CN114672474A - 一种ace2突变体及其突变方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)蛋白或其胞外段的突变体，其为ACE2胞外段的N端的锌离子依赖性活性位点中的一个或多个组氨酸(即，N端第345位点、第374位点、第378位点、第505位点的任意一个或多个位置处的组氨酸)突变为非极性氨基酸而获得的突变体。该突变体作为冠状病毒的诱饵蛋白，能够在细胞外发挥诱捕冠状病毒的作用，阻止病毒进入细胞；同时由于特定位点的突变从而无法降解血管紧张素II水平，进而避免ACE2或其胞外段大量快速升高所带来的同时伴有的RAAS紊乱和心肌纤维化等副作用。

Description

一种ACE2突变体及其突变方法和应用

技术领域

本发明涉及一种ACE2蛋白或其胞外段的突变体，以及该突变体在预防或治疗由冠状病毒引起的肺炎以及肺水肿、呼吸窘迫、脓毒血症甚至多器官衰竭发生中的应用，尤其是该突变体在对抗冠状病毒的同时，避免了ACE2或其胞外段大量快速升高所带来的同时伴有的RAAS紊乱、心肌纤维化等副作用。

背景技术

新型冠状病毒是正链RNA单链病毒，其表面的刺突蛋白(spike protein,SP)是一种含有180个氨基酸的糖蛋白，其结构域分为N端的S1与C端的S2。在弗林蛋白酶(furin)以及跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serines 2,TMPRSS2)的作用下，刺突蛋白中含有RBD(receptor binding domain,受体识别区，能够识别并结合人细胞膜表面ACE2)的S1段被剪切，S2段与细胞膜融合，从而介导病毒进入细胞⁽¹⁾。进入细胞后，SARS-CoV-2以正链为模板合成负链，并以新合成的负链为模板，大量合成转录相关蛋白所需的正链。最终病毒在细胞内完成蛋白与核酸的装配，裂解细胞并被释放出细胞外⁽²⁾。

作为SARS-CoV-2的特异性受体，ACE2可作为潜在靶点治疗冠状病毒导致的疾病。外源人重组可溶的ACE2(human recombinant soluble ACE2,hrsACE2)能够阻断病毒进入细胞⁽³⁾，抑制冠状病毒对人血管及肾脏类器官的感染⁽⁴⁾。外源人重组ACE2的安全性于2013年、2017年经过了临床Ⅰ期及Ⅱ评估⁽⁵⁾。健康人群对于外源人重组ACE2耐受良好，尽管其血液中Ang 1-8、Ang 1-7的浓度发生了改变，但是短期注射没有体现出对心血管的不良影响⁽⁶⁾。在临床上，Zoufaly团队首次使用hrsACE2治疗COVID患者：该患者为一名45岁的女性，具有轻微2型糖尿病史，进行过甲状腺切除，于发病7天后入院治疗，入院表现为发热(38.1℃)、血氧轻微降低(动脉血氧分压PaO2 56mm Hg)、胸部X光检测提示病毒感染。入院时即进行辅助通气及羟化氯喹(400mg一日两次)治疗；次日肺部磨玻璃样病灶加重，进行插管辅助通气；再次日进行静脉输入hrsACE2(0.4mg/kg,1日2次，持续7日)。静脉首次输入hrsACE2后几小时内，该患者发热消退；此后，该患者体内中和抗体浓度持续上升，病毒载量持续下降，并均在接受注射3次后达到稳定水平。对肾素-血管紧张素系统多种成分的监测显示，接受hrsACE2注射后，该患者体内AngⅡ的浓度降低，而降解产物Ang1-7、Ang 1-5、Ang 1-9的总含量升高。IL-6与IL-8是两种重要的炎症因子，在肺损伤、细胞因子风暴发生过程中发挥着重要的作用。在接受hrsACE2注射后，该患者体内IL-6、IL-8以及TNF-α的浓度均显著下降，而预示着肺损伤与炎症反应的生物标记物sRAGE(soluble advanced glycosylation endproduct-specific receptor,可溶性糖基化终末产物受体)与铁蛋白含量随之降低。从接受hrsACE2注射起21天，该患者体征稳定，并进行拔管；57天后该患者康复出院⁽⁷⁾。

