CN101330931B - 制备缀合物 - Google Patents

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Abstract

将第一化学本体与第二化学本体反应以生成缀合物的方法，其中所述第一和第二化学本体彼此共价结合，所述方法包括将第一化学本体、第二化学本体和硫醇生成剂同时接触，其中硫醇生成剂在硫醇化反应中与第一化学本体反应，在第一化学本体上形成游离巯基，并且游离巯基与第二化学本体反应以形成缀合物，其中第二化学本体在其与巯基的反应性方面是多价的。本发明与现有技术的主要区别在于，在硫醇生成剂和第一化学本体的反应与第二化学本体的反应之间不涉及分离步骤。本发明还提供了缀合试剂盒。

Description

制备缀合物
发明领域
本发明涉及缀合物的制备，并且涉及方法以及用于进行该方法的试剂盒。
发明背景
缀合物广泛应用于生物科学研究、诊断和医学中。在最简单的情况下，缀合物呈这样的形式，第一化学本体(A)，通常是分子与第二化学本体(B)例如标记分子连接，以形成AB杂合体。由式AjBk代表的寡聚形式也是可能的，其中j和k是整数。缀合物通常是为了特定目的而设计，并且经常涉及天然不存在的新的材料组合。通常，缀合物的一个成分能够与其他分子(例如抗原)相互作用，例如该成分是抗体，而第二个成分加入一些其他有用性质(例如可测定性、杀死癌细胞的能力)，例如第二个成分是标记物。
本发明的缀合物可以包含本体的组合，其中A和/或B可以包含下列之一：抗体、抗体片段、核酸、珠子、聚合物、脂质体、碳水化合物、荧光蛋白和染料、肽、放射性核素、毒素、金颗粒、链霉抗生物素蛋白、生物素、酶、螯合剂、半抗原、药物和很多其他分子。该目录包括数量巨大的分子排列，因此缀合物中可能组合的数目几乎是无限的。由此断定，有相当的范围来产生具有不寻常或独特性质的新杂合分子。
免疫缀合物的最重要应用之一是定量测定和/或检测经常存在于表面上的抗原。例如，在western印迹应用中，将抗原固定在硝化纤维素片上；在酶联免疫吸附测定测定(ELISA)中，将抗原吸附在聚苯乙烯板上；在免疫组织化学中，将抗原与很多其他蛋白一起包埋在薄的组织切片内，所述组织切片连接在载玻片上。虽然这些技术在其中抗原呈现于缀合物上的方法方面是基本不同的，但是检测方法的选择基本上是相同的。主要有两种类型。对于直接检测，将‘第一’抗体(即与抗原结合的抗体)与标记物缀合，所述标记物可用合适的测定装置来测定。对于间接检测，将标记物经由结合主要抗体的辅助试剂引入。辅助试剂最经常是抗体缀合物，其包含与标记物缀合的第二抗体。存在更复杂的检测策略，但是每一这些策略通常是上述两种方案之一的变型。
对于间接方法，一定范围的未标记的第一抗体可以使用一种辅助试剂，这是及其方便的，虽然与直接方法相比，需要更多的培养和洗涤步骤是主要缺点。第二抗体与固定的抗原有可能发生不需要的交联反应。虽然直接检测方法在速度、成本和数据质量方面有显著优点，但是目前间接方法占主导地位。对于该事实的解释是，大部分第一抗体仅以未标记的形式商购获得。此外，这些试剂很昂贵，并且不能由研究人员以能够容许使用目前标记技术成本有效生成标记缀合物的量购得。
为了产生缀合物，一般使用含有两个反应性基团的双官能试剂来连接两个目标分子。双官能试剂上的反应性基团在官能度上是相同的(‘同双官能’)或在官能度上是不同的(‘异双官能’)。同双官能试剂的同双官能试剂的最有名的实例是戊二醛，其与胺(酰肼)反应。因为大部分生物分子含有多个胺，所以使用戊二醛通常导致形成高分子量缀合物。此外，可随着时间显著改变的戊二醛溶液的聚合性质意味着用戊二醛制备的缀合物通常相当难以再现。
在缀合物制备中异双官能试剂通常是优选的，因为他们容许操作人员在缀合过程中施加较高程度的控制。通常的异双官能缀合物策略涉及经由异双官能试剂(X-Y)将一个分子(B)上的胺基团与另一个分子(A)上的游离硫醇(SH)偶联，所述异双官能试剂(X-Y)具有胺反应性部分(X)何巯基反应性部分(Y)。‘间隔基团’经常分隔异双官能试剂的反应性部分；有很多具有不同间隔基团结构，但是具有基本上相同化学反应性的异双官能试剂。
通常，将欲缀合的一个生物分子(B)经由胺基团与异双官能试剂的X官能团反应，生成B-Y衍生物。然后除去过量异双官能试剂，并且将纯化的B-Y与另一个分子(A)上的巯基反应。X通常是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，而Y可以是几种部分之一。Y可以整合成或者不整合成最终的AB缀合物。衍生自A的巯基几乎总是作为稳定的硫醚键或者作为A与B之间的可逆性(可还原的)二硫化物桥的一半引入的。Y可以是巯基反应性官能团，包括：马来酰亚胺、环氧化物、碘乙酰基、溴乙酰基、吡啶二硫醇、甲硫代磺酸酯等。
胺与巯基反应性异双官能试剂的实例包括：N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)；具有延长的间隔基团(LC-SPDP；LC＝‘长链’)和磺基以提高水溶解性的SPDP的变型(磺基-LC-SPDP)；琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)；磺基-LC-SMPT；琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)；磺基-SMCC；m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；磺基-MBS；N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)；磺基-SIAB；琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMBP)；磺基-SMBP；N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)；磺基-GMBS；琥珀酰亚胺基-6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)；及其延长的间隔基团形式SIAXX；琥珀酰亚胺基4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(SIAC)；及其延长的间隔基团形式(SIACX)；碘乙酸对硝基苯酯(NPIA)。有很多其他相关实例，例如羰基和巯基反应性连接物，β-马来酰亚胺基丙酸酰肼(BMPH)。
A上的巯基可以是固有的。然而，更通常地，不存在巯基，并且需要在缀合步骤之前通过硫醇化(thiolation)反应来引入。对于抗体，硫醇基团可以通过还原剂(例如MEA或二硫苏糖醇(DTT))来产生，所述还原剂在抗体分子的不同位置上打破二硫化物桥。或者，可以修饰由于其他官能团(通常是胺)而已知的技术以引入游离硫醇或保护的巯基，保护的巯基之后可通过用还原剂处理来脱保护，以产生硫醇化产物(即A-SH)。在已知的常规技术中，在与B-Y缀合之前，至少需要一个分离步骤来分离从未反应的硫醇化试剂，以及包含将竞争与B-Y缀合的游离硫醇的任何副产物以及将与A-SH竞争缀合B-Y的还原剂中分离出所需硫醇化产物。通过技术，包括在色谱柱上脱盐、凝胶过滤、透析或洗涤，来进行分离。该分离步骤不可避免地导致材料的损失和稀释。由于分离步骤的冗长性质和/或需要大量A，所以硫醇化步骤不可能彻底优化。
例如，2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)(2IT)，还称为Traut’s试剂(Traut等人，Biochemistry 12，3266-3273，1973)之前已经被用于将SH引入蛋白内，特别是抗体内。试剂与第一胺(例如存在于赖氨酸上)反应，并且在开环反应中产生末端巯基。除去过量Traut’s试剂，一般通过脱盐来除去，然后将所得硫醇化分子与另一分子上的硫醇反应性基团缀合。虽然在有关生物缀合化学的综合著作(例如BioconjugateTechniques；G.T Hermanson，Academic Press 1996)中没有提及，但是2IT还进行第二反应，其中新生硫醇进行分子内反应以形成非反应性硫代酯(Bartlett & Busch.，Biol.Mass Spectrom.23，353-356，1994；Singh等人，Anal.Biochem.236，114-125，1996)。从Traut’s试剂的已知化学中可以清楚地看出，硫醇化反应的持续时间对于随后缀合步骤的成功是至关重要的，并且需要脱盐或其他分离步骤来迅速完成。
在具有工程化分子以含有硫醇反应性官能团的缀合物生产中，2IT的现有技术常规应用采用过量2IT，然后脱盐、透析或洗涤步骤。这种方法是由2IT的供应商推荐的(例如Pierce technical bulletin 0414；product 26101)，并且产品用于制备生物缀合物(例如Prozyme TechNote#TNPJ300)。描述该方法的其他出版物包括：US专利6962703、6936701、6669938、6010902、5869045、5164311；Stanisic等人，Infection andImmunity 71，5700-5713，2003；Mandler等人，Journal of the NationalCancer Institute，92，1573-1581，2000；Huwyler等人，Proc Natl AcadSci 93，14164-14169，1996。
