CN104447986B - 一种中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体及其制备方法，属于细胞免疫技术领域。本发明利用杆状病毒表达系统体外表达、纯化获得了MERS‑CoV病毒S蛋白受体结合区域RDB蛋白，并用该高纯度MERS RBD蛋白免疫Bab/c小鼠，通过ELISA和假病毒中和实验等方法筛选到高效的抗病毒的中和抗体，为临床检测甚至预防和治疗MERS‑CoV病毒感染提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体及其制备方法，属于细胞免疫技术领域。
背景技术
中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Cononaviruse,MERS-CoV)与SARS-CoV同属冠状病毒科，beta冠状病毒属。为正链、单链RNA病毒。它表面刺突蛋白—S蛋白在病毒感染人和动物时起着关键作用。曾有科学家推测此病毒可能有来源于蝙蝠。序列分析发现，MERS-CoV病毒与蝙蝠和猪冠状病毒序列同源性非常高，与蝙蝠冠状病毒HKU4和HKU5可高达60％。目前仍然没有确定MERS-CoV病毒的来源和天然宿主，无法采取有效的措施来预防和阻止此病毒传播。
由于临床病症中MERS-CoV和SARS-CoV之间的相似性，提出它们可能会使用相同的细胞受体—血管紧张素转换酶2(ACE2)。然而，进一步研究发现：二肽基肽酶-4(DPP4，也被称为CD26)是MERS-CoV的受体，在人支气管和肾上皮细胞表达。病毒感染人时，病毒S蛋白受体结合区(Receptor Binding Domain,RBD)会与这种蛋白结合，病毒以它们为“登陆点”，附着到呼吸道细胞上，随之进一步侵人体内。CD26蛋白的氨基酸序列是高度保守的，还存在于蝙蝠和其他许多动物体内，因此，MERS-CoV病毒可能利用这种蛋白质在多个物种之间持续传播，有较大的潜在威胁。目前，感染MERS-CoV病毒后尚无有效治疗药物，主要是对症治疗，也没有预防性疫苗。单克隆抗体是针对特异抗原产生的特异抗体，它具有高度专一性，能精确地瞄准、捕获目标靶点，特异性地与靶目标发生反应，从而直接清除病毒的目的。
MERS-CoV病毒表面有一个膜蛋白称之为S蛋白，在病毒的复制和生命周期中发挥着重要作用。S蛋白上有部分区域，称之为受体结合区(Receptor Binding Domain,RBD)可以与细胞表面的CD26蛋白结合，介导病毒感染细胞。因而，寻找和制备有效的抗体阻止MERSRBD蛋白结合CD26蛋白，进而抑制病毒侵染细胞，成为检测、预防和治疗MERS-CoV病毒感染的方法之一。通过制备抗MERS RBD蛋白单克隆抗体，筛选可与之特异性结合的中和抗体，在分子水平上分析抗体与之结合的关键位点，进一步对其人源化，已成为制备预防或治疗性抗体的有效手段。目前还没有关于抗MERS-CoV病毒中和抗体的报道。
由于目前缺乏抗MERS-CoV病毒中和抗体，而且制备大量抗体及应用于临床需要较长时间，不能快速有效在临床上进行检测。
本发明描述了筛选具有中和活性的MERS-CoV鼠源单克隆抗体的技术，用于MERS-CoV的检测甚至预防和治疗。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)中和抗体，包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变结构域和氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的轻链可变结构域。
在本发明的一种实施方式中，所述MERS-CoV抗体是鼠源单克隆抗体2E6，其重链、轻链的氨基酸序列分别如SEQ IDMO.3、SEQ ID NO.4所示。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种制备MERS-CoV鼠源单克隆中和抗体的方法，首先是制备MERS-CoV病毒受体结合区蛋白(MERS RBD)，然后以该蛋白为抗原筛选到抗MERS-CoV病毒的鼠源单克隆中和抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：
