KR20220109346A - 신경 퇴행성 질환의 치료를 위한 유전자 요법 - Google Patents

신경 퇴행성 질환의 치료를 위한 유전자 요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규의 신경 퇴행성 질환에 대한 유전자 치료제를 제공한다.
본 발명은 Aβ 변이체를 세포 밖으로 분비하여, 인체 내에서 wt Aβ polymerization을 느리게 하거나 방해하며 독성을 감소시킴으로써 신경 퇴행성 질환에 우수한 예방, 개선 및 치료 효과를 나타낸다.

Description

신경 퇴행성 질환의 치료를 위한 유전자 요법{GENE THERAPIES FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISORDER}
본 발명은 신경 퇴행성 질환의 치료를 위한 유전자 치료 요법에 관한 것이다.
신경퇴행성 질환은 주로 뉴런에 영향을 미치는 것이다. 퇴행성 공정에는 뉴런 구조의 진행성 손실, 뉴런 기능의 진행성 손실, 또는 진행성 뉴런 세포사가 관여될 수 있다. 여러 구체적 장애가 신경퇴행성 질환으로 분류된다.
알츠하이머병은 모든 치매의 약 60%를 차지하며, 추정치는 세계적으로 2600만 명을 초과하는 개인이 알츠하이머병을 갖는 것으로 보고된다. 치매에는 보통 기억, 언어 및 인지 공정에서의 결핍을 포함하는 정신 기능의 진행성 쇠퇴가 관여된다. 알츠하이머 병은 환자 자신에 영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라 종종 비용을 지급받지 못한 채 환자를 돌봐야 하는 수백만 명의 보호자에게 큰 영향을 받는다. 알츠하이머병의 가장 큰 위험 인자는 연령이므로, 사람들이 더 고령으로 더 오래 생존함에 따라 유병률은 극적으로 증가한다.
알츠하이머병과 연관된 전형적인 병리에는 뇌의 거시적 아트로피, 대뇌 피질의 회색질 박화, 뉴런 손실을 시사하는 확대된 뇌실, 단백질 덩어리로 응집하는, 베타-아밀로이드 펩타이드[Aβ]를 포함하는 미시적인 세포외 아밀로이드 플라크, 응집된 타우 단백질을 포함하는 세포외 신경원섬유 매듭, 및 뇌혈관 아밀로이드, 즉 혈관 주위 아밀로이드 단백질이 관여된다.
특히, 알츠하이머병의 병리학적 특징은 환자의 뇌에 신경 섬유 엉킴 (NFT) 및 아밀로이드 침착물의 존재이다. 노인성 플라크는 주요 성분이 응집된 아밀로이드 -β 단백질 (Aβ)이고 세포외에서 축적되며 노인성 플라크가 신경 종말 주위에서 발생하는 것으로 알려져 있다.
수십 년에 걸친 연구는 알츠하이머병에서 병리학적 Aβ의 처리 및 축적을 이해하는 데 전념해왔다. 이 연구를 바탕으로 항 -Aβ 요법을 개발하려는 노력은 β-,γ- secretase를 억제하거나, 면역 요법을 통해 신경세포에서 방출된 펩타이드를 격리시키거나, Aβ polymerization을 예방하는 데 중점을 두었다. 이러한 접근법을 테스트하는 대부분의 임상 시험에서 결과는 만족스럽지 못했기 때문에 이러한 요법은 크게 성공하지 못했다. 최근 aducanumab 면역 요법에 대한 EMERGE 시험의 재분석은 Aβ targeting을 표적으로 삼는 것이 임상적으로 실행 가능하다는 아이디어에 새로운 희망을 주었다. 최적의 AD 치료가 Aβ 단독을 목표로 할 것 같지는 않지만, 질병 단계에 맞춘 미래의 병용 치료의 일부를 구성할 수도 있다. 하지만 항체 요법은 클리닉에 도달하는 최초의 Aβ - 감소 전략일 수 있지만, 부작용 프로파일과 반복적인 정맥 내 투여의 필요성은 광범위한 사용에 문제가 될 수 있다.
또한, 최근 아밀로이드 및 독성 올리고머의 형성을 방지할 수 있는 작은 펩타이드를 개발하기 위해 엄청난 노력이 기울여졌다. 펩타이드는 높은 특이성 및 낮은 독성과 관련된 높은 생물학적 활성을 제공하지만, 이러한 이점에도 불구하고 펩타이드 약물의 효능은 생체 내에서 짧은 반감기에 의해 심각하게 방해될 수 있고, 특히 뇌에 대한 투여 및 전달에 문제를 일으킬 수 있다.
따라서 상기 관점에서, 신경 재생 또는 생존의 촉진, 신경퇴행성 장애의 치료, 예방, 또는 완화를 위한 개선된 유전자 치료법에 대한 필요성이 존재한다.
대한민국 공개특허공보 10-2020-0075865 대한민국 공개특허공보 10-2019-0127266
본 발명자들은 BBB 침투 및 생체 내 반감기에 대한 과거의 한계를 극복하기 위해 Aβ 변이체를 분비하기 위한 신규의 발현 벡터 기반 유전자 요법을 개발하였다.
이에 따라, 본 발명은 인체 내에서 wt Aβ polymerization을 느리게 하거나 방해하며 이의 독성을 감소시키는 Aβ 변이체를 발현시킬 수 있는 유전자 작제물, 재조합 발현 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 신규한 유전자 작제물을 구축하였다.
따라서, 본 발명은 Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 코딩 서열; 및 이에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 작제물을 제공한다.
본 발명자들은 Aβ 펩타이드 변이체를 코딩하는 유전자를 단일 유전자 작제물를 이용하면, 재조합 단백질을 직접 주사할 필요 없이 적은 수의 투여(단일 투여 또는 그 이상)로 신경 퇴행성 질환의 유전자 치료를 이룰 수 있음을 확인하였다. 특히, Aβ 펩타이드 변이체는 wt Aβ를 방해하거나 억제하며, 기존의 응집된 Aβ plaques의 disassembly를 통해 우수한 질환 개선 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 Aβ 펩타이드 변이체는 amyloid precursor protein 서열을 기초로 하여 이루어진 변이체일 수 있다. amyloid precursor protein 서열은 3개의 isoform, APP 695, 751, 그리고 770 aa를 가지는 것으로 알려져 있다. 그 중에서 amyloid precursor protein은 695 aa가 주로 신경에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 상기 기초 서열을 기반으로 하는 변이체들은 본 발명의 범주에 포함된다. 일 예시로, 대표적인 mRNA APP 서열은 GenBank® Accession No. NM_000484에서 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 Aβ 펩타이드 변이체는 amyloid precursor protein 서열을 기초로 (서열번호 1, APP 770 aa 기준 (핵산 서열: 서열번호 2))로 V689P, F690D, 및 A692D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 것일 수 있다. 즉, Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 코딩 서열은 상기 언급한 V689P, F690D, 및 A692D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 펩타이드 서열을 인코딩하는 서열일 수 있다.
이러한 인코딩 서열의 예시적인 서열은 서열번호 3 또는 4에 각각 구체적으로 기재하였다. 상기 서열번호 3 또는 4는 각각 V689P/A692D, 또는 V689P/F690D/A692D 변이를 포함하도록 디자인되며, 임의의 변이체의 일예시에 해당하며, 이러한 변이체로 내용이 한정되는 것은 아니다. 즉, V689P, F690D, 및 A692D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 것과 이의 인코딩 서열은 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에 따른 상기 변이체들은 "생물학적으로 활성"이 동등하게 유지되는 한도 내에서 이의 추가적인 변이를 더 포함할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 서열번호 3 또는 4의 서열에서 추가의 변이를 포함할 수 있다. 구체적으로, 각각의 서열에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것을 이용할 수 있다. 이러한 서열은 인코딩 서열에 의해 제조되는 위 Aβ 펩타이드 변이체의 생물학적 활성이 동등 수준에서 유지되는 서열을 본 발명의 범주로 포함하는 것이다. 보다 구체적으로, Aβ 펩타이드 변이체의 689 내지 692 아미노산 위치에서 추가의 변이를 포함할 수 있도록 상기 서열번호 3 또는 4의 서열에 있어서 서열 변형이 이루어지거나 디자인될 수 있다. 이러한 서열은 적어도 80% 이상의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것으로, 제조된 Aβ 펩타이드 변이체의 생물학적 활성이 동등 수준에서 유지되는 서열을 본 발명의 범주에서 포함할 수 있다.
상기 서열번호 3 또는 4로부터 인코딩되는 펩타이드 서열의 예시를 서열번호 5 또는 6에 각각 나타내었다.
