態では、本発明は、酸性セラミダーゼ欠乏症を処置する方法における使用のための、本発明のrAAVベクターに関する。特定の実施形態では、ベクターは、嚢胞性線維症を処置する方法に使用するためである。好ましい実施形態では、酸性セラミダーゼ欠乏症は、FD又はSMA-PMEである。特定の実施形態では、酸性セラミダーゼ欠乏症はSMA-PMEである。特定の実施形態では、本発明のrAAVベクターは、FDを処置する方法に使用するためである。なお別の実施形態では、rAAVベクターは、ファーバー病(FD)の少なくとも1つの神経学的及び/又は末梢臨床症状を処置する方法に使用するためである。更なる実施形態では、rAAVベクターは、FDの少なくとも血液学的症状を処置する方法に使用するためである。一実施形態では、rAAVベクターは、FDの神経学的及び血液学的症状を処置する方法に使用するためである。
特定の実施形態では、本明細書を通して定義される場合、rAAVベクターは、遺伝子治療によって疾患を処置する方法における使用のための、rAAV9ベクターである。特定の実施形態では、本発明は、酸性セラミダーゼ欠乏症を処置する方法における使用のための、本明細書に開示されるrAAV9に関する。特定の実施形態では、ベクターは、嚢胞性線維症を処置する方法に使用するためである。好ましい実施形態では、酸性セラミダーゼ欠乏症は、FD又はSMA-PMEである。特定の実施形態では、rAAV9ベクターは、FDを処置する方法に使用するためである。なお別の実施形態では、rAAV9ベクターは、ファーバー病(FD)の少なくとも1つの神経学的及び/又は末梢臨床症状を処置する方法に使用するためである。更なる実施形態では、rAAVベクターは、FDの少なくとも血液学的症状を処置する方法に使用するためである。一実施形態では、rAAV9ベクターは、FDの神経学的及び血液学的症状を処置する方法に使用するためである。
別の実施形態では、前記rAAVベクターは、特に髄腔内及び/又は脳室内注射によって、対象の脳脊髄液中に投与するためである。或いは、前記rAAVベクターは、末梢投与、例えば血管内(例えば、静脈内又は動脈内)、筋肉内、又は腹腔内投与のためである。
なお別の実施形態では、rAAVベクターはAAV9カプシドを含み、ASAH1 ORFはCAGプロモーターの制御下にあり、及びrAAVベクターは血管内投与のためである。一実施形態では、rAAVベクターはAAV9カプシドを含み、ASAH1 ORFはCAGプロモーターの制御下にあり、及びrAAVベクターは静脈内投与のためである。一実施形態では、rAAVベクターはAAV9カプシドを含み、ASAH1 ORFはCAGプロモーターの制御下にあり、及びrAAVベクターは動脈内投与のためである。
なお別の実施形態では、rAAVベクターはAAV9カプシドを含み、ASAH1 ORFはPGKプロモーターの制御下にあり、及びrAAVベクターは血管内投与のためである。一実施形態では、rAAVベクターはAAV9カプシドを含み、ASAH1 ORFはPGKプロモーターの制御下にあり、及びrAAVベクターは静脈内投与のためである。一実施形態では、rAAVベクターはAAV9カプシドを含み、ASAH1 ORFはPGKプロモーターの制御下にあり、及びrAAVベクターは動脈内投与のためである。
無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びCAGプロモーターの制御下でhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの5×1013vg/kgを3週齢時に静脈内に処置したAsahP361R/P361Rマウスのカプランマイヤー生存曲線の図である。 無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びCAGプロモーターの制御下でhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの5×1013vg/kgを7週齢時に静脈内に処置したAsahP361R/P361Rマウスのカプランマイヤー生存曲線の図である。 無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びCAGプロモーターの制御下でhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの5×1013vg/kgを3週齢時に静脈内に処置したAsahP361R/P361Rマウスの体重の評価の図である。全ての群の性別を均等にした。データを、平均値±SEMとして表記し、WT+PBS、AsahP361R/P361R+PBS、及びAsahP361R/P361R+AAV-hASAH1の曲線間の差を、多重T検定によって比較した(*P<0.05; **P<0.0001)。 無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びCAGプロモーターの制御下でhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの5×1013vg/kgを7週齢時に静脈内に処置したAsahP361R/P361Rマウスの体重の評価の図である。全ての群の性別を均等にした。データを、平均値±SEMとして表記し、WT+PBS、AsahP361R/P361R+PBS、及びAsahP361R/P361R+AAV-hASAH1の曲線間の差を、多重T検定によって比較した(*P<0.05; **P<0.001; $ P<0.0001)。 3週齢時に注射したマウスにおける10週間の処置後の組織質量の全体重に対する比(mg/g)の図である。結果を平均値±SEMとして表記する。群間の差を、多重T検定によって解析した(*P<0.005)。 7週齢時に注射したマウスにおける6ヶ月間の処置後の組織質量の全体重に対する比(mg/g)の図である。結果を平均値±SEMとして表記する。群間の差を、多重T検定によって解析した(統計学的有意差なし)。 4週間の処置後の全血球数に及ぼす、hASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの効果の評価の図である。マウスを3週齢時に処置した。ヒストグラムは、無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びCAGプロモーターの制御下でhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの5×1013vg/kgを静脈内に処置したAsahP361R/P361Rマウスの結果を示す。結果を平均値±SEMとして表記する。群間の差を多重T検定によって解析した(*P<0.001)。 4週間の処置後の全血球数に及ぼす、hASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの効果の評価の図である。マウスを7週齢時に処置した。ヒストグラムは、無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びCAGプロモーターの制御下でhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの5×1013vg/kgを静脈内に処置したAsahP361R/P361Rマウスの結果を示す。結果を平均値±SEMとして表記する。群間の差を多重T検定によって解析した(*P<0.05; **P<0.001)。 3週齢時に、無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターによって静脈内経路を介して処置したAsahP361R/P361Rマウスの筋力の評価の図である。結果を平均値±SEMとして表記する。群間の差を多重T検定によって解析した(*P<0.01; **P<0.0001)。 無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターによって静脈内経路を介して処置したAsahP361R/P361Rマウスの筋力の評価の図である。マウスを7週齢時に処置した。結果を平均値±SEMとして表記する。群間の差を多重T検定によって解析した(*P<0.05; **P<0.0005)。 無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びCAGプロモーターの制御下でhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの1×1013vg/kgを出生時(P0)に脳室内注射によって処置したAsahP361R/P361Rマウスの体重評価の図である。結果を平均値±SEMとして表記する。群間の差を多重T検定によって解析した(*P<0.05; **P<0.00001)。 無処置AsahP361R/P361Rマウス、野生型動物、及びCAGプロモーターの制御下でhASAH1トランスジーンを含むrAAVベクターの1×1013vg/kgを出生時(P0)に脳室内注射によって処置したAsahP361R/P361Rマウスの筋力評価の図である。結果を平均値±SEMとして表記する。群間の差を多重T検定によって解析した(*P<0.005)。
本発明によれば、用語「約」は、数値を指す場合、この数値のプラス又はマイナス5%を意味する。
本発明の文脈において、「AAVxベクター」又は「rAAVxベクター」として記載されるベクターは、血清型xカプシドを含むベクターである。例えば、AAV9カプシド又はAAV10カプシドを含むベクターはそれぞれ、rAAVベクターに含有されるゲノムが由来する血清型とは無関係に、「AAV9ベクター」又は「AAVrh10ベクター」と呼ばれる。したがって、AAV9ベクターは、AAV9カプシド及びAAV9由来ゲノム(すなわち、AAV9 ITRを含む)を含むベクター、又はAAV9カプシド及びAAV9血清型とは異なる血清型に由来するゲノムを含むシュードタイプベクターであり得る。同様に、AAVrh.10ベクターは、AAVrh.10カプシド及びAAVrh.10由来ゲノム(すなわち、AAVrh10 ITRを含む)を含むベクター、又はAAVrh.10カプシド及びAAVrh.10血清型とは異なる血清型に由来するゲノムを含むシュードタイプベクターであり得る。この定義は、AAV9及びAAV10カプシドとは異なるカプシドを含む他のAAVベクターにも必要な変更を加えて当てはまる。
発現カセット
本発明のrAAVベクターは、ASAH1 ORFを送達するためである。前記遺伝子は、適した調節エレメントを含む発現カセットに含まれる。
特定の実施形態では、ASAH1 ORFは、ヒトASAH1(hASAH1)遺伝子に由来する。任意の機能的ASAH1遺伝子を使用してもよい。特定の実施形態では、hASAH1 ORFの核酸配列は、配列番号5に示される、ヒト(Homo sapiens)N-アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ1(ASAH1)、転写物バリアント1、Genbank受託番号NM_177924を有するmRNA配列に由来するか、又は配列番号6に示される、ヒトN-アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ1(ASAH1)、転写物バリアント2、Genbank受託番号NM_004315.5を有するmRNA配列に由来するが、特に配列番号5に示される転写物バリアント1に由来する。特定の実施形態では、本発明において使用されるhASAH1 ORFの核酸配列は、配列番号5又は配列番号6に示される配列、特に配列番号5に示される配列からなるか又はそれらを含む。
別の特定の実施形態では、ASAH1 ORFの核酸配列は最適化されている。配列の最適化は、コドン最適化、GC含有量の増加、CpGアイランド数の減少、代替オープンリーディングフレーム(ARF)数の減少、並びに/又はスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位の数の減少を含む、核酸配列における複数の変化を含み得る。遺伝子コードの縮重のために、異なる核酸分子が同じタンパク質をコードし得る。同様に、異なる生物の遺伝子コードがしばしば、他と比較して同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンのうちの1つを使用することに偏っていることも周知である。コドン最適化を通して、結果として得られたコドン最適化ヌクレオチド配列が、非コドン最適化配列と比較して比較的高レベルでそのような所定の細胞状況で発現される可能性がより高くなるように、所定の細胞状況に存在するコドンバイアスを利用する変化がヌクレオチド配列に導入される。本発明の特定の実施形態では、そのような配列最適化ヌクレオチド配列は、例えば、ヒト特異的コドン使用バイアスを利用することによって、同じタンパク質をコードする非コドン最適化ヌクレオチド配列と比較してヒト細胞におけるその発現を改善するようにコドン最適化される。
特定の実施形態では、最適化されたコード配列は、コドン最適化され、及び/又は、野生型コード配列(例えば、配列番号5又は6、特に配列番号5の野生型ヒトASAH1配列)と比較して、増加したGC含有量を有し、及び/又は減少した代替オープンリーディングフレーム数を有し、及び/又は減少した数のスプライスドナー及び/若しくはスプライスアクセプター部位を有する。