(1)以pFastBac1为表达载体，构建含有编码MERS RBD的基因的重组质粒pFastBac-MERS RBD转化DH10Bac感受态细胞、筛选鉴定阳性克隆，提取重组杆状病毒质粒，转染sf9细胞，培养获得高滴度病毒；然后感染Hi5细胞，从细胞培养上清液中纯化浓缩得到目的蛋白MERS-RBD。
(2)以MERS-RBD蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，取血清抗体效价最高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5：1比进行融合，通过HAT筛选培养基和有限稀释法获得杂交瘤细胞；并进一步用ELISA检测筛选获得高效分泌MERS-RBD蛋白抗体的单克隆细胞株，注入小鼠腹腔制备腹水单抗，纯化获得鼠源抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括将所得鼠源抗体通过流式细胞仪检测抑制RBD结合CD26的效果，并用病毒(假病毒和活病毒)中和试验确认得到有中和病毒活性的抗体2E6。所述假病毒是将质粒pCAGGS-MERS S与HIV pNL4-3.luc.RE共转染293T细胞培养获得，活病毒实验在高级别生物安全实验室进行。
本发明成功筛选到了抗MERS-CoV病毒中和抗体，此抗体是能够有效抑制MERS-CoV病毒侵入的中和抗体，对MERS-CoV表面蛋白具有高亲和力，因此该抗体不仅可以应用于临床检测，而且对其人源化后为制备预防或治疗性抗体提供了结构基础和可能性。
附图说明
图1：MERS RBD蛋白纯化分子筛和SDS-PAGE图；分子筛图中线为280nm吸收值；SDS-PAGE图中1号泳道为低分子量蛋白Marker，其余泳道分别对应分子筛图中MERS RBD二聚体和单体。
图2：单克隆细胞株上清对MERS RBD蛋白结合CD26抑制作用流式图。
图3：抗体2E6中和假病毒曲线；横坐标是抗体浓度，纵坐标是中和率。
图4：抗体2E6中和活病毒曲线，横坐标是抗体浓度，纵坐标是中和率。
图5：抗体2E6结合MERS RBD蛋白表面等离子共振动力学曲线；横坐标是结合解离时间，单位是秒；纵坐标是芯片表面的结合响应强度，单位是RU(即Response unit)。
具体实施方式
实施例1质粒构建
我们将编码MERS RBD蛋白的DNA片段(SEQ IDNO.5)用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点连入pFastBac1载体中，并在蛋白的编码片段前加入信号肽gp67有助于蛋白分泌表达，在蛋白的编码片段后插入6组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子，这样会得到一个C-端带有组氨酸标签的重组蛋白，利于后续的蛋白分离纯化，命名为pFastBac-MERSRBD。将MERS RBD基因(氨基酸M1-S17，E367-Y606，NCBI登录号JX869059)插入pCAGGS载体EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间，在Xho Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位点间加入鼠Fc基因片段(SEQ IDNO.6)，利于后续蛋白纯化及细胞染色，命名为pCAGGS-MERS RBD mFc。将CD26(二肽基肽酶-4)基因序列(SEQ ID NO.7)插入pEGFPC1载体Xho Ⅰ和Sma Ⅰ酶切位点之间，命名为pEGFPC1-CD26。将ACE2(血管紧张素转换酶2)基因序列(SEQ ID NO.8)插入pEGFPN1载体Xho Ⅰ和SmaⅠ酶切位点之间，命名为pEGFPN1-ACE2。将MERS S基因(SEQ ID NO.9)插入到pCAGGS载体EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ酶切位点之间，在基因后面加入Flag标签(SEQ ID NO.10)，命名为pCAGGS-MERS S。重组质粒通过PCR、酶切鉴定和测序证实插入的外源片段完全正确。
实施例2MERS RBD蛋白表达与纯化