상기 Aβ 펩타이드 변이체는 wt Aβ monomer와 상호 작용을 통해 Aβ polymerization을 방해하는 입체 변화를 유도할 수 있다. 즉, Aβ polymerization 형성이 Aβ의 중심 소수성 클러스터로부터 이루어질 수 있는데, 상기 언급된 변이 서열을 포함하는 Aβ 펩타이드 변이체는 wt Aβ와 상호 작용하여 응집을 억제하고 독성을 감소시킨다. 즉, 응집 억제 작용은 아밀로이드 형성 및 Aβ- 매개 신경 독성을 감소시킬 수 있다. 이러한 Aβ 펩타이드 변이체 자체로는 응집을 하지 않고 독성을 일으키지 않으나 wt Aβ 펩타이드와 함께 있을 때에는 wt Aβ polymerization을 억제하거나 침착된 Aβ의 disassembly를 통해서 질환의 치료 효과를 나타낼 수 있다.
Aβ 펩티드들은 신경 및 다른 세포들 내에서 발견되는 부모 막-수송 단백질(parent trans-membrane protein)인 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP)의 과도한 진행(excessive processing)의 결과로서 생성된다. 아밀로이드 반점들은 베타-세크레타아제(beta-secretase)인 아스파틸 프로테아제(aspartyl protease)에 의해 촉매되는 순차적 단백질 분해 및 후속하는 프레세닐린-의존적 감마-세크레타아제 개열(presenilin-dependent gammasecretase cleavage)에 의해 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 유도되는 40 및 42개의 아미노산 펩티드들 (각각 Aβ40 및 Aβ42라고 불리움)로 주로 구성된다. Aβ42가 Aβ40에 비해 더 소수성이고 그리고 덜 가용성이며, 아밀로이드 반점들 내에서 우월한 종이다.
특히, Aβ42가 응집(aggregation) 및 침착(deposition)되는 경향이 강하게 존재하며, 이에 따라 시냅스 손실(synaptic loss)과 마찬가지로 세포독성을 더 야기하는 경향이 있다. 따라서 본 발명에서는 Aβ42 펩타이드 변이체를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
Aβ42 펩타이드의 응집 및 침착은 신경 퇴행성 질환, 특히 알츠하이머병에 큰 영향을 미친다.
따라서, 본 발명에서는 Aβ42 펩타이드 변이체는 위와 같은 펩타이드의 응집 및 침착에 큰 영향을 미치는 Aβ42 서열을 기초(서열번호 7 (핵산서열 : 서열번호 8))로 V18P, F19D, 및 A21D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 것일 수 있다. 즉, Aβ42 펩타이드 변이체를 인코딩하는 코딩 서열은 상기 언급한 V18P, F19D, 및 A21D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 펩타이드 서열을 인코딩하는 서열일 수 있다.
이러한 인코딩 서열의 예시적인 서열은 서열번호 9 또는 10에 각각 구체적으로 기재하였다. 상기 서열번호 9 또는 10은 각각 V18P/A21D 또는 V18P/F19D/A21D 변이를 포함하도록 디자인되며, 위 임의의 변이체의 일예시에 해당하며, 이러한 변이체로 내용이 한정되는 것은 아니다. 즉, V18P, F19D, 및 A21D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 것과 이의 인코딩 서열은 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에 따른 상기 변이체들은 "생물학적으로 활성 "이 동등하게 유지되는 한도 내에서 이의 추가적인 변이를 더 포함할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 서열번호 9 또는 10의 서열에서 추가의 변이를 포함할 수 있다. 구체적으로, 각각의 서열에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것을 이용할 수 있다. 이러한 서열은 인코딩 서열에 의해 제조되는 위 Aβ42 펩타이드 변이체의 생물학적 활성이 동등 수준에서 유지되는 서열을 본 발명의 범주로 포함하는 것이다.
보다 구체적으로, Aβ42 펩타이드의 18 내지 21 번째 아미노산 위치에서 추가의 변이를 포함할 수 있도록 상기 서열번호 9 또는 10의 서열에 있어서 서열 변형이 이루어지거나 디자인될 수 있다. 이러한 서열은 적어도 80% 이상의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것으로, 제조된 Aβ42 펩타이드 변이체의 생물학적 활성이 동등 수준에서 유지되는 서열을 본 발명의 범주에서 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적인 실시양태에 따르면, Aβ42 펩타이드 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
Aβ(V18P/A21D) : DAEFRHDSGYEVHHQKLPFFDEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (서열번호 11)
Aβ(V18P/F19D/A21D) : DAEFRHDSGYEVHHQKLPDFDEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (서열번호 12)
본 발명에서는 상기 언급한 바와 같이, V18P, F19D, 또는 A21D의 각각의 변이, 이들의 2개의 조합 변이, 3개의 조합 변이를 모두 포함한다. 필요에 따라, 상기 언급된 변이를 포함하면서 서열번호 11 또는 12에 대하여 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 서열도 본원 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, Aβ 펩타이드 변이체 및/또는 Aβ42 펩타이드 변이체는 TVIVITLVMLKK (서열번호 13)의 서열을 서열말단에 더 포함할 수 있다(하기 실시예 상에서 약어 KK로 표현). 이러한 서열은 membrane 상에서 Aβ변이체를 γ-secretase에 의해 extracellular space로 분비할 수 있게 한다. 상기 서열번호 13을 인코딩하는 서열로 예시적으로 서열번호 14가 본 발명에 따른 유전자 작제물에 더 포함될 수 있으며, 변이체를 인코딩하는 서열에 이어서 위치할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 작제물은 신경에서의 발현 및/또는 투여를 목적한다. 구체적으로, 신경 조직, 보다 구체적으로 신경세포, 성상세포(Astrocyte), 미세아교세포(Microglia), 희소돌기아교세포 (Oligodendrocyte) 등을 포함하는 뇌에서 발현하는 세포에서의 발현을 목적한다.
상기 발현에서, Aβ 펩타이드 변이체는 Extracellular space에서 발현되는 것이 보다 바람직하다. 이러한 발현을 통하여 노인성 플라크의 주요 성분인 응집된 아밀로이드-β 단백질 (Aβ)의 세포외에서 축적을 방지할 수 있다.
본 발명에 있어서, Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 코딩 서열은 γ secretase cleavage를 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 이러한 γ secretase cleavage의 예시적인 서열은 서열번호 15에 나타내었고, 이를 인코딩하는 서열은 서열번호 16에 나타내었다. γ secretase cleavage의 서열을 통하여 Aβ 펩타이드 변이체의 경우 Extracellular space에서 발현할 수 있으며, 이에 따라 Extracellular space에서의 상기 Aβ 펩타이드 변이체 발현을 통해 질환의 치료 효과를 달성할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "작동적으로 연결된"이란, 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합위치의 어레이)과 다른 뉴클레오티드 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 작제물은 하나 이상의 프로모터의 제어 하에 Aβ 펩타이드 변이체를 발현할 수 있다.
본 발명에 있어서 프로모터 서열은 일반적으로 벡터 발현에서 사용되는 프로모터 서열, 신경 세포 특이적으로 알려져 있는 프로모터 서열 또는 과발현을 목적하는 프로모터 서열 등을 포함할 수 있다. 예를 들어 일반적인 프로모터 서열로 CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터 등을 이용할 수 있다.
특히, 본 발명에 있어서, 프로모터 서열은 신경 특이적으로 알려져 있는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 신경 특이 프로모터들로 human synapsin I (hSyn) 프로모터(예를 들어, 서열번호 17), mouse calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) 프로모터(예를 들어, 서열번호 18), rat tubulin alpha I (Tuba1a) 프로모터(예를 들어, 서열번호 19), rat neuron-specific enolase (NSE) (예를 들어, 서열번호 20) 및 human platelet-derived growth factor-beta chain (PDGF) 프로모터(예를 들어, 서열번호 21) 등을 이용할 수 있다.
신경 특이적 프로모터에 의해 조절되는 유전자는 다른 조직의 세포에서는 발현되지 않지만 대부분 또는 모든 신경세포에서 발현된다. 이러한 신경세포는 단순히 신경 세포뿐만 아니라 성상세포(Astrocyte), 미세아교세포(Microglia), 희소돌기아교세포 (Oligodendrocyte) 등의 뇌 등의 신경 조직에 포함된 세포를 포함하는 것일 수 있다.
과발현 프로모터들로 EF-1α 프로모터(예를 들어, 서열번호 22), CAG 프로모터(예를 들어, 서열번호 23), CMV 프로모터 (예를 들어, 서열번호 24)등을 이용할 수 있다.
바람직하게 프로모터는 CAG, CaMKII, human synapsin I (hSyn) 프로모터일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 유전자 작제물은 하나 이상의 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열, 효율적인 RNA 처리 신호, 예컨대 세포질의 mRNA를 안정화시키는 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리A) 신호, 예를 들어 Kozak 서열; 번역 효율을 증대시키는 서열 또는 WPRE; mRNA 안정성을 증대시키는 서열; 및 필요에 따라, 암호화된 생성물의 분비를 증대시키는 서열 등을 함유할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 유전자 작제물은 또한 인핸서를 포함할 수 있다. 이러한 인핸서는 CMV 인핸서, WPRE 인핸서, HPRE 인핸서, CTE 인핸서, 또는 이의 유도체 또는 하이브리드를 포함하나 이에 한정되지 않는 바이러스 인핸서이다.