特定の実施形態では、ASAH1の核酸配列は、配列番号5又は6、特に配列番号5に示される配列と少なくとも70%同一、特に少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、又は少なくとも99%同一である。
上記で言及したように、GC含有量及び/又はARF数に加えて、配列最適化はまた、配列中のCpGアイランド数の減少並びに/又はスプライスドナー及びアクセプター部位の数の減少も含み得る。当然のこととして、当業者に周知であるように、配列最適化は、これら全てのパラメーターの間のバランスであり、このことは、最適化された配列がトランスジーンの改善、例えば改善された発現及び/又はin vivoでトランスジーンに対して減少した免疫応答をもたらす限り、上記のパラメーターのうちの少なくとも1つが改善されるが、他のパラメーターのうちの1つ又は複数が改善されない場合に、配列は最適化されたと考えられ得ることを意味する。
加えて、ASAH1 ORFのヌクレオチド配列のヒト細胞のコドン使用への適応は、コドン適応指数(CAI)として表記され得る。コドン適応指数は、本明細書において高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に対する遺伝子のコドン使用の相対的適応性の測定として定義される。各コドンの相対的適応性(w)は、各コドンの使用の、同じアミノ酸に関する最も豊富なコドンの使用に対する比である。CAIは、これらの相対的適応値の幾何平均として定義される。非同義コドン及び終止コドン(遺伝子コードに応じて)は除外される。CAI値は0～1の範囲であり、より高い値は、最も豊富なコドンの割合がより高いことを示している(Sharp及びLi、1987年、Nucleic Acids Research 15: 1281～1295頁を参照されたい;同様に、Kimら、Gene. 1997年、199:293～301頁; zur Megedeら、Journal of Virology、2000年、74: 2628～2635頁も参照されたい)。
特定の実施形態では、ASAH1 ORFの核酸配列は、野生型配列、例えば配列番号5若しくは配列番号6、特に配列番号5に示される配列、又は最適化配列、例えば配列番号7若しくは配列番号8に示される配列からなるか又はそれらを含む。更に特定の実施形態では、ASAH1 ORFの核酸配列は、野生型配列、例えば配列番号5又は配列番号6、特に配列番号5に示される配列からなるか又はそれらを含む。
rAAVベクターのゲノムは、ASAH1 ORFを含む発現カセットを含む。本発明の文脈において、「発現カセット」は、真核細胞における前記遺伝子の発現を可能にする配列に作動可能に連結された遺伝子(本明細書において、ASAH1 ORF)を含む核酸配列である。本発明のrAAVベクターにおいて、ASAH1 ORFは、1つ又は複数の発現制御配列及び/又は遺伝子の発現を改善する他の配列に作動可能に連結され得る。本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係にある場合に、「作動可能に連結され」ている。例えば、プロモーター、又は別の転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。そのような発現制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、イントロン、及びポリアデニル化シグナルは当技術分野で公知である。
本発明のrAAVベクターにおいて、ASAH1 ORFは、プロモーターに作動可能に連結されている。
特定の実施形態によれば、ユビキタスプロモーターが使用される。代表的なユビキタスプロモーターとしては:
- CAGプロモーター、これはサイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータアクチンプロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子の第1のエクソン及び第1のイントロン、並びにウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む(配列番号9);
- ホスホグリセリン酸キナーゼ1(PGK)プロモーター、例えば配列番号3に示されるヒトPGKプロモーター;
- サイトメガロウイルスエンハンサー/プロモーター(CMV)(必要に応じてCMVエンハンサーを伴う)(例えば、Boshartら、Cell、41:521～530頁(1985年)を参照されたい);
- SV40初期プロモーター;
- レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター(必要に応じてRSVエンハンサーを伴う);
- ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター;
- β-アクチンプロモーター;及び
- EF1プロモーター
が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実践において有用な他のユビキタスプロモーターとしては、CB7プロモーター、ベータグルコシダーゼ(GUSB)プロモーター、及びJeTiプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
別の実施形態によれば、特にrAAVベクターが、SMA-PMEを処置する方法に使用するためである場合、プロモーターは、ニューロン又はグリア細胞における選択的発現を駆動するプロモーターであり得る。ニューロンへの発現を駆動する代表的なプロモーターとしては、公知の運動ニューロン由来因子であるカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)のプロモーターが挙げられるがこれに限定されない。他のニューロン選択的プロモーターとしては、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、シナプシン、Hb9のプロモーター、及びニューロン限定サイレンサーエレメント(NRSE)を含むユビキタスプロモーターが挙げられる。グリア細胞における選択的発現を駆動する代表的なプロモーターとしては、グリア線維性酸性タンパク質遺伝子(GFAP)のプロモーターが挙げられる。
別の実施形態によれば、rAAVベクターが、嚢胞性線維症を処置する方法に使用するためである場合、プロモーターは、肺上皮細胞におけるASAH1タンパク質の発現を駆動するプロモーターである。肺上皮細胞における発現を駆動するために適した代表的なプロモーターとしては、ユビキタスプロモーター及び内臓の上皮細胞における選択的発現、特に肺上皮細胞における選択的発現を駆動するプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。嚢胞性線維症を処置するために本発明の実践において有用な代表的なプロモーターとしては、ヒトサーファクタントタンパク質B(SP-B)プロモーター(Strayerら、2002年、Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol、282(3): L394～404頁に記載される)、ヒトサイトケラチン18(K18)プロモーター及びこれらを含む構築物(例えば、Chowら、1997年、PNAS、94(26)、14695頁に記載される構築物)、サーファクタントタンパク質C(SP-C)プロモーター(Zhuoら、2006年、Transgenic Research、15、543頁に記載される)、及びCTP:ホスホコリンシチジルトランスフェラーゼプロモーター(CCTα)(Zhouら、2004年、Am J Respir Cell Mol Biol 30(1)、61頁に記載される)が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、嚢胞性線維症の処置に使用するためのrAAVベクターは、ユビキタスプロモーター、例えば本明細書に開示されるCAG又はPGKプロモーターである。
特定の実施形態では、プロモーターは、CAGプロモーター又はPGKプロモーターから選択される。
更なる特定の実施形態では、CAGプロモーターは、配列番号9に示される配列からなるか、又は配列番号9に示される配列と少なくとも80%同一である、特に配列番号9と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を有する、配列番号9に示される配列の機能的バリアントである。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号9と少なくとも99%同一性を有するCAGプロモーターの機能的バリアントである核酸配列からなる。なお別の実施形態では、プロモーターは、配列番号9からなる核酸配列を有するCAGプロモーターである。
更なる特定の実施形態では、PGKプロモーターは、配列番号3に示される配列からなるか、又は配列番号3に示される配列と少なくとも80%同一である、特に配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも96%、97%、98%、若しくは99%同一であるヌクレオチド配列を有する、配列番号3に示される配列の機能的バリアントである。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号3と少なくとも99%同一性を有するPGKプロモーターの機能的バリアントである核酸配列からなる。なお別の実施形態では、プロモーターは、配列番号3からなる核酸配列を有するPGKプロモーターである。
本発明の文脈において、プロモーターの機能的バリアントは、1つ又は複数のヌクレオチド改変、例えばヌクレオチド置換、付加、又は欠失によってそれに由来し、それに作動可能に連結されたASAH1 ORFの同じ又は実質的に同じ発現レベル(例えば、±20%、例えば±10%、±5%又は±1%)を結果としてもたらす配列である。
他の調節エレメントがプロモーターの下流に存在してもよい。例えば、発現カセットからの発現を増加させるためにイントロンの提供を挙げることができる。そのような更なる調節エレメントの組込みは、発現カセットに使用されるプロモーター及び結果として得られるカセットのサイズに依存する。特定の実施形態では、発現カセットは、プロモーターの下流の更なる調節エレメント、例えばヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列で構成される配列を含み得る。特定の実施形態では、ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列は、配列番号4に示される配列を有するか、又は配列番号4と少なくとも80%同一性を有する、特に配列番号4と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも96%、97%、98%、若しくは99%同一性を有する、配列番号4に示される配列の機能的バリアントである。特定の実施形態では、更なる調節エレメントは、配列番号4と少なくとも99%同一性を有する核酸配列からなるヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列の機能的バリアントである。なお別の実施形態では、更なる調節エレメントは、配列番号4に示される配列からなる改変イントロン2/エクソン3配列である。本発明の文脈において、ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列の機能的バリアントは、1つ又は複数のヌクレオチド改変、例えばヌクレオチド置換、付加又は欠失によってそれに由来し、それに作動可能に連結したASAH1 ORFの同じ又は実質的に同じ発現レベル(例えば±20%、例えば±10%、±5%、又は±1%)を結果としてもたらす配列である。
本発明の特定の実施形態では、発現カセットは、PGKプロモーター、例えば配列番号3に示される配列を有するプロモーター、及び前記プロモーターの下流でASAH1 ORFの上流に位置し、配列番号4に示されるヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列で構成される配列を含む。