已知七种能够感染人的冠状病毒中，有三种以ACE2作为受体进入细胞：HCoV-NL63^(8,9)、SARS-CoV⁽¹⁰⁾以及SARS-CoV-2；其余四种，HCoV-229E、HCoV-229E以APN(aminopeptidase N,氨肽酶N)为受体⁽¹¹⁾，MERS-CoV以DPP4(dipeptidyl peptidase 4,二肽基肽酶4)为受体⁽¹²⁾，而HCoV-OC43与HCoV-HKU1以9-O-乙酰基唾液酸(9-O-acetylatedsialic acid)为受体(Liu,D.X.,Liang,J.Q.,&Fung,T.S.,2020)。故而ACE2蛋白对现有的冠状病毒感染以及将来可能爆发的冠状病毒的防治具有重要意义。

ACE2的N端1-740氨基酸是冠状病毒入侵细胞所必需的刺突蛋白(spike protein,SP)与细胞膜结合的主要蛋白区段(其中包含K417、Y453、Q474、F486、Q498、T500、N501等7个核心结合位点)^(13,14)。本发明涉及到的ACE2蛋白或其胞外段的突变体包含并保留了病毒和ACE2报道的全部结合位点，从而保持了ACE2对病毒的高亲和力，使得游离的ACE2蛋白或其胞外段的突变体能够在细胞外发挥诱捕病毒的作用，阻止病毒进入细胞内，并且由于特定位点的突变从而不会降解血管紧张素II的水平，进而避免ACE2大量快速升高所带来的同时伴有的RAAS紊乱和心肌纤维化等副作用。

ACE2除了作为冠状病毒的诱饵之外，它具有独特的生理与病生理作用，在急性呼吸窘迫、肾损伤等多种病理状态下均体现出了保护作用。但是，过量表达ACE2或ACE2水平的快速升高会产生严重的负面影响，例如对心脏组织具有严重的负面影响。作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone System，RAAS)重要的负性调控因子，ACE2将胞外或血液中的血管紧张素II降解为血管紧张素1-7，在血压和血糖调节中发挥重要作用⁽²¹⁾。大量注射ACE2至血液中，很有可能造成病人血压和血糖的紊乱。更重要地，小鼠心脏过表达ACE2会导致严重的心肌纤维化⁽²²⁾，伴随着心脏破裂的风险^(23,24)。这些严重的副作用，是ACE2临床应用的严重障碍，也业内所关心的且不希望其正负面作用共存的一个问题，至今没有解决渠道。

发明内容

本发明的目的是公开了ACE2蛋白或其胞外段的突变体，以及所述突变体的新用途，具体是在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染疾病的药物中的用途。冠状病毒感染最常见的后果是引起急性非典型性肺炎。患者出现发热、干咳、乏力、嗅觉味觉减退，冠状病毒感染严重者会出现肺部感染、炎症风暴，甚至肺部纤维化，还可能引起心脏、肾脏的急性损伤。本发明所述的突变体既能预防和/或治疗冠状病毒的感染，也能预防和/或治疗冠状病毒引起的肺炎以及一系列冠状病毒所致并发症，同时降低该治疗过程中所带来的副作用。

本发明提供一种ACE2蛋白或其胞外段的突变体，该突变体是野生型ACE2蛋白或其胞外段的N端的锌离子依赖的活性位点的任一个或多个组氨酸突变为非极性氨基酸(例如亮氨酸)的突变体。该突变体在对抗冠状病毒感染的同时，避免了野生型ACE2或其胞外段所带来的同时伴有的降解血管紧张素II以及心肌纤维化等副作用。

野生型ACE2蛋白能够对抗冠状病毒的浸染，也就是说可以通过增加循环或外界环境中的ACE2的含量保护人们免受病毒的感染，其中，所述ACE2蛋白主要通过其胞外段与病毒结合。但文献显示，ACE2含量的增加在对抗冠状病毒的同时，会引起血管紧张素II的降解，和血管紧张素1-7的积累。过多的血管紧张素1-7会加重心肌纤维化的进程，导致心脏破裂。也就是说ACE2在抑制冠状病毒感染的同时，伴有RAAS紊乱以及心肌纤维化等副作用。为促进ACE2蛋白在抗击冠状病毒中能进一步去劣存优，本发明人进行大量的科研工作，最主要目的是对ACE2蛋白进一步突变，希望能在不引起RAAS紊乱以及心肌纤维化等前提下，使突变体保留行使对抗冠状病毒感染的作用，但不伴随相应的副作用。