또한, 본 발명에 따른 유전자 작제물은 Kozak 서열을 포함할 수 있다.
포장 신호는 5' 역 말단 반복부 (ITR) 및 3' ITR일 수 있다. 예를 들어 유전자 작제물은 AAV 벡터에서 사용을 위한 AAV ITR 서열을 포함한다. 한 구체예에서, ITR은 캡시드를 공급하는 것과는 상이한 AAV로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, ITR 서열은 AAV2로부터 유래하거나, 편리를 위해 및 규제 승인을 가속화하기 위해 사용될 수 있는 그것 (ITR)의 결실된 버전이다. 그러나, 다른 AAV 공급원으로부터 유래되는 ITR이 선택될 수도 있다. ITR의 공급원이 AAV2로부터 유래하고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 공급원으로부터 유래되는 경우에, 그 결과의 벡터는 위형 (pseudotype)으로 명명될 수 있다. 전형적으로, AAV 벡터 게놈은 AAV 5' ITR, 본 발명에 따른 임의의 코딩 서열 및 임의의 조절 서열, 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 요소들의 다른 배치 형태도 적합할 수 있다. ITR로 명명되는, D-서열 및 말단 분해 부위(terminal resolution site) (trs)가 결실되어 있는, 5' ITR의 단축된 버전이 기술되었다. 다른 구체예에서, 전체-길이 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다.
일부 구현예에서, 조절 서열은 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리A 신호는 소(bovine) 성장 호르몬 폴리아데닐화(bovine growth hormone polyadenylation, bGH 폴리A) 신호, 작은 폴리A(small polyA, SPA) 신호, 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화(human growth hormone polyadenylation, hGH 폴리A) 신호, SV40 폴리A 신호, SV40 후기(late) 폴리A 신호, 또는 이의 유도체 또는 하이브리드이다.
본 발명에 따른 유전자 작제물은 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 적절한 폴딩 또는 생성을 촉진하는 임의의 신호 펩타이드일 수 있으며 세포막으로 이의 이동을 도와주는 신호서열일 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 신호 펩타이드는 본원에 개시된 임의의 신호 펩타이드일 수 있다. 구체적으로, APP (amyloid precursor protein), Human serum albumin, interleukin-2, CD5, Immunoglobulin Kappa light chain, Gaussia Luciferase, trypsinogen, 및 prolactin로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이러한 신호 서열을 가지고 있는 Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 서열이 소포체에서 잘 발현될 수 있도록 역할을 한다.
본 발명에 따른 유전자 작제물은 작제물의 동일성을 유지하는 한도에서 변형 가능하다. 즉, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 하기 기술된 기본 매개변수를 이용한 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해(예를 들어, NCBI 웹사이트 등 참조) 측정된 바와 같이 명시된 영역 (예를 들어, 비교 창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 일치에 대하여 비교 및 정렬될 때 본원에서 제공된 변형된 ORF 중 어느 하나)에 걸쳐 같거나 또는 같은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 퍼센트 (즉, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성)를 갖는 둘 이상의 서열 또는 부분 서열을 말한다. 즉, 목적하는 Aβ 펩타이드 변이체의 작용 효과를 유지하는 한도 내에서 유전자 작제물의 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명은 상기 유전자 작제물을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본원에 기재되는 유전자 작제물 및 발현 벡터는 신경퇴행성 질환의 치료 및 개선을 위해 사용될 수 있다.
재조합 발현 벡터는 유전자 작제물을 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있다. 특히, 렌티바이러스 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 이용하는 방법이 바람직하다.
아데노-관련 바이러스 (AAV) 바이러스 벡터는 그 안에 표적 세포로의 전달을 위해 핵산 서열이 포장되어 있는 AAV 단백질 캡시드을 가지는 AAV DNase-내성 입자이다. AAV 캡시드는 선택된 AAV에 따라 대략 1:1:10 내지 1:1:20의 비율로 정이십면체 대칭으로 정리된, 60개의 캡시드 (cap) 단백질 하위유닛, VP1, VP2 및 VP3으로 구성된다. AAV 캡시드는, 변종을 포함하여, 기술분야에 공지되어 있는 것들로부터 선택될 수 있다.
"rAAV"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 이종 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈이 아닌 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 포유동물 세포에 전달될 트랜스진)를 포함하는 캡시드화된(encapsidated) 폴리뉴클레오타이드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. rAAV 입자는 임의의 변형, 유도체 또는 위형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 또는 이들의 유도체/변형/위형)을 포함하는 임의의 AAV 혈청형을 가질 수 있다. 이러한 AAV 혈청형 및 유도체/변형/위형 및 이러한 혈청형/유도체/변형/위형의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Asokan et al., Mol. Ther. 20(4):699-708 (2012)] 참고). 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다.
본 개시내용의 rAAV 입자는 임의의 혈청형 또는 혈청형의 임의의 조합(예를 들어, 2개 이상의 혈청형을 포함하는, 예를 들어, rAAV2, rAAV8 및 rAAV9 입자 중 2개 이상을 포함하는 rAAV 입자의 집단)을 가질 수 있다. 일부실시형태에서, rAAV 입자는 rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10 또는 다른 rAAV 입자 또는 이들 둘 이상의 조합이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 rAAV8 또는 rAAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 2개 이상의 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16 캡시드 단백질로부터 선택된 2개 이상의 혈청형의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8, AAV9의 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다.
바람직하게는, rAAV는 AAV2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 AAV 벡터는 혈액-뇌-장벽(BBB)를 통과할 수 있는 것이다. 이러한 본 발명에 따른 AAV는 CNS 내 뉴런에 효율적이고 광범이하게 형질 도입을 위해 사용될 수 있다.
아데노-부속 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.
유리하게는, 재조합 AAV2는 숙주 유기체에서 최소 면역 반응을 유발하며 벡터 투여 후 적어도 1년 동안 지속될 수 있는 장기 트랜스유전자 발현을 매개한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 AAV(rAAV) 벡터"는 적어도 하나의 말단 반복 서열을 함유하는 재조합 AAV-유래 핵산을 의미한다.
상기 유전자 작제물을 포함하는 벡터의 바람직한 구현예를 도 1에 나타낸다.
구체적으로, 도 1에 따르면 CMV enhancer에 hSyn 프로모터를 처리하고 일 예시로 V18P/F19D/A21D 변이를 가지는 Aβ42 변이체가 포함될 수 있도록 발현 벡터를 구성할 수 있다.
상기 유전자 작제물을 포함하는 벡터의 또다른 바람직한 구현예를 도 2에 나타낸다. 구체적으로, 도 2에 따르면 CMV enhancer에 hSyn 프로모터를 처리하고 앞서 언급된 변이를 가지는 Aβ 변이체가 포함될 수 있도록 발현 벡터를 구성할 수 있다.
본 발명은 amyloid precursor protein을 기초로 V689P, F690D, 및 A692D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 Aβ42을 기초로 V18P, F19D, 및 A21D로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 Aβ 변이체, 구체적으로 amyloid precursor protein의 변이체, Aβ42 변이체의 펩타이드 서열 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 앞서 살핀 바와 같다.
상기 펩타이드 서열은 wt Aβ polymerization을 느리게 하거나 방해하며 독성을 감소시킴으로써 신경 퇴행성 질환에 우수한 예방, 개선 및 치료 효과를 나타낸다.
본 발명은 상기 유전자 작제물 또는 상기 재조합 발현 벡터, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공한다.
본 발명은 상기 유전자 작제물 및/또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 신경 퇴행성 질환은 알렉산더 질환, 알페르 질환, 알츠하이머병, 근위축 측삭 경화증(ALS), 모세관 확장 실조, 뉴런 지방 갈색소증, 바튼 질환, 소 해면양 뇌증(BSE), 카나반 질환, 뇌성 마비, 코케인 증후군, 피질기저 퇴행, 크로츠펠트-야콥 질환, 전두측두엽 퇴행, 고셔 질환, 헌팅턴 질환, HIV-연관 치매, 케네디 질환, 크라베 질환, 레위체 치매, 리소좀 저장 장애, 신경보렐리아증, 마차도-조세프 질환, 운동 뉴런 질환, 다시스템 아트로피, 다발 경화증, 다중 설파타제 결핍, 점액지질증, 기면증, 니만-픽 C형, 니만 픽 질환, 파킨슨 질환, 펠리체우스-메르츠바허 질환, 픽 질환, 폼페 질환, 원발성 측삭 경화증, 프리온 질환, 진행성 핵상 마비, 레프숨 질환, 산도프 질환, 실더 질환, 악성 빈혈에 이차적인 척추의 아급성 조합 퇴행, 스피엘마이어-포그트-쇼그렌-바텐 질환, 척추소뇌 실조, 척추 근육 아트로피, 스틸레-리차드슨-올제우스키 질환, 척수 매독, 및 태이-삭스 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
바람직한 구현예에서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 헌팅턴 질환, 파킨슨 질환 및 운동 뉴런 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다. 보다 바람직하게 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병이다.