首先，将重组质粒pFastBac-MERS RBD转化DH10Bac感受态细胞，37℃过夜培养，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定出阳性克隆，并提取重组Bacmid(杆状病毒质粒)，即已含有MERSRBD基因序列的质粒。将重组bacmid转染sf9细胞，转染3d后收取培养上清，得到P1代杆状病毒。连续扩增3代病毒即可得到大量高滴度病毒。然后感染Hi5细胞，48h离心收取细胞上清，将细胞培养上清液与Ni-NTAResin(GE)于4℃结合过夜。以缓冲液A(20mM Tris,150mMNaCl，pH8.0)洗涤树脂，以去除非特异结合的蛋白。最后将目的蛋白以缓冲液B(20mM Tris,150mM NaCl，pH8.0,300mM imidazole)从树脂上洗脱下来，并以10K截留(10K cutoff)的浓缩管将洗脱液浓缩至5ml。将浓缩后的蛋白溶液进一步以分子排阻层析纯化，使用AKTA-purifier(GE)和Superdex200Hiload 16/60柱子(GE)，使用缓冲液A(20mM Tris,150mMNaCl，pH8.0)，同时监测280nm的紫外吸收值，收取目的蛋白，并通过SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。典型的目的蛋白的分子筛图谱和SDS-PAGE分析图如图1所示。
实施例3鼠源单克隆抗体制备和纯化
MERS-RBD蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠3只，取100g蛋白溶解于50μl无菌的PBS溶液中，与50μl弗式完全佐剂均匀混合，皮下多点注射。2周后加强免疫一次，3天后取尾静脉血，检测血清抗体效价，取效价最高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5：1比进行融合，通过HAT筛选培养基选择培养，用有限稀释法获得杂交瘤细胞。取纯化的MERS-RBD蛋白为包被抗原，经ELISA检测，获得高效分泌MERS-RBD蛋白抗体的单克隆细胞株。按照杂交瘤细胞(1-5)×106/小鼠的量注入小鼠腹腔制备腹水单抗，10天后收取腹水，离心去除沉淀。0.22M滤膜过滤腹水，通过Protein G亲和层析柱(GE)纯化抗体。
实施例4筛选中和抗体
(1)ELISA筛选分泌抗MERS-RBD抗体的单克隆细胞株
将4μg MERS-RBD蛋白溶于1ml pH 9.6的碳酸盐缓冲液中包被酶标板，400ng/孔，4℃过夜。用含3％牛血清白蛋白BSA的PBS溶液于37℃封闭1小时。用PBST溶液(含0.05％(体积百分含量)Tween 20的PBS)洗涤3次，分别加入梯度稀释的杂交瘤细胞培养上清，100μl/孔，37℃孵育1小时，设小鼠心脏血清为阳性对照，牛血清白蛋白为阴性对照。用PBST洗涤3次后，加入HRP标记的抗鼠的二抗(1：2000稀释，Santa Cruz,Inc.)，100μl/孔，37℃孵育40分钟。用PBST洗涤3次后，加入TMB(四甲基联苯胺，Sigma.)进行显色，37℃孵育15-30分钟，然后加入0.1M H2SO4终止反应。最后，用酶标仪检测OD450nm处的光吸收值。结果表明：筛选的1000个克隆中，有67个Elisa反应阳性，滴度达到104以上。
(2)抗体抑制MERS RBD与受体CD26结合
首先，利用Lipofectamine 2000转染质粒pEGFPC1-CD26和pEGFPN1-ACE2至BHK21细胞，24小时后在荧光显微镜下观察到CD26-GFP和ACE2-GFP融合蛋白主要分布在细胞膜上。收取细胞，并计数，PBS洗涤两次后重悬至1×107cell/ml，分装细胞至EP管中，100μl/管。将pCAGGS-MERS RBD mFc利用Lipofectamine 2000转染真核细胞293T，72小时后收取上清通过ProteinA亲和层析纯化得到MERD RBD-Fc融合蛋白，将MERS RBD-Fc融合蛋白与单克隆细胞株培养上清混合，室温共孵育30分钟后加入到表达CD26-GFP或ACE2-GFP融合蛋白的BHK21细胞中，室温再孵育30分钟。PBS洗涤细胞2次，加入TRITC标记的抗鼠的二抗(1：200稀释)，室温孵育30分钟。