本发明提供了一种野生型ACE2蛋白或其胞外段的突变体，该突变体为在野生型ACE2蛋白或其胞外段的N端的锌离子依赖的活性位点4个组氨酸中的任一个或多个组氨酸突变为非极性氨基酸的突变体；该4个组氨酸分别是ACE2锌离子依赖的活性位点的第345位点、第374位点、第378位点、第505位点。

上述这4个组氨酸都处于ACE2蛋白的胞外段且是ACE2蛋白活性的重要氨基酸结构，同时不属于冠状病毒与ACE2的必需结合位点。因此，上述突变位点不影响ACE2或其胞外段与病毒结合。而锌离子依赖的活化区域是其行使降解血管紧张素II，生成血管紧张素1-7所必需的，这4个组氨酸位点也可能与ACE2引起心脏纤维化和心脏破裂等副作用有关，因此发明人选择了这4个组氨酸作为研究对象。

本发明提供的上述野生型ACE2蛋白或其胞外段的突变体在对抗冠状病毒的入侵的同时，不会同时降低血管紧张素II的水平，进而避免ACE2所带来的同时伴有的RAAS紊乱和心肌纤维化等副作用，且抗病毒作用却不受任何影响。

上述突变体中，所述的非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、或蛋氨酸。优选地，非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。最优选地，该非极性氨基酸为亮氨酸。

当上述突变体中非极性氨基酸为亮氨酸时，所述突变体选自ACE2H345L、ACE2H374L、ACE2H378L、ACE2H505L中的任一。

具体地，本发明人经过研究首先证明了：游离的ACE2蛋白对于新型冠状病毒具有高亲和力，能够在体外结合SARS-Cov-2假病毒，减少病毒颗粒进入离体肺上皮细胞(BEAS-2B)；在细胞表面上过表达全长ACE2可致使更多的刺突蛋白进入细胞，而病毒刺突蛋白无法进入无ACE2表达的细胞(图1和图2)，以上结果说明ACE2蛋白是SARS-Cov2进入细胞必需的膜蛋白，其对于新型冠状病毒具有高亲和力，增加细胞外游离的ACE2可阻止病毒进入细胞内，减少SARS-Cov-2对肺上皮细胞的结合和侵入。

随后，本发明人发现：在ACE2蛋白或其胞外段的H345、H374、H378和H505位点进行突变并不影响其与新型冠状病毒的结合亲和力。结果如图6所示，说明上述位点的突变并不影响其与病毒的结合，突变体依然保持与SARS-CoV-2结合的高亲和力。根据上述实验结果，由于ACE2突变体保持了与SARS-CoV-2结合的高亲和力，我们可以推测细胞外的游离ACE2突变体同样可以阻止病毒进入细胞内，减少SARS-Cov-2对肺上皮细胞的结合和侵入。

接下来，本发明人在293T细胞中过表达ACE2及所述突变体蛋白，观察血管紧张素II的水平。结果显示，使用质粒过表达ACE2及其突变体后孵育细胞和1μg/ml血管紧张素II，发现ACE2野生蛋白可显著降解血管紧张素II，而所述突变体则不会降解血管紧张素II(图3)。说明了本发明所述的突变体可消除ACE2对RAAS的调控，从而避免RAAS紊乱以及心肌纤维化等副作用。

已知七种能够感染人的冠状病毒中，有三种以ACE2作为受体进入细胞：HCoV-NL63、SARS-CoV以及SARS-CoV-2；其余四种，HCoV-229E、MERS-CoV、HCoV-OC43与HCoV-HKU1也有报道与ACE2具有高的亲和力(Liu,D.X.,Liang,J.Q.,&Fung,T.S.,2020)。故而从理论上讲，ACE2蛋白对现有的冠状病毒感染以及将来可能爆发的冠状病毒，均具有一定程度的防治效果。