이에 본 발명은 대상체에서 신경 퇴행성 질환을 치료하거나, 예방하거나, 완화하는, 또는 대상체에서 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에 상기 유전자 작제물, 또는 재조합 발현 벡터의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
유전자 작제물, 또는 재조합 발현 벡터가 약제에서 사용될 수 있고, 이는 신경퇴행성 질환을 치료하거나, 완화하거나, 예방하기 위한, 또는 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위한 단독치료법으로서 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 대안적으로, 본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터는 신경퇴행성 질환을 치료하거나, 완화하거나, 예방하기 위한, 또는 신경 재생 및/또는 생존을 촉진하기 위한 공지된 치료법에 부가하여 또는 이와 조합되어 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 신경 퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 신경 퇴행성 질환의 치료 사용하기 위한 약제의 제조에서 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터는 특히 조성물이 사용될 방식에 따라 여러 상이한 형태를 갖는 조성물에서 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 분말, 정제, 캡슐, 액체, 연고, 크림, 겔, 하이드로 겔, 에어로졸, 스프레이, 마이셀 용액, 경피 패치, 리포좀 현탁액의 형태 또는 치료를 필요로 하는 사람 또는 동물에 투여될 수 있는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 약제의 담체는 이것이 주어지는 대상체에 의해 잘 관용되는 것이어야 함이 이해될 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제는 혈류, 신경 내로 또는 직접 치료를 필요로 하는 부위 내로 주사에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 혈액-뇌-장벽을 통과하도록 구성된다. 주사는 정맥내(볼루스 또는 주입) 또는 피하(볼루스 또는 주입) 또는 피내(볼루스 또는 주입)일 수 있다.
요구되는 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터의 양이 그 생물학적 활성 및 생체이용률에 의해 결정되고, 이는 다시 투여 방식, 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터의 물리화학적 특성 및 이것이 단독치료법으로서 또는 조합 치료법에서 사용되는지 여부에 의존함이 이해될 것이다. 투여 빈도는 또한 치료받는 대상체 내에서 순환 폴리펩타이드의 반감기에 의해 영향받을 것이다. 투여될 최적 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 사용 중인 특정 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터, 약학적 조성물의 강도, 투여 방식, 및 장애의 진행 또는 단계와 함께 변할 것이다. 치료받는 특정 대상체에 따라, 대상체 연령, 체중, 성별, 식이, 및 투여 시점을 포함하는 추가 요인이 투여량을 조정하는 것을 필요로 할 것이다.
일반적으로, 사용되는 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터에 따라, 본 발명에 따른 작제물 또는 벡터의, 0.001 ㎍/체중㎏ 내지 10 ㎎/체중㎏, 또는 0.01 ㎍/체중㎏ 내지 1 ㎎/체중㎏의 1일 용량이 신경퇴행성 질환를 치료하거나, 완화하거나, 예방하기 위해 사용될 수 있다.
유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터는 질환 및/또는 장애의 개시 전에, 동안, 또는 후에 투여될 수 있다.
공지된 절차, 예컨대 약학 산업(예로, 생체내 실험, 임상 시험 등)에서 통상적으로 채택되는 것들이 본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터의 특정 제형물 및 정확한 치료 요법(예컨대 제제의 1일 용량 및 투여 빈도)을 형성하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 "대상체"는 척추동물, 포유류, 또는 가내 동물일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물 및 약제는 임의의 포유류, 예를 들어 가축(예로, 말), 애완 동물을 치료하기 위해 사용될 수 있거나, 다른 수의학적 적용에서 사용 될 수 있다. 그러나 가장 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
유전자 작제물, 재조합 발현 벡터 또는 약학적 조성물의 "치료 유효량"은 대상체에 투여되는 경우, 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해, 또는 요망되는 효과, 예컨대 신경 재생 및/또는 생존 촉진을 생성하기 위해 필요한 상기 언급된 양인 임의의 양이다.
예를 들어, 사용되는 유전자 작제물, 재조합 발현 벡터 또는 약학적 조성물의 치료 유효량은 약 0.01 ㎎ 내지 약 800 ㎎, 및 바람직하게는 약 0.01 ㎎ 내지 약 500 ㎎일 수 있다. 유전자 작제물, 재조합 발현 벡터 또는 약학적 조성물의 양이 약 0.1 ㎎ 내지 약 250 ㎎인 것이 바람직하다.
본원에서 언급되는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 조성물의 제형화에서 유용한 당업자에게 공지된 임의의 공지된 화합물 또는 공지된 화합물들의 조합이다.
약학적 담체는 액체일 수 있고, 약학적 조성물은 용액 형태이다. 액체 담체는 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭서 및 가압 조성물을 제조하는 데 사용된다. 본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터는 약학적으로 허용가능한 액체 담체, 예컨대 물, 유기 용매, 둘 다의 혼합물 또는 약학적으로 허용가능한 오일 또는 지방 중에 용해되거나 현탁될 수 있다. 액체 담체는 다른 적합한 약학적 첨가제, 예컨대 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 풍미제, 현탁화제, 증점제, 컬러, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투압-조절제를 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 담체의 적합한 예에는 물(부분적으로는 상기와 같은 첨가제, 예로, 셀룰로스 유도체, 바람직하게는 나트륨 카복시메틸 셀룰로스 용액을 함유함), 알코올(1가 알코올 및 다가 알코올, 예컨대 글리콜을 포함함) 및 이의 유도체, 및 오일(예로, 분획화된 코코넛 오일 및 아라키스 오일)이 포함된다.　비경구 투여를 위해, 담체는 또한 유성 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 멸균 액체 담체는 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에서 유용하다. 가압 조성물을 위한 액체 담체는 할로겐화 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용가능한 추진제일 수 있다.
멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약학적 조성물은, 예를 들어, 뇌간, 근육내, 경막내, 경막외, 척수강내, 복강내, 정맥내 및 피하 주사에 의해 이용될 수 있다. 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터는 투여 시 멸균수, 식염수, 또는 다른 적절한 멸균 주사용 매질을 사용해서 용해되거나 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물로서 제조될 수 있다.
본 발명의 유전자 작제물, 재조합 발현 벡터 및 약학적 조성물은 다른 용질 또는 현탁화제(예를 들어, 용액을 등장성으로 만들기 충분한 식염수 또는 글루코스), 담즙 염, 아카시아, 젤라틴, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 80(소르비톨의 올레에이트 에스테르 및 에틸렌 옥사이드와 공중합된 그 무수물) 등을 함유하는 멸균 용액 또는 현탁액 형태로 경구 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 유전자 작제물, 재조합 발현 벡터 또는 약학적 조성물은 또한 액체 또는 고체 조성물 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 투여에 적합한 조성물에는 고체 형태, 예컨대 알약, 캡슐, 과립, 정제, 및 분말, 그리고 액체 형태, 예컨대 용액, 시럽, 엘릭서, 및 현탁액이 포함된다.　비경구 투여에 유용한 형태에는 멸균 용액, 에멀젼, 및 현탁액이 포함된다.
본원(모든 첨부 청구범위, 요약 및 도면 포함)에 기재된 모든 특성 및/또는 이렇게 개시된 모든 방법 또는 공정의 모든 단계는 이러한 특성 및/또는 단계의 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 임의의 상기 양태와 조합될 수 있다.
본 발명의 유전자 작제물은 Aβ 변이체를 분비하여 인체 내에서 wt Aβ polymerization을 느리게 하거나 방해하며 독성을 감소시킴으로써 신경 퇴행성 질환에 우수한 예방, 개선 및 치료 효과를 나타낸다.
본 발명의 더 우수한 이해를 위해, 그리고 이의 구현예가 어떻게 실제로 수행될 수 있는지를 나타내기 위해, 이제 예로서 첨부되는 도면에 대한 언급이 수행될 것이다:
도 1은 Aβ42 펩타이드 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터의 일 예시를 나타내는 도이다. 일예시적으로 유전자 작제물은 hSyn 프로모터를 포함하며 Aβ42 펩타이드 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
도 2는 Aβ 펩타이드 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터의 일 예시를 나타내는 도이다. 일예시적으로 유전자 작제물은 hSyn 프로모터를 포함하며 Aβ펩타이드 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
도 3은 ThT 분석에서의 응집체 생성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 경쟁적 응집체 생성 결과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 Aβ42 (V18P/F19D/A21D) 변이체의 원섬유(fibrils) 분해를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 Aβ42 (V18P/F19D/A21D) 변이체의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 pAAV-hSyn-V18P/A21D 또는 pAAV-hSyn-V18P/F19D/A21D를 N2a 세포에 형질감염시킨 후, 배지상에 분비되는 Aβ 분비를 측정하기 위해 immunoprecipitation을 수행한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 펩타이드 서열을 포함하는 AAV 투여에 의해 Aβ42(V18P/F19D/A21D, (6E10, 녹색)) 변이와 내인성 마우스 APP(Y188, 빨간색)에 대한 공동 염색을 통한 colocalization을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9은 본 발명에 따른 펩타이드 서열을 포함하는 AAV 투여에 의해 플라크 부담의 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 펩타이드 서열을 포함하는 AAV 투여에 의해 미세아교세포와 성상교세포의 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명에 따른 펩타이드 서열을 포함하는 AAV 투여에 의해 미세아교세포와 성상교세포의 변화를 수치화한 결과를 나타낸다.