本発明の発現カセットにおけるポリアデニル化シグナルは、複数の遺伝子に由来し得る。例示的なポリアデニル化シグナルとしては、ASAH1遺伝子ポリアデニル化シグナル、ヒトβグロビン遺伝子(HBB)ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、及びSV40ポリアデニル化シグナルが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、HBBポリアデニル化シグナル、例えば配列番号2に示される配列からなる配列を有するHBBポリアデニル化シグナルである。特定の実施形態では、HBBポリアデニル化シグナルは、配列番号2と少なくとも80%同一性を有する、特に配列番号2と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも96%、97%、98%、又は99%同一性を有する、配列番号2に示される配列の機能的バリアントである。別の特定の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号2に示される配列と少なくとも99%同一である配列を有するHBBポリアデニル化シグナルの機能的バリアントである。更なる実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号2に示される配列からなるHBBポリアデニル化シグナルである。本発明の文脈において、HBBポリアデニル化シグナルの機能的バリアントは、1つ又は複数のヌクレオチド改変、例えばヌクレオチド置換、付加又は欠失によってそれに由来し、それに作動可能に連結したASAH1トランスジーンの同じ又は実質的に同じ発現レベル(例えば±20%、例えば±10%、±5%、又は±1%)を結果としてもたらす配列である。
当然、他の配列、例えばコザック配列(例えばGCCACC)が当業者に公知であり、トランスジーンの発現を可能にするために導入される。
別の特定の実施形態では、発現カセットは、ASAH1 ORFとポリアデニル化シグナルとの間に位置する更なる調節エレメントを含み得る。本発明において有用であり得る代表的な調節エレメントとしては、遺伝子の3'-非翻訳領域(3'-UTR)、例えばASAH1遺伝子の3'-UTR、HBB遺伝子の3'-UTR、SV40の3'-UTR、又はウシ成長ホルモンの3'-UTRが挙げられるがこれらに限定されない。或いは、ASAH1 ORFとポリアデニル化シグナルとの間に位置する更なる調節エレメントは、WPRE配列、例えば配列番号10に示される核酸配列を有するWPRE配列である。
なお別の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- PGKプロモーター;
- ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列;
- ASAH1 ORF;及び
- ポリアデニル化シグナル
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号3のPGKプロモーター、又はその機能的バリアント;
- 配列番号4のヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列、又はその機能的バリアント;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル、又はその機能的バリアント
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号3のPGKプロモーター、又は配列番号3と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント;
- 配列番号4のヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列、又は配列番号4と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル、又は配列番号2と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号3のPGKプロモーター;
- 配列番号4のヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列、又は配列番号4と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル、又は配列番号2と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号3のPGKプロモーター、又は配列番号3と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント
- 配列番号4のヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル、又は配列番号2と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号3のPGKプロモーター、又は配列番号3と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント;
- 配列番号4のヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列、又は配列番号4と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号3のPGKプロモーター;
- 配列番号4のヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル、又は配列番号2と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号3のPGKプロモーター;
- 配列番号4のヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列、又は配列番号4と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号3のPGKプロモーター、又は配列番号3と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント;
- 配列番号4のヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル
を含む。
更に特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号3のPGKプロモーター;
- 配列番号4のヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル
を含む。
好ましい実施形態では、発現カセットは、CAGプロモーターを含む。
本発明の特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- CAGプロモーター;
- ASAH1 ORF;及び
- ポリアデニル化シグナル
を含む。
本発明の特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号9のCAGプロモーターであるプロモーター、又はその機能的バリアント;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル、又はその機能的バリアント
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号9のCAGプロモーターであるプロモーター、又は配列番号9と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル、又は配列番号2と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号9に示されるCAGプロモーターであるプロモーター;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル、又は配列番号2と少なくとも99%同一であるその機能的バリアント
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号9に示されるCAGプロモーターであるプロモーター、又はその機能的バリアント;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル
を含む。
更なる特定の実施形態では、発現カセットは、この順に:
- 配列番号9に示されるCAGプロモーターであるプロモーター;
- ASAH1 ORF;及び
- 配列番号2のHBBポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナル
を含む。
上記の特定の発現カセットの好ましい実施形態は、ASAH1 ORFの使用を含み、前記ASAH1 ORFの核酸配列は:
- 配列番号5に示される野生型配列、又はその機能的バリアント、例えば配列番号5と少なくとも99%同一である機能的バリアント;
- 配列番号6に示される野生型配列、又はその機能的バリアント、例えば配列番号6と少なくとも99%同一である機能的バリアント;
- 配列番号7からなる最適化配列、又はその機能的バリアント、例えば配列番号7と少なくとも99%同一である機能的バリアント;又は
- 配列番号8からなる最適化配列、又はその機能的バリアント、例えば配列番号8と少なくとも99%同一である機能的バリアント
を含むか又はそれらからなる。
好ましい実施形態では、前記ASAH1 ORFの核酸配列は:
- 配列番号5に示される野生型配列、又はその機能的バリアント、例えば配列番号5と少なくとも99%同一である機能的バリアント;又は
- 配列番号7若しくは配列番号8からなる最適化配列、又はその機能的バリアント、例えば配列番号7と少なくとも99%同一である機能的バリアント
を含むか又はそれらからなる。
なお別の好ましい実施形態では、前記ASAH1 ORFの核酸配列は:
- 配列番号5に示される野生型配列;又は
- 配列番号7若しくは配列番号8からなる最適化配列
を含むか又はそれらからなる。
なお更なる好ましい実施形態では、前記ASAH1 ORFの核酸配列は:
- 配列番号5に示される野生型配列;
- 配列番号7からなる最適化配列;
- 配列番号8からなる最適化配列
からなる。
特定の実施形態では、前記ASAH1 ORFの核酸配列は、配列番号5に示される野生型配列からなる。
組換えベクター
rAAVベクターのゲノムとして使用するために、本明細書に開示される発現カセットは、発現カセットをrAAVベクターにパッケージングするために適したAAV 5'-ITR及びAAV 3'-ITR配列をその両端に有する。
ヒトパルボウイルスであるアデノ随伴ウイルス(AAV)は、感染した細胞のゲノムに組み込まれ、潜伏感染を確立することができる、天然の複製欠損であるディペンドウイルスである。AAVベクターは、ヒト遺伝子治療のための潜在的ベクターとして非常に関心が高まっている。ウイルスの好ましい特性は、如何なるヒト疾患ともその関連がないこと、分裂細胞及び非分裂細胞の両方、並びに感染することができる異なる組織に由来する広範囲の細胞株に感染できることである。
本発明の文脈において、用語「アデノ随伴ウイルス」(AAV)及び「組換えアデノ随伴ウイルス」(rAAV)は互換的に使用され、野生型(wt)AAVゲノムと比較して、wtゲノムの一部を目的のトランスジーンと交換することによりそのゲノムが改変されたAAVを指す。用語「トランスジーン」は、その核酸配列がAAVゲノムに天然に存在しない遺伝子を指す。特に、rAAVベクターは、遺伝子治療に使用される。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子治療」は、遺伝性又は後天性の疾患又は状態を処置又は防止するために、目的の遺伝材料(例えば、DNA又はRNA)の宿主への移入を指す。
組換えAAVは、従来の分子生物学技術を使用して操作されてもよく、核酸配列の細胞特異的送達のために、免疫原性を最小限にするために、安定性及び粒子の寿命を調整するために、効率的な分解のために、核への正確な送達のために、これらの粒子を最適化することが可能である。ベクターにアセンブルするために望ましいAAVエレメントとしては、vp1、vp2、vp3を含むcapタンパク質、並びに超可変領域、rep 78、rep 68、rep 52、及びrep 40を含むrepタンパク質、及びこれらのタンパク質をコードする配列が挙げられる。これらのエレメントは、多様なベクター系及び宿主細胞において容易に使用され得る。