提出了一种可能有希望的解决脱盐问题的方法(Haughland.Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，6th edition，Molecular Probes，p49)，其包括通过TCEP(三(2-羧基乙基)膦)还原被保护的巯基。虽然提出除去TCEP不是必须的，但是其不影响随后的缀合步骤，Getz等人(Anal Biochem 273，73-80，1999)表明了缀合反应中TCEP的显著干扰。此外，Shafer等人(Anal Biochem 282，161-164，2000)报道，TCEP与巯基反应性马来酰亚胺和碘乙酰基迅速合并。此外，生物缀合反应通常在磷酸盐缓冲液中于pH 7-8进行，在该条件下TCEP是不稳定的(Han & Han，Anal Biochem 220，5-10，1994)。TCEP在与大部分生物分子不相容的极端PH下是非常稳定的(例如在100mMHCl或100mM NaOH中)。虽然TCEP已经发现一些niche应用，但是其严格限制已经保证用于制备生物缀合物的优选方法改变很小，因为其在1992年可以商购获得。TCEP不含有硫原子，因此，对于本发明目的，其不被视为“硫醇生成剂”。
McCall等人(1990Bioconjugate Chem.1，222-226)公开了用于使用2IT将大环螯合剂与抗体缀合的一步方法。他们具体使用2IT来连接6-[对(溴乙酰氨基)苄基]-1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N1，N11，N111-四乙酸，缩写为BAT，或类似化合物2-[对(溴乙酰氨基)苄基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N1N11，N111-四乙酸(缩写为BAD)与小鼠抗体。BAT/BAD试剂在巯基反应性基团方面是单价的，即每个分子只有一个基团能够与巯基反应。McCall等人提出，其中公开的“一步”法仅适用于特定BAT/BAD试剂(“因为在弱碱性条件下生物乙酰胺与巯基迅速反应，但是与氨基仅缓慢反应，BAT和2IT溶液能够在反应混合物中合并”)。没有人提出该技术一般是可以应用的，并且商业上使用的标准方法保留了具有插入的脱盐、纯化或洗涤阶段的两步骤方法。
发明概述
在一个方面，本发明提供了将第一化学本体与第二化学本体反应以生成缀合物的方法，其中所述第一和第二化学本体彼此共价结合，所述方法包括将第一化学本体、第二化学本体和硫醇生成剂同时接触，其中硫醇生成剂在硫醇化反应中与第一化学本体反应，在第一化学本体上形成游离巯基，并且游离巯基与第二化学本体反应以形成缀合物，其中第二化学本体在其与巯基的反应性方面是多价的(即第二化学本体的一个分子可以两个或多个巯基反应)。
本发明与常规现有技术不同之处在于，在硫醇生成剂和第一化学本体的反应以及和第二化学本体的反应之间不涉及任何分离步骤。相反，在本发明中，这三种材料在缀合方法的某一阶段同时接触，其中硫醇生成剂在与欲缀合的两个本体接触时起作用以在第一化学本体上生成游离硫醇。不进行硫醇化第一化学本体与过量硫醇生成剂或者与可能在与第二化学本体接触之前形成的任何副产物的分离或部分分离。该方法的一个优点是，新形成的虽然不稳定的SH基团可以立即与第二化学本体反应。
本发明部分基于以下认识：分离步骤不是必需的，并且在现有技术中坚持使用分离是基于错误概念。通过取消在缀合过程之前的分离步骤，本发明方法被显著简化。此外，因为没有采取将不可避免带来物质损失的分离步骤，本发明的缀合反应可以使用非常少量的材料来进行。因此，本发明为易于以任何规模形成标记试剂形式的缀合物铺平了道理，所述标记试剂可用于直接测定，例如促进几乎任何蛋白的直接标记，并且提供了免疫分析简化、更大的再现性和成本降低的另外的优点。
硫醇生成剂(TG)含有一个或多个硫原子，并且与第一化学本体反应(例如开环、重排等)以在第一化学本体上生成共价键结合的巯基(或硫醇)，所述巯基包括来自硫醇生成剂的硫原子。硫醇生成剂适宜地包括硫代内酯(见下文)和/或亚氨基亚氨基硫代内酯(见下文)和/或环硫化物例如1，2-环硫丙烷和/或噻唑烷例如2-[(4-二甲基氨基)苯基]-1，3-噻唑烷和噻唑烷的N-取代的类似物，其中可以引入所述N-取代基来修饰开环性质(Canie等人，Pure & Appl.Chem 68，813-818，1996)。可以使用材料的混合物。合适的硫代内酯包括N-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯(NAHCT)(Benesch & Benesch.Proc.Natl.Acad.Sci.44，848-853，1958)。合适的亚氨基硫代内酯包括2-亚氨基硫杂环戊烷(2IT)，还称为Traut’s试剂，其作为2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐市售。还可以使用取代和衍生化的材料，例如5-和4，5-烷基取代的2-亚氨基硫杂环戊烷(Goffand Carroll.Bioconjugate Chem.1，381-386，1990)。可能的变体包括5-甲基-；5-叔丁基；5-苯基-；5，5-二甲基-；5-螺合-；和4，5-环类似物。
第一化学本体(A)包括能够与硫醇生成剂反应以生成A的硫醇化变型A-SH的化学官能团。该官能团通常是亲核性基团，典型地是胺，特别是伯胺，或羟基。典型的硫醇化反应如下：
Figure S200680046760XD00061
2IT是完全水溶性的，并且与伯胺在7-10的pH范围内反应。在常规缀合物形成反应中，2IT在约8的pH下使用，在该条件下，2IT与伯胺，例如肽、多肽和蛋白中存在的赖氨酸残基中的伯胺有效且迅速地反应。对于与伯胺的反应，现在已经发现，优选将2IT在低于常规值8的pH下反应。因此，当使用2IT时，缀合反应优选在低于8，优选低于7.8，更优选低于pH 7.7的pH下进行。优选的pH范围是7.0-7.5。因为硫醇与很多类型硫醇反应性基团Y的反应在pH 6.5-7.5有利地进行，所以不希望在高pH值下使用TG，在高pH下，竞争性水解反应产生不希望的游离硫醇。此外，如下所述，Y还可以在碱性pH下发生水解反应，或者可以表现出对于硫醇的降低的选择性，如在常用的马来酰亚胺官能团情况下。在较高pH，例如在约pH 10，2IT还可以与脂族或芳族羟基反应，虽然这些基团的反应速度仅是伯胺的约0.01(Alagon & King.Biochemistry 19，4341-4345，1980)。在不存在胺的情况下，碳水化合物例如琼脂糖或纤维素膜可以用2IT修饰以包含巯基残基。对于免疫分析过程，以这种方式修饰的多糖在共价交联抗体中是有效的。
第一化学本体(在本文中通常称为“A”)通常是聚合物，优选生物分子聚合物(即天然存在于一个或多个活系统中的聚合物分子)。优选的生物分子聚合物是多肽。理想但不是必须地，第一化学本体包含以下成分或者由以下成分组成：抗体或抗原结合片段，例如Fab、Fv、scFv或单结构域抗体，或抗体或其抗原结合片段的多聚体。A的其他实例包括链霉抗生物素蛋白、neutravidin、蛋白A、多肽受体分子和多肽配体。包含一个或多个硫醇基团的第一化学本体可以由A-SH代表。
当第一化学本体包括一个以上的与TG反应的化学本体例如伯胺时，在第一化学本体上将形成一个以上巯基。
第二化学本体(在本文中通常称为“B”)包括多个巯基反应性官能团(Y)，所述官能团与在第一化学本体上形成的巯基反应，由此产生缀合物。因此，第二化学本体通常由B-Y代表。在缀合反应期间，A-SH上的硫原子通常作为稳定的硫醚键或者作为可逆性(可还原的)二硫化物桥的一半整合到最终的缀合物内。
第二化学本体包括一个以上的可具有相同或不同化学的巯基反应性官能团。巯基反应性本体包括马来酰亚胺、环氧化物、碘乙酰基、溴乙酰基、吡啶基硫醇(pyridylolthiol)等。对歌巯基反应性官能团(Y)可以天然存在于第二化学本体中，但是在初始步骤中通常需要把一个或多个巯基反应性官能团引入到分子B内以产生第二化学本体。合适的引入技术是本领域技术人员众所周知的。
第二化学本体(B-Y)通常包含或包括标记物，例如酶、荧光材料等以经由缀合的第一化学本体或毒素、治疗剂等的结合来鉴定或测定材料结，以及经由缀合的第一化学本体的结合来靶向递送。
本发明提供了通常适应的方法。尽管如此，在优选的实施方案中，第二化学本体是聚合物或包含聚合物。在优选的实施方案中，第二化学本体包括多肽。
在优选的实施方案中，第二化学本体包括酶。优选的酶的实例包括HRP、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。HRP是特别优选的。
第一和第二化学本体的功能可以是相反的。
因为不是产生自A与TG之间的反应的硫醇可以与A-SH分子竞争B上的有限数目的Y官能团，因此对于可采用的缀合条件范围有一些限制。试剂，尤其是TG的初始纯度是重要考虑，因为这是不需要的游离硫醇的可能来源(例如TG的水解产物)。缀合反应的增加的pH将趋于把A上的胺脱质子化，导致胺与TG的反应更快，但是TG的水解速度也可能增加。因此，与任何化学反应一样，缀合的效率将取决于反应物的浓度，但是也取决于硫醇污染物的初始水平，A-SH的生成(由A与TG的反应生成)与其他硫醇相比的速度，含有硫醇的不同分子与B-Y的相对反应性，以及缀合可利用的Y官能团的总量。
本发明者们已经发现，在‘n’变得更小时，式B-Yn的分子(其中‘n’是整数)与A-SH的缀合将变得更容易受到污染硫醇的干扰。如果n＝1，B-Y的分子与仅一分子污染游离硫醇的反应将阻止该特定B-Y分子参与任何其他偶联反应。因此，如果‘n’很小，则可能需要大大过量的B-Y来保证每一A-SH分子可以与B-Y反应。使用过量B-Y可能是不能实施的和不经济的，特别是如果B是大的生物分子时。此外，最后缀合物中高水平的游离B在一些应用中可能是麻烦的。相反，本发明者们认识到，面对不希望的与不需要的硫醇的竞争反应，通过使用具有高的‘n’的值的B-Y试剂，制备缀合物的改善方法能够提高A-SH与B-Yn之间的缀合的效率。
