CN107179342B - 一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种基于GQDs‑CuO@3D‑rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用。所制备的免疫传感器具有特异性强，灵敏度高和检出限低等优点，对乙肝标志物HBs、HBe的检测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备 方法及应用
技术领域
本发明属于新型功能纳米材料、电化学免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术
HBs、HBe等标志物，对于乙型肝炎的诊断都能起到一定的作用。电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、等领域都有重要的应用价值。
GQDs具有良好的导电性、热稳定性、分散性，能增强电子传导，同时具有较大的比表面积、小尺寸效应，以及良好的生物相容性、低毒性，使其能有效吸附固载抗体蛋白。GO表面有大量的羧基官能团，使得他容易与金属氧化物结合。三维石墨烯网3D-rGO能够有效吸附GQDs，且其三维形貌具有大的比表面积，增加GQDs和CuO的负载量。GQDs和CuO对过氧化氢均有催化作用，两者协同作用增加电子传递能力和催化性能，从而获得高强度的检测信号，提高了传感器的灵敏度。GQDs-CuO@3D-rGO通过简单的一步微波方法合成，具有良好的分散性和稳定性，能够紧密结合到巯基乙酸预处理的电沉积金电极上，因此能够保证所构建传感器的稳定性。
发明内容
本发明提供了一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法及应用，实现了对乙肝标志物的灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的乙肝标志物免疫传感器，用于检测乙肝标志物。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，包括以下几个步骤：
（1）将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将预处理过的电极浸入10 mL、1 mmol/L的HAuCl4溶液中，于-0.2 V恒定电压下扫描30 s，得到电沉积金改性的电极表面，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将上述步骤（2）处理过的电极浸入10mL、10 mmol/L的巯基乙酸TGA中，室温避光反应24 h后，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（4）继续将6 µL、2 ~ 4 mg/mL的GQDs-CuO@3D-rGO溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（5）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的乙肝标志物抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）继续将3 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、0.5 ~120 ng/mL的一系列不同浓度的乙肝标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥，制得一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器。
一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，所述GQDs-CuO@3D-rGO的制备，包括以下几个步骤：
（1）GO的制备
将300 ~ 500 mL H2SO4/H3PO4的混合酸缓慢加入到2 ~ 4 g 石墨粉和16 ~ 20 gKMnO4的混合物中，室温下搅拌混合，恒温50℃下搅拌反应10 ~ 14 h，冷却至室温，将反应液倒入350 ~ 450 mL冰中，加入2 ~ 4 mL、30%H2O2，20min后，以8000rpm转速离心分离，超纯水洗涤至中性，50℃下真空干燥，制得GO，备用；
所述H2SO4/H3PO4的混合酸是将9体积的浓硫酸与1体积的磷酸混合而得；
（2）GQDs的合成
将200 ~ 300 mg研磨过的GO粉末分散于15 mL二甲基甲酰胺中，超声分散30 min后转移到高压反应釜内，于200℃下反应4 ~ 6 h，冷却到室温，得到棕色透明悬浮液和黑色沉淀，离心除去黑色沉淀，悬浮液透析纯化，得到GQDs的溶液；
（3）GQDs-CuO@3D-rGO的合成
将40 ~ 60 mg的GO分散到50 mL乙醇中，超声分散5 min；将0.2 ~ 0.3 g CuCl2·2 H2O溶解于10 mL超纯水中，得到CuCl2·2H2O水溶液，搅拌下逐滴加入到GO的乙醇分散液中；再逐滴加入0.5 ~ 1.5 mL的GQDs溶液，搅拌10 min后，逐滴加入0.1 ~0.3 mol/L的NH3·H2O，再搅拌10 ~ 20 min后，鼓风干燥箱中烘干，所得粉末置于微波反应器中加热3 ~4 h，得到GQDs-CuO@3D-rGO。
乙肝标志物的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 8.00磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
所述乙肝标志物选自下列之一：HBs、HBe。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）GODs具有良好的导电性、热稳定性、分散性，能增强电子传导，同时具有较大的比表面积、小尺寸效应，以及良好的生物相容性、低毒性，使其能有效吸附固载抗体蛋白；
（2）采用GQDs-CuO@3D-rGO作为捕获乙肝标志物抗体的材料，具有良好的分散性和稳定性，能够紧密结合到巯基乙酸预处理的电沉积金电极上。3D-rGO能够有效吸附GODs，其中三维形貌具有大的比表面积，增加GODs和CuO的负载量，且GODs和CuO对过氧化氢均有催化作用，两者协同作用增加电子传递能力和催化性能，从而获得高强度的检测信号，提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；
（3）一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器，对HBs的检测，其线性范围0.5pg/mL～120 ng/mL，检测限最低0.17 pg/mL；对HBe进行检测，其线性范围为1.0 pg/mL~100 ng/mL，检测限为0.33 pg/mL；表明一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，包括以下几个步骤：