도 12는 Morris Water Maze test에서 본 발명에 따른 펩타이드 서열을 포함하는 AAV 투여에 의해 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Aβ42 변이 포함 AAV 벡터 디자인
Aβ42 펩타이드 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제조하였으며, 이의 개략적인 모식도는 도 1에 나타내었다.
Kozak 순서와 Gaussia luciferase signal peptide (GLSP) DNA 가 Aβ-CTF (C-terminal fragment)의 N-terminus에 결합하고 제한 효소 HindIII 및 EcoRV를 이용하여 잘릴 수 있도록, CAG 프로모터와 WPRE 순서를 포함하는 pAAV 벡터에 클로닝하여 제한 효소 pAAV-GLSP-Aβ-CTF를 제조하였다. 그리고 나서, CMV enhancer을 증폭하고 제한 효소XhoI 과 ApaI을 이용하여 자르고 pAAV- hSyn-eGFP 벡터에 붙여서 pAAV-CMV enhancer-hSyn-eGFP를 제조하였다. 다음으로 CMV enhancer와 hSyn promoter를 pAAV-CMV enhancer-hSyn-eGFP부터 증폭하고 제한 효소 KpnI 및 HindIII을 이용하여 자르고 WPRE 와 polyA 순서를 가지고 있는 pAAV 벡터로 클로닝을 하여 pAAV-CMV enhancer-hSyn-WPRE-polyA 벡터를 제조하였다. 마지막으로, pAAV-GLSP-Aβ-CTF로부터 Aβ의 변이체인 Aβ(V18P/A21D)(서열번호 11) 또는 Aβ(V18P/F19D/A21D)(서열번호 12)를 발현시키는 DNA를 증폭하고 제한효소 HindIII와 EcoRV를 이용하여 자르고 pAAV-CMV enhancer-hSyn-WPRE-polyA에 클로닝하여 pAAV-hSyn-GLSP-Aβ(V18P/A21D)-KK-WPRE-polyA, 또는 pAAV-hSyn-GLSP-Aβ(V18P/F19D/A21D)-KK-WPRE-polyA를 각각 제조하였다.
위 단계의 제조 공정과 유사하게, 표 2와 같이 추가의 Aβ42 펩타이드의 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터와 Aβ(APP) 펩타이드의 변이체의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터를 디자인하였다(AAV-PhP.eB 사용).
Figure pat00001
Figure pat00002
실시예 2. In silico 분석
AGGRESCAN 프로그램을 이용하여 변이 발생에 따른 폴리펩타이드의 응집이 일어날 수 있는 Hot spot(An aggregation-propensity value per each residue)을 분석하였다.
구체적으로, AGGRESCAN은 생체 내 실험에서 파생된 천연 아미노산에 대한 응집 성향 척도와 짧고 특정 서열이 단백질 응집을 조절한다는 가정을 기반으로 하고 있다. 이 알고리즘은 질병 관련 단백질의 응집과 관련된 일련의 단백질 단편을 식별하고 유전적 돌연변이가 침착 성향에 미치는 영향을 예측한다. 또한 구형 단백질, 기본적으로 펼쳐진 폴리펩티드, 아밀로이드 생성 단백질 및 박테리아 inclusion body에서 발견되는 단백질에 의해 표시되는 차별적 응집 특성에 대한 결과를 또한 제공할 수 있다.
상기 프로그램을 이용한 분석을 통해 Aβ42 펩타이드 서열의 V18P/A21D 변이, V18P/F19D/A21D 변이가 WT와 대비하였을 때, 응집 수준을 크게 떨어트릴 수 있는 변이 인자에 해당함을 확인하였다. 즉, V18P/A21D 변이, V18P/F19D/A21D 변이의 경우 응집 억제에 매우 우수한 효과를 나타내었다. 구체적으로, V18P/A21D 변이 및 V18P/F19D/A21D에서 발린(V) 과 페닐알라닌(F)은 β- 시트 형태를 채택하려는 펩타이드 성향을 감소시키기 위해 β- 시트 차단 아미노산으로 잘 알려진 프롤린(P)과 아스파르트 산(D)으로 대체되고, 알라닌 또한 하전된 잔기인 아스파르트(D) 산으로 용해도를 높이기 위해 대체되었을 때, 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 3. Aβ자가 응집과 WT 펩티드와의 경쟁에 관한 역학 확인
(1) WT Aβ42 또는 변이 펩타이드 스톡의 제조
합성 Aβ42 WT 또는 변이 펩타이드는 Biomatik에서 구입하였다. 응집체가 없는 Aβ42 WT 또는 변이체 펩티드의 스톡 용액을 준비하기 위해 동결 건조된 Aβ42 펩티드(WT, V18P/F19D/A21D 변이)를 HFIP (Hexafluoroisopropanol)에 용해시켰다. Aβ-HFIP 용액을 실온 (RT)에서 30 분 동안 배양한 다음 분취량으로 나누고, HFIP를 흄 후드에서 밤새 증발시킨 다음 1 시간 동안 SpeedVac으로 이동하여 HFIP의 나머지 흔적을 제거하였다. 펩티드 필름을 포함하는 튜브를 사용할 때까지 -20℃에서 건조제 위에 보관하였다. 실험 사용 직전에, 동결 건조된 펩티드를 0.1% NH4OH에 최종 농도 100 uM으로 용해시키고 수조 초음파 처리기에서 10 분 동안 초음파 처리하였다.
(2) Aβ자가 응집과 WT 펩티드와의 경쟁에 관한 역학을 테스트하기 위한 ThT 분석
Aβ42 WT 또는 변이 펩티드의 자가 응집을 50μM Thioflavin T (ThT)를 포함하는 PBS에서 10μM의 시작 농도에서 테스트하였다. ThT 형광을 Excitation 파장 440 nm 및 Emission 파장 485 nm에서 Biotek Synergy H1를 사용하여 측정하였다. 37℃ 에서 배양하였으며 형광을 읽기 전에 10 분마다 5 초 동안 흔들었다. 변이체와 Aβ42 WT 간의 경쟁은 유사하게 수행되었지만 혼합물의 각 펩티드에 대해 시작 농도 10 uM을 사용하였으며,(1 : 1, WT : 변이체). 오차 막대는 반복 측정 값의 표준 편차를 보여준다.
그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3은 ThT 분석에서의 응집체 생성을 확인한 것이며, 도 4는 경쟁적 응집체 생성 결과를 확인한 결과를 나타내며, 이러한 결과는 Aβ42 펩타이드 변이체가 Aβ42 WT의 섬유소 형성(fibrillization)을 감소시키는 것을 보여준다. 구체적으로, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, Aβ42 WT와 비교하여 Aβ42 펩타이드 변이체의 자가 응집을 위한 Thioflavine-T (ThT) 분석에서는 3 가지 변이 중 어떤 것도 반응 동안 자기 응집을 나타내지 않았다. 또한, 비교를 위해 Aβ42 WT는 7 시간 이내에 ThT 결합 정점에 도달하여 응집반응을 발생시켰음을 보여주었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, Aβ42 WT 응집 억제를 테스트하는 경쟁 분석에서 각 Aβ42 펩타이드 변이체는 Aβ42 WT와 1:1로 혼합하여 ThT와 함께 배양되었을 때, Aβ42(V18P/F19D/A21D)가 Aβ42 WT 펩티드의 응집을 완전히 약화시켰다.
상기 결과로부터 본 발명에 따른 Aβ 펩타이드 변이체는 wt Aβ를 방해하거나 억제하며, 기존의 응집된 Aβplaqu의 disassembly를 통해 우수한 질환 개선 및 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. Aβ42 (V18P/F19D/A21D) 변이의 원섬유(fibrils) 분해 확인
Aβ42 WT를 다양한 농도의 단량체 V18P/F19D/A21D 펩타이드에 노출시키고, ThT 형광의 농도 의존적 변화를 확인하였다. 구체적으로, Aβ42 WT 및/또는 변이 펩티드의 자가 응집을 5 μM Thioflavin T (ThT)를 포함하는 PBS에서 Aβ42 WT의 10 μM에 대하여 변이 펩티드 5 μM 10μM 및 20 μM을 농도별로 처리하여 테스트하였다(1:1 비율로 혼합). ThT 형광을 Excitation 파장 440 nm 및 Emission 파장 485 nm에서 Biotek Synergy H1를 사용하여 측정하였다. 37℃에서 배양하였으며 형광은 37℃에서 40시간 배양 동안 10시간마다 흔들지 않고 측정하였다. 오차 막대는 반복 측정 값의 표준 편차를 보여준다.