为了验证ACE2对心肌纤维化的作用，本发明人在AC16人心肌成纤维细胞和新生大鼠心肌成纤维细胞中过表达ACE2及所述突变体蛋白。结果显示，野生型ACE2过表达可显著增加纤维化层纤连蛋白和胶原蛋白I的表达。在血管紧张素II和血管紧张肽1-7刺激下，ACE2过表达可进一步显著促进纤维细胞纤维化(图4A和4B)。然而，过表达ACE2突变体则不引起纤维化层纤连蛋白和胶原蛋白I的表达增加，即消除野生型ACE2过载导致心肌纤维化的副作用(图4C)。

本发明人使用新冠刺突蛋白鼻部滴注方法诱导小鼠产生肺部早期病变，包括细胞间隙变窄、肺泡水肿、炎症浸润及肺部损伤等。而使用ACE2及ACE2突变体蛋白预处理小鼠10分钟之后，在鼻部滴注刺突蛋白，可以观察到小鼠的肺部损伤显著减弱(图5)。

本发明人使用新型冠状病毒不同突变株的刺突蛋白核心结合域(RBD)，来验证ACE2及其突变体对新型冠状病毒不同突变株进入人肺上皮细胞(BEAS-2B)的保护作用。结果显示，ACE2突变体可以显著抑制新型冠状病毒野生型刺突蛋白RBD、β突变株RBD、δ突变株RBD以及omicron突变株RBD进入细胞，其抑制能力与野生型ACE2的抑制作用相当(图6)。

至此，本发明的一个方面涉及野生型ACE2蛋白或其胞外段的突变体蛋白在制备用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病的药物中的用途，且同时可消除ACE2对RAAS的调控，避免副作用。其中所说的疾病包括冠状病毒感染所导致的肺炎以及相应并发症。

本发明另一方面涉及用于预防和/或治疗冠状病毒诱导疾病的药物，它包括作为活性成分的上述突变体蛋白以及药用的赋型剂或载体。

作为一种预防和/或治疗冠状病毒感染的药物，本发明所述的突变体可以从两个方面应用于临床。在预防方面，可将所述突变体涂布在口罩或者空气净化器滤芯中，减少高风险环境中人吸入病毒的含量；或可使用所述突变体对高危人员进行注射，进行暴露前阻断。在治疗方面，由于冠状病毒必须进入细胞才能发挥感染人的作用。因而，对冠状病毒感染的病人(尤其是COVID-19)注射所述突变体，能够显著降低病毒入侵肺上皮细胞，从而减轻肺水肿、呼吸窘迫、脓毒血症甚至多器官衰竭发生的程度或可能性，发挥治疗作用，并且同时降低治疗过程中RAAS紊乱和心肌纤维化等副作用。

综上，本发明涉及以下实施方案：

1.ACE2蛋白或其胞外段的突变体，其特征在于，其是将野生型ACE2蛋白或其胞外段的N端第345位点、第374位点、第378位点、第505位点的任意一个或多个位置处的氨基酸置换为非极性氨基酸而获得的突变体。

2.根据项目1所述的突变体，其中，所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸；优选为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。

3.根据项目1所述的突变体，其中，所述非极性氨基酸为亮氨酸；优选地，所述突变体选自ACE2H345L、ACE2H374L、ACE2H378L、ACE2H505L中的任意一种、多种或其任意组合。

4.含有项目1-3中任一项所述的突变体作为活性成分的药物，优选地，所述药物还包括药用赋形剂或载体；更优选地，所述药物为注射剂、吸入剂、鼻滴剂等的形式。

5.含有项目1-3中任一项所述的突变体的产品；优选地，所述产品为口罩或空气净化器滤芯；更优选地，所述突变体涂布在口罩或空气净化器滤芯中。

6.ACE2蛋白或其胞外段的突变体在制备用于预防和治疗冠状病毒及其突变株感染性疾病的产品或药物中的用途。

7.根据项目6所述的用途，其中，所述突变体是将野生型ACE2蛋白或其胞外段的N端第345位点、第374位点、第378位点、第505位点的任意一个或多个位置处的氨基酸置换为非极性氨基酸而获得的突变体。

8.根据项目6所述的用途，其中，所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸。

9.根据项目6所述的用途，其中，所述非极性氨基酸为亮氨酸；优选地，所述突变体选自ACE2H345L、ACE2H374L、ACE2H378L、ACE2H505L中的任意一种、多种或其任意组合。