PBS洗涤细胞2次，然后用500μl重悬细胞，通过流式细胞仪检测抗体对RBD结合CD26的抑制作用。其中，阳性对照为MERS RBD-Fc融合蛋白与培养基DMEM混合染色表达CD26-GFP的BHK21细胞，阴性对照为MERS RBD-Fc融合蛋白与培养基混合染色表达ACE2-GFP的BHK21细胞。结果表明：MERS RBD-Fc染表达ACE-GFP融合蛋白的细胞后没有红光偏移，即MERS RBD-Fc不能结合ACE2-GFP；MERS RBD-Fc染表达CD26-GFP融合蛋白的细胞后红光有偏移，即MERS RBD-Fc可以结合CD26-GFP。抗体与MERS RBD-Fc混合后，若抗体和RBD有结合则可抑制RBD与CD26的结合，那么红光则无偏移；反之，若抗体不能与RBD结合则红光有偏移。
将Elisa反应阳性的细胞上请按上述方法进行实验后，我们发现，单克隆细胞株2E6上清中分泌表达的抗体与MERS RBD-Fc混合后，红光偏移量较少，即此抗体可有效抑制MERSRBD蛋白与CD26结合(图2)，抑制率达到94％。
图2中，N-BHK21为未转染质粒的BHK21细胞，是实验双阴性对照；ACE2-GFP为BHK21细胞转染pEGFPN1-ACE2质粒后可以表达ACE2-GFP融合蛋白,是实验单阳性对照；ACE2-GFP+MERS RBD-Fc是MERS RBD-Fc蛋白染表达ACE2-GFP融合蛋白的BHK21细胞，是实验阴性对照；CD26-GFP+MERS RBD-Fc是MERS RBD-Fc蛋白染表达CD26-GFP融合蛋白的BHK21细胞，为实验阳性对照；CD26-GFP+MERS RBD-Fc+2E6为抗体2E6与MERS RBD-Fc蛋白混合后染表达CD26-GFP融合蛋白的BHK21细胞。
实施例5假病毒中和实验
(1)假病毒包装
利用Lipofectamine2000将质粒pCAGGS-MERS S与HIV pNL4-3.luc.RE(Invitrogen)共转染293T细胞。转染6小时后，PBS洗涤细胞2次，换为无血清DMEM。48小时后收取细胞上清，离心去掉细胞碎片，分装冻存-80℃。
(2)TCID50测定
将收取的病毒液10倍倍比稀释，依次为10-1,10-2......10-10,加入到96孔板中，此时Huh7细胞汇合度为80％-100％。感染4小时后，弃掉病毒液，PBS洗涤细胞2次，换为含10％血清的完全培养基DMEM。48小时后，弃掉培养液，PBS洗涤细胞2次，加入细胞裂解液，利用GloMax 96Microplate Luminometer(Promega)检测荧光素梅活性值。通过Reed-Muench法计算TCID50。
(3)中和实验
将纯化的抗体2倍倍比稀释，与100TCID50假病毒混合，抗体终浓度依次为2μg/ml、1μg/ml……7.5ng/ml，37℃共孵育30分钟，将混合液加入到已铺满Huh7细胞的96-well中。37℃孵育4小时后，弃掉病毒液，PBS洗涤细胞2次，换为含10％血清的完全培养基DMEM。48小时后，弃掉培养液，PBS洗涤细胞2次，加入细胞裂解液，检测荧光素梅活性值。
结果表明：抗体2E6有中和假病毒活性，即可以抑制MERS病毒S蛋白与细胞表面受体CD26的结合，ND50为310ng/ml(图3)。
实施例6活病毒中和实验
将纯化的抗体2倍倍比稀释，与100TCID50假病毒混合，抗体终浓度依次为50μg/ml、25μg/ml……20ng/ml，37℃共孵育30分钟，将混合液加入到已铺满Huh7细胞的96-well中。37℃孵育1小时后，弃掉病毒液，PBS洗涤细胞2次后加入培养基。每隔12小时观察病变。
结果表明：抗体2E6有中和活性，即可以抑制MERS病毒入侵宿主细胞，ND50为638ng/ml(图4)。
实施例7表面等离子共振技术检测MERS RBD与抗体2E6亲和力
表面等离子共振分析是用Biacore3000(Biacore Inc.)进行的。具体步骤如下：