위 실험 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, WT Aβ42 원섬유 단독과 비교하여 V18P/F19D/A21D 펩타이드와 배양은 ThT 형광의 농도 의존적 감소를 생성하였다.
이러한 결과는 본 발명에 따른 Aβ42 변이체가 WT Aβ42 원섬유를 분해함으로 Aβ42 변이체가 뇌에서 발현될 때 기존에 형성된 Aβ 플라크를 제거할 수 있음을 나타낸다.
실시예 5. Aβ42변이의 세포 독성 확인
MTS 분석을 통하여, Aβ42의 세포 독성을 확인하였다.
구체적으로, MTS 분석을 위하여 1) Aβ42 WT, 2) V18P/A21D 변이 서열, 3) V18P/F19D/A21D 변이 서열, 4) Aβ42 WT + V18P/A21D 변이 서열, 5) Aβ42 WT + V18P/F19D/A21D 변이 서열 100 μM 씩을 각각 4℃에서 24시간 배양을 하여 올리고머를 형성하였다.
N2a 세포를 96웰 플레이트에 분주한 후에 10 uL의 각 제제의 올리고머(WT Aβ 단독, 변이체 단독 또는 WT Aβ + 변이체) 를 90 uL의 배양 배지에 첨가하여 마지막 제제의 농도가 10uM이 되었다. 세포 생존력을 MTS 분석을 사용하여 처리 후 24시간 후 결정하였다. 구체적으로, 20 uL의 AQueous One Solution Reagent를 배양 웰에 직접 첨가하고, 5% CO2 분위기에서 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음, 분광 광도계를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 기록하여 분석을 수행하였다.
위 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, Aβ42 WT 와 달리 V18P/F19D/A21D나 V18P/A21D 변이는 모두 자체적으로 N2a 세포의 독성을 일으키지 않음을 확인하였고, 이는 대조군과 유사한 수준에 해당하여 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.
대조적으로, 올리고머 Aβ42 형성 동안 변이체(V18P/F19D/A21D 또는 V18P/A21D)와 WT Aβ42의 공동 배양은 Aβ42 WT 보다 나은 세포 생존율을 나타내었다. (ANOVA, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됨.)
실시예 6. 조건 배지에서 Aβ 면역 침전 확인
상기 실시예 1에서 제조된 pAAV-hSyn-GLSP-Aβ(V18P/A21D)-KK-WPRE-polyA, 또는 pAAV-hSyn-GLSP-Aβ(V18P/F19D/A21D)-KK-WPRE-polyA 벡터를 이용하여 형질전환을 수행하였다. 그리고 나서, 형질감염된 N2a 세포(6mL)의 조건 배지를 4C에서 밤새 회전기에서 Dynabead-6E10 복합체와 함께 배양하였다. 다음 날, 자기 분리를 사용하여 비드를 수집하여 상등액을 제거하고, 비드를 0.02% Tween-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 면역 침전된 복합체를 50mM 글리신(pH 2.8)으로 용리하고, 샘플들을 인간 Aβ에 반응하는 6E10 항체를 이용하여 확인하였다.
이의 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 변이체의 투여는 immunoprecipitation 결과에서 Aβ의 분비에 대한 측정 결과를 명확히 나타내었다.
이러한 결과는 신경세포 밖에서 일어나는 Aβ aggregation 이나 Aβ플라크 형성에 대하여 치료 효과를 나타내기 위하여 AAV가 적합하게 변이체를 분비하는 결과를 보여준다.
실시예 7. Aβ42 변이 서열 포함 AAV 벡터 투여에 따른 치료 효과 확인
(1) 동물 모델
3xTg AD mouse의 뇌 또는 정맥에 상기 실시예 1에서 제조된 AAV(pAAV-CMV enhancer-hSyn-GLSP-Aβ(V18P/F19D/A21D)-KK-WPRE-polyA)와 대조군 AAV(pAAV-CMV enhancer-hSyn-WPRE-polyA)를 각각 주입하고 AD 관련 마커를 관찰하였다. 바이러스 주사후 9개월 또는 12개월 후에 3xTg AD mouse는 행동 테스트를 받고 테스트가 끝날 때 동물을 희생시킨 후에 그들의 뇌는 추가 생화학 및 면역 조직 화학 분석을 위해 처리하였다.
(2) Aβ 생화학 및 면역 조직 화학 분석
플라크 부담은 뇌 침전물 추출에 쓰이는 구아니딘을 이용하여 전두엽 피질에서 Aβ-40과 -42 를 추출하여 Aβ ELISA에 의해 정량적인 Aβ40과 42 축적량을 확인하였다. 아밀로이드 플라크는 비대성 성상 세포와 미세 아교 세포가 코어된 퇴적물을 둘러싸도록 이동하거나 분열하는 뚜렷한 신경 면역 반응을 유도하였다. GFAP 면역 염색은 성상 세포를 검출하기 위해 사용되었고 microglia를 검출하기 위해서는 Iba1이 사용되었다.
(3) Aβ (V18P/F19D/A21D) 변이와 내인성 마우스 APP(Y188, 빨간색)에 대한 공동 염색을 통한 colocalization 확인과 미세아교세포와 성상교세포의 변화 확인
12개월 후에 3xTg AD mouse를 희생시킨 후 뇌 절편을 트리스 완충 식염수(TBS)로 헹군후에, 0.1% Triton X-100(TBS-T)을 포함하는 TBS로 차단하고 GFAP 항체, Iba1 항체, 또는 인간 Aβ 항체-6E10와 마우스Aβ 항체-Y188과 함께 4℃에서 밤새 배양한 후 섹션을 Alexa Fluor-568 Gt 항-Rb 및 Alexa Fluor-488 Gt 항-마우스 2차 항체와 함께 인큐베이션한 후에 형광 현미경을 통해 확인하였다.
pAAV-hSyn-GLSP-Aβ(V18P/F19D/A21D)-KK-WPRE-polyA로 전달된 변이체 Aβ (V18P/F19D/A21D; 6E10, 녹색)와 내인성 마우스 APP(Y188, 빨간색)에 대한 공동 염색을 통해 피질 뉴런에서 변이체 펩타이드의 막 전달을 확인하여, 이를 도 8에 나타내었다.
도 8을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 전달된 변이체 Aβ (V18P/F19D/A21D; 6E10, 녹색)와 내인성 마우스 APP(Y188, 빨간색)가 colocalization을 나타내는 것을 확인하였고, 이를 통해 피질 뉴런에서 펩타이드의 막 전달이 이루어졌음을 확인하였다.
플라크의 부담의 변화를 확인하기위해 pAAV-CMV enhancer-hSyn-GLSP-Aβ(V18P/F19D/A21D)-KK-WPRE-polyA 감염 후 마우스를 12개월 차에 희생시키고 플라크의 주요 구성성분인 Aβ 40와 Aβ 42 양의 변화를 ELISA를 확인하였다. 도 9에 나타나것 같이 본 발명에 의한 AAV처리는 약 78%의 Aβ40 와 64%의 Aβ42을 감소 시켜 플라크 부담의 개선효과를 보여 주었다.(t-test, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됨.)
미세아교세포 및 성상교세포의 변화를 확인하기 위하여, pAAV-hSyn-GLSP-Aβ(V18P/F19D/A21D)-KK-WPRE-polyA 감염 후 마우스를 12개월 차에 희생시키고, 미세아교세포 및 성상교세포의 변화를 확인하였다.
구체적으로, 면역 염색을 통하여 미세아교세포 및 성상교세포의 변화를 확인한 결과를 도 10에 나타내었다.
GFAP 면역염색 (빨간색)은 성상세포를 검출하는 데 사용되었고, Iba1 (빨간색)은 미세아교세포를 감지하는데, 사용되었다. 아밀로이드 플라크는 현저한 신경 면역 반응을 유발함으로, 그 반응에 따라서 비대성상아교세포와 미세아교세포가 이동하거나 주변에 코어가 있는 퇴적물로 분화된다. 대부분의 조건에서 신경교의 범위 유도는 아밀로이드 부하의 심각성과 유사하다. 도면을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 AAV의 처리는 미세아교세포 및 성상교세포에 대한 개선 효과를 나타내었다.
상기 염색 결과를 수치화 한 것을 도 11에 나타내었다.
도 11를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, GFAP 및 IBA1 염색이 차지하는 면적의 정량화의 결과는 본원 발명에 따른 AAV의 처리를 통해 처리에 의해 신경교 초점의 크기와 주변 세포 수가 모두 감소를 달성하였음을 보여주었다. (t-test, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됨.)
(4) Morris Water Maze test를 통한 공간 지각 능력 및 기억력 개선 효과 확인
마우스의 시야에서 플랫폼이 보이지 않도록 플랫폼이 1cm 잠길 수 있을 만큼 수조에 물을 채운 후, 수조 주위에는 마우스가 볼 수 있는 시각적 힌트를 부착하였다. 마우스의 움직임은 천장에 부착된 카메라로 촬영하여 Any-maze system을 이용해 분석하였다.