本发明方法随着‘n’的值增加而变得不断地更加有效。优选地，第二化学本体每个分子包含三个以上的巯基反应性基团。更优选地，第二化学本体每个分子包含五个或五个以上的巯基反应性基团。最优选地，第二化学本体每个分子包含十个或十个以上的巯基反应性基团。有利地，第二化学本体包含10-15个巯基反应性基团。如果在第二化学本体中巯基反应性基团的所需数目不是天然固有的，则他们可以如本文其他地方所述通过化学或酶合成来引入。对于本发明目的，“巯基反应性基团”是在缀合反应条件下与巯基反应分基团。显然，反应条件必须是基本上保持第一和第二化学实体的活性。
对于仅具有6个赖氨酸残基的HRP，只有两个赖氨酸残基可被用来引入Y官能团(Bioconjugate Techniques 1996，GT Hermanson，p632)，试剂具有低的硫醇含量以及反应条件不导致TG过量水解的的反应条件是特别重要的。然而，无论所用的条件如何，由于生成不需要的游离硫醇而导致的缀合酰氯降低可以通过把一个Y基团引入B内或者通过聚合B-Y或者通过联合采用这两种方法来解决。对于用于把额外Y基团引入B内的方法没有特别限制，虽然该方法应当优选基本上保留B的生物活性，特别是如果B是酶时。
本发明的一个优点在于，其避免了需要采用大的第二化学本体与硫醇生成剂的摩尔比(即B∶TG比例)以克服干扰性游离硫醇的存在。因此，在本发明中，缀合反应中第二化学本体与硫醇生成剂的摩尔比适宜地不超过2.0∶1，典型地1∶1或更小，优选为1∶1-1∶20，最优选为1∶10-1∶15。
Y基团可以直接连接在已经存在于B上的官能团上。或者，或此外，可以引入新的反应中心。例如，可以用过氧化钠将具有糖链的分子氧化以产生醛官能团。这些官能团易于与含有胺或酰肼的化合物反应以分别形成Schiff碱或腙键，其可以用氰基硼氢化钠、硼氢化钠或另一合适的还原剂稳定。因此，如果将过量二胺化合物与醛基团反应，则对于被修饰的每个醛引入一个胺部分。如果二胺不以过量存在，则可能会发生交联反应(即生成B聚合物)，其在一些情况下可是有用的(见下文)。
将胺基团引入B内不限于B与简单二胺的反应。可以采用具有两个(或更多个)官能团的其他分子。这些官能团中的一个必须能够与B反应，并且其必须能够将其他官能团转化成Y基团。Y还可以直接引入到B内，而不使用在B上的任何胺部分。例如，如果B是糖蛋白，则与高碘酸盐反应生成醛官能团，随后醛官能团可以与具有醛和巯基反应性基团的异双官能试剂(例如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼；MPBH)(Chamow SM等人，J.Biol.Chem.1992 267，15916-22)反应。还可以使用类似于MPBH的化合物(例如M2C2H)(BioconjugateTechniques 1996，GT Hermanson，p250)。
引入官能团的另一种方法是修饰羧酸(例如通过多肽链中的谷氨酸或天冬氨酸提供)。碳二亚胺介导的含有胺的分子与羧酸的缩合被广泛用于化学合成中，并且可以用于把胺(例如通过与二胺、三胺反应)和其他官能团引入到B内。例如，胺化的HRP已经使用碳二亚胺(EDC)介导的HRP与乙二胺的缩合来产生(US 5,039,607)，这给予HRP 11个胺官能团。如果在B上缺乏糖链的情况下不能采用基于高碘酸盐的方法，则碳二亚胺方法是特别有用的。
将胺引入到B内，然后转化成Y官能团的一个优点是，有多种可能有用的含有胺的分子可商购获得。在这些分子中，胺基团可以连接在或不连接在同一原子上。通过提高B上胺(其最终可以转化成Y基团)的数目，可以产生对于缀合反应中的硫醇干扰具有更好抗性的HRP的衍生物。
在优选的实施方案中，将高碘酸盐活化的HRP与携带‘c’个胺基团的分子C反应(其中c＝2或2以上)，获得对于每个修饰的醛基团具有c-1个另外的胺的HRP类似物，在优选的实施方案中，C是二胺(例如乙二胺、丙二胺、丁二胺；2，2’-(亚乙二氧基)二-乙基胺(EDBA)；赖氨酸等)或具有3个或更多个胺官能团的分子(例如lys-lys(c＝3)、三赖氨酸(c＝4)、Jeffamine T403(c＝3)、胺化葡聚糖和其他多氨基物质。
降低不需要的游离硫醇对于缀合效率的影响的另一个策略是减少B-Y的聚合，B-Y的聚合提供具有nq个马来酰亚胺官能团的聚合物[(B)n]q，其中‘n’是聚合物中每个B分子Y官能团的数目，‘q’是聚合物中B分子的平均数目。因此，即使在其中‘n’很小的情况下，游离硫醇的影响也将减小，这是因为B分子是物理连接的，并且A-SH与任何可利用Y官能团的缀合有效地把聚合物中的所有B分子都连接在A上。该方法的另一个优点是，检测的敏感性可能随着例如可能连接在A上的HRP分子的数目的增加而提高。在免疫分析中使用聚合HRP以提高分析敏感性是众所周知的，并且这样的形式是可以商购获得的。
或者，可首先将具有游离胺(天然存在或者通过例如与二胺反应而引入的)的B分子(而不是B-Y)通过以下方法聚合：与同双官能交联试剂(例如二醛)反应或者使用异双官能试剂来促进胺与B上的其他官能团偶联。还可以通过将B与其中B分子可以连接于其上的‘构架’分子(例如dendrimers、葡聚糖、蛋白)反应来产生杂聚物。这可以包括将B上的胺与构架分子上的醛或者与异双官能交联试剂介导的其他可利用的官能团(例如硫醇)反应。通过与异双官能试剂例如SMCC反应，可以将剩余未反应的表面胺官能团转化成Y基团。如果聚合步骤之后剩余的游离胺不足，则可以在引入Y基团之前连接上另外的胺。例如，如果使用碳二亚胺化学来把胺引入随后在聚合反应中使用或部分使用的B内，则可以使用不同化学(例如糖链的高碘酸盐活化)来引入另外的胺(之后可以将其转化成Y基团)或者直接引入Y基团(例如通过与MPBH反应)。聚合的HRP还可以从商业来源获得，并且进一步修饰来产生用于本发明的多个Y官能团。
赋予缀合物有用性质的B分子经常以B-Y形式制得合贮存以用于之后的应用。例如，某些标记物可以作为马来酰亚胺活化的衍生物(冷冻干燥的马来酰亚胺激活的酶或小荧光分子的马来酰亚胺或碘乙酰基衍生物)商购获得。如果需要的话，还可以使用本领域已知的方法临时制备B-Y。B的实例包括酶例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶(Gox)；荧光分子例如藻胆蛋白(例如别藻蓝蛋白、藻红蛋白)、低分子量染料(例如荧光素、罗丹明)等。桥连或连接分子包括链霉抗生物素蛋白或生物素。细胞杀死剂包括毒素(例如蓖麻素和放射性同位素)。酶HRP和碱性磷酸酶是尤其广泛应用于抗体和其他多肽的酶标记物，并且这些酶代表第二化学本体的优选实例。
当实施本发明时，将TG和B-Y合并，并且培养合适的时间。可以改变加入顺序以适应具体情况。
例如，在一种方法中，在第一个步骤中，将TG与A混合。期间生成A-SH的一段合适的时间后，在第二个步骤中，将该混合物加到B-Y中。一段合适的的时间是获得A与B-Y之间的高效缀合的任何时间。这段时间通常是最高达18小时(即过夜)，但是可以在最佳条件下于约2-24小时内进行。如果适当的话，这两个反应步骤中的反应条件可以改变，例如，通过使用合适的缓冲剂，第一和第二个步骤可以在不同pH值进行。
在另一个方法中，将A与B-Y混合，然后将该混合物与TG接触。
在另一个方法中，将TG与B-Y混合，然后将该混合物与A接触。
期望地，为了贮存稳定性，最初将TG和B-Y当中的一个或两个置于干燥条件下，例如冷冻干燥或冻干。优选地，使用第一本体的溶液(通常是水溶液)来重新配制其他组分，这导致样本体积的最小扩大。
在特别优选的实施方案中，将A以液体形式加到包含B-Y和TG的冻干混合物中。
或者，将TG和B-Y的冻干混合物用溶剂(通常是水)重新配制以获得不含有A的混合物，然后向其中加入A。
其中发生缀合反应的溶液可以任选包括一个或多个除了A、B-Y和TG以外的组分。这些组分可以影响或不影响缀合反应的速度。例如，可以在组分的冻干之前引入某些添加剂，以主要为了稳定所述组分或易于溶解。最初可以采用其他组分，尤其是缓冲剂来提供pH条件，在这样的pH条件下，优选的反应以合适的速度进行。这些缓冲剂可以经由一次或多次加入来引入到最终的缀合混合物内，这样最终的混合物具有所需组成。优选地，虽然不是必须的，将缓冲物质与一种或多种其他组分(A、B-Y或TG，或其组合)一起加入以把制备缀合物中的劳动量减至最小。
当确定组分加入到反应混合物中的优选顺序时，TG以及进行缀合所需的条件应当小心地考虑。例如，碱不稳定的TG可以在酸性介质中贮存(或者从这样的介质中冻干)，并且最后引入到适当缓冲的反应混合物内。可以设计缓冲的混合物以适应与TG一起加入的酸，以及提供适于进行目的缀合反应的最终pH和组成。
对于缀合反应，合适的条件，例如温度、pH和浓度将取决于试剂的性质。合适的条件可以由本领域技术人员通过常规试验和误差确定。
本发明的方法还提供了缀合试剂盒的基础。TG和B-Y优选是作为干燥的，例如冷冻干燥(冻干)组分，单独或者作为混合物，在合适的容器中提供。任选与其中A可以溶解于其中的缓冲剂一起。或者，可以将A脱盐或者透析到所述缓冲液中，特别是如果A的制剂含有可能干扰缀合反应的组分时。
在另一个方面，本发明因此提供了用于本发明方法中的缀合试剂盒，所述试剂盒包含至少一个选自第一化学本体、第二化学本体和硫醇生成剂的试剂的样本，以及有关进行本发明方法的说明书。
所述试剂盒期望地包含至少两种选自第一化学本体、第二化学本体和硫醇生成剂的试剂的样本。
所述试剂盒优选包含第二化学本体的样本和硫醇生成剂的样本。这两种试剂可以单独提供或者可以以混合物形式提供。相对于第二化学本体，硫醇生成剂优选以过量存在，例如以最高达约20倍摩尔过量的量存在。
试剂或试剂混合物的多个等份试样或样本优选在合适的容器中提供，例如在单独的管、瓶或多孔(例如96孔)微量滴定板的孔中提供。样本可以以不同预定量提供，这样使用者可以选择有关欲处理材料(例如第一组分)的合适的样本大小。一种优选的实施方案包括不同量的第二化学本体和硫醇生成剂的混合物的多个样本，所述样本用于缀合一种或多种不同化学本体(可能由最终的使用者提供)，以例如标记不同分子，例如欲在免疫测定中使用的抗体。
试剂或试剂混合物的样本可任选包括其他材料例如缓冲剂等以给反应提供合适的条件。
当硫醇生成剂包含2IT时，2IT的样本优选在低于8，更优选低于7.8，还更优选低于7.7的pH下。pH的优选范围是7.0-7.5。