首先，将抗体2E6溶于10mM NaAc(pH5.0)固定在CM5芯片(GE)上，然后将浓度梯度为3.125nM-100nM的MERS RBD蛋白分别注入芯片，分析在恒温25℃进行，使用的缓冲液是HEPES-Tween缓冲液(10mM HEPES[pH 7.4],150mM NaCl,,0.005％Tween-20)，流速为30μl/min。芯片表面的再生使用的是100mM H3PO4，结合曲线如图4所示。图中5条曲线的抗体浓度由上到下分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125nM，不同浓度的曲线组成图示的动力学曲线。结合动力学常数的计算是利用BIAevaluation software version 3.2(Biacore,Inc.)软件进行的。结果表明，抗体2E6和MERS RBD蛋白的亲和力常数为9nM。
实施例8抗体2E6 Fab序列测定
(1)抗体亚型鉴定
将纯化的2E6抗体进行SDS-PAGE，分别在约45kD和30kD处有重链和轻链两条带，切割用ddH2O浸泡洗涤3次。经过脱水和酶解后进行鉴定，仪器为MALDI-TOF/TOF质谱仪。数据采集后，将一级和二级质谱数据整合并使用GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot2.1(Matrix Science)对质谱数据进行分析和蛋白鉴定。在NCBI中进行搜索与比对，鉴定出抗体2E6亚型为IgG1(κ)。
(2)抗体基因克隆
收取单克隆细胞株细胞1×106，Trizol法提取mRNA。首先设计基因特异性的引物进行逆转录(RT-PCR)获得cDNA，然后利用PCR扩增获得2E6 Fab(抗原结合片段)序列。测序获得主要序列后，通过NCBI比对获得2E6 Fab全序列。2E6 Fab VH-CH1的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，2E6Fab VL-CL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2E6 Fab VH-CH1扩增所用引物及反应条件如下：
OligodC-fix1:
ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTAGCAGCAGTTCGATAAGCGGCCGCCATGGAGGGHN
AP1:ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTA
AP2:AGCAGTAGCAGCAGTTCGATAA；
IgHG1-R1：GTACATATGCAAGGCTTACAACCAC
IgHG1-R2：AATTTTCTTGTCCACCTTG
IgHG1-R3：GGATCCAGAGTTCCAGGTCA
反应条件：42°，90min—72°，7min
反应条件：94°,2min—30cycles:94°,30S；55°,30S；68°,45S—68°,5min
2E6 Fab VL-CL的扩增引物序列和反应条件如下：
IgKC-R1：TGGGGTAGAAGTTGTTCA；
IgKC-R2：TGAGGCACCTCCAGATG；
2E6-IgKV-F1：ATTTAGCATGGTATCAGCAG
RT-PCR：
PCR
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种中东呼吸综合征冠状病毒抗体，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变结构域和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链可变结构域。
2.一种中东呼吸综合征冠状病毒抗体，其特征在于，其重链、轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID MO.3、SEQ ID NO.4所示。
3.一种含有权利要求1或2所述抗体的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，含有药物学上可接受的载体。
5.权利要求1或2所述抗体在制备用于检测、预防或治疗中东呼吸综合征的药物中的应用。
6.编码权利要求1或2所述抗体的基因。
7.携带权利要求6所述基因的转化体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |