KR20190127266A - 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터, 및 GFAP 프로모터를 포함하고, 신경교세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터를 세포에 공동 형질감염시켜 생산된 신경교세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는 HSV 또는 AAV 기반 유전자 전달용 재조합 바이러스를 제공한다. 상기 재조합 바이러스는 퇴행성 뇌질환 치료용 표적 유전자를 이용하여 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물{A recombinant vector for gene delivery, and a composition for preventing or treating neurodegenerative diseases using the same}
본 발명은 단순포진바이러스(Herpes simplex virus; HSV) 또는 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서도 뇌에서 발생하는 질환을 뜻하며, 주요 증상과 침범되는 뇌 부위를 고려하여 구분할 수 있는데, 대표적으로 알츠하이머 질환(Alzheimer’s disease)이나 파킨슨 질환 등이 포함된다. 퇴행성 뇌질환은 노화에 따른 신경퇴화 및 유전적·환경적 요인들로 인해 단백질이 응집되어 신경세포가 사멸해 야기되는 것으로 알려져 있지만, 아직까지 정확한 원인은 밝혀지지 않아 원인 규명을 위한 기초 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.
빠르게 고령화가 진행되고 있는 우리나라의 상황에서도 퇴행성 뇌질환 치료제의 개발은 가장 시급한 숙제가 아닐 수 없다. 2026년에는 65세 이상이 전체 인구의 20%를 넘어 초고령 사회에 도달할 것으로 예측되고 있으며, 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로 퇴행성 뇌질환 문제가 심각하게 부상할 것으로 예상된다. 우리나라의 치매 환자 수도 2010년 47만 명에서 2020년 75만 명으로 증가할 것으로 추정되고 있으며, 뇌혈관 질환은 지난 10여 년간 우리나라 주요 사망원인 중 2위를 고수하고 있다.
파킨슨 질환(Parkinson's Disease; PD)은 떨림, 경직, 서동(행동이 느려짐) 및 자세 이상증 등을 주된 증상으로 하는 질병으로 뇌에서 도파민(dopamine)이라는 신경전달물질이 부족하게 되어 생기는 만성질환이다. 도파민은 뇌의 흑색질(Substantia nigra pars compacta; SNpc)이라는 신경세포에서 생성되며 흑색질의 신경세포는 뇌의 운동피질 및 기타 여러 부위와 복잡하게 연결되어 있어 인체의 운동을 부드럽고 조화 있고 정확하게 수행할 수 있도록 해주는 기저핵이라는 부위와 연결되어 있다. 파킨슨 질환은 흑색질에서 기저핵의 기능을 조절하기 위하여 분비되는 물질인 도파민이 부족하여 발병하게 된다.
파킨슨 질환의 증상은 크게 일차적 증상과 이차적 증상으로 나눌 수 있는데, 일차적 증상은 경직, 떨림, 몸의 움직임이 느리거나 줄어들고, 몸의 불균형 및 보행 장애 등의 증상들로서 흑색질의 신경세포 파괴로 인하여 생기는 직접적인 현상들을 말하며, 이차적 증상은 일차적 증상으로부터 파생되어 생기거나 흑색질 외의 다른 신경계의 침범에 의하여 생기는 증상들을 지칭한다.
현재 파킨슨 질환의 치료를 위해 사용되고 있는 치료법으로는 약물치료법, 수술치료법 및 물리치료법 등이 있는데, 약물치료의 경우, 일반적으로 뇌에서 부족해진 도파민을 보충해주고, 도파민의 부족으로 인한 신경전달물질의 불균형을 맞춰주며, 신경세포의 파괴를 예방 또는 지연시키고자 하는 목적과 기타 우울증 등의 증상을 조절하기 위한 약물들이 사용되고 있으며, 그 예로 아만타딘, 항콜린성 약제, 엘-도파, 씨네메트, 마도파, 도파민 효능제, 엘데프릴 및 항우울제 등이 있다. 그러나 이러한 약물은 죽어버린 신경세포를 다시 살릴 수 없기 때문에 완치를 목적으로 하는 것이 아니라 증상의 조절을 목적으로 한다는 한계가 있다.