试剂盒可任选包括组分例如溶剂、缓冲溶液等。
对于贮存稳定性，试剂样本期望地呈肝脏例如冷冻干燥(冻干)形式。期望地，试剂样本是从水溶液中冷冻干燥，所述水溶液磷酸钠缓冲剂，pH为5-6.5，优选为5.0-6.0。期望地，将试剂样本从包含Mg2+离子，尤其是浓度为1-10mm的Mg2+的水溶液中冷冻干燥。还可以存在常规低温防护剂和冻干保护剂(lyoprotectant)，例如多元醇，尤其是海藻糖或葡聚糖。
在优选的实施方案中，冻干试剂在小的聚丙烯管(例如0.5ml或1.5ml Eppendorf管)、聚丙烯冷冻管或瓶、玻璃瓶、96-孔聚丙烯或聚苯乙烯微量滴定板，以及用于目的缀合反应的具有适当尺寸的其他容器中提供。优选地，在冻干之前或者随后用合适的溶剂重新配制时，容器的材料不与TG显著反应以释放出硫醇基团。容器的性质不特别限于上述实例。
适用于本发明的缓冲组分包括磷酸盐缓冲剂，尤其是磷酸钠，N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-吗啉代乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、碳酸氢盐以及不与TG反应或者与TG和A上官能团的反应速度相比反应较慢的其他缓冲剂。缓冲剂可因此包括以适当慢速度反应的含有胺的缓冲剂。
缀合反应混合物的其他成分可以包括盐(例如NaCl)以及不直接参与反应，但是提供能够稳定成分或者以某些其他途径促进所需反应或者将例如容器表面上的损失最小化的合适的环境的其他无机或有机成分。
因为TG是反应性的，所以其可以与缀合混合物中的其他亲核物质反应。水是弱亲核物质，但是其以高浓度存在，并且水解反应能够提高没有与A共价结合的硫醇的浓度，尤其是在pH值显著高于pH 7时。
TG优选包括很少或不包括游离硫醇基团，其水平适当地为5％摩尔以下。优选3％摩尔以下，更优选1％摩尔以下。
商业来源的TG可含有大量游离硫醇，游离硫醇还可能在贮存一定时间后产生。游离硫醇可以与A-SH竞争B-Y上的Y基团，并且降低缀合效率。对于2-亚氨基硫杂环戊烷，一个供应商指出游离硫醇的污染是‘最高达5％’。用于本文所述操作的批次经测定具有约1％摩尔的硫醇含量。
优选地，小心选择反应物的摩尔比以使得TG中可能存在的游离硫醇的量不显著影响缀合效率。Traut’s试剂比用于引入硫醇或保护的硫醇的其他分子更稳定，并且不需要使用大的摩尔过量。具有NHS基团的某些胺反应性异双官能试剂在水溶液中具有短的半衰期，并且以大的过量使用以补偿快速水解。通常，TG以合理过量使用，例如相对于相关化学官能团例如第一化学本体上的胺，10倍摩尔过量，以保证第一化学本体的所有分子都被硫醇化。然而，在选择TG的合适的浓度时，使用者必须考虑反应的可能速度，其被溶液的pH影响。TG在固定pH的合适的浓度易于通过测定不同浓度的TG对于所得缀合物的性能的影响来确定。优选地，反应条件容许A的有效硫醇化，但是避免过度硫醇化以防止破坏A的生物活性。同样，不应当让过量第二化学本体与A-SH缀合，否则这可能会导致缀合物的亚最佳性能。第二化学本体通常以适度过量存在，例如相对于硫醇化第一化学本体，约5倍摩尔过量，以保证所有第一化学本体被缀合。反应后，可通过任意合适的技术来除去过量材料。
使用本发明中提出的方法，缀合反应可以含有仅10μg IgG抗体(Mr 150,000)。典型地，每个分子引入大约5个硫醇基团。因此，在10μl体积(6.7μM抗体)中，胺(欲被修饰的)的浓度为～33μM。因为没有脱盐步骤，所以新生硫醇将立即与B-Y反应。对于标记物例如马来酰亚胺-活化的HRP(分子量为40,000)，所有新生硫醇的标记将需要～33μM酶，这相当于在10μl反应体积中的～13μg HRP。如果使用25倍摩尔过量的TG，TG溶液中1％硫醇污染将表现出约8μM或1/4(摩尔比)马来酰亚胺-活化的HRP的浓度。此外，如果HRP平均每个分子用2个或多个Y基团标记，则HRP分子与一个污染性游离硫醇的反应将不必然阻止该分子与B-Y缀合。由此断定，使用过量B-Y或具有多个Y基团的B-Y可能会改善污染性游离硫醇以及由于缀合反应期间TG水解所产生的游离硫醇的不利影响。在某些应用中，尤其是具有固定在表面上的抗原的应用，使用过量B-Y不是问题，因为剩余试剂(即未与A连接的试剂)可在免疫测定期间被容易地洗出来。此外，通常使用过量B-Y来将未反应的A-SH的量降至最小，未反应的A-SH将与AB竞争并且降低分析敏感性。
在某些免疫测定应用中，尤其是其中抗原在自由溶液(free solution)中测定的那些免疫测定应用，可能希望将缀合的B的量最大化以及将游离B-Y减至最少。这可通过使用本领域众所周知的方法将AB从缀合混合物中纯化或者通过小心地控制反应条件来实现。在本发明中，避免导致物质的收率难以确定的脱盐步骤，尤其是当需要快速进行缀合步骤时，非常有助于建立反应物的精确比例以及有助于优化条件来满足特定试验目标。
如果游离B-Y的浓度需要保持很低，则游离硫醇的水平变得更加重要，因为不需要的硫醇可能使得B，尤其是用Y轻微修饰的B(也就是说，B-Yn中n的值很小，例如为1或接近1)不能够缀合A-SH。当在缀合后难以或者不希望分离游离B-Y时，优选通过使用不引起非-A-依赖性硫醇释放的条件(即低pH、不含胺的缓冲剂)来将副反应降至最小。
在TG用于硫醇化A的目的之前，可以除去或者除去大部分游离硫醇。例如，游离硫醇可以通过使用固体载体进行纯化来除去，其中TG和游离硫醇对于所述载体表现出不同的亲和力，由此使得能够选择性洗脱出较纯的TG。与固体载体的结合可以是共价或非共价的。
在一个方法中，将TG的溶液与其中Y基团已经连接于其上的固体载体接触。这样的材料可以以碘乙酰基琼脂糖(Pierce)(Sepharose是商标)的形式商购获得，或者可以使用本领域已知的方法(J.Biol.Chem.245 3059-3065(1970)通过碳二亚胺介导的卤代乙酸酯与携带胺的琼脂糖的缀合来制得。在优选的实施方案中，Y基团的数目超过游离硫醇的数目，这样固体载体能够通过共价键捕获所有或基本上所有不需要的游离硫醇。没有与固体载体结合的TG优选立即使用或者迅速冷冻或冻干以保持物质大部分呈完整状态。
另一方法是测定TG样本中游离硫醇的浓度，例如使用众所周知的5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸酯)(DTNB)方法或其他用于测定游离硫醇的合适的方法。然后加入含有携带Y的分钟并且没有可能干扰随后缀合步骤的官能团的溶液，优选以稍微摩尔过量加入，并且优选在这样的条件下加入，其中(a)不产生另外的硫醇或者非常缓慢地产生另外的硫醇，(b)污染性硫醇与Y迅速反应以形成稳定的硫醚，由此从样本中消除了硫醇。该策略当然可用于除去硫醇而无论其来源如何。
将携带Y的分子适当地与TG接触一段能容许大部分游离硫醇与Y反应的时间。所述一段时间之后，将TG样本与A和B-Y接触。用于除去游离硫醇的分子可以是下列之一：N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺、碘乙酸酯或盐、溴乙酰胺、溴乙酸酯或盐、氯乙酸酯或盐、汞化合物等。N-乙基马来酰亚胺是特别优选的。
通过依据本发明同时接触A、TG和B-Y，TG可以获得机会与存在于B-Y以及A上的胺反应的机会。如果B是大的生物分子，则非常有可能仍然存在游离胺，即使Y基团已经经由可获得的胺的化学修饰而引入时也是如此。对于HRP，生物缀合物化学中的一种非常常用的标记物，每个分子中胺的数目通常很低(0.15每kDa)，与之相比，对于牛血清白蛋白(BSA)是0.88/kDa，对于卵白蛋白是0.44/kDa。因此，TG与B-Y反应的程度可以通过以下途径来控制：(i)所使用的B的类型，(ii)B上Y基团的密度(关于残余游离胺)，(iii)试剂加入的顺序。
当B上的胺的水平高，并且处于所用的实验条件下时，发生了与TG的显著反应，B可能被部分聚合(即B-Y与新生B-SH的反应)。当这被视为不理想时，简单地采用两步骤策略就可以解决该问题。首先，将TG与A接触，经过其中生成A-SH的一段合适的时间后，将该混合物与B-Y接触。这使得AB缀合物在可以生成大量B聚合物之前形成。
B-Y的部分聚合在某些情况下可以是有利的。提高免疫分析敏感性的一种简单方法是每个分子A上连接更多的B。B-Y的聚合已经用于实现该目标。通过小心地选择试剂浓度(TG，A)以及第一步骤(A-SH生成)的持续时间以及考虑到B上游离胺和Y基团的数目，原位B聚合物生成的程度可以按照需要来操控。
虽然本发明的一步缀合方法是非常有吸引力的，其中所有试剂都是在一个步骤中合并在一起，但是两步变型(例如包括两个试剂加入操作而不是一个)与大部分目前的缀合方法相比仍然是显著简单的，并且如果需要的话，具有提供另外选择的优点，以针对特定应用来优化缀合物。
例如，在一个实施方案中，反应设定在有利于生成AB缀合物(由A-SH和B-Y生成)的条件下。在单独的反应中，将B与TG反应以生成含有B-SH的溶液，然后将其加到预形成的AB复合物中，该复合物可含有未反应的Y基团。通过引入B-SH，可以经由AB-Y分子上的B-SH涂层来获得缀合物分子量的受控增加。通过小心地考虑B-Y的输入以及Y基团的密度，可以设计初始缀合物来与B-SH的分子反应至不同程度。
某些应用可能需要具有较低分子大小的缀合物。涉及试剂透入含有抗原的样本内的应用(例如免疫组织化学)通常用低分子量缀合物能最好地进行。然而，如果抗原沉积并且暴露在表面(例如硝化纤维素，如在western印迹中)上，采用更大的分子缀合物，其可以表现出更高的敏感性。因此，目的应用的考虑决定形成缀合物的优选方法。
在使用基于硫醇的方法的免疫缀合物的制备中，通常在缀合反应结束时采用‘阻断’步骤来除去任何未利用的硫醇。在某些情况下，实际上不需要该步骤，但是中午常规部分来进行。在本发明中，如果TG是2-亚氨基硫杂环戊烷，在参与偶联的硫醇由于次级分子内反应而是自我限制性的时，不太可能需要阻断步骤。然而，因为开环反应必须在通过次级分子内反应或者通过常规硫醇阻断措施的衰退之前进行，可以使用简单的衍生化步骤来促进过量TG的开环。