（1）将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将预处理过的电极浸入10 mL、1 mmol/L的HAuCl4溶液中，于-0.2 V恒定电压下扫描30 s，得到电沉积金改性的电极表面，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将上述步骤（2）处理过的电极浸入10mL、10 mmol/L的巯基乙酸TGA中，室温避光反应24 h后，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（4）继续将6 µL、2 mg/mL的GQDs-CuO@3D-rGO溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（5）继续将6 µL、8 µg/mL的乙肝标志物抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）继续将3 µL、1.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、0.5 ~ 120ng/mL的一系列不同浓度的乙肝标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥，制得一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器。
实施例2一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，包括以下几个步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将预处理过的电极浸入10 mL、1 mmol/L的HAuCl4溶液中，于-0.2 V恒定电压下扫描30 s，得到电沉积金改性的电极表面，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将上述步骤（2）处理过的电极浸入10mL、10 mmol/L的巯基乙酸TGA中，室温避光反应24 h后，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（4）继续将6 µL、3 mg/mL的GQDs-CuO@3D-rGO溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（5）继续将6 µL、10 µg/mL的乙肝标志物抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）继续将3 µL、1.5 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、0.5 ~ 120ng/mL的一系列不同浓度的乙肝标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥，制得一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器。
实施例3一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，包括以下几个步骤：
（1）将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将预处理过的电极浸入10 mL、1 mmol/L的HAuCl4溶液中，于-0.2 V恒定电压下扫描30 s，得到电沉积金改性的电极表面，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将上述步骤（2）处理过的电极浸入10mL、10 mmol/L的巯基乙酸TGA中，室温避光反应24 h后，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（4）继续将6 µL、4 mg/mL的GQDs-CuO@3D-rGO溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（5）继续将6 µL、12 µg/mL的乙肝标志物抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）继续将3 µL、2.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、0.5 ~ 120ng/mL的一系列不同浓度的乙肝标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥，制得一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器。
实施例4所述GQDs-CuO@3D-rGO的制备，包括以下几个步骤：
（1）GO的制备
将300 mL H2SO4/H3PO4的混合酸缓慢加入到2 g 石墨粉和16 g KMnO4的混合物中，室温下搅拌混合，恒温50℃下搅拌反应10 h，冷却至室温，将反应液倒入350 mL冰中，加入2mL、30%H2O2，20min后，以8000rpm转速离心分离，超纯水洗涤至中性，50℃下真空干燥，制得GO，备用；
所述H2SO4/H3PO4的混合酸是将9体积的浓硫酸与1体积的磷酸混合而得；
（2）GQDs的合成
将200 mg研磨过的GO粉末分散于15 mL二甲基甲酰胺中，超声分散30 min后转移到高压反应釜内，于200℃下反应4 h，冷却到室温，得到棕色透明悬浮液和黑色沉淀，离心除去黑色沉淀，悬浮液透析纯化，得到GQDs的溶液；
（3）GQDs-CuO@3D-rGO的合成
将40 mg的GO分散到50 mL乙醇中，超声分散5 min；将0.2 g CuCl2·2 H2O溶解于10 mL超纯水中，得到CuCl2·2H2O水溶液，搅拌下逐滴加入到GO的乙醇分散液中；再逐滴加入0.5 mL的GQDs溶液，搅拌10 min后，逐滴加入0.1 mol/L的NH3·H2O，再搅拌10 min后，鼓风干燥箱中烘干，所得粉末置于微波反应器中加热3 h，得到GQDs-CuO@3D-rGO。
实施例5所述GQDs-CuO@3D-rGO的制备，包括以下几个步骤：
（1）GO的制备
将400 mL H2SO4/H3PO4的混合酸缓慢加入到3 g 石墨粉和18 g KMnO4的混合物中，室温下搅拌混合，恒温50℃下搅拌反应12 h，冷却至室温，将反应液倒入400mL冰中，加入3mL、30%H2O2，20min后，以8000rpm转速离心分离，超纯水洗涤至中性，50℃下真空干燥，制得GO，备用；
所述H2SO4/H3PO4的混合酸是将9体积的浓硫酸与1体积的磷酸混合而得；
（2）GQDs的合成