알츠하이머는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로 알려져 있는 질환이다. 대개 만성적으로 진행성으로 나타나며, 점진적인 기억·판단·언어능력 등 지적 기능의 감퇴와 일상생활능력, 인격, 행동양상의 장애를 보인다. 알츠하이머는 치매의 원인 중 절반 정도를 차지할 정도로 그 비중이 크다. 가장 흔한 치매로서, 전체 치매의 절반 정도를 차지하고 있다. 상기 치매는 정상세포의 손상으로 아세틸콜린(acetylcolline)이라는 신경전달 물질이 감소되어 기억력, 언어기능, 판단력이 상실되고 성격이 변화되어 결국에는 스스로를 돌볼 수 있는 능력이 상실되는 질환이다.
상기와 같이, 고령화가 진행됨에 따라 관련 질병, 특히 퇴행성 뇌질환이 증가하고 있다. 이에, 퇴행성 뇌질환 치료에 대한 관심이 증대되고 있으며, 약물이 아닌 원하는 세포에 특이적으로 유전자를 발현시키기 위한 유전자 치료에 대한 관심이 증가하고 있다. 이를 바탕으로 원하는 유전자를 쉽고 빠르게 전달하고, 장기간 치료 효과가 지속 가능하도록 하는 바이러스를 이용한 유전자 치료에 대한 기술 개발의 필요성이 높아지고 있으나, 아직까지 원하는 세포에 특이적으로 유전자를 발현시키는 기술이 부족하고, 바이러스의 야생형 발현으로 인한 독성 생성의 문제 때문에 연구 개발이 어려운 실정이다.
대한민국 등록특허 제 10-1055305호 (2011.08.02 등록)
본 발명의 목적은 단순포진바이러스 또는 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단순포진바이러스(herpes simplex virus; HSV) 또는 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및 HSV 또는 AAV 벡터에 GFAP 프로모터를 포함하고, 신경교세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;를 포함하며, 신경교세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는, 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 단순포진바이러스(herpes simplex virus; HSV) 또는 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및 HSV 또는 AAV 벡터에 GFAP 프로모터를 포함하고, 신경교세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;로 공동 형질감염시켜 생산된 재조합 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터, 및 GFAP 프로모터를 포함하고, 신경교세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터를 세포에 공동 형질감염시켜 생산된 신경교세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는 HSV 또는 AAV 기반 유전자 전달용 재조합 바이러스를 제공한다. 상기 재조합 바이러스는 퇴행성 뇌질환 치료용 표적 유전자를 이용하여 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 HSV 재조합 바이러스(pHSV-CMV-GFP)로 신경아세포종 SK-N-SH 세포와 신경교종 U-87MG 세포를 감염시킨 후, 3일째에 GFP 단백질의 발현을 확인한 것이다.
도 2는 HSV 재조합 바이러스(pHSV-CMV-GFP)에서 야생형 HSV 바이러스의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 3은 HSV 재조합 바이러스(pHSV-CMV-GFP)의 역가를 확인한 것이다.
도 4는 유전자의 장기 발현을 유도하는 EF1a 프로모터가 포함된 HSV 재조합 바이러스(pHSV-EF1a-GFP)로 SK-N-SH 세포와 U-87MG 세포를 감염시킨 후, 3일째와 14일째에 GFP 단백질의 발현을 확인한 것이다.
도 5는 EF1a 프로모터를 포함하는 HSV 재조합 바이러스(pHSV-EF1a-GFP)의 역가를 확인한 것이다.
도 6은 EF1a 프로모터 및 GFAP 프로모터가 포함된 HSV 재조합 바이러스(pHSV-EF1a-dfGFP 및 pHSV-GFAP-Cre)로 SK-N-SH 세포를 감염시킨 후, GFP 단백질의 발현을 확인한 것이다.