中止缀合以及去活化TG的最快方法是加入在合适的缓冲液中的亲核试剂(Nu)例如甘氨酸。去活化速度与pH以及Nu的类型和浓度有关；用于去活化TG的条件必须与缀合物以及优选缀合物将使用的应用相容，否则会需要纯化步骤。以这种方式从TG上释放的硫醇将发生分子内反应或者与B-Y或AB-Y上的过量Y基团反应。因此，加入Nu可去活化TG以及间接去活化Y基团。因为释放的硫醇可以与AB形成共价连接，因此需要小心地考虑Nu的选择以不给缀合物引入来自Nu的不需要的基团(例如大的取代基)。然而，如果需要的话，可以在TG的开环之前用低分子量硫醇(例如巯基乙醇)处理该混合物来去活化Y基团。
适宜地，通过以下方法来终止缀合反应：加入Nu例如甘氨酸以攻击过量TG，以及加入硫醇阻断试剂(TBR)例如N-乙基马来酰亚胺，N-乙基马来酰亚胺常用于该特定目的的生物缀合物化学。然而，作为Nu的甘氨酸与作为TBR的N-乙基马来酰亚胺的组合不是意味着限制，并且很多其他可能的Nu物质以及硫醇阻断剂对于本领域技术人员来说也是显而易见的。
在优选的实施方案中，Nu和TBR是顺序引入。优选地，Nu是在TBR之前加入。优选地，TBR相对于游离硫醇以稍微过量加入。可以用例如DTNB测定游离硫醇的水平。当硫醇的水平不能测定时，加入相对于已知水平的TG稍微过量的TBR，因为该水平的硫醇不能超过TG的初始浓度，如果TG是游离硫醇的唯一来源。
在一个实施方案中，将缀合混合物简单地与Nu(例如在磷酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的50mM甘氨酸，pH 8.0)接触。任选地，可以给该混合物进一步补充硫醇阻断试剂(例如N-乙基马来酰亚胺)、稳定剂(例如BSA、卵白蛋白和其他蛋白类成分；甘油)和抗微生物试剂(例如叠氮化钠)或其他防腐剂。缀合物可以在4℃贮存，或者以小的等份试样在-20℃冷冻，或者呈在-20℃的液体形式(即含有50％甘油)或者在-70℃冷冻，这取决于缀合物的性质及其温度温度下以及对于冷冻-融化的敏感性。
本发明的一个应用领域是制备用于免疫接种的缀合物。制备了大量抗小肽的第一抗体试剂，其通常与载体蛋白缀合。合适的载体包括马来酰亚胺活化的匙孔血蓝蛋白(KLH)、BSA、卵白蛋白等。对于已经用末端半胱氨酸残基化学合成的肽抗原，以及对于仅含有胺的其他小分子，本发明容许在原位生成用于缀合例如马来酰亚胺活化的载体的硫醇官能团。避免了脱盐步骤是有意义的，不仅是因为该方法更适宜，而且是因为硫醇化之后的低分子量分子纯化经常难以进行或者是不可能的。在这样的应用中，存在过量B没有问题，并且B的摩尔量可以大大超过A，以保证有过量新生硫醇与载体上所有马来酰亚胺官能团偶联。
生物缀合物的另一个应用是免疫毒素治疗，该治疗涉及抗体介导的物质递送，所述物质能够杀死特异性细胞类型(例如表达是癌症状态诊断指标的抗原的细胞)。这些毒素当中有一些是极度危险的，并且意味着给从事治疗剂生产的人带来了很大危险。本发明固有的简化提供了将强效毒素与抗体缀合，而不产生由于脱盐柱或透析步骤所带来的危险废液的机会。例如，蓖麻毒素可能包含在合适的容器中，并且整个缀合操作是在同一容器中进行。在这种情况下，抗体优选是马来酰亚胺活化的，并且与毒素合并，所述毒素在原位用TG处理以释放出用于缀合反应的硫醇。
另一应用涉及用包括含有胺的荧光小分子的B分子进行标记。荧光染料通常是NHS活化的，并且与A上的胺反应。这样的试剂在水溶液中是非常不稳定的，并且如果不在干燥状态下贮存，会迅速失效。因此，优选的方法经常使用过量试剂，然后从B中纯化AB。然而，另一方法是将含有胺的稳定荧光团与冻干的马来酰亚胺活化的载体混合，并且使用TG在原位生成反应性硫醇。在该方法中，不需要过量高不稳定的荧光团，并且染料不含有在贮存下会水解的反应性基团。
本发明方法教导了如何使用证实的异双官能化学来制备缀合物，但是没有麻烦的脱盐步骤，脱盐步骤增加了劳动量以及限制了其应用于能够以较大量获得的组分。可以使用很少量材料来进行多个硫醇化试验，并且缀合物性能可以迅速并且成本节约地优化。本发明中描述的方法使得其易于自动化。例如，使用目前的机器人技术，在微量滴定板中采用96个不同硫醇化条件将被视为简单可行的。在该规模上优化硫醇化过程在涉及脱盐或透析步骤的方法中是完全不可行的。
本发明的重要应用之一是标记第一抗体。因为目前的抗体试剂已经可以不用考虑直接标记来配制，可以存在多种添加剂，包括抗微生物剂例如叠氮化钠，和稳定剂例如BSA或甘油。此外，抗体贮存缓冲剂可以不是缀合反应的优选缓冲剂。在其他情况下，抗体可以作为冷冻血清或腹水的粗样本来提供。
对于含有添加剂例如BSA或源自动物流体的其他蛋白，包括来自组织培养过程的物质(例如胎牛血清)的样本，抗体可以是最少组分，并且难以选择性地标记。幸运的是，纯化抗体的方法是众所周知的，并且包括在已经连接了抗原的载体基质上进行的生物特异性亲和色谱法。其他合适的方法包括具有偶联的蛋白A、蛋白G等的载体基质，其可用于通过与哺乳动物IgG的Fc区域相互作用来从复合物混合物中纯化IgG。应当小心地选择洗脱缓冲剂来促进随后的缀合反应。例如，在亲和色谱中，洗脱经常使用低pH缓冲剂(例如甘氨酸，pH 2.3)来进行，其将不是合适的，至少如果材料直接加到缀合混合物中时是不合适的。其他低pH缓冲剂是更优选的，包括柠檬酸盐/柠檬酸以及基于HCl/NaCl混合物的那些。
除去物质例如BSA的另一种方法是在树脂例如Blue-Sepharose(Amersham)上进行的色谱。该方法的优点是抗体通过树脂，并且不暴露于有可能破坏某些抗体的低pH处理。产自Pierce的新产品Melon(Melon是商标)凝胶最近已经可以商购获得，其明显能从抗体样本中除去宽范围的蛋白。然而，扣除方法例如这些方法不能除去不需要的低分子量物质。
通过结合载体基质上的抗原或蛋白来纯化所需抗体的方法具有这样的优点，即所有不需要的分子都被洗出来。当低pH洗脱不能用于打破抗体：抗原相互作用时，也是由于破坏一个成分的危险性，可以使用另一洗脱方法，例如低渗洗脱(例如Gee & Kenny，Biochem J.230，753-764，1985)。
已经例举了多个应用，并且表明了本发明将容许第一抗体和通常昂贵并且研究人员以少量获得的其他试剂能够容易地标记。这可能导致更多地使用相对于间接抗原检测方法具有很多优点的直接检测方法。
为了避免疑问，现清楚地指出，除非另有说明，在本文中作为“优选的”、“希望的”、“适宜的”、“有利的”等描述的任何特征可以单独在本发明中采用，或者可以与任何一个或多个其他所述特征联合在本发明中使用。
在下面的实施例中举例说明本发明，这些实施例提及了附图，其中：
图1是吸收度对2IT浓度的柱形图，其表明了如在实施例4中测定的Ab1-HRP缀合物的ELISA结果；
图2是吸收度对pH的图，其表明了如在实施例5中测定的改变的pH对缀合效率的影响；
图3是吸收度对pH的图，其表明了如在实施例6中测定的对于Ab1-GOX缀合的pH最优化；
图4是吸收度对多个不同缓冲剂的柱形图，其表明了如在实施例7中测定的缓冲剂类型对于缀合效率的影响；
图5是如在实施例8中测定的吸收度对磷酸盐缓冲剂和Tris缓冲剂的pH的一对图；
图6是吸收度对时间的图，其表明了如在实施例9中测试的缀合物形成的时间过程；
图7是吸收度对不同样本的柱形图，其表明了如在实施例10中测定的改变的试剂加入顺序的影响；
图8是吸收度(任意单位，405nm)对缀合物稀释(log比例刻度)的图，其表明了与OLA-HRP-IgG缀合物(正方形)相比，两批不同EDBA-HRP-IgG缀合物(实心圆圈和空心圆圈)的ELISA中的性能。将用不含抗原的微量滴定板产生的对照数据叠加在基准上。
图9是吸收度(任意单位，405nm)对缀合物稀释(log比例刻度)的图，其表明了在pH 6.5(空心圆圈)、pH 7.0(实心圆圈)、pH 7.5(正方形)或pH8.0(三角形)制备的EDBA-HRP-Ig缀合物的ELISA中的性能。
图10是吸收度(任意单位，405nm)对缀合物稀释(log比例刻度)的图，其表明了EDBA-Gox-Ig缀合物(实心圆圈)和OLA-Gox-Ig缀合物(空心圆圈)的ELISA中的性能。
图11是吸收度(任意单位，405nm)对缀合物稀释(log比例刻度)的图，其表明了碘乙酰基-活化的EDBA-HRP-Ig缀合物(对照的数据叠加在基准上)的ELISA中的性能。
图12是吸收度(405mm)对Ig与mal-EBDA-HRP(实心黑色柱)或mal-OLA-HRP(灰色阴影柱)的重量比的柱形图。
图13是吸收度对时间的图，其表明了如在实施例17中测试的硫醇通过不同胺从2IT中的释放；
图14是类似于图13的图，其表明了如在实施例18中测试的使用DTNB的硫醇捕获；和
图15是吸收度(405nm)对缀合物稀释因子的图，其表明了在不同温度贮存后冻干试剂在ELISA中形成活性缀合物的能力。
实施例
实施例1
将HRP(5mg)(Sigma，P6782)(B)在0.5m 100mM磷酸钠，pH 7.2中用磺基-SMCC(4mM)(Pierce，22322)于25℃活化1小时。将马来酰亚胺活化的HRP(‘mal-HRP’)(B-Y)在用10mM磷酸钠、150mM NaCl、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 7.03平衡的PD10柱(AmershamBiosciences)上脱盐。将活化的蛋白(2.5mg/ml)立即使用或者冻干。
实施例2
将葡萄糖氧化酶(5mg)(Biozyme GO3B3)在0.5ml 100mM磷酸钠，pH 7.2中用磺基-SMCC(2mM)于25℃活化30分钟。将马来酰亚胺活化的Gox(mal-Gox)如实施例1中所述进行脱盐和加工。
实施例3