10.根据项目6所述的用途，其中，所述产品或药物是注射剂的形式，优选将所述产品或药物注射到处于冠状病毒感染风险的受试者或患有冠状病毒感染的受试者中。

11.根据项目6所述的用途，其中，所述冠状病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、MERS-CoV、HCoV-OC43或HCoV-HKU1；优选地，所述冠状病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV、SARS-CoV-2；更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

本发明的技术效果

本发明所述ACE2蛋白或其胞外段的突变体包含了ACE2的与冠状病毒结合的全部结合位点，从而保留了对病毒的高亲和力，使得游离的ACE2蛋白或其胞外段的突变体在细胞外发挥诱捕冠状病毒的作用，阻止病毒进入细胞内，并且由于特定位点的突变从而不会降解血管紧张素II的水平，进而避免ACE2或其胞外段大量快速升高所带来的同时伴有的RAAS紊乱和心肌纤维化等副作用。

定义

在本发明中，所述“ACE2蛋白”是指野生型ACE2蛋白，在本发明中一般指灵长类动物的ACE2蛋白，优选为人ACE2蛋白。现有技术中关于ACE2蛋白的结构和序列以及其功能均有描述，具体如下：人ACE2全长蛋白结构详见文献(Wang Q,Cell,2020.Yan R,Science,2020.Lan J.Nature.2020.)。全长ACE2的氨基酸序列详见pubmed网站信息：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q9BYF1.2.

在本发明中，所述“ACE2蛋白胞外段”是指从全长ACE2的N端开始，第1-740位的连续氨基酸，即为ACE2胞外段。本文中使用的ACE2胞外段，更具体指的是N端1-615位，具有亲和能力、可与刺突蛋白结合的连续氨基酸。

在本发明中，所述“冠状病毒”包括HCoV-NL63、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、MERS-CoV、HCoV-OC43或HCoV-HKU1；优选地，所述冠状病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV、SARS-CoV-2；更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

附图说明

图1：SARS-Cov2进入细胞依赖于细胞膜上的ACE2蛋白；

图2：孵育ACE2胞外段对SARS-Cov-2假病毒进入人肺上皮细胞的抑制作用；

图3：ACE2突变体消除ACE2对血管紧张素II的降解；

图4：四位点突变体消除ACE2诱导心肌纤维化的作用；

图5：人重组ACE2及ACE2突变体蛋白显著缓解新冠症状；

图6：人重组ACE2突变体蛋白抑制病毒刺突蛋白进入细胞。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。

试剂和材料：人肺上皮细胞和HEK293细胞购自协和细胞库，细胞培养液和胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司(Scientific Thermo Fisher Corp.)。SARS-Cov-2刺突蛋白RBD段(携带mFc标签，mFc:在c端表达小鼠IgG1的Fc区域)与假病毒购自北京义翘神州科技有限公司(40592-V05H)。如无特别说明，其他化学试剂均来自Sigma-Aldrich公司。

质粒构建：

(1).先设计引物，使上下游引物包含ACE2的外显子编码区段；

(2).以引物(Forward5’-GGGATCAGAGATCGGAAGAAGAAA-3’(SEQ ID NO:1),Reverse5’-AGGAGGTCTGAACATCATCAGTG-3’(SEQ ID NO:2))对应ACE2胞外段序列作为模板，使用DNA聚合酶，用特异性突变引物进行PCR反应扩增，退火温度为55℃，35个循环，反应产物使用琼脂糖凝胶进行鉴定；

(3).利用DpnⅠ进行酶切反应处理PCR产物；

(4).转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，融解感受态TOP10，加入处理后的PCR产物，冰上孵育，加入LB，孵育，涂氨苄抗性LB平板，培养，挑取平板上的单菌落，DNA测序，检测得突变结果为阳性，即是构建ACE2胞外段表达载体成功。

根据类似的方法，构建获得刺突蛋白或ACE2蛋白或胞外段的突变体的表达载体。

改造方法与定点突变：

本发明的ACE2蛋白胞外段突变体的改造可使用市售可得到的北京全式金公司的Easy Mutagenesis System(试剂盒)，该试剂盒的说明书对于突变改造方法和步骤均有详细的说明记载，获得了ACE2H345L、ACE2H374L、ACE2H378L、ACE2H505L突变体。