도 7은 EF1a 프로모터 및 GFAP 프로모터가 포함된 HSV 재조합 바이러스(pHSV-EF1a-dfGFP 및 pHSV-GFAP-Cre)로 U-87MG 세포를 감염시킨 후, GFP 단백질의 발현을 확인한 것이다.
도 8은 EF1a 프로모터 및 GFAP 프로모터가 포함된 HSV 재조합 바이러스(pHSV-EF1a-dfGFP 및 pHSV-GFAP-Cre)를 마우스 뇌내에 투여한 후, GFP 발현을 확인한 것이다.
도 9는 HSV 재조합 바이러스(pHSV-EF1a-dfGFP) 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 10은 HSV 재조합 바이러스(pHSV-EF1a-dfMCS) 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 11은 HSV 재조합 바이러스(pHSV-GFAP-Cre) 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
본 발명의 발명자들은 Cre/LoxP 시스템을 이용하여 신경교세포에 특이적인 GFAP 프로모터를 가지며 Cre를 발현하는 pHSV-GFAP-Cre 벡터를 클로닝하고, Cre 단백질에 반응하여 GFP를 발현하는 pHSV-EF1a-dfGFP 벡터를 클로닝한 후, 상기 두 바이러스를 수용세포에 동시 형질감염시킨 결과, GFAP 특이적인 신경교세포에서 장기간 GFP를 발현하는 것을 확인하며, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 단순포진바이러스(herpes simplex virus; HSV) 또는 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및 HSV 또는 AAV 벡터에 GFAP 프로모터를 포함하고, 신경교세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;를 포함하며, 신경교세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는, 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템을 제공한다.
상기 제 1 재조합 발현 벡터는 도 9 또는 도 10의 개열지도를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 제 2 재조합 발현 벡터는 도 11의 개열지도를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 발현 목적 유전자는 퇴행성 뇌질환 치료용 표적 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 단순포진바이러스(herpes simplex virus; HSV) 또는 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및 HSV 또는 AAV 벡터에 GFAP 프로모터를 포함하고, 신경교세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;로 공동 형질감염시켜 생산된 재조합 바이러스를 제공한다.
상기 재조합 바이러스는 신경교세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현할 수 있다.
상기 발현 목적 유전자는 퇴행성 뇌질환 치료용 표적 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨 질환(Parkinson’s disease), 알츠하이머 질환(Alzheimer’s disease), 뇌졸중(Stroke), 중풍, 경도 인지장애, 뇌경색, 치매, 알코올성 치매, 헌팅톤 병(Huntington’s disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 다발성 경화증, 알코올성 뇌신경환, 척수손상(spinal cord injury), 루게릭 병 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff’s syndrome)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : Helper virus free 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus; HSV) 기반 벡터 및 재조합 바이러스 개발
1-1. 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein; GFP)을 발현하는 helper virus free HSV 기반 벡터 및 재조합 바이러스의 제조
(1) pHSV-CMV-GFP 벡터 제작
GFP 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 서열분석(sequencing)을 통해 GFP 유전자의 염기서열을 확인한 후, pHSV-CMV 벡터에 삽입하여 pHSV-CMV-GFP 벡터를 클로닝하였다.
(2) 바이러스 패키징
pHSV-CMV-GFP 벡터와 HSV 패키징 구조물(packaging construct) (Mol Ther. 2001 Apr;3(4):591-601.)을 함께 vero2-2 세포에 형질주입(transfection)하여 GFP를 발현하는 재조합 바이러스를 제조하였다. 이후 Sucrose gradient 방법으로 바이러스를 정제하여 고농도의 재조합 바이러스를 획득하였다.