本発明において、AAVベクターのカプシドは、天然に存在する又は天然に存在しない血清型に由来し得る。特定の実施形態では、AAVベクターのカプシドの血清型は、AAVの天然の血清型から選択される。AAVの天然の血清型を使用することの代替として、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するAAVを含むがこれに限定されない人工AAV血清型を、本発明の文脈において使用してもよい。そのような人工カプシドは、任意の適した技術によって、選択されたAAV配列(例えば、vp1カプシドタンパク質の断片)を、異なる選択されたAAV血清型、同じAAV血清型の不連続部分、非AAVウイルス起源、又は非ウイルス起源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用することによって生成され得る。人工AAV血清型からのカプシドは、キメラAAVカプシド、組換えAAVカプシド、又は「ヒト化」AAVカプシドであり得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、AAVベクターのカプシドは、AAV-1、-2、AAV-2バリアント(例えば、Y44+500+730F+T491Vの変化を有する操作されたカプシドを含む四重変異体カプシド最適化AAV-2、Lingら、2016年7月18日、Hum Gene Ther Methods. [印刷前の電子出版]に開示される)、-3及びAAV-3バリアント(例えば、2つのアミノ酸変化、S663V+T492Vを有する操作されたAAV3カプシドを含むAAV3-STバリアント、Vercauterenら、2016年、Mol. Ther. Vol. 24(6)、1042頁に開示される)、-3B及びAAV-3Bバリアント、-4、-5、-6、及びAAV-6バリアント(例えば、三重変異AAV6カプシドY731F/Y705F/T492V型を含むAAV6バリアント、Rosarioら、2016年、Mol Ther Methods Clin Dev. 3、16026頁に開示される)、-7、-8、-9、及びAAV9バリアント(例えば、AAVhu68)、-2G9、-10、例えば-cy10及び-rh10、-11、-12、-rh39、-rh43、-rh74、-dj、Anc80L65、LK03、AAV.PHP.B、AAV2i8、クレードF AAVHSC、ブタAAV、例えばAAVpo4及びAAVpo6、並びにAAV血清型のチロシン、リジン、及びセリンカプシド変異体のカプシドである。加えて、シャッフリング、合理的設計、エラープローンPCR、及び機械学習技術によって得られた他の非天然の操作されたバリアント(例えば、AAV-spark100)、キメラAAV又はAAV血清型のカプシドもまた有用であり得る。
AAVベクターはまた、P1ペプチド、例えばAAV9P1カプシドによって改変されたカプシドであるカプシド(Kunzeら、2018年、Glia、66(2): 413頁;及びWeinmannら、2020年、Nature Communications、11(1):5432頁に記載される)又はAAVpo1A1カプシド(WO 2019/207132号に記載される)も含み得る。
特定の実施形態では、AAVベクターは、天然に存在するカプシド、例えばAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-cy.10、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV11、AAV12、及びクレードF AAVHSCカプシドを有する。特定の実施形態では、rAAVベクターは、血液脳関門を通過することができる。血液脳関門を通過する能力を有する例示的なAAVベクターとしては、AAV9カプシド、AAV10カプシド、例えばAAVrh.10、又はAAVcy.10、又はクレードF AAVHSC(例えば、AAVHSC7、AAVHSC15、及びAAVHSC17)カプシドを含むベクターが挙げられるがこれらに限定されない。なお別の実施形態では、AAVベクターはAAV9カプシドを含む。
本発明の特定の実施形態では、rAAVベクターは、AAV9若しくはAAV10カプシド(例えば、AAVrh.10カプシド又はAAVcy.10カプシド、特にAAVrh.10カプシド)、又は血液脳関門を通過することができるAAV血清型からの任意の他のカプシド、例えばAAV9P1カプシド、AAVpo1A1カプシド、AAVrh.39カプシド、若しくはクレードF AAVHSCカプシドを含み得る。更なる実施形態では、AAVベクターは、AAV9若しくはAAV10カプシド(例えば、AAVrh.10カプシド又はAAVcy.10カプシド、特にAAVrh.10カプシド)、又は血液脳関門を通過することができるAAV血清型からの任意の他のカプシド、例えばAAVrh.39カプシド若しくはクレードF AAVHSCカプシドを含む。別の実施形態では、AAVベクターは、AAV9又はAAV10カプシド(例えば、AAVrh.10カプシド又はAAVcy.10カプシド、特にAAVrh.10カプシド)を含む。なお別の実施形態では、AAVベクターは、AAV9カプシドを含む。
本発明のrAAVベクター内に存在するゲノムは、一本鎖又は自己相補的であり得る。本発明の文脈において、「一本鎖ゲノム」は、自己相補的ではないゲノムであり、すなわちその中に含有されるコード領域が、McCartyら、2001年及び2003年(前掲)に開示されるように分子内二本鎖DNA鋳型を形成するように設計されていない。これに対し、「自己相補的AAVゲノム」は、McCartyら、2001年及び2003年(前掲)に開示されるように分子内二本鎖DNA鋳型を形成するように設計されている。
特定の実施形態では、rAAVゲノムは一本鎖ゲノムである。
rAAVベクター内に存在するゲノムは、好ましくはAAV rep及びcap遺伝子を欠如してもよく、目的のトランスジーンを含む。したがって、AAVゲノムは、AAV ITRをその両端に有する目的のトランスジーンを含み得る。上記のように、目的のトランスジーンは、発現カセットに含まれるASAH1 ORFである。ITRは、任意のAAVゲノム、例えばAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVcy.10、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV11、AAV12又はクレードF AAVHSCゲノムに由来し得る。特定の実施形態では、AAVベクターのゲノムは、5'-及び3'-AAV2 ITRを含む。
AAV血清型カプシド及びITRの任意の組合せを本発明の文脈においてインプリメントしてもよく、このことは、AAVベクターが同じAAV血清型に由来するカプシド及びITR、又は第1の血清型に由来するカプシド及び第1の血清型とは異なる血清型に由来するITRを含み得ることを意味する。異なる血清型に由来するカプシドITRを有するそのようなベクターはまた、「シュードタイプベクター」とも呼ばれる。より詳細には、シュードタイプrAAVベクターは、以下を含み得る:
- AAV1 5'-及び3'-ITR、並びにAAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV2 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV3 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV4 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV5 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV6 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV7 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV8 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV9 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVrh.10 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV11 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV12 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVrh.39 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV-PHP.B 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;又は
- AAVHSC 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、及びAAV-PHP.Bカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム。
別の実施形態では、シュードタイプrAAVベクターは、以下を含み得る:
- AAV1 5'-及び3'-ITR、並びにAAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV2 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV3 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV4 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV5 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV6 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV7 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV8 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV9 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVrh.10 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV11 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV12 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVrh.39 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV-PHP.B 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;又は
- AAVHSC 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、及びAAV-PHP.Bカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム。
別の実施形態では、シュードタイプrAAVベクターは、以下を含み得る:
- AAV1 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV2 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV3 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV4 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV5 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV6 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV7 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV8 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV9 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVrh.10 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;又は
- AAV11 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV12 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVrh.39 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV-PHP.B 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVHSC 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、及びAAV-PHP.Bからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム。
別の実施形態では、シュードタイプrAAVベクターは、以下を含み得る:
- AAV1 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV2 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV3 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV4 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV5 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV6 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV7 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV8 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV9 5'-及び3'-ITR、並びにAAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVrh.10 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;又は