将兔IgG(Sigma I5006)以1mg/ml溶解在Tris缓冲盐水(TBS)(50mM Tris/150mM NaCl，pH 8.0)中，并且以小的等份试样于-70℃贮存。为了制备包被的ELISA平板，将IgG融化，并且在TBS中稀释至20μg/ml。将Nunc maxisorb平板(透明，96-孔)(代码071832)与50μl(1μg)IgG/孔培养。把平板在室温宝贝1小时以上，然后在箔中缠绕，并且转移至4℃以贮存。包被的平板在10天内使用。临使用前，将平板用TBS/0.1％BSA，pH 8.0阻断30分钟以上。为了通过ELISA测定缀合物，将一式两份或一式三份的孔与50μl在TBS/0.1％BSA中适当稀释的缀合物一起培养。在25℃保持60分钟后，将平板用TBS洗涤5次。加入合适的底物(见下文)，2或10分钟后，使用Victor3型1420多标记计数器(Perkin Elmer)，在合适的波长(取决于所用的标记物)测定吸收度。使用1mM 2，2′-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)底物，在含有1μl H2O2/ml试剂的50mM乙酸钠，pH 5.0中测定HRP活性。在使用100mM乙酸钠，100mM葡萄糖，pH 5.0的含有HRP(50μg/ml)和2mM ABTS的偶联分析系统中测定Gox活性。使用5mM磷酸对硝基苯酯(PNPP)，在含有1mM MgCl2和0.5mM ZnSO4的50mM甘氨酸缓冲液，pH 9.6中测定碱性磷酸酶活性。
实施例4
将冻干的抗-兔IgG抗体(1mg)(Sigma R2004)(‘Ab1’)重悬在1ml150mM NaCl中，并且在4℃贮存。制备下列2-亚氨基硫杂环戊烷(2IT)在1.2mM HCl中的贮备液：1000mM、100mM、10mM、1mM、0.1mM和0.01mM。将Ab1(A)、mal-HRP(B-Y)(如实施例1所述制备的)和缓冲液(100mM磷酸钠，1mM EDTA，pH 7.4)以1∶1∶2的比例合并，并且将20μl部分分配到1.5ml Eppendorf管中。管接收5μl 2IT(TG)以给出200mM(C7)、20mM(C8)、2mM(C9)、0.2mM(C10)、0.02mM(C11)and0.002mM(C12)的最终2IT浓度。对照管(neg)接收1.2mM HCl来代替2IT。‘Pos’是进行了1/1000稀释的阳性对照抗体(Sigma A6667)。90分钟后，将样本C7-C12用TBS/0.1％BSA稀释，并且使用实施例3的方法，以1/200的稀释(关于未稀释的Ab1)通过ELISA进行测定。结果如图1所示。
从图1中可以看出，存在吸收度对2IT浓度的钟形依赖关系。在较的2IT浓度，该作用可能通过容许有效缀合的Ab1的硫醇化不足来解释。在高浓度下，这种作用可通过Ab1经由赖氨酸基团的过度修饰的破坏来解释，虽然其他解释也是可能的。例如，可商购获得的2IT被小百分比的游离硫醇污染，在高浓度2IT下，游离硫醇可以与硫醇化Ab1竞争与mal-HRP的反应。在没有2IT存在的情况下(neg)吸收度很小。对照孔的吸收度值很低(＜0.1)，除了C7(～0.25)。将从抗原包被孔获得的数据减去从对照孔(没有包被的抗原)获得的数据，获得图1中显示的值。该实验表明，能够将2IT、Ab1和mal-HRP在一个管中合并，并且生成活性缀合物。
实施例5
使用一系列磷酸盐缓冲剂来测定改变的pH对于缀合效率的影响，所述缓冲剂是通过将0.2M Na2HPO4与0.2M NaH2PO4以下列比例混合而制得的：10∶0(缓冲剂P1，pH 9.29)；9∶1(缓冲剂P2，pH 7.72)；4∶1(缓冲剂P3，pH 7.38)；7∶3(缓冲剂P4，pH 7.14)；3∶2(缓冲剂P5，pH 6.94)；1∶1(缓冲剂P6，pH 6.75)；2∶3(缓冲剂P7，pH 6.58)；3∶7(缓冲剂P8，pH 6.39)；1∶4(缓冲剂P9，pH 6.12)；1∶9(缓冲剂P 10，pH 5.81)；0∶10(缓冲剂P11，pH 4.29)。将Ab1(如实施例4所述制得的)和mal-HRP(2.5mg/ml)(从实施例1中获得的；用水重新配制冻干物)以1∶1昆合，并且将20μl等份试样分配到Eppendorf管中。然后每个管接收缓冲剂(来自P1-P11中之一)(20μl)，然后接收10μl 5mM TG(即1mM最终浓度)。60分钟后，加入950μl TBS/0.1％BSA，pH 8.0，并且使用兔IgG-包被的平板(参见实施例3)通过ELISA分析样本。结果如图2中所示。
从图2中可以看出，活性缀合物可以在多种条件下产生，仅在极端pH下反应是效率差的。值得注意的是，最佳pH(～7)显著低于通常用于通过2IT将生物分子硫醇化的pH。目前通常使用8.0或以上的pH，其往往将胺去质子化，并且提高与2IT的反应速度。然而，对于在马来酰亚胺活化的生物分子存在下用2IT在原位硫醇化，这些条件显然不是最佳的。这可以通过在较高pH，mal-HRP上的马来酰亚胺官能团的水解增加和/或2IT的水解增加来解释。这两种方法都降低了mal-HRP与硫醇化Ab1之间的缀合反应的效率。
实施例6
如实施例5所述测定改变的pH对于使用mal-GOX的缀合效率的影响，只是将样本体积减半，并且通过加入975μl TBS/0.1％BSA来终止反应。使用兔IgG-包被的平板(实施例3)通过ELISA分析样本。结果如图3中所示。
从图3中可以看出，缀合Ab1和Gox的最佳pH类似于有关HRP标记物说看到的最佳pH(实施例5)。
实施例7
在7.4的固定pH值，测定改变的缓冲剂种类的影响。将缓冲剂(200mM)与Ab1以1∶1混合，并且将10μl等份试样分配到Eppendorf管内，然后加入5μl 2.5mg/ml mal-HRP(实施例1)和5μl 5mM 2IT。用1.2mM HCl代替2IT来设定对照反应。每一缓冲剂缓冲剂(Tris、HEPES或磷酸钠)的最终浓度为50mM。结果如图4所示。
从图4中可以看出，在磷酸盐或HEPES缓冲剂存在下的缀合生成的缀合物表现出类似的通过ELISA测定的性能。尽管Tris相对于2IT是40倍摩尔过量，但是对于在Tris存在下制备的缀合物，吸收度仅降低了～2的因数(factor)。如果省去2IT，则看到了低的吸收度值。在一个单独的类似实验中，在MOPS缓冲剂中于pH 7.0制备的缀合物表现出与在相同pH使用磷酸盐缓冲剂制备的缀合物(未显示)类似的ELISA结果。因此，缀合反应可以在几种缺乏胺官能团的缓冲剂中进行，即使在Tris存在下，性能也只有轻度损失。Tris的影响可以通过2IT的胺诱导的开环(参见实施例8)以及游离硫醇与硫醇化Ab1竞争mal-HRP来解释。
实施例8
使用一系列磷酸盐缓冲剂或Tris缓冲剂来测定pH对于硫醇从2IT中释放的影响。将90μl每一缓冲剂的样本与10μl 100mM 2IT混合，并且将一式两份的等份试样(20μl)在透明微量滴定板中于25℃培养45分钟。加入DTNB 200μl(来自80μg/ml在200mM磷酸钠，1mM EDTA，pH 8.0中的贮备液)，1分钟后，在A405读取平板。结果如图5所示。
从图5中可以看出，采用磷酸盐缓冲剂，随着pH的增加，硫醇的释放变得更加显著，这可归因于2IT的水解。pH 8或更大的pH值目前经常用于通过2IT将生物分子硫醇化。在低pH，2IT是非常稳定的。对于任何固定的pH值，在Tris存在下硫醇产生的速度大于在磷酸盐存在下的速度，这与实施例7中的结果一致，实施例7表明了在Tris存在下缀合的效率降低。
实施例9
在磷酸盐缓冲剂中以3个不同pH值测定缀合物形成的速度。50μl反应包含10μl Ab1(实施例4)、20μl缓冲剂、10μl mal-HRP(实施例1)(2.5.mg/ml)和10μl 1mM 2IT。在特定时间点(5分钟、20分钟、60分钟和2小时)，取5μl样本，并且在TBS/0.1％BSA中进行1/200稀释，然后使用兔IgG-包被的平板(实施例3)通过ELISA测定。结果如图6所示。
从图6中可以看出，缀合物产生的速度是pH依赖性的。对于pH6.39和pH 7.14培养，分别在前4个小时和前2个小时，观测到了吸收度随着时间的稳定增加。在pH 8.15，吸收度增加的初始速度最大，但是20分钟后，增加的速度变慢，并且对于pH 7.14培养，在1小时后，吸收度值追上了pH 8.15培养的吸收度值。最后，低pH培养的吸收度值也超过了pH 8.15培养的吸收度值(数据未显示)。
实施例10
将HRP(2.5mg/ml)和缓冲剂(P4；实施例5)(样本1-4)或Ab1(实施例4)和P4缓冲剂(样本9-6)混合(1∶1)，并且通过相对于时间＝0分钟，在-30分钟、-15分钟、-5分钟和-1分钟交错加入2IT来将10μl部分与5μl 2IT(1mM)混合，在时间＝0分钟加入任何在外面的物质(Ab1或mal-HRP)。这使得在实验的一半中，硫醇化Ab1形成是在加入mal-HRP之前，在实验的另一半中，mal-HRP在引入Ab1之前可能发生聚合。在时间＝0分钟通过同时向2IT中加入Ab1和HRP来产生参考样本(管5)。培养60分钟后，加入975μl TBS/0.1％BSA，并且使用兔IgG-包被的平板(实施例3)通过ELISA测定样本。结果如图7所示。
从图7中可以看出，虽然不是必须物理相同，但是缀合物通过ELISA都给出非常类似的吸收度值，这表明在该特定实验中加入顺序不是关键的。重要的是，将mal-HRP和2IT合并长时间而没有不利影响的能力意味着二者可能容易地合并以及冻干，以容许简单的一步缀合操作，其中欲标记的分子的溶液用于重新配制冻干混合物。
实施例11(制备EDBA-修饰的和乙醇胺修饰的酶)
将160μl高碘酸钠(0.1M)加到2ml HRP(12.5mg/ml在0.1M磷酸钠中的溶液pH 7.2)，并且在25℃于黑暗条件下培养25分钟。将使得醛-HRP在Sephadex G-25上脱盐以除去过量高碘酸盐，并且与2，2′-(亚乙二氧基)二-乙基胺(“EDBA”，最终的体积浓度为1％)在0.5M碳酸氢钠，pH 9.2中反应。在室温反应1小时后，加入氰基硼氢化钠至50mM(从5M贮备液中加入)以稳定Schiff碱。又过了1小时后，将EDBA修饰的HRP样本脱盐到0.1M磷酸钠pH 7.2内，并且调节至5mg/ml。