(3) GFP 발현 분석
신경세포(Nurocyte) 계통 세포로 신경아세포종(neuroblastoma)인 SK-N-SH(KCLB No. 30011) 세포와 성상교세포(Astrocyte) 계통 세포로 신경교종(astrocytoma)인 U-87MG(KCLB No. 30014) 세포를 재조합 바이러스로 감염시킨 후, 3일째에 GFP 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 1을 참조하여 보면, SK-N-SH 세포와 U-87MG 세포 모두에서 GFP 발현이 관찰되었고, 이를 통해 HSV 재조합 바이러스가 주요 신경세포에 감염되며 GFP를 발현하는 것을 확인하였다.
(4) HSV 재조합 바이러스에서 야생형(wild type) HSV 검출 분석
HSV 재조합 바이러스 제조 시, 사용되는 Vero2-2 세포는 대표적으로 ICP27 유전자(1539 bp)를 가지고 있어 HSV 재조합 바이러스를 생성한다. 즉, ICP27 유전자의 결실은 HSV 재조합 바이러스의 복제를 불가능하게 한다. 따라서 제작된 HSV 재조합 바이러스가 ICP27 유전자를 발현하는지 여부를 확인하기 위해, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 수행하였다.
Standard로는 ICP 유전자를 가지고 있는 HSV gDNA(ATCC VR-260D)를 사용하였고, 음성대조군으로 아데노바이러스 gDNA(ATCC VR-5D) 1 ng을 사용하였으며, 측정 시료로는 HSV gDNA 1 ng을 사용하였다. 표준곡선은 100 pg에서 1 pg까지 (p=0.9998) 직선형 그래프를 그려서 검증하였으며, 정량한계(limit of quantitation) 값은 1 pg이었다.
상기 표준곡선을 이용하여 HSV와 아데노바이러스의 CT 값을 대입하여 분석한 결과, 도 2를 참조하여 보면, 모든 HSV 시료는 정량한계 이하 값을 나타내었으며, 이는 본 발명의 재조합 바이러스에서 야생형 HSV 유전자를 가질 확률이 0.1% 이하(ng 당 1pg 이하) 임을 의미한다.
(5) HSV 재조합 바이러스의 적정 시험
HSV 재조합 바이러스의 적정(titration)을 측정하기 위해, 본 발명의 재조합 바이러스가 가지는 CMV 프로모터에 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
Standard는 HSV 구조 DNA를 복제(copy) 수로 환산하여 109에서 106까지 CT 값을 통해 표준곡선(p=0.9938)을 구한 후, HSV로부터 gDNA를 추출하여 HSV 재조합 바이러스의 적정을 측정하였다.
그 결과, 도 3을 참조하여 보면, ml 당 9.67 X 1011에서 1.43 X 1012의 역가를 나타내는 것을 확인하였다.
1-2. 표적 유전자의 장기간 발현이 가능한 HSV 기반 벡터 및 재조합 바이러스의 제조
(1) pHSV-EF1a-GFP 벡터 제작
유전자의 장기 발현을 유도하는 것으로 알려져 있는 EF1a 프로모터에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 서열분석을 통해 EF1a의 염기서열을 확인한 후, 제한효소를 이용하여 CMV 프로모터가 제거된 pHSV-GFP 벡터에 삽입하여 pHSV-EF1a-GFP 벡터를 클로닝하였다. 클로닝된 pHSV-EF1a-GFP 벡터는 특정 제한효소를 이용하여 확인하였다.
(2) 바이러스 패키징
pHSV-EF1a-GFP 벡터와 HSV 패키징 구조물을 함께 vero2-2 세포에 형질주입하여 EF1a 프로모터를 가지며, GFP를 발현하는 재조합 바이러스를 제조하였다. 이후 Sucrose gradient 방법으로 바이러스를 정제하여 고농도의 재조합 바이러스를 획득하였다.
(3) 표적 유전자의 장기간 발현 여부 분석
신경세포(Nurocyte) 계통 세포로 신경아세포종(neuroblastoma)인 SK-N-SH(KCLB No. 30011) 세포와 성상교세포(Astrocyte) 계통 세포로 신경교종(astrocytoma)인 U-87MG(KCLB No. 30014) 세포를 재조합 바이러스로 감염시킨 후, 3일째 및 14일째에 GFP 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 4를 참조하여 보면, SK-N-SH 세포와 U-87MG 세포 모두에서 GFP 발현이 관찰되었고, 이를 통해 HSV 재조합 바이러스가 주요 신경세포에 감염되며, 14일 동안 안정적으로 GFP를 발현하는 것을 확인하였다.
(4) EF1a 프로모터를 가지는 HSV 재조합 바이러스의 적정 시험
HSV 재조합 바이러스의 적정을 측정하기 위해, 본 발명의 재조합 바이러스가 가지는 EF1a 프로모터에 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
Standard는 HSV 구조 DNA를 복제수로 환산하여 109에서 105까지 CT 값을 통해 표준곡선(p=0.9941)을 구한 후, HSV로부터 gDNA를 추출하여 HSV 재조합 바이러스의 적정을 측정하였다.
그 결과, 도 5를 참조하여 보면, ml 당 8.18 X 1011에서 1.07 X 1012의 역가를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 세포 특이적으로 표적 유전자를 발현하는 HSV 기반 벡터 및 재조합 바이러스의 제조
Cre/LoxP 시스템(대한내분비학회지: 제21권 제5호 2006)을 이용하여 신경아교세포(성상교세포 등)에 특이적인 GFAP 프로모터를 가지며 Cre를 발현하는 pHSV-GFAP-Cre 벡터를 클로닝하고, Cre 단백질에 반응하여 GFP를 발현하는 pHSV-EF1a-dfGFP 벡터를 클로닝하였다. 상기 두 바이러스가 함께 형질주입되는 경우, GFAP 특이적인 세포에서 GFP를 발현하는 특성을 가지게 된다.
2-1. 성상교세포 특이적으로 유전자를 발현하는 HSV 기반 벡터 제작 및 재조합 바이러스 제조
(1) pHSV-GFAP-Cre 벡터 제작
성상교세포 특이적으로 Cre를 발현하는 재조합 바이러스를 제조하기 위해, GFAP 및 Cre 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 서열분석을 통해 GFAP 및 Cre 유전자의 염기서열을 확인한 후, 제한효소를 이용하여 프로모터가 제거된 pHSV 벡터에 삽입하여 pHSV-GFAP-Cre 벡터를 클로닝하였다. 클로닝된 pHSV-GFAP-Cre 벡터는 특정 제한효소를 이용하여 확인하였다.
(2) pHSV-EF1a-dfGFP 벡터 제작
Cre 단백질이 작용할 때 GFP가 발현되는 재조합 바이러스를 제조하기 위해, dfGFP 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 서열분석을 통해 dfGFP 유전자의 염기서열을 확인한 후, 제한효소를 이용하여 pHSV-EF1a 벡터에 삽입하여 pHSV-EF1a-dfGFP 벡터를 클로닝하였다. 클로닝된 pHSV-EF1a-dfGFP 벡터는 특정 제한효소를 이용하여 확인하였다.
(3) 바이러스 패키징
pHSV-GFAP-Cre 벡터와 HSV 패키징 구조물을 함께 vero2-2 세포에 형질주입하여 GFAP 프로모터를 가지며, Cre를 발현하는 재조합 바이러스를 제조하였다. 또한, pHSV-EF1a-dfGFP 벡터와 HSV 패키징 구조물을 함께 vero2-2 세포에 형질주입하여 EF1a 프로모터를 가지며 Cre에 의해 GFP가 발현하는 재조합 바이러스를 제조하였다. 이후 Sucrose gradient 방법으로 바이러스를 정제하여 고농도의 재조합 바이러스를 획득하였다.