- AAV11 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV12 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVrh.39 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAV-PHP.B 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム;
- AAVHSC 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、及びAAV-PHP.Bからなる群から選択されるカプシドを含むゲノム。
特定の実施形態では、シュードタイプrAAVベクターは、ゲノム、特にAAV2 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含む一本鎖ゲノムを含む。更なる実施形態では、シュードタイプrAAVベクターは、ゲノム、特にAAV2 5'-及び3'-ITR、並びにAAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV11、AAV12、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含む一本鎖ゲノムを含む。別の特定の実施形態では、シュードタイプrAAVベクターは、ゲノム、特にAAV2 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、及びAAVHSCカプシドからなる群から選択されるカプシドを含む一本鎖ゲノムを含む。なお別の特定の実施形態では、シュードタイプrAAVベクターは、ゲノム、特にAAV2 5'-及び3'-ITR、並びにAAV9カプシドを含む一本鎖ゲノムを含む。
別の態様では、本発明は、本発明のrAAVゲノムを含むDNAプラスミドを提供する。rAAVの産生は、以下の成分が単一の細胞(本明細書においてパッケージング細胞として示される)内に存在することを必要とする:rAAVゲノム、rAAVゲノムから離れている(すなわちその中に存在しない)AAV rep及びcap遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能。シュードタイプrAAVの産生は、例えばWO 01/83692号に開示されている。産生は、2つ、3つ、又はそれより多くのプラスミドによる細胞のトランスフェクションをインプリメントし得る。例えば、以下を含む3つのプラスミドを使用してもよい:(i)Rep/Capカセットを有するプラスミド、(ii)rAAVゲノム(すなわち、AAV ITRをその両端に有するトランスジーン)を有するプラスミド、及び(iii)ヘルパーウイルス機能(例えば、アデノウイルスヘルパー機能)を有するプラスミド。別の実施形態では、(i)Rep及びCap遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を含むプラスミド、並びに(ii)rAAVゲノムを含むプラスミドを含む、2プラスミド系を使用してもよい。
更なる態様では、本発明は、上記の発現カセットを含むプラスミドに関する。このプラスミドは、rAAVゲノムを細胞に提供することによって本発明によるrAAVベクターを産生するために前記細胞に導入され得る。
パッケージング細胞を生成する方法は、AAV粒子産生にとって必要な全ての成分を安定に発現する細胞株を作製することである。例えば、AAV rep及びcap遺伝子を欠如するrAAVゲノム、rAAVゲノムから離れたAAV rep及びcap遺伝子、及び選択可能マーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子、を含むプラスミド(又は複数のプラスミド)を、細胞のゲノムに組み込む。AAVゲノムは、GCテーリング(Samulskiら、1982年、Proc. Natl. Acad. S6. USA、79:2077～2081頁)、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加(Laughlinら、1983年、Gene、23:65～73頁)、又は直接の平滑末端ライゲーション(Senapathy及びCarter、1984年、J. Biol. Chem.、259:4661～4666頁)等の手順によって細菌プラスミドに導入されている。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、rAAVの大規模産生にとって適している点である。適した方法の他の例は、rAAVゲノム並びに/又はrep及びcap遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくてアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。
rAAV産生の一般的原理は、例えば、Carter、1992年、Current Opinions in Biotechnology、1533～539頁;及びMuzyczka、1992年、Curr. Topics in Microbial、and Immunol.、158:97～129頁)において論評されている。様々なアプローチが、Ratschinら、Mol. Cell. Biol. 4:2072頁(1984年); Hermonatら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:6466頁(1984年); Tratschinら、Mol. Cell. Biol. 5:3251頁(1985年); McLaughlinら、J. Virol.、62: 1963頁(1988年);及びLebkowskiら、1988 Mol. Cell. Biol.、7:349頁(1988年); Samulskiら(1989年、J. Virol.、63:3822～3828頁);米国特許第5,173,414号;WO 95/13365号及び対応する米国特許第5,658,776号; WO 95/13392号; WO 96/17947号; PCT/US98/18600号; WO 97/09441号(PCT/US96/14423号); WO 97/08298号(PCT/US96/13872号); WO 97/21825号(PCT/US96/20777号); WO 97/06243号(PCT/FR96/01064号); WO 99/11764号; Perrinら(1995年) Vaccine 13: 1244～1250頁; Paulら(1993年) Human Gene Therapy 4:609～615頁; Clarkら(1996年) Gene Therapy 3: 1124～1132頁;米国特許第5,786,211号;米国特許第5,871,982号;及び米国特許第6,258,595号に記載されている。このように、本発明はまた、感染性rAAVを産生するパッケージング細胞も提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、安定に形質転換されたがん細胞、例えばHeLa細胞、HEK293細胞、HEK 293T、HEK293vc、及びPerC.6細胞(同起源の293細胞株)であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば継代回数の低い293細胞(アデノウイルスのE1によって形質転換されたヒト胎児腎細胞)、MRC-5細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、WI-38細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、Vero細胞(サル腎細胞)、及びFRhL-2細胞(アカゲザル胎児肺細胞)である。
rAAVは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配等の当技術分野で標準の方法によって精製され得る。ヘルパーウイルスからrAAVベクターを精製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Clarkら、Hum. Gene Ther.、10(6): 1031～1039頁(1999年); Schenpp及びClark、Methods Mol. Med.、69: 427～443頁(2002年);米国特許第6,566,118号及びWO 98/09657号に開示される方法を含む。
別の態様では、本発明は、本出願に開示されるrAAVを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中にrAAVを含む。組成物はまた、他の成分、例えば希釈剤及び補助剤も含み得る。許容される担体、希釈剤、及び補助剤は、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは使用される投薬量及び濃度で不活性であり、緩衝液、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、若しくは他の有機酸緩衝液;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸;低分子量ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジン;単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えばEDTA;糖アルコール、例えばマンニトール若しくはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばTween、pluronic類、若しくはポリエチレングリコール(PEG)を含む。
別の態様では、本発明は、それぞれの広い及び特異的実施形態の各々に開示されるように、ASAH1 ORF、及び上記の調節エレメント(例えば、プロモーター、イントロン、3'-UTR、及びポリアデニル化シグナル)を含む発現カセットに関する。
上記のように、発現カセットを、AAVベクターに導入することができる。代替の実施形態では、本発明の発現カセットを、別のベクター、例えば別の組換えウイルスベクター又は非ウイルスベクターに導入することができる。したがって、本発明はまた、本発明の発現カセットを含むベクターであって、減少した酸性セラミダーゼ活性レベルを呈する他の疾患の酸性セラミダーゼ欠乏症を処置するために、ASAH1 ORFを目的の標的細胞において発現させる遺伝子治療にとって適しているベクターにも関する。特定の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクター、例えばプラスミド、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、又はリポソームである。別の実施形態では、ベクターは、組換えウイルスベクター、例えば上記のrAAVベクター、又は別のウイルスベクター、例えばアデノウイルスである。特定の実施形態では、本発明の発現カセットを含む組換えウイルスベクターは、レンチウイルスではない。
本発明の治療的使用
本発明はまた、治療に使用するためのベクター、例えば本明細書に開示されるrAAVベクターにも関する。
本発明により、ASAH1 ORFは、それを必要とする対象に送達され得る。それを必要とする対象は、酸性セラミダーゼ欠乏症、又は正常レベルと比較して減少した酸性セラミダーゼ活性レベル若しくは増加したセラミドレベルに関連する若しくはそれらを呈する疾患を有する対象であり得る。特定の実施形態では、増加したセラミドレベルを呈する疾患は、嚢胞性線維症、一部の網膜症(例えば、網膜色素変性症(RP26))及び遺伝性盲目である。
好ましい実施形態では、本発明のrAAVベクターは、酸性セラミダーゼ欠乏症、例えば嚢胞性線維症、FD又はSMA-PMEを処置する方法に使用するためである。より特に、本発明のrAAVベクターは、FD又はSMA-PMEを処置する方法に使用するためである。特定の実施形態では、本発明のrAAVベクターは、SMA-PMEを処置する方法に使用するためである。特定の好ましい実施形態では、本発明のベクター、特に本発明のrAAVベクターは、FDの処置に使用するためである。
特定の実施形態では、本発明のベクター、特に本発明のrAAVベクターは、FDの少なくとも1つの神経症状及び/又は少なくとも1つの末梢症状の処置に使用するためである。
FDの神経学的症状は、中枢神経系(CNS)の症状及び末梢神経系(PNS)の症状を含む。