蛋白纯化的方法：

(1).使用1mg/ml上述获得的表达刺突蛋白或ACE2胞外段或ACE2突变体的质粒转染HEK293细胞(协和细胞库)；

(2).离心收集蛋白上清，垂直离心机中2000rpm 4℃离心15min，转速至4000rpm 4℃离心15min，将上清收集至干净并用wash buffer批量分装至离心管中，8000rpm 4℃离心10min，收集上清备用(1L的菌液分装配平离心一共预计需要2-2.5小时)；

(3).过滤除杂：将0.22um的过滤器用超纯水清洗2-3遍，用wash buffer润洗过滤器，过滤(1)中备好的蛋白上清，向过滤好的蛋白上清按照1:1000的比例添加蛋白酶抑制剂(1L的菌液根据细胞状态，上清过滤所需时间会受到影响，本步骤可与1交叉进行，约需要1-2小时)；

(4).预处理Ni resin：按照10mg/ml的附载量计算所需要的resin→取所需量的Niresin于重力柱中→millionQ水洗5-10个柱体积→binding buffer清洗5个柱体积2次；

(5).结合：将(4)中处理好的resin转移至(3)中处理好的蛋白上清中于4℃层析柜中的摇床上结合1小时(或者过夜结合)；

(6)预处理超滤管：取10KDa的超滤管→倒掉管中的保存液→用millionQ水4000rpm 4℃离心5min重复操作2-3遍，用binding buffer 4000rpm 4℃离心5min重复操作2-3遍备用(本步骤可与步骤5交叉进行，约需30min)

(7)柱纯化：将结合好的蛋白上清流穿2-3遍，wash buffer流穿5-10个柱体积，Elute buffer洗脱3mlX4次，收集洗脱液与6中备好的超滤管，4℃4000rpm离心至500ul；

(8).所得蛋白即为目的蛋白，分装液氮速冻，-80℃存放。

假病毒粒子的包装：

(1).转染前一天，传HEK293细胞(购自协和细胞库)至10cm培养皿，细胞数为2×10^6个/10ml DMEM/10％FBS

(2).用10ug的pNL-Luc-R+Env-和10ug的pSV7d-Env(包含SARS-Cov-2的刺突蛋白编码)两种质粒(均购买自北京微旋基因技术有限公司)共转染293细胞。转染前纯化质粒，用乙醇沉淀质粒再用450ul去离子水重悬这两种质粒，加入70ul的2.0mol/L CaCl₂，再逐滴加入500u1的2×HBS，冰上静置30min，逐滴加人293细胞中；

(3).转染24小时后换培养基；

(4).转染48小时后收上清，用0.45um的滤膜过滤细胞沉淀；

(5).分装成l ml小管，80℃保存，取少量检测p24蛋白含量或逆转录酶含量。

细胞培养方法：细胞使用90％基础培养液和10％血清作为完全培养液培养细胞，待细胞密度达到80-90％，加入一定浓度合成的ACE2蛋白或SARS-Cov-2假病毒或SARS-Cov-2刺突蛋白RBD，孵育一定时间后，观察病毒组分进入细胞的情况。

实施例1：SARS-Cov-2刺突蛋白RBD进入细胞依赖于细胞膜上的ACE2蛋白

培养细胞(HEK293T，人肾胚细胞系，购自协和细胞库)密度至60-80％，血清组分占总体积的10％；

转染空载质粒(对照)或过表达ACE2的质粒(该质粒的构建方法参见“质粒构建”部分)；

转染后加入1ug/ml重组的SARS-Cov-2刺突蛋白RBD(购自北京义翘神州科技有限公司，40592-V05H)，孵育细胞6小时；

使用免疫印迹法，观察SARS-Cov-2刺突蛋白进入细胞的情况；

结果显示，SARS-Cov-2刺突蛋白RBD可显著进入过表达ACE2的细胞，但不能进入无ACE2表达的HEK293T细胞(如图1所示)。以上结果提示，ACE2的表达是新型冠状病毒入侵细胞必须的膜蛋白，即ACE2或其胞外段对新型冠状病毒具有高亲和力，因此外源性添加ACE2的胞外段而非全长ACE2，可以发挥抑制新型冠状病毒入侵的作用。

实施例2：孵育ACE2胞外段对SARS-Cov2假病毒进入人肺上皮细胞的抑制作用

培养细胞(293T与BEAS-2B人肺上皮细胞，购自协和细胞库)密度至60-80％；

向培养液中添加SARS-Cov-2假病毒(1*10^-6pfu/L)(北京义翘神州科技有限公司)，血清组分占总体积的10％；

在添加SARS-Cov-2假病毒的同时，加入0、0.25、1μg/ml的ACE2胞外段蛋白(该蛋白的构建在方法中有具体描述)，与假病毒共同孵育细胞；

孵育细胞6小时后，使用荧光素酶检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司,SY0058)，观察在不同浓度的胞外段ACE2的孵育下，细胞内荧光越强，就意味着SARS-Cov-2假病毒进入细胞越多；

结果显示培养细胞时在细胞培养液中添加游离的ACE2胞外段蛋白，可显著抑制SARS-Cov-2假病毒进入BEAS-2B细胞，且ACE2胞外段浓度越高，抑制效应越明显，且病毒颗粒无法进入无ACE2表达的293T细胞(如图2所示)，结果说明ACE2胞外段蛋白对SARS-Cov-2病毒具有高亲和力，可有效的抑制SARS-Cov-2病毒进入人肺上皮细胞。

实施例3：ACE2突变体消除ACE2对血管紧张素II的降解；

培养细胞(293T细胞，购自协和细胞库)密度至60-80％；

向培养液中转染或不转染过表达野生型ACE2蛋白或突变型ACE2的质粒(质粒的构建方法参见“质粒构建”部分)，血清组分占总体积的10％；

在转染质粒48小时后，加入1ng/ml重组的血管紧张素II(promocell)，孵育细胞12小时；

孵育细胞12小时后，获得细胞上清，使用血管紧张素II的ELISA试剂盒(购自Raybiotech，ELA-ANGII-1)，测量培养液上清中的血管紧张素II的浓度；

结果显示过表达ACE2的细胞可显著降低培养液血管紧张素II的水平，而突变体ACE2 H345N、ACE2 H374L、ACE2 H378L和ACE2 H505N及多位点突变可抵消ACE2对血管紧张素II的降解，并抑制血管紧张素1-7(Ang1-7)的积累(如图3所示)，表达结果说明，单位点、双位点和四位点ACE2突变体均可有效消除ACE2对RAAS的调控作用，进而避免RAAS紊乱和心肌纤维化等副作用。

实施例4：四位点突变消除野生型ACE2诱导的心脏细胞纤维化；

培养人心肌细胞系AC16(购自美国ATCC细胞库)、原代新生大鼠成纤维细胞(Neonatal Rat Fibroblast,取自新生大鼠心脏)密度至60-80％；

向培养液中转染或不转染过表达野生型ACE2或突变型ACE2的质粒(质粒的构建方法参见“质粒构建”部分)，血清组分占总体积的10％；

在转染质粒的同时，添加1ng/ml血管紧张素II(AngII)或血管紧张肽1-7(Ang1-7)(sigma aldrich)孵育细胞；

孵育细胞48小时后，使用免疫印迹法，观察纤连蛋白(fibronectin)和胶原蛋白(collagen)1a的表达情况。

结果显示在细胞表面过表达ACE2可显著促进人和大鼠心脏细胞纤维化蛋白的表达，而四位点突变则不引起这些蛋白的表达增加，完全反转野生型ACE2促纤维化的作用(如图4所示)，即，体外实验表明ACE2突变体可减轻或消除ACE2导致的心脏副作用(单位点突变可减轻ACE2导致的心脏副作用，四位点突变可消除ACE2导致的心脏副作用)。

实施例5：人重组ACE2及ACE2突变体蛋白显著缓解新冠症状；

使用人重组野生型或ACE2突变体，100μg/只尾静脉注射(蛋白纯化方法参加“蛋白纯化”部分)，观察5-10分钟；

向Balb/C小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)鼻腔滴注1mg/ml新型冠状病毒刺突蛋白50μg/只，观察小鼠24小时；