2-2. 바이러스 동시 감염을 통한 GFAP 특이적인 GFP 발현 분석
(1) 세포실험
SK-N-SH 세포와 U-87MG 세포에 Cre를 발현하며 GFAP 프로모터를 가지는 HSV 재조합 바이러스(pHSV-GFAP-Cre)와 Cre에 의해 GFP가 발현되는 HSV 재조합 바이러스(pHSV-EF1a-dfGFP)를 동시 감염시켜 GFP가 발현되는지 여부를 분석하였다.
대조군으로 상기 두 세포에서 모두 발현하는 EF1a 프로모터를 가진 GFP를 사용하여 비교한 결과, 도 6(SK-N-SH 세포) 및 도 7(U-87MG 세포)을 참조하여 보면, pHSV-EF1a-GFP는 두 세포에서 14일째까지 GFP 발현이 관찰된 반면, pHSV-GFAP-Cre와 pHSV-EF1a-dfGFP를 동시 감염한 경우 GFAP 프로모터 특이적인 U-87MG 세포에서만 GFP가 발현되는 것을 관찰하였다.
(2) 동물실험
시험군은 하기 표 1과 같이 구성하였으며, 마우스 전용 뇌심부 고정장치(stereotaxic apparatus)에 마우스를 고정시키고, 해밀턴 주사기(Hamilton syringe) 및 펌프(pump)를 이용하여 뇌내에 HSV 재조합 바이러스를 동시 투여하였다.
군 성별 개체수
(마리)		 개체식별 번호
 투여액량
(μl/마리)		 투여용량
(마리 당)		 시험종료

대조군
(PBS)


수컷
5
1 내지 5
3
PBS
투여 후,
14일째 계획도살

시험군
(rHSV)
15
6 내지 20
3
3 X 109
투여 후,
3일, 7일, 14일째
계획도살
시험 기간 동안 1일 1회 이상 반응 및 사망 유무를 관찰하였으며, 도살 전까지 질병 또는 사망은 관찰되지 않았다. 또한, 도 8을 참조하여 보면, 소뇌 및 대뇌 피질에서 3일, 7일, 14일째 모두 GFP 발현이 관찰되었으며, 날짜에 따른 발현량의 차이는 관찰되지 않았다. 형광이 발현된 세포의 형태를 관찰한 결과, 소뇌 및 대뇌 피질에서 대부분이 신경교세포인 것으로 간주되었다.
상기 결과를 종합해 보면, pHSV-GFAP-Cre와 pHSV-EF1a-dfGFP 재조합 바이러스를 동시 감염 시, 마우스에서도 세포 실험과 유사하게 투여 후 14일째까지 신경교세포에 특이적으로 GFP가 발현되는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 단순포진바이러스(herpes simplex virus; HSV) 또는 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및
    HSV 또는 AAV 벡터에 GFAP 프로모터를 포함하고, 신경교세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;를 포함하며,
    신경교세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는, 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 재조합 발현 벡터는 도 9 또는 도 10의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 재조합 발현 벡터는 도 11의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 발현 목적 유전자는 퇴행성 뇌질환 치료용 표적 유전자인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템.
  5. 단순포진바이러스(herpes simplex virus; HSV) 또는 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및
    HSV 또는 AAV 벡터에 GFAP 프로모터를 포함하고, 신경교세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;로 공동 형질감염시켜 생산된 재조합 바이러스.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 바이러스는 신경교세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 발현 목적 유전자는 퇴행성 뇌질환 치료용 표적 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  8. 제 5항의 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨 질환(Parkinson’s disease), 알츠하이머 질환(Alzheimer’s disease), 뇌졸중(Stroke), 중풍, 경도 인지장애, 뇌경색, 치매, 알코올성 치매, 헌팅톤 병(Huntington’s disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 다발성 경화증, 알코올성 뇌신경환, 척수손상(spinal cord injury), 루게릭 병 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff’s syndrome)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제 5항의 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
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