FDのCNS症状としては、脳幹、大脳皮質、及び小脳における水頭及び脳萎縮蓄積病態による発作、発達の遅延、知的障害;脊髄の前方部分における蓄積病態による緊張低下、筋力低下、及び萎縮;又は脊髄の前方部分における蓄積病態による筋力低下及び萎縮が挙げられる。FDのCNS症状はまた、脊髄の他の場所での症状も含み得る。
FDのPNS症状としては、末梢神経のシュワン細胞における蓄積病態による、緊張低下、筋力低下、及び萎縮が挙げられ、車椅子での生活をもたらす。
末梢症状としては:
- 皮下脂肪肉芽腫;
- 関節痛;
- しわがれ声;
- 血液学的症状、例えば増加した白血球数及び赤血球沈降速度、上昇した血漿キトトリオシダーゼ及びC反応性タンパク質(CRP)、肥大したリンパ節、貧血、血小板減少症、有核赤血球の存在;
- 肺所見:FDの古典的及び症状の弱い型の両方における疾患のより一般的な徴候のうちの1つ:胸骨陥没、呼吸性喘鳴、失声症、呼吸困難;
- 眼科所見:最も一般的な徴候は、桜実紅斑、網膜混濁、角膜混濁、黄斑変性である;
- 消化管所見:持続性の下痢;
- 肝臓所見:肝腫大、胆汁うっ滞性黄疸、腹水、肝線維症、及び肝酵素上昇;
- 脾臓:脾腫;
- 軟骨及び骨所見:関節びらん、傍関節性骨びらん、及び脱塩、骨粗しょう症、短い指及び足指を伴う末梢骨溶解;並びに
- 皮膚科症状:皮下結節、皮膚病変及び斑点、過角化、ケロイド
が挙げられる。
特定の実施形態では、本発明のrAAVベクターは、FDの少なくとも1つの末梢症状の処置に使用するためである。本発明の更なる特定の実施形態では、本発明のrAAVベクターは、FDの血液学的症状の処置に使用するためである。なお更なる実施形態では、本発明のベクター、特に本発明のrAAVベクターは、FDの神経学的、脾臓、肺、又は血液学的症状の処置に使用するためである。なお更なる実施形態では、本発明のベクター、特に本発明のrAAVベクターは、FDの神経学的、脾臓、肺、及び血液学的症状の処置に使用するためである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのベクターは、上で定義されたゲノム、例えば一本鎖ゲノムを含むrAAVベクターである。なお別の実施形態では、本発明による使用のためのベクターは、上で定義されたゲノム、例えば一本鎖ゲノムを含む、AAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、又はクレードF AAVHSCベクター、好ましくはAAV9、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV-PHP.B、又はクレードF AAVHSCベクター、好ましくはAAV9又はAAVrh.10ベクター、より好ましくはAAV9ベクターであり得る。
本発明によれば、使用するためのベクターは、全身性の同時送達を伴って又は伴わずに局所的に投与され得る。本発明の文脈では、局所投与は、例えばrAAVベクターの髄腔内注射を介した、対象の脳脊髄液への投与を指す。一部の実施形態では、ベクターの有効量は脳内投与によって投与される。一部の実施形態では、ベクターは、髄腔内投与によって又は脳内投与によって投与され得る。一部の実施形態では、ベクターは、髄腔内及び/又は脳内及び/又は末梢(例えば、血管、例えば静脈内又は動脈内、特に静脈内)投与の組合せによって投与され得る。
本明細書で使用される場合、用語「髄腔内投与」は、本発明によるベクター、又は本発明のベクターを含む組成物の、脊柱管内への投与を指す。例えば、髄腔内投与は、脊柱管の頸部領域、脊柱管の胸部領域、又は脊柱管の腰部領域への注射を含み得る。典型的に、髄腔内投与は、作用剤、例えば本発明のベクターを含む組成物を、脊柱管のくも膜と軟膜との間の領域である脊柱管のくも膜下の腔(くも膜下腔)に注射することによって行われる。くも膜下腔は、小柱(くも膜から延びて軟膜に混じり合う微細な結合組織微細繊維)、及び脳脊髄液が含有される相互連絡チャネルからなる海綿状組織によって占有されている。一部の実施形態では、髄腔内投与は、脊髄血管への投与ではない。ある特定の実施形態では、髄腔内投与は、対象の腰部領域への投与である。
本明細書で使用される場合、用語「脳内投与」は、作用剤の脳の中への及び/又はその周囲への投与を指す。脳内投与は、大脳、髄質、橋、小脳、頭蓋内腔、及び脳周囲の髄膜への作用剤の投与を含むが、これらに限定されない。脳内投与は、脳の硬膜、くも膜、及び軟膜への投与を含み得る。脳内投与は、一部の実施形態では、脳周囲のくも膜下腔の脳脊髄液(CSF)への作用剤の投与を含み得る。脳内投与は、一部の実施形態では、脳室/前脳、例えば右側脳室、左側脳室、第3脳室、第4脳室への作用剤の投与を含み得る。一部の実施形態では、脳内投与は、脳血管への投与ではない。
一部の実施形態では、脳内投与は、定位手順を使用する注射を伴う。定位手順は、当技術分野で周知であり、典型的に、特定の脳内領域、例えば脳室領域への注射を誘導するために共に使用されるコンピューター及び三次元走査デバイスの使用を伴う。微量注射ポンプ(例えば、World Precision Instruments社)もまた使用してもよい。一部の実施形態では、微量注射ポンプを使用して、本発明のベクターを含む組成物を送達する。一部の実施形態では、組成物の注入速度は、1μl/分～100μl/分の範囲である。当業者に認識されるように、注入速度は、例えば対象の種、対象の年齢、対象の体重/体格、ベクターの種類(すなわち、プラスミド又はウイルスベクター、ウイルスベクターのタイプ、rAAVベクターの場合にはベクターの血清型)、必要な投薬量、標的化される脳内領域等を含む多様な要因に依存する。このように、ある特定の状況では、他の注入速度が、当業者によって適切であると思われ得る。
更に、ある特定のrAAVベクター(例えばrAAV9、rAAVrh.10、rAAVrh.39、又はrAAVHSCベクター)によって誘発される血液脳関門を通過する能力により、全身経路を介した投与を考慮してもよい。したがって、rAAVベクターの投与方法は、筋肉内、腹腔内、血管内(例えば、静脈内又は動脈内)、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、全身投与は、rAAVベクターの血管内注射、特に静脈内注射である。
なお別の特定の実施形態では、本発明のrAAVベクターは、血液脳関門を通過する能力を有するベクター、例えばrAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、rAAVrh.10、rAAVrh.39、又はrAAVHSCベクター、特に例えばrAAV9、rAAVrh.10、rAAVrh.39、又はrAAVHSCベクター(特に、rAAV9又はrAAV10ベクター、より特にrAAV9ベクター)であり、rAAVベクターは血管内(特に静脈内)に投与され、処置される疾患はFDである。
更なる実施形態では、本発明のrAAVベクターは、血液脳関門を通過する能力を有するベクター、例えばrAAV9、AAV9P1、AAVpo1A1、rAAVrh.10、rAAVrh.39、又はrAAVHSCベクター、特に例えばrAAV9、rAAVrh.10、rAAVrh.39、又はrAAVHSCベクター(特にrAAV9又はrAAV10ベクター、より特にrAAV9ベクター)であり、rAAVベクターは、血管内(特に静脈内)及びCSF内(特に、脳室内又は髄腔内)に投与され、処置される疾患はFDである。
特定の実施形態では、ベクターは、脳脊髄液中に、特に髄腔内注射によって投与される。特定の実施形態では、患者は、rAAVベクターの髄腔内送達後、トレンデレンブルグ位置に置かれる。
FD又はSMA-PMEの処置に有効な本発明のベクターの量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な投薬量範囲を予測するのを助けるために、in vivo及び/又はin vitroアッセイを必要に応じて使用してもよい。それを必要とする対象に投与される本発明のベクターの投薬量は、処置される疾患の特定のタイプ又はステージ、対象の年齢、又は治療効果を得るために必要な発現レベルを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に基づいて変化する。当業者は、この分野における自身の知識に基づいて、これらの要因及びその他に基づいて必要な投薬量範囲を容易に決定することができる。AAVベクターの典型的な用量は、少なくとも1×108ベクターゲノム/キログラム体重(vg/kg)、例えば少なくとも1×109vg/kg、少なくとも1×1010vg/kg、少なくとも1×1011vg/kg、少なくとも1×1012vg/kg 少なくとも1×1013vg/kg、少なくとも1×1014vg/kg又は少なくとも1×1015vg/kgの用量である。
更に、本発明による使用するためのベクター、特に本明細書に開示されるrAAVを、別の治療と組み合わせて使用することができる。例示的な非限定的実施形態は、以下の実施形態を含み、この中で、それを必要とする対象は:
- 本発明による組換えベクター、例えば本発明のrAAV、及び造血幹細胞移植;
- 本発明による組換えベクター、例えば本発明のrAAV、及び造血幹細胞がASAH1 ORFを有するベクター、例えばレンチウイルスベクターによって形質導入されている造血幹細胞移植;又は
- CSF中(例えば、脳室内経路による)に投与される本発明による組換えベクター、例えば本発明のrAAV、及び末梢経路、例えば血管内投与、より特に静脈内投与を介してERTとして投与される組換えASAH1タンパク質
を与えられ得る。
本発明による組換えベクターを含む組合せ治療の他の例示的な実施形態としては:
- 本発明のrAAVベクター及びASAH1 ORFをコードするレンチウイルスベクター;
- 本発明のrAAVベクター及びERTとして投与される組換えASAH1タンパク質;並びに
- 本発明のrAAVベクター及び酸性セラミダーゼ欠乏症の処置にとって適した任意の他の物質、化合物、又は組成物
が挙げられるがこれらに限定されない。
材料及び方法
ベクターの産生
ユビキタスCAGプロモーターの制御下で野生型ASAH1 ORF(配列番号5)を有する一本鎖血清型9 AAVベクターを、浮遊培養のHEK293細胞における3プラスミドトランスフェクション系を使用して産生し、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ベクター力価(ウイルスゲノム/mL)を、qPCRによって決定した。
ユビキタスPGKプロモーター(配列番号3)の制御下で野生型ASAH1 ORF(配列番号5)又は最適化ASAH1 ORF(配列番号7又は配列番号8)を有し、プロモーターの下流にヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列(配列番号4)を有する一本鎖血清型9 AAVベクターを、浮遊培養のHEK293細胞における3プラスミドトランスフェクション系を使用して産生し、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ベクター力価(ウイルスゲノム/mL)を、qPCRによって決定した。
マウス遺伝子型決定及びベクター注射
ホモ接合Asah1P361R/P361R変異体マウスを、ヘテロ接合Asah1P361R/+マウスを交配させることによって得た(Alayoubiら2013年; EMBO Mol Med; 5; 827頁)。同腹子を、注入プロトコールに応じて出生時又は15日齢で遺伝子型決定した。マウスを、12時間照明12時間消灯サイクルで維持し、標準飼料を与え、飼料及び水を自由に与えた。マウスのケア及び取り扱いは、動物実験に関する国内及び欧州規則に従って実施され、施設内倫理委員会によって承認された。
遺伝子型決定に関して、本発明者らは、ゲノムDNAから、以下のプライマー:野生型Asah1対立遺伝子増幅に関して、フォワード5'(CAGAAGGTATGCGGCATCGTCATAC)3'(配列番号11)及びリバース5'(AGGGCCATACAGAGAAACCCTGTCTC)3'(配列番号12)、並びにAsah1ノックインP361R対立遺伝子増幅に関して、フォワード5'(TCAAGGCTTGACTTTGGGGCAC)3'(配列番号13)及びリバース:5'(GCTGGACGTAAACTCCTCTTCAGACC)3'(配列番号14)を使用して、PCRを実施した。
変異体AsahP361R/P361Rマウスに、5×1013vg/kgのベクターの静脈内、又は1×1013vg/kgのベクターの脳室内注射を3週齢時又は出生時(P0)にそれぞれ与えた。対照の同腹子には、等量の食塩水(PBS-MK、1mM MgCl2、2.5mM KCl)を与えた。生存、全般的外観、体重、及び筋力を週に2回モニターした。ベクター注射の4又は10週間後、マウスを、ケタミン/キシラジンカクテルによって麻酔し、末梢血を収集し、その後頸椎脱臼して組織を解剖した。選択した臓器及び筋肉の質量を測定した後、組織を凍結保存した。
イムノブロット分析