24小时后取材，小鼠肺部使用多聚甲醛包埋，石蜡切片观察肺部组织形态，使用马松染色观察肺部纤维化情况。

结果如图5所示，显示小鼠鼻腔滴注新型冠状病毒刺突蛋白24小时，可出现严重的肺部水肿、炎症浸润和纤维化，而提前注射ACE2及其突变体均可显著缓解刺突蛋白导致的肺部损伤，即在体实验表明，ACE2的突变不影响ACE2对新型冠状病毒感染引起的相关肺部损伤的保护作用。

实施例6：人重组ACE2突变体蛋白抑制病毒刺突蛋白进入细胞；

培养细胞(BEAS-2B细胞，购自美国ATCC细胞库)密度至60-80％；

向培养液添加1ug/ml的野生型ACE2或突变型ACE2重组蛋白(蛋白纯化的方法参见“蛋白纯化”部分)，N端1-76位(76aa)以及N端1-360位(360aa)的短肽当作实验阴性对照，血清组分占总体积的10％；

孵育ACE2蛋白10分钟后，添加1μg/ml SARS-Cov-2的刺突蛋白RBD(北京义翘神州科技有限公司)孵育细胞；

孵育细胞2小时后，使用免疫印迹法，观察SARS-Cov-2刺突蛋白进入细胞的情况；

结果如图6所示，显示ACE2及其突变体(即ACE2H345L、ACE2H374L、ACE2H378L、ACE2H505L四位点同时突变)可以显著抑制野生型新冠刺突蛋白RBD、β突变株RBD、δ突变株RBD以及omicron突变株RBD进入细胞(如图6所示)，即，体外实验表明，ACE2的突变不影响病毒刺突蛋白与ACE2结合，仍然保留与病毒的高亲和力，不影响ACE2抵抗病毒入侵细胞的保护作用。

经实验证实，游离的ACE2胞外段可高亲和力结合SARS-Cov-2病毒，从而抑制SARS-Cov-2假病毒和SARS-Cov-2刺突蛋白进入哺乳动物细胞。并且，对ACE2蛋白或其胞外段的特定位点进行突变并不影响其与冠状病毒的结合能力。所以，所述突变体与野生ACE2蛋白一样，可帮助机体免除冠状病毒的入侵，同时还可以消除ACE2对血管紧张素II的调控。本发明可应用于基础科研，并向生物产品和药物的应用转化。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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Claims (11)

1.ACE2蛋白或其胞外段的突变体，其特征在于，其是将野生型ACE2蛋白或其胞外段的N端第345位点、第374位点、第378位点、第505位点的任意一个或多个位置处的氨基酸置换为非极性氨基酸而获得的突变体。

2.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸；优选为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。

3.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述非极性氨基酸为亮氨酸；优选地，所述突变体选自ACE2H345L、ACE2H374L、ACE2H378L、ACE2H505L中的任意一种、多种或其任意组合。

4.含有权利要求1-3中任一项所述的突变体作为活性成分的药物，优选地，所述药物还包括药用赋形剂或载体；更优选地，所述药物为注射剂、吸入剂、鼻滴剂等的形式。

5.含有权利要求1-3中任一项所述的突变体的产品；优选地，所述产品为口罩或空气净化器滤芯；更优选地，所述突变体涂布在口罩或空气净化器滤芯中。

6.ACE2蛋白或其胞外段的突变体在制备用于预防和治疗冠状病毒及其突变株感染性疾病的产品或药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述突变体是将野生型ACE2蛋白或其胞外段的N端第345位点、第374位点、第378位点、第505位点的任意一个或多个位置处的氨基酸置换为非极性氨基酸而获得的突变体。

8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸。

9.根据权利要求6所述的用途，其中，所述非极性氨基酸为亮氨酸；优选地，所述突变体选自ACE2H345L、ACE2H374L、ACE2H378L、ACE2H505L中的任意一种、多种或其任意组合。

10.根据权利要求6所述的用途，其中，所述产品或药物是注射剂的形式，优选将所述产品或药物注射到处于冠状病毒感染风险的受试者或患有冠状病毒感染的受试者中。

11.根据权利要求6所述的用途，其中，所述冠状病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、MERS-CoV、HCoV-OC43或HCoV-HKU1；优选地，所述冠状病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV、SARS-CoV-2；更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

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