还使用基本上相同的操作将HRP分批用乙醇胺修饰(产生末端羟基而不是胺)以获得对照物OLA-HRP。EDBA-和OLA修饰的HRP通常分别包含13和2个TNBS-反应性胺(即提供B-Yn分子，其中n的值分别是13和2)。使用类似操作制备葡萄糖氧化酶(Gox)的类似衍生物。
使用4mM磺基-SMCC(如实施例1中所述)将EDBA-和OLA修饰的HRP(5mg/ml)马来酰亚胺活化以分别生成mal-EDBA-HRP和mal-OLA-HRP。将样本脱盐到弱的缓冲剂(10mM磷酸钠pH 7.2)内以促进随后通过再加入浓的缓冲剂溶液来调节pH。
在某些实验中，使用4mM碘乙酸琥珀酰亚胺基酯来在EDBA-HRP上进行类似活化反应，以向HRP内引入碘乙酰基而不是马来酰亚胺官能团。
实施例12(在缀合反应中比较mal-EDBA-HRP和mal-OLA-HRP)
将Mal-EDBA-HRP(由两批不同的EDBA-HRP和mal-OLA-HRP(得自实施例11)制得的)(10μl；25μg)分别与2μl 5mg/ml山羊抗-兔IgG(在200mM Hepes，pH 7.5中)和1.3μl 8mM TG1缀合。在25℃反应4小时后，将样本用TBS/0.1％BSA稀释至1ml，由其制备一系列稀释物，并且使用兔IgG包被的平板或对照平板(没有兔IgG)在ELISA中测定。结果如图8所示。
衍生自mal-EDBA-HRP的缀合物的滴度曲线彼此非常类似，其中在1/10,000稀释的OD值超过1.5。与之相比，用mal-OLA-HRP制备的缀合物需要高～10倍的浓度来获得类似吸收度值。将对照平板(即没有抗原)的数据彼此叠加，并且表现出有关测试的稀释物的全部范围的基准读数。因此，在马来酰亚胺活化之前引入更多的胺官能团的策略显著提高了ELISA中缀合物的性能。
实施例13(评估与mal-EDBA-HRP缀合的pH最优化)
将如上所述制备的Mal-EDBA-HRP(10μl)与5μl 2mg/ml山羊抗-兔IgG(20mM磷酸钠/150mM NaCl)、2ul TG1(8mM)和3μl下列1M缓冲剂之一混合：MOPS pH 6.5，MOPS pH 7，Hepes pH 7.5或EPPS pH 8)。在25℃培养过夜后，制备一系列稀释物，并且使用兔IgG包被的平板或对照平板(没有兔IgG)在ELISA中测定。结果如图9所示。
在与mal-EDBA-HRP(pH 6.5-7.5)的反应中观测到非常宽的最优pH，在pH 7制备的缀合物仅略好于在pH 6.5或pH 7.5制备的缀合物。因此，加入额外的马来酰亚胺官能团具有以下作用：与用非二胺处理的HRP(比较实施例5)相比，缀合反应更加不受pH改变的影响。
实施例14(在缀合反应中比较mal-EDBA-Gox和mal-OLA-Gox)
进一步通过葡萄糖氧化酶来举例说明EDBA处理在提高缀合物性能中的应用，葡萄糖氧化酶天然具有比HRP更多的可利用的胺。尽管如此，高碘酸盐氧化与EDBA处理获得了显著好于对照缀合物(用乙醇胺处理的)的缀合物，在对照缀合物中，连接的是羟基而不是胺。
如实施例11和12所述制备EDBA-Gox-Ig和OLA-Gox-Ig缀合物，并且在ELISA中测试。结果在图10中显示。
实施例15(与碘乙酰基-HRP的缀合反应)
将碘乙酰基-EDBA-HRP(如实施例11中所述制得的)(10μl；25μg)与2μl of 5mg/ml山羊抗-兔IgG(在200mM Hepes，pH 7.5中)和1.3μl of8mM TG1缀合。在25℃于黑暗中培养过夜(～16小时)后，将样本用TBS/0.1％BSA稀释至1ml，由其制备一系列稀释物，并且使用兔IgG包被的平板或对照平板(没有兔IgG)在ELISA中测定。结果如图11所示。
这表明了本发明方法不限于如通过马来酰亚胺举例说明的亲电加成型反应，也适用于用卤代乙酰基衍生物进行的置换反应。
实施例16(改变的Ab：酶比例的影响)
将mal-EDBA-HRP或mal-OLA-HRP(10μl；25ug)与10μl不同浓度的山羊和兔IgG(在200mM Hepes pH 7.5中)和2ul TG1(8mM)混合。在25℃培养4小时后，将样本稀释至250ng抗体/ml，并且使用兔IgG包被的平板或对照平板(没有兔IgG)在ELISA中测定。结果如图12所示。
从图12中可以看出，在所有抗体：HRP比例下，用mal-EDBA-HRP制备的缀合物表现出比用mal-OLA-HRP制备的缀合物高得多的吸收度值。吸收度值显著低于高的抗体与HRP的比例，假定这是由于没个抗体分子上连接的HRP分子的数目不能超过2(2∶1重量比＝～1∶2摩尔比)，而在低的抗体与HRP比例下，可以连接更高的数目。因此，在需要透入组织内的应用(例如在免疫组织化学中)可能有利的低分子量的缀合物受益于高的抗体：HRP比例。
从图12中可以看出，提高mal-OLA-HRP与Ab的比例(通过降低每一反应中抗体的量)对于缀合物性能仅有轻度影响。即使采用显著过量的mal-OLA-HRP(16∶1重量比；～64∶1摩尔比)，缀合物的效率也不能达到用mal-EDBA-HRP所观测到的效率。因为对于两种类型HRP，在固定Ab-HRP比例下生成硫醇化抗体的速度是相同的，所以必须采用某些其他方法来限制过量mal-OLA-HRP情况下的缀合效率。如果我们考虑更常见的A与B-Y反应的情况，TG1与A上的胺反应以生成A-SH。其还在竞争性水解反应中与水反应，水解反应随着pH的增加而进行的更快，尤其是在pH 7以上时，生成不需要的游离硫醇。
在图12中，因为大大过量的mal-OLA-HRP生成明显表现出亚最近性能的缀合物，在所有Ab-NH2分子已经转化成Ab-SH之前，不需要的游离硫醇的浓度必须达到一个关键点(即当缀合效率被影响时)。在该实施例中，硫醇生成剂(TG)的浓度是800μM。胺反应物的浓度是是～6μM(即对于1mg/ml抗体)或有效地60μM胺(假定约10个赖氨酸能够与TG反应)。对于mal-OLA-HRP，在SMCC之前马来酰亚胺官能团的浓度不能大于初始胺含量，并且因此不大于～50-100μM。虽然在生理pH值下胺的亲核性比水分子强，但是在典型的缀合反应中，反应物和溶剂(即水)的浓度是不利的。
因此，仅仅提高HRP与Ab的比例不足以克服不希望的竞争反应。在缀合反应中，必须有足够的马来酰亚胺与释放比A-SH生成快的游离硫醇(即TG水解)竞争，。虽然A上的胺的反应性比水分子的羟基强，但是非常高浓度的水(55M)也会攻击TG。这强调了为什么多价HRP尤其有效，因为其可以与不需要的硫醇反应，所述硫醇是在2-3小时缀合反应期间产生的并且尚未与A-SH反应。
实施例17
为了评估不同胺作为如果需要的话可使用的可能终止剂(quenchagent)来终止缀合反应，我们使用标准DTNB分析测定了硫醇从2IT上的释放。在100mM磷酸钠缓冲剂，pH 7.4中制备5mM甘氨酸、乙醇胺或1，3-二氨基丙烷(DAP)的5mM溶液。将980μl等份试样的每一缓冲剂与20μl 100mM 2IT在1.2mM HCl中的溶液混合。经由一定时间将新制备的DTNB试剂(200μl 80μg/ml在100mM磷酸钠，1mM EDTA，pH 8.0中的溶液)加到20μl等份试样的每一反应混合物中。在进入DTNB 1分钟内读取样本。结果如图13所示。
所选择的胺，乙醇胺、甘氨酸和DAP分别还含有中性、酸性和碱性基团。有必要注意到，图14可能呈现了以下两条相反途径的净作用：(i)从2IT中释放硫醇；(ii)释放的硫醇的分子内反应。特别明显的是，对于甘氨酸，硫醇的量在1小时后开始降低。对于DAP得到了最高‘表观’速度，但是其胺官能团与甘氨酸或乙醇胺相差不大，这似乎不能解释更大的硫醇释放(参见实施例18)，但是较慢的分子内反应，这也许是与初始开环反应的产物内引入额外正电荷有关。
实施例18
为了更好地采用可能终止剂的硫醇释放速度，对实施例17的实验进行了改变，以通过与DTNB反应来立即‘捕获’任何释放的硫醇。由于需要在pH 8测定DTNB反应，因此不能使用与实施例17相同的pH，但是试验相同的三种胺。将DTNB(80μg/ml)在0.2M磷酸钠，1mMEDTA，pH 8.0中新配制，并且分配(200μl/孔)到透明的96-孔中。加入20μl 100mM 2IT，并且使用自动平板循环操作功能来每2分钟在A405读取吸收度。结果如图14所示。
从图14中可以看出，这三种胺以非常类似的速度释放硫醇，虽然甘氨酸是最快的。因为甘氨酸还似乎支持导致硫醇消失的较快分子内反应(实施例17)，所以对于中止缀合反应，其是三种胺当中最有希望的。在通常用于生物分子的硫醇化的条件下(即该实验中的对照反应)，硫醇的显著释放也很明显。
实施例19
冷冻干燥通常用于稳定和延长基于蛋白的产品的半衰期。经常用于帮助稳定活性组分的赋形剂包括低温防护剂，其主要功能是在冷冻步骤期间给予保护作用，和冻干保护剂，其主要功能是在冷冻干燥期间和/或贮存期间防止降解。对于任何新的样本，冷冻干燥的最佳配方可以仅凭经验确定。据我们所知，对于TG的冷冻干燥或者对于在B-Y分子存在下的TG的冷冻干燥，没有任何先例。TG与B-Y的混合物的冷冻干燥需要开发一种制剂来稳定Y功能(例如马来酰亚胺类)、TG(例如2-IT)以及B的生物活性(例如HRP、碱性磷酸酶)。显然，如果对一种活性组分造成显著破坏，那么随后的缀合反应将受影响，即使其他成分被良好保护。
在改变组成和pH的缓冲剂范围内进行的初始实验中，通过使用DTNB试剂测定冷冻干燥材料的游离硫醇含量来评估冷冻干燥期间2-IT(单独)的不需要的开环程度。游离硫醇的释放似乎依赖于冷冻干燥前溶液的pH。酸性溶液，包括稀盐酸(1.2mM-12mM)、20mM磷酸钠(pH＜6.5)和20mM乙酸钠(pH 5)，生成具有低硫醇含量的冻干材料，这与之前注意到的在低pH下2-IT具有更强的溶液稳定性(实施例8)相一致。常用于缀合反应的缓冲剂(即基于磷酸盐、NaCl和EDTA的中性或弱碱性溶液的那些缓冲剂)是冷冻干燥的2-IT的较差稳定剂，象pH＞6.5的其他缓冲剂一样。