静脈内注射の4週間後、タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete Mini、Roche Applied Science社)を補充したRIPA溶解緩衝液を使用して、製造元のプロトコール(Fisher社)に従って組織から抽出した。タンパク質試料(100μg及び50μg)を、SDS-PAGE電気泳動によって分離し(1.0mm、4～12%勾配のNovex NuPAGE Bis-Tris Gel、Life Technologies社)、Protran Premiumニトロセルロース膜(GE Healthcare社)に転写した。膜を、βサブユニットを検出するためのヒトASAH1のC末端に対するポリクローナル抗体(Sigma社)、αサブユニットを検出するためのヒトASAH1に対するモノクローナル抗体(BD Science社)、及び内部対照としてのGAPDHに対するウサギポリクローナル抗体(Millipore社)によってプロービングした。対応する二次IRDye-680CW又は-800CW-コンジュゲート抗体(1:10,000、LI-COR Biosciences社)と共にインキュベートした後、赤外線蛍光をOdyssey Imaging System(LI-COR Biosciences社)において読み取った。バンド強度を、Odysseyアプリケーションソフトウェア(LI-COR Biosciences社、Image Studio Lite、4.0バージョン)を使用して測定した。
機能の評価
四肢ハンギング試験又はコンジエラ倒立スクリーニング試験は、マウスの筋力を評価する方法を表す。グリッドを約35cmの高さに設定し、マウスがグリッドから落ちた場合にマウスが怪我をしないように下に軟らかい床敷きを置いた。本発明者らは、29～90日齢のマウスの把持時間を週に1回定量した(3回/セッション、最大把持時間180秒)。試験を、Treat-NMDガイドライン(プロトコール番号DMD_M.2.1.005)に基づいて実施した。
血液分析
マウスにベクター又は食塩水を静脈内注射した4週間後に、血液を後眼窩から、抗凝固クエン酸塩溶液を含有するチューブに収集した。血液試料を、MS9.3カウンター(Schloessing Melet社、France)を使用して、白血球(WBC、リンパ球、単球、及び顆粒球)数、赤血球又は赤血球(erythrocyte)(RBC)数、及び血小板数を含む標準的な血液学パラメーターに関して分析した。
結果
材料及び方法の節で記載した各発現カセットに由来する酸性セラミダーゼα及びβサブユニット(ASAH1)の発現レベルを、野生型マウスに5×1013vg/kgの血清型9ベクターを静脈内注射した4週間後に、脊髄、心臓、及び前脛骨筋(TA)において評価した。酸性セラミダーゼレベルは、PGKプロモーターの制御下で野生型又は最適化ASAH1 ORFを含有する構築物を注射したマウスの組織では類似であり、CAGプロモーターの制御下で野生型ASAH1 ORFを含有する構築物ではより高かった。このことは、また、PGKプロモーターからの発現は有効であったが、CAGプロモーターは、これらの組織においてPGKプロモーターより強いASAH1発現をもたらすことを示している。このため、以下の結果を、CAGプロモーターを含有する構築物について得た。
図1に示すように、3週齢時にAAV9-CAG-hASAH1ベクターの5×1013vg/kgを静脈内投与すると、平均70日齢で死亡した無処置変異体マウスと比較して、処置した全てのAsahP361R/P361Rマウスの生存を最大で少なくとも180日間延長した(注射時、n=26 WT+PBS、n=20 AsahP361R/P361R+PBS、及びn=10 AsahP361R/P361R+AAV-hASAH1マウス)。図2に示すように、7週齢時にAAV9-CAG-hASAH1(5×1013vg/kg)を1回静脈内注射すると、平均66日齢で死亡した無処置変異体マウスと比較して、処置した全てのAsahP361R/P361Rマウスの生存を延長した(注射時、n=19 WT+PBS、n=10 AsahP361R/P361R+PBS、及びn=16 AsahP361R/P361R+AAV-hASAH1マウス)。
加えて、図3は、3週齢時(初期症候性段階)に5×1013vg/kgのAAV9-CAG-hASAH1を静脈内に処置した変異体AsahP361R/P361Rマウスの体重が、時間と共に次第に増加し、野生型同腹子と同等であったことを示している。無処置変異体マウスはおよそ5週齢時から成長に欠陥があった(注射時、n=26 WT+PBS、n=20 AsahP361R/P361R+PBS、及びn=10 AsahP361R/P361R+AAV-hASAH1マウス)。更に、図4は、7週齢時(後期症候性段階)にAAV9-CAG-hASAH1を静脈内に処置した変異体AsahP361R/P361Rマウスの増加した体重回復を示している。体重の発展は、時間と共に一定の増加を示すが、無処置変異体マウスは、12週齢まで成長の減少を呈する(注射時、n=19 WT+PBS、n=10 AsahP361R/P361R+PBS、及びn=16 AsahP361R/P361R+AAV-hASAH1マウス)。
臓器の検査によるAsahP361R/P361Rマウスにおける疾患表現型の評価により、13週齢の対照及び注射したマウスを比較していくつかの末梢組織、例えば脾臓、腎臓、肝臓、肺、及び胸腺の肥大が明らかとなる(図5)。3週齢時にssAAV9-CAG-hASAH1を静脈内注射すると、10週間の処置後、組織質量は野生型レベルへと正常化した。中枢神経系もまた影響を受け、脳質量は対照組織と比較してより高かった。AAV9-CAG-hASAH1注射は、表現型を正常サイズへと修正する。組織質量の全体重に対する比(mg/g)はまた、7週齢時にベクターの静脈内注射を受けたマウスにおいても評価した(図6)。組織質量の野生型レベルへの正常化は、19週間の処置後に観察された。
AAV9-CAG-hASAH1ベクターの投与が造血に及ぼす効果もまた評価した(図7及び図8)。図7に示されるように、無処置AsahP361R/P361Rマウス(N=10)は、7週齢時に野生型マウス(N=11)と比較して変化した造血を呈した。3週齢時にAAV9-CAG-hASAH1を静脈内注射すると、処置の4週間後に末梢血中のリンパ球、単球、及び顆粒球の数を回復した(N=13)。更に、図8に示されるように、7週齢時にAAV9-CAG-hASAH1を全身投与すると、AsahP361R/P361Rマウス(N=16)の血液特徴の変化を野生型レベル(N=6)に修正した。血球計数を、注射した4週間後の11週齢時に実施した。無処置のAsahP361R/P361Rは、より大きい造血の変化を示した(N=2)。
静脈内に処置したマウスの筋力もまた評価した(図9及び図10)。図9に示されるように、3週齢で注射したAsahP361R/P361Rマウスの筋力は、四肢ハンギング試験を使用して評価した場合に、試験期間を通して野生型動物と同等であったが、無処置変異体マウスの筋力は時間と共に減少した(注射時、n=9 WT+PBS、n=11 AsahP361R/P361R+PBS、及びn=9 AsahP361R/P361R+AAV-hASAH1マウス)。図10は、疾患の後期症候性段階(7週齢)でssAAV9-CAG-hASAH1を注射すると、試験期間(4～13週齢)を通して、注射したAsahP361R/P361Rマウスの筋力が野生型スコアまで回復したが、無処置変異体マウスの筋力は時間と共に減少したことを示している(注射時、n=9 WT+PBS、n=5 AsahP361R/P361R+PBS、及びn=8 AsahP361R/P361R+AAV-hASAH1マウス)。結果を、平均値±SEMとして表記する。群間の差を、多重T検定によって解析した(*P<0.05; $ P<0.005)。
加えて、図11は、出生時(P0)に1×1013vg/kgのAAV9-CAG-hASAH1の脳室内(ICV)注射によって処置した変異体AsahP361R/P361Rマウスの体重が時間と共に次第に増加し、野生型同腹子と同等であったが、無処置変異体マウスは、5週齢時頃から成長が停止したことを示している(注射時、n=32 WT+PBS、n=16 AsahP361R/P361R+PBS、及びn=32 AsahP361R/P361R+AAV-hASAH1マウス)。
最後に、図12は、出生時にAAV9-CAG-hASAH1のICV投与によって処置したAsahP361R/P361Rマウスの筋力が、四肢ハンギング試験を使用して評価した場合に、試験期間を通して野生型動物と同等であったが、無処置変異体マウスの筋力は時間と共に増加しなかったことを示している(注射時、n=9 WT+PBS、n=11 AsahP361R/P361R+PBS、及びn=11 AsahP361R/P361R+AAV-hASAH1マウス)。
結論として、本明細書において、hASAH1 ORFを有するrAAVベクターは、酸性セラミダーゼ欠乏症に関連する表現型を広く修正することができることが示される。実際に、上記の結果は、IV又はCSF経路を介して投与されたそのようなベクターが、マウスの寿命を大きく延長し、質量減少及び臓器傷害を防止し、筋力を回復し、血球組成に対して正の効果を有することを示している。この最後の結果は、hASAH1 ORFを有するrAAV9ベクターが血球組成に対して効果を有し得ることが予想されなかったために、特に驚くべきである。血液学での欠点を修正するためのこれまでの試みは、造血幹細胞移植又はレンチウイルスベクターによって遺伝子改変された造血細胞を使用するex vivo遺伝子治療のいずれかを伴ったが、これらのアプローチは、神経系におけるASAH1欠乏症の症状に対して有意な効果を有しなかった。文献において、生後3日目にレンチウイルスベクターを介してhASAH1 ORFを注射することによるファーバー病の遺伝子治療アプローチが、生後120日の間に成長遅滞及び生存率に対抗することができなかったことが報告された。したがって、本明細書の知見はまた、初期症候性段階(3週齢時)及び後期症候性段階(7週齢時)の両方で疾患表現型を広く修正することができる遺伝子置換療法を行うために、レンチウイルスと比較してrAAVアプローチを使用する利点を強調する。本明細書において、酸性セラミダーゼ障害によって誘導される複数の傷害、特にFDにおいて誘導される傷害に対処するために有用である治療戦略が提供される。

Claims (33)

  1. 酸性セラミダーゼ欠乏症を処置する方法における使用のための、ASAH1オープンリーディングフレーム(ORF)を含む組換えAAV(rAAV)ベクター。
  2. 前記酸性セラミダーゼ欠乏症が、ファーバー病(FD)及び進行性ミオクロニーてんかんを伴う脊髄性筋萎縮症(SMA-PME)から選択される障害である、請求項1に記載の使用のためのrAAVベクター。
  3. 前記rAAVベクターが、AAV9、AAV9P1、AAV10、AAVpo1A1、クレードF AAVHSC、AAVrh.39、又はAAV-PHP.Bカプシドを含む、請求項1又は2に記載の使用のためのrAAVベクター。
  4. 前記rAAVベクターがAAV9カプシドを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
  5. 前記ASAH1 ORFがユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
  6. 前記ユビキタスプロモーターが、CAGプロモーター又はPGKプロモーターである、請求項5に記載の使用のためのrAAVベクター。
  7. 前記プロモーターがCAGプロモーターである、請求項6に記載の使用のためのrAAVベクター。
  8. 前記rAAVベクターが、この順に:
    - CAGプロモーター;
    - ASAH1 ORF;及び
    - ポリアデニル化シグナル配列
    を含む発現カセットを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
  9. 前記プロモーターがPGKプロモーターである、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
  10. 前記rAAVベクターが、この順に:
    - PGKプロモーター;
    - ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列;
    - ASAH1 ORF;及び
    - ポリアデニル化シグナル配列
    を含む発現カセットを含む、請求項1から6及び9のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
  11. 前記障害がFDである、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
  12. ファーバー病(FD)の少なくとも1つの神経学的症状及び/又は末梢症状を処置する方法における、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
  13. 前記方法がFDの少なくとも血液学的症状を処置するためのものである、請求項12に記載の使用のためのrAAVベクター。
  14. 前記方法が、FDの神経学的及び血液学的症状を処置するためのものである、請求項12又は13に記載の使用のためのrAAVベクター。