将250 mg研磨过的GO粉末分散于15 mL二甲基甲酰胺中，超声分散30 min后转移到高压反应釜内，于200℃下反应5 h，冷却到室温，得到棕色透明悬浮液和黑色沉淀，离心除去黑色沉淀，悬浮液透析纯化，得到GQDs的溶液；
（3）GQDs-CuO@3D-rGO的合成
将50 mg的GO分散到50 mL乙醇中，超声分散5 min；将0.25 g CuCl2·2 H2O溶解于10 mL超纯水中，得到CuCl2·2H2O水溶液，搅拌下逐滴加入到GO的乙醇分散液中；再逐滴加入1.0 mL的GQDs溶液，搅拌10 min后，逐滴加入0.2 mol/L的NH3·H2O，再搅拌15 min后，鼓风干燥箱中烘干，所得粉末置于微波反应器中加热3.5 h，得到GQDs-CuO@3D-rGO。
实施例6所述GQDs-CuO@3D-rGO的制备，包括以下几个步骤：
（1）GO的制备
将500 mL H2SO4/H3PO4的混合酸缓慢加入到4 g 石墨粉和20 g KMnO4的混合物中，室温下搅拌混合，恒温50℃下搅拌反应14 h，冷却至室温，将反应液倒入450 mL冰中，加入4mL、30%H2O2，20min后，以8000rpm转速离心分离，超纯水洗涤至中性，50℃下真空干燥，制得GO，备用；
所述H2SO4/H3PO4的混合酸是将9体积的浓硫酸与1体积的磷酸混合而得；
（2）GQDs的合成
将300 mg研磨过的GO粉末分散于15 mL二甲基甲酰胺中，超声分散30 min后转移到高压反应釜内，于200℃下反应6 h，冷却到室温，得到棕色透明悬浮液和黑色沉淀，离心除去黑色沉淀，悬浮液透析纯化，得到GQDs的溶液；
（3）GQDs-CuO@3D-rGO的合成
将60 mg的GO分散到50 mL乙醇中，超声分散5 min；将0.3 g CuCl2·2 H2O溶解于10 mL超纯水中，得到CuCl2·2H2O水溶液，搅拌下逐滴加入到GO的乙醇分散液中；再逐滴加入1.5 mL的GQDs溶液，搅拌10 min后，逐滴加入0.3 mol/L的NH3·H2O，再搅拌20 min后，鼓风干燥箱中烘干，所得粉末置于微波反应器中加热4 h，得到GQDs-CuO@3D-rGO。
实施例7 HBs的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 8.00磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化,
(4) 绘制标准曲线，测定样品中HBs的线性范围为0.5 pg/mL~120 ng/mL，检测限为0.17 pg/mL。
实施例8 HBe的检测
按照实施例7的方法对样品中HBe进行检测，其线性范围为1.0 pg/mL ~ 100ng/mL，检测限为0.33 pg/mL。

Claims (4)

1.一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
（1）将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将预处理过的电极浸入10 mL、1 mmol/L的HAuCl4溶液中，于-0.2 V恒定电压下扫描30 s，得到电沉积金改性的电极表面，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将上述步骤（2）处理过的电极浸入10mL、10 mmol/L的巯基乙酸TGA中，室温避光反应24 h后，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（4）继续将6 µL、2 ~ 4 mg/mL的GQDs-CuO@3D-rGO溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（5）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的乙肝标志物抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（6）继续将3 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；滴加6 µL、0.5 ~ 120ng/mL的一系列不同浓度的乙肝标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥，制得一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器；
所述GQDs-CuO@3D-rGO的制备，包括以下几个步骤：
（1）GO的制备
将300 ~ 500 mL H2SO4/H3PO4的混合酸缓慢加入到2 ~ 4 g 石墨粉和16 ~ 20 g KMnO4的混合物中，室温下搅拌混合，恒温50℃下搅拌反应10 ~ 14 h，冷却至室温，将反应液倒入350 ~ 450 mL冰中，加入2 ~ 4 mL、30%H2O2，20min后，以8000rpm转速离心分离，超纯水洗涤至中性，50℃下真空干燥，制得GO，备用；
所述H2SO4/H3PO4的混合酸是将9体积的浓硫酸与1体积的磷酸混合而得；
（2）GQDs的合成
将200 ~ 300 mg研磨过的GO粉末分散于15 mL二甲基甲酰胺中，超声分散30 min后转移到高压反应釜内，于200℃下反应4 ~ 6 h，冷却到室温，得到棕色透明悬浮液和黑色沉淀，离心除去黑色沉淀，悬浮液透析纯化，得到GQDs的溶液；
（3）GQDs-CuO@3D-rGO的合成
将40 ~ 60 mg的GO分散到50 mL乙醇中，超声分散5 min；将0.2 ~ 0.3 g CuCl2·2 H2O溶解于10 mL超纯水中，得到CuCl2·2H2O水溶液，搅拌下逐滴加入到GO的乙醇分散液中；再逐滴加入0.5 ~ 1.5 mL的GQDs溶液，搅拌10 min后，逐滴加入0.1 ~0.3 mol/L的NH3·H2O，再搅拌10 ~ 20 min后，鼓风干燥箱中烘干，所得粉末置于微波反应器中加热3 ~ 4 h，得到GQDs-CuO@3D-rGO。
2.如权利要求1所述的一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述乙肝标志物选自下列之一： HBs、HBe。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器，用于乙肝标志物检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 8.00磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
4.如权利要求3所述的一种基于GQDs-CuO@3D-rGO的乙肝标志物免疫传感器，其特征在于，所述乙肝标志物选自下列之一： HBs、HBe。
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