Day 1~4: Trial
정해진 위치에서 마우스 입수후에 플랫폼을 찾도록 1분간 탐험시키고, 1분 안에 마우스가 플랫폼을 찾아갔을 경우에는 5초 머무는 것 확인한 뒤 종료하였다.
1분 안에 마우스가 플랫폼을 찾아가지 못했을 경우에는 플랫폼으로 가도록 유도 (Training, 10초) 하였으며, 하루에 총 3회 위 사항을 반복하였다.
Day 5: Probe test
플랫폼을 제거한 후에, 정해진 위치에서 마우스 입수 후 1분간 탐험시키고, Probe test에서 target quadrant에 머무는 시간을 비교하였다.
3xTg 마우스는 알츠하이머 치매 모델의 마우스로서 인지기능과 공간 지각능력이 떨어진다. 이를 이용하여 인지기능이 감소된 3xTg에 비해 본원 발명에 따른 펩타이드를 AAV 바이러스 전달체를 전달한 마우스에서 인지기능의 개선을 확인하였고, 이를 도 12에 나타내었다.
Day1~4일까지의 trial 경과에 따른 플랫폼을 찾는 시간은 군 간 차이는 없었다. 그러나, 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이 Day5 Probe test에서 target quadrant에 머무는 시간이 pAAV-hSyn-GLSP-Aβ(V18P/F19D/A21D)-KK-WPRE-polyA를 처리한 군에서 증가한 결과를 확인하였다. 이러한 결과는 기억력 및 공간 지각능력의 개선을 보였음을 의미한다. (* : P < 0.05, ** : P <0.01)
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> ABrain <120> GENE THERAPIES FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISORDER <130> A-beta <150> KR 10-2021-0012117 <151> 2021-01-28 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 770 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amyloid precursor protein <400> 1 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 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Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Pro Asp Phe Asp Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 7 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 <400> 7 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 8 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 <400> 8 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt 60 gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 120 atagcg 126 <210> 9 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 (V18P/A21D) <400> 9 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt gccgttcttt 60 gacgaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 120 atagcg 126 <210> 10 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 (V18P/F19D/A21D) <400> 10 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt gccggacttt 60 gacgaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 120 atagcg 126 <210> 11 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42(V18P/A21D) <400> 11 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Pro Phe Phe Asp Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 12 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 (V18P/F19D/A21D) <400> 12 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Pro Asp Phe Asp Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KK <400> 13 Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KK <400> 14 acagtgatcg tcatcacctt ggtgatgctg aagaag 36 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gamma secretase cleavage <400> 15 Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile 1 5 10 15 Val Ile Thr Leu Val Met Leu 20 <210> 16 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gamma secretase cleavage <400> 16 gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcga cagtgatcgt catcaccttg 60 gtgatgctg 69 <210> 17 <211> 271 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human synapsin I (SYN) promoter <400> 17 gcggacagtg ccttcgcccc cgcctggcgg cgcgcgccac cgccgcctca gcactgaagg 60 cgcgctgacg tcactcgccg gtcccccgca aactcccctt cccggccacc ttggtcgcgt 120 ccgcgccgcc gccggcccag ccggaccgca ccacgcgagg cgcgagatag gggggcacgg 180 gcgcgaccat ctgcgctgcg gcgccggcga ctcagcgctg cctcagtctg cggtgggcag 240 cggaggagtc gtgtcgtgcc tgagagcgca g 271 <210> 18 <211> 1293 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CamKII promoter <400> 18 ttaacattat ggccttaggt cacttcatct ccatggggtt cttcttctga ttttctagaa 60 aatgagatgg gggtgcagag agcttcctca gtgacctgcc cagggtcaca tcagaaatgt 120 cagagctaga acttgaactc agattactaa tcttaaattc catgccttgg gggcatgcaa 180 gtacgatata cagaaggagt gaactcatta gggcagatga ccaatgagtt taggaaagaa 240 gagtccaggg cagggtacat ctacaccacc cgcccagccc tgggtgagtc cagccacgtt 300 cacctcatta tagttgcctc tctccagtcc taccttgacg ggaagcacaa gcagaaactg 360 ggacaggagc cccaggagac caaatcttca tggtccctct gggaggatgg gtggggagag 420 ctgtggcaga ggcctcagga ggggccctgc tgctcagtgg tgacagatag gggtgagaaa 480 gcagacagag tcattccgtc agcattctgg gtctgtttgg tacttcttct cacgctaagg 540 tggcggtgtg atatgcacaa tggctaaaaa gcagggagag ctggaaagaa acaaggacag 600 agacagaggc caagtcaacc agaccaattc ccagaggaag caaagaaacc attacagaga 660 ctacaagggg gaagggaagg agagatgaat tagcttcccc tgtaaacctt agaacccagc 720 tgttgccagg gcaacggggc aatacctgtc tcttcagagg agatgaagtt gccagggtaa 780 ctacatcctg tctttctcaa ggaccatccc agaatgtggc acccactagc cgttaccata 840 gcaactgcct ctttgcccca cttaatccca tcccgtctgt taaaagggcc ctatagttgg 900 aggtggggga ggtaggaaga gcgatgatca cttgtggact aagtttgttc gcatcccctt 960 ctccaacccc ctcagtacat caccctgggg gaacagggtc cacttgctcc tgggcccaca 1020 cagtcctgca gtattgtgta tataaggcca gggcaaagag gagcaggttt taaagtgaaa 1080 ggcaggcagg tgttggggag gcagttaccg gggcaacggg aacagggcgt ttcggaggtg 1140 gttgccatgg ggacctggat gctgacgaag gctcgcgagg ctgtgagcag ccacagtgcc 1200 ctgctcagaa gccccaagct cgtcagtcaa gccggttctc cgtttgcact caggagcacg 1260 ggcaggcgag tggcccctag ttctgggggc agc 1293 <210> 19 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tuba1a promoter <400> 19 tccccctcaa aaaaaaggag cgctggagaa atacaagccc acacaaagag ctcgttttta 60 aactcactcc tttctcctta cagtttctga attccgtatt agaagggatg gctcatttct 120 agggacaaaa taacacaggc tctggggtga ggtagggtcg ggtaaggggg cgagcgggga 180 ggggtgatgg gagagcacta ccgctaaaga aagcaagctc tctagtaaag cgttaagtac 240 tactttgtat attgtttctc ttttttcctt tctctctctc tctctctttg tttgtttttg 300 gtttttgaga caggatatca cactatatat ccaggccggg tacaaaataa ccgcagtcct 360 ccgcttccca atgctgggat ttacaggcat aaaccactaa gggcggttat gatgaccttg 420 agctgcaagt cttcctgcct ctgcctccca ggtgctgttg agggtcatag gcgtggtcta 480 ttcatactga gcttctgaat tttgctcaaa tattaataat aatagtaata ataataataa 540 ccacaataat acaactgtaa aactaaacat ttacccacgc ctttttgacc atcattccca 600 tagctcttgc tactttattt aaagcgaaca gagatgttga atcctgacgg aacgtattta 660 aatttagtgt agtataaatg aaaagctgga atttaccata aagaatctca acacaaattc 720 tgtgattaag tgttggggaa aaccttaaat tatcctaact acagtttaag gtttaagctc 780 cgtataatca cccaaccccc gttttctttc ttccctctct acccctcccc agctccaccc 840 cataatggat gctcggctag ttgcttttgc gaggcctttg tctgaaggat gcaaaatcta 900 cggatgctag cgaggggggg aaggggggag agattacctc ataccatgtc gcttgcacca 960 atcaccactc tcctgtcgcg gcttctctgg gcagacggag gggtctggac caacaggaaa 1020 aggccttggc ccatccccat ggtgaccgag ctgtatataa ggaggcgcat ccgcccaagt 1080 gccgcaggtt ctcttacatc gacc 1104 <210> 20 <211> 1800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSE promoter <400> 20 agagttttgg aaagaagaac attacaagac tgagcttttt attcaagctg gggggctcaa 60 tccatcctta gctctgggtt ccttactgaa ggaagcactc ccaccccaca gtaccccact 120 cttagctctg agctcctcct ctgctcgccc aatccttcca accccctatg gtggtatggc 180 tgacacagaa aatgtctgct cctgtatggg acatttgccc ctcttctcca aatataagac 240 aggatgaggc ctagcttttg ctgctccaaa gttttaaaag aacacattgc acggcattta 300 gggactctaa agggtggagg aggaatgagg gaattgcatc atgccaaggc tggtcctcat 360 ccatcactgc ttccagggcc cagagtggct tccaggaggt attcttacaa aggaagcccg 420 atctgtagct aacactcaga gcccattttc ctgcgttaac ccctcccgac ctcatataca 480 ggagtaacat gatcagtgac ctgggggagc tggccaaact gcgggacctg cccaagctga 540 gggccttggt gctgctggac aacccctgtg ccgatgagac tgactaccgc caggaggccc 600 tggtgcagat ggcacaccta gagcgcctag acaaagagta ctatgaggac gaggaccggg 660 cagaagctga ggagatccga cagaggctga aggaggaaca ggagcaagaa ctcgacccgg 720 accaagacat ggaaccgtac ctcccgccaa cttagtggca cctctagcct gcagggacag 780 taaaggtgat ggcaggaagg cagcccccgg aggtcaaagg ctgggcacgc gggaggagag 840 gccagagtca gaggctgcgg gtatctcaga tatgaaggaa agatgagaga ggctcaggaa 900 gaggtaagaa aagacacaag agaccagaga agggagaaga attagagagg gaggcagagg 960 accgctgtct ctacagacat agctggtaga gactgggagg