  15. 前記rAAVベクターがAAV9カプシドを含み、前記ASAH1 ORFがCAGプロモーターの制御下にあり、及び前記rAAVベクターが血管内投与用である、請求項12から14のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
  16. i)AAV9、AAV9P1、AAV10、クレードF AAVHSC、AAVrh.39、AAVpo1A1、及びAAV-PHP.Bカプシドからなる群から選択されるカプシド;並びに
    ii)この順に:
    - CAG又はPGKプロモーター;
    - ASAH1 ORF;及び
    - ポリアデニル化シグナル配列
    を含む発現カセットを含むゲノム
    を含む、組換えAAV(rAAV)ベクター。
  17. i)AAV9カプシド;並びに
    ii)この順に:
    - CAG又はPGKプロモーター;
    - ASAH1 ORF;及び
    - ポリアデニル化シグナル配列
    を含む発現カセットを含むゲノム
    を含む、請求項16に記載のrAAVベクター。
  18. 前記プロモーターがCAGプロモーターである、請求項16又は17に記載のrAAVベクター。
  19. 前記CAGプロモーターの核酸配列が、配列番号9に示される配列又は配列番号9と少なくとも99%同一であるその機能的バリアントからなる、請求項18に記載のrAAVベクター。
  20. 前記プロモーターがPGKプロモーターである、請求項16又は17に記載のrAAVベクター。
  21. 前記CAGプロモーターの核酸配列が、配列番号3に示される配列又は配列番号3と少なくとも99%同一であるその機能的バリアントからなる、請求項20に記載のrAAVベクター。
  22. 前記発現カセットが、この順に:
    - PGKプロモーター;
    - ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列;
    - ASAH1 ORF;及び
    - ポリアデニル化シグナル配列
    を含む、請求項16、17、20、及び21のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
  23. 前記ヒトβグロビン遺伝子の改変イントロン2/エクソン3配列が、配列番号4に示される配列からなるか、又は配列番号4と少なくとも99%同一であるその機能的バリアントである、請求項22に記載のrAAVベクター。
  24. 前記ポリアデニル化シグナルが、配列番号2からなる核酸配列、又は配列番号2と少なくとも99%同一であるその機能的バリアントを有するHBBポリアデニル化シグナルである、請求項16から23のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
  25. 前記発現カセットがAAV2 5'-ITR及びAAV2 3'-ITRをその両端に有する、請求項16から24のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
  26. 前記ゲノムが一本鎖である、請求項16から25のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
  27. 酸性セラミダーゼ欠乏症を処置する方法における使用のための、請求項16から25のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
  28. 前記酸性セラミダーゼ欠乏症が、ファーバー病(FD)及び進行性ミオクロニーてんかんを伴う脊髄性筋萎縮症(SMA-PME)から選択される障害である、請求項27に記載の使用のためのrAAVベクター。
  29. 前記障害がFDである、請求項27又は28に記載の使用のためのrAAVベクター。
  30. ファーバー病(FD)の少なくとも1つの神経学的症状及び/又は末梢症状を処置する方法における、請求項27から29のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
  31. 前記方法が、FDの少なくとも血液学的症状を処置するためのものである、請求項30に記載の使用のためのrAAVベクター。
  32. 前記方法が、FDの神経学的及び血液学的症状を処置するためのものである、請求項30又は31に記載の使用のためのrAAVベクター。
  33. 前記rAAVベクターが血管内投与用である、請求項27から32のいずれか一項に記載の使用のためのrAAVベクター。
JP2022562547A 2020-04-14 2021-04-14 酸性セラミダーゼ欠乏症を処置するためのベクター Pending JP2023523573A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20169463 2020-04-14
EP20169463.5 2020-04-14
PCT/EP2021/059709 WO2021209521A1 (en) 2020-04-14 2021-04-14 Vectors for the treatment of acid ceramidase deficiency

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023523573A true JP2023523573A (ja) 2023-06-06
JPWO2021209521A5 JPWO2021209521A5 (ja) 2024-04-25

Family

ID=70289590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022562547A Pending JP2023523573A (ja) 2020-04-14 2021-04-14 酸性セラミダーゼ欠乏症を処置するためのベクター

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230151390A1 (ja)
EP (1) EP4135776A1 (ja)
JP (1) JP2023523573A (ja)
CN (1) CN115379863A (ja)
CA (1) CA3174863A1 (ja)
WO (1) WO2021209521A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023192998A1 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treating orthopedic injury with a vector driving expression of acid ceramidase

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
JP3952312B2 (ja) 1993-11-09 2007-08-01 メディカル カレッジ オブ オハイオ アデノ関連ウイルス複製遺伝子を発現可能な安定な細胞株
PT733103E (pt) 1993-11-09 2004-07-30 Targeted Genetics Corp Criacao de elevados titulos de vectores de aav recombinantes
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
US6143548A (en) 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
JPH11514853A (ja) 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
EP0932418B1 (en) 1996-09-06 2007-12-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
CA2302992C (en) 1997-09-05 2011-11-01 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US7056502B2 (en) 2000-04-28 2006-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with AAV5 capsids and AAV5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
ES2635726T3 (es) * 2007-06-06 2017-10-04 Genzyme Corporation Terapia génica para enfermedades de almacenamiento lisosómico
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
EP3652324A1 (en) * 2017-07-08 2020-05-20 Genethon Treatment of spinal muscular atrophy
SG11202010645VA (en) * 2018-04-27 2020-11-27 Medical College Wisconsin Inc Use of lentivector-transduced t-rapa cells for amelioration of lysosomal storage disorders
AU2019258830A1 (en) 2018-04-27 2020-12-03 Universität Heidelberg Modified AAV capsid polypeptides for treatment of muscular diseases

Also Published As

Publication number Publication date
EP4135776A1 (en) 2023-02-22
WO2021209521A1 (en) 2021-10-21
CA3174863A1 (en) 2021-10-21
CN115379863A (zh) 2022-11-22
US20230151390A1 (en) 2023-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200370069A1 (en) Treatment of spinal muscular atrophy
JP6966463B2 (ja) 組換えウイルス産物及びｄｕｘ４エクソンスキッピングを誘導するための方法
US20230272422A1 (en) Adeno-associated viral vector for glut1 expression and uses thereof
US20210147872A1 (en) Adeno-associated virus (aav) systems for treatment of progranulin associated neurodegenerative diseases or disorders
US20230151390A1 (en) Vectors for the treatment of acid ceramidase deficiency
US20220042045A1 (en) Expression cassettes for gene therapy vectors
EP3969060A1 (en) Optimized gene therapy targeting retinal cells
US20230330265A1 (en) GENE THERAPY VECTOR FOR eEF1A2 AND USES THEREOF
US20220049270A1 (en) Transgene cassettes, aav vectors, and aav viral vectors for expression of human codon-optimized cstb
CA3177341A1 (en) Engineered parkin and uses thereof
US20220389453A1 (en) Materials and methods for the treatment of disorders associated with the irf2bpl gene
WO2023086966A1 (en) Materials and methods for slc6a1 gene therapy
WO2023168400A2 (en) Materials and methods for the treatment of eif2b5 mutations and diseases resulting therefrom
WO2024011115A1 (en) Adeno-associated virus delivery of cln1 polynucleotide

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240412

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240412