aagggatgaa ccctgagcgc 1020 atgaagggaa ggaggtggct ggtggtatat ggaggatgta gctgggccag ggaaaagatc 1080 ctgcactaaa aatctgaagc taaaaataac aggacacggg gtggagaggc gaaaggaggg 1140 cagagtgagg cagagagact gagaggcctg gggatgtggg cattccggta gggcacacag 1200 ttcacttgtc ttctcttttt ccaggaggcc aaagatgctg acctcaagaa ctcataatac 1260 cccagtgggg accaccgcat tcatagccct gttacaagaa gtgggagatg ttcctttttg 1320 tcccagactg gaaatccgtt acatcccgag gctcaggttc tgtggtggtc atctctgtgt 1380 ggcttgttct gtgggcctac ctaaagtcct aagcacagct ctcaagcaga tccgaggcga 1440 ctaagatgct agtaggggtt gtctggagag aagagccgag gaggtgggct gtgatggatc 1500 agttcagctt tcaaataaaa aggcgttttt atattctgtg tcgagttcgt gaacccctgt 1560 ggtgggcttc tccatctgtc tgggttagta cctgccacta tactggaata aggggacgcc 1620 tgcttccctc gagttggctg gacaaggtta tgagcatccg tgtacttatg gggttgccag 1680 cttggtcctg gatcgcccgg gcccttcccc cacccgttcg gttccccacc accacccgcg 1740 ctcgtacgtg cgtctccgcc tgcagctctt gactcatcgg ggccccccgg gtcacatgcg 1800 1800 <210> 21 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFB Promoter <400> 21 gcctgcgtgt cccgaggggg gtgctgggcc cagtgtgagt acgtgtgact gtgactgaga 60 cagtgtgact gctgaaggca gggacacagc agctccctga ctgggggcag aaggcgttaa 120 ctgtgtgaag gctggttgtg ggtgggtggg ctctgggcct cgaacccggg ggctgaggga 180 gatagtaaac agcagggtga ctgacgggaa gatcatgttg gtagccctgc gaagatgctg 240 cagggctgtg ggggtttgtg tgactttgca gttcaacaaa ttcaaattca gccaacgctg 300 gcagggcctg ttgtgccagg caaccagcta ggaggaggag actcggaccc agcttgcagc 360 tgaagggcgc tggctgccgg gttctgtggg ttcaccttgc ggtgtcttcc cttgctaaca 420 ctgagtcctt acaatagccc catctccagg ttgaggctag atggagggga cagagggaag 480 tgacttgccc aaggtgaccc aagctcccga gtgccagggc aggatctgaa ttcaggctct 540 cagactgcag agcctgagtc cctccctgcc atgcctgtgc cagggtggaa atgtctggtc 600 ctggagggga gcgtggactc ctggccttgg ctctggagac atccccctag accacgtggg 660 ctcctaacct gtccatggtc actgtgctga ggggcgggac ggtgggtcac ccctagttct 720 tttttcccca gggccagatt catggactga agggttgctc ggctctcaga gaccccctaa 780 gcgccccgcc ctggccccaa gccctccccc agctcccgcg tcccccccct cctggcgctg 840 actccgggcc agaagaggaa aggctgtctc cacccacctc tcgcactctc ccttctcctt 900 tataaaggcc ggaacagctg aaagggtggc aacttctcct cctgcagccg ggagcggcct 960 gcctgcctcc ctgcgcaccc gcagcctccc ccgctgcctc 1000 <210> 22 <211> 1178 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF-1alpha promoter <400> 22 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccactg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360 agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420 ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480 tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540 aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600 cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660 cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720 gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780 ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840 cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900 cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960 agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020 agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080 tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140 tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178 <210> 23 <211> 996 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAG promoter <400> 23 tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct aggaagagta 60 ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 120 cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 180 atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 240 cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 300 attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc 360 ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg 420 gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 480 cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 540 aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 600 cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 660 ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 720 tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 780 ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 840 ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 900 agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 960 ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaatt 996 <210> 24 <211> 508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV promoter <400> 24 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480 acggtgggag gtctatataa gcagagct 508

Claims (19)

  1. Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 코딩 서열 및 이에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 코딩 서열은 서열번호 7의 Aβ42 펩타이드 서열을 기초로 V18P, F19D, 및 A21D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 펩타이드 서열을 인코딩하는 서열인, 유전자 작제물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 코딩 서열은 서열번호 7의 Aβ42 펩타이드 서열을 기초로 V18P/A21D 또는 V18P/F19D/A21D 의 변이를 포함하는 펩타이드 서열을 인코딩하는 서열인, 유전자 작제물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 코딩 서열은 서열번호 9 또는 10 인, 유전자 작제물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 Aβ 펩타이드 변이체는 서열번호 11 또는 12인, 유전자 작제물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 과발현 프로모터 또는 신경 특이적 프로모터인, 유전자 작제물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 프로모터는 human synapsin I (SYN) 프로모터, mouse calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) 프로모터, rat tubulin alpha I (Ta1) 프로모터, rat neuron-specific enolase (NSE) 및 human platelet-derived growth factor-beta chain (PDGF) 프로모터, EF-1α 프로모터, CAG 프로모터 및 CMV 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 유전자 작제물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 프로모터는 human synapsin I (SYN), CaMKII 또는 CAG 프로모터이며, 각각 서열번호 17, 18 또는 23인, 유전자 작제물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 유전자 작제물은 인핸서 서열, 폴리아데닐화 서열 및 Kozak 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것인, 유전자 작제물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 유전자 작제물을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 재조합 발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이며, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 재조합 발현 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 AAV2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 재조합 발현 벡터.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 유전자 작제물을 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제10항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알렉산더 질환, 알페르 질환, 알츠하이머병, 근위축 측삭 경화증(ALS), 모세관 확장 실조, 뉴런 지방 갈색소증, 바튼 질환, 소 해면양 뇌증(BSE), 카나반 질환, 뇌성 마비, 코케인 증후군, 피질기저 퇴행, 크로츠펠트-야콥 질환, 전두측두엽 퇴행, 고셔 질환, 헌팅턴 질환, HIV-연관 치매, 케네디 질환, 크라베 질환, 레위체 치매, 리소좀 저장 장애, 신경보렐리아증, 마차도-조세프 질환, 운동 뉴런 질환, 다시스템 아트로피, 다발 경화증, 다중 설파타제 결핍, 점액지질증, 기면증, 니만-픽 C형, 니만 픽 질환, 파킨슨 질환, 펠리체우스-메르츠바허 질환, 픽 질환, 폼페 질환, 원발성 측삭 경화증, 프리온 질환, 진행성 핵상 마비, 레프숨 질환, 산도프 질환, 실더 질환, 악성 빈혈에 이차적인 척추의 아급성 조합 퇴행, 스피엘마이어-포그트-쇼그렌-바텐 질환, 척추소뇌 실조, 척추 근육 아트로피, 스틸레-리차드슨-올제우스키 질환, 척수 매독, 및 태이-삭스 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알렉산더 질환, 알페르 질환, 알츠하이머병, 근위축 측삭 경화증(ALS), 모세관 확장 실조, 뉴런 지방 갈색소증, 바튼 질환, 소 해면양 뇌증(BSE), 카나반 질환, 뇌성 마비, 코케인 증후군, 피질기저 퇴행, 크로츠펠트-야콥 질환, 전두측두엽 퇴행, 고셔 질환, 헌팅턴 질환, HIV-연관 치매, 케네디 질환, 크라베 질환, 레위체 치매, 리소좀 저장 장애, 신경보렐리아증, 마차도-조세프 질환, 운동 뉴런 질환, 다시스템 아트로피, 다발 경화증, 다중 설파타제 결핍, 점액지질증, 기면증, 니만-픽 C형, 니만 픽 질환, 파킨슨 질환, 펠리체우스-메르츠바허 질환, 픽 질환, 폼페 질환, 원발성 측삭 경화증, 프리온 질환, 진행성 핵상 마비, 레프숨 질환, 산도프 질환, 실더 질환, 악성 빈혈에 이차적인 척추의 아급성 조합 퇴행, 스피엘마이어-포그트-쇼그렌-바텐 질환, 척추소뇌 실조, 척추 근육 아트로피, 스틸레-리차드슨-올제우스키 질환, 척수 매독, 및 태이-삭스 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 서열번호 11 또는 서열번호 12의 Aβ 펩타이드 변이체.
  19. 제18항의 Aβ 펩타이드 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드
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