当冷冻干燥的2-IT样本与DTNB试剂一起培养几小时后，得到了预料不到的观测结果。通常，由于2-IT在用于DTNB反应的pH(pH 8)下不稳定，存在硫醇的时间依赖性释放，并且因此产生背景信号。尽管2-IT在乙酸钠中具有明显的稳定性(即在冷冻干燥后不存在硫醇)，但是在背景信号中的预计的时间依赖性增加大大地不存在。该观测结果不能通过乙酸盐对于DTNB和硫醇的反应的影响来解释。没有进一步研究阻止硫醇释放的TG1的假定的化学转化，但是其可以类似于在TG1的其他条件下观测到的次级反应(参见p4)，其导致形成非反应性硫醚。与在5mM乙酸钠pH 5存在下冷冻干燥的那些相比，用在4mM磷酸钠，pH 5.8存在下冷冻干燥的mal-HRP/TG1混合物制备的缀合物在ELISA中给出强得多的信号。这些结果一起表明了，虽然在冷冻干燥期间低pH是稳定TG1所必需的(并且因此随后在弱碱性pH下进行有效的缀合物形成)，但是单独的低pH不足以保护TG1的完整性。
在本发明的优选实施方案中用于B-Y/TG1的冷冻干燥混合物的缓冲剂包括磷酸钠。该缓冲剂的pH优选低于6.5，更优选低于6.0。
因为在用A的缓冲液重新配制时，需要提高冷冻干燥混合物的pH来给生物缀合反应提供最佳条件，所以弱缓冲的冷冻干燥混合物是优选的。缓冲剂的浓度优选低于200mM；更优选低于50mM，最优选低于20mM。
在本发明的优选实施方案中，冷冻干燥的TG/B-Y/磷酸盐缓冲剂的混合物还含有多元醇例如糖或葡聚糖或多元醇的组合。最优选的多元醇是海藻糖。海藻糖的浓度优选＞1％，最优选为约5％(w/v)。
在特别优选的实施方案中，其中B-Y是HRP或碱性磷酸酶，该混合物还含有金属离子。在特别优选的实施方案中，金属离子是Ca2+或Mg2+(通常作为MgCl2加入)，优选在1-10mM Mg2+范围内，理想地为约5mM。
实施例19.1马来酰亚胺活化的酶与2-IT的冷冻干燥
将在5mM Tris/5mM MgCl2/0.1mM ZnCl2，pH 7.0中的碱性磷酸酶(16.2mg/ml；Biozyme编码ALP112G)用0.1M磷酸钠pH 7.2稀释至5mg/ml，并且用4mM磺基-SMCC于25℃活化1小时。然后将样本脱盐到10mM磷酸钠pH 5.8中以给出3.125mg/ml的浓度。按照需要加入赋形剂，并且最后以通常400或800μM的浓度加入2-IT。在冷冻干燥之前，酶的最终浓度是2.5mg/ml。将样本在聚丙烯管或玻璃瓶中在液氮内迅速冷冻，然后在Advantage ES冷冻干燥器中使用24小时循环进行冷冻干燥：步骤1，搁置温度-40℃，1320分钟，步骤2，搁置温度-10℃，60分钟，和步骤3，搁置温度+20℃，60分钟。冷冻干燥之后，将样本在-20或37℃贮存几天。
如实施例11所述制备EDBA修饰的HRP，并且如上所述用SMCC活化。如上所述将样本脱盐到10mM磷酸钠pH 5.8内，并且进一步如上关于碱性磷酸酶所述进行冷冻干燥制备。
实施例20冷冻干燥的mal-HRP/2-IT混合物的稳定性
将马来酰亚胺活化的EDBA修饰的HRP脱盐到pH 5.8缓冲剂内(如上所述，实施例19)，并且加入TG1以给出800μM的最终浓度，然后以40μl分批(100μg HRP)冷冻干燥。给在20mM磷酸钠/150mMNaCl，pH 7.2中的320μl 1mg/ml山羊抗-小鼠IgG抗体补充32μl 2MHepes/10mM EDTA，pH 7.25。使用100μl该材料来重新配制每个瓶中的冷冻干燥混合物。让缀合在25℃进行过夜，并且在如实施例3所述制备的小鼠IgG-包被的平板上通过ELISA进行测定。
结果如图15中所示，其是在405nm的吸收度(任意单位)对缀合稀释的log比例刻度的图。该图表明了如在本实施例中所述，使用冻干混合物制备的缀合物的滴度，所述冻干混合物在缀合之前于-20℃(实心圆圈)、25℃(空心圆圈)或37℃(实心正方形)培养过夜。
从中可以看出，在给冻干混合物施以渐增温度时，所得缀合物的性能显著损失。在1/10,000稀释，用在37℃贮存过夜的混合物制备的缀合物的吸收度信号是用在-20℃贮存的混合物制备的缀合物的约20％，并且给出1.0的稀释度所需的缀合物的稀释度以数量级改变。
实施例21.冷冻干燥的mal-酶/2-IT的稳定
在冷冻干燥和/或贮存期间，糖经常有助于稳定蛋白，并且与缺乏糖的样本相比，在37℃向马来酰亚胺-EDBA-HRP/TG和马来酰亚胺-碱性磷酸酶/TG的冷冻干燥混合物中加入海藻糖显著提高了稳定性(如通过测定由混合物制备的缀合物的ELISA中的性能所衡量的)(参见下表和实施例20)。因为碱性磷酸酶通常在Mg2+和Zn2+离子存在下分析，所以我们考虑在冷冻干燥或贮存期间金属离子可能进一步帮助稳定酶的可能性。然而，因为在冷冻干燥期间金属离子可能对其他成分(例如2-IT)有破坏作用，或者可能干扰随后的缀合反应，所以我们使用比碱性磷酸酶便宜的HRP进行某些初步试验。
如实施例19所述制备在10mM磷酸钠缓冲剂，pH 5.8中含有马来酰亚胺活化的EDBA修饰的HRP与海藻糖5％(w/v)、金属离子(如下所示)和2-IT(400μM)的冷冻干燥的混合物。在缀合之前将混合物在37℃贮存。令我们惊讶的是，对于掺杂5mM MgCl2(其对于HRP活性不是必需的)，然后冷冻干燥的HRP样本，冷冻干燥的混合物在37℃的稳定性显著改善，这是通过用混合物制备的山羊抗-兔IgG-HRP缀合物的ELISA中的性能判断的，并且如实施例3所述进行测定。在用海藻糖/2-IT/马来酰亚胺-碱性磷酸酶混合物进行的随后的实验中，我们发现MgCl2不仅在高温贮存期间对于碱性磷酸酶具有保护作用，而且具有低温保护作用。这些结果和有关其他金属离子的结果总结在下表中。
通过ELISA中的缀合物稳定性测定的mal-EDBA-HRP/2-IT和mal-碱性磷酸酶/2-IT混合物在37℃的稳定性
  酶   添加剂   ％海藻糖(-20℃)
  Mal-EDBA-HRP   海藻糖   25
  Mal-EDBA-HRP   海藻糖/Mg2+(5mM)   77
  Mal-EDBA-HRP   海藻糖/Zn2+(0.5mM)   34
  Mal-EDBA-HRP   海藻糖/Ca2+(5mM)   84
  Mal-碱性磷酸酶   海藻糖   37
  Mal-碱性磷酸酶   海藻糖/Mg2+(5mM)   104
  Mal-碱性磷酸酶   海藻糖/Zn2+(0.5mM)   44
  Mal-碱性磷酸酶   海藻糖/Mg2+(5mM)/Zn2+(0.5mM)   102
  Mal-碱性磷酸酶   海藻糖/Mg2+(5mM)   148*
*Mg2+/海藻糖在-20℃对海藻糖在-20℃
将冷冻干燥的混合物37℃培养6天(HRP)或5天(碱性磷酸酶)，然后用于制备在兔IgG ELISA中测定的山羊抗-兔缀合物。除非另有说明，％活性值是通过将由在37℃贮存的材料制备的缀合物的1/10,000稀释的ELISA吸收度值除于由在-20℃贮存的材料制备的海藻糖制剂(即没有金属离子)所获得的吸收度值而确定的。
由此可以看出，海藻糖改善了混合物对于高温的稳定性(6天损失了75％的活性the 75％loss of activity over 6days[表的第一行]很类似于没有海藻糖时1天损失的活性；参见实施例20)。Mg2+进一步显著改善了mal-EDBA-HRP/2-IT/海藻糖混合物的稳定性，并且将用于制备缀合物的冷冻干燥混合物在37℃放置6天后仅有23％的活性损失。至于包含冷冻干燥材料的缀合试剂盒，含有海藻糖和Mg2+的制剂大大地促进了在室温的运输。钙(5mM)还稳定mal-EDBA-HRP/2-IT/海藻糖混合物，但是在常用于碱性磷酸酶分析的浓度(0.5mM)下，Zn2+具有很小的保护作用。
采用碱性磷酸酶出现了类似模式，如果将mal-碱性磷酸酶/2-IT混合物在海藻糖和Mg2+存在下冷冻干燥，则所得缀合物的ELISA反应性显著提高。与仅含有海藻糖并且在-20℃贮存的制剂相比，在37℃贮存5天后，明显没有任何活性损失。然而，与HRP不同，对于HRP，赋形剂的有益作用是在高温下看到的，而不是在冷冻干燥期间，在冷冻/冷冻干燥期间，赋形剂也保护了mal-碱性磷酸酶/2-IT混合物。因此，在Mg2+存在下冷冻干燥的样本在刚刚冷冻干燥后的活性显著高于没有金属离子存在的那些。

Claims (14)

1.将第一化学本体与第二化学本体反应以生成缀合物的方法，所述第一化学本体是生物分子聚合物，其中所述第一和第二化学本体彼此共价结合，所述方法包括在含水条件下，将第一化学本体、第二化学本体和硫醇生成剂同时接触，其中硫醇生成剂在硫醇化反应中与第一化学本体反应，在第一化学本体上形成游离巯基，并且游离巯基与第二化学本体反应以形成缀合物，其中第二化学本体在其与巯基的反应性方面是多价的，并且其中第二化学本体与硫醇生成剂的摩尔比是1∶1或更小。
2.权利要求1的方法，其中所述硫醇生成剂是2-亚氨基硫杂环戊烷。
3.权利要求1或2的方法，其中第二化学本体与硫醇生成剂的比例为1∶1至1∶20。
4.权利要求3的方法，其中所述比例为1∶10至1∶15。
5.权利要求1或2的方法，其中第一化学本体、第二化学本体和硫醇生成剂在一个步骤操作中同时合并。
6.权利要求1或2的方法，所述方法包括第一个步骤，其中将硫醇生成剂与第一化学本体合并，和第二个步骤，其中将第二化学本体与硫醇生成剂以及第一化学本体合并。
7.权利要求1或2的方法，所述方法包括第一个步骤，其中将第一和第二化学本体合并，和第二个步骤，其中将硫醇生成剂与第一和第二化学本体合并。
8.权利要求1或2的方法，所述方法包括第一个步骤，其中将硫醇生成剂和第二化学本体合并，和第二个步骤，其中将第一化学本体与硫醇生成剂和第二化学本体合并。
9.权利要求8的方法，其中将第一化学本体以液体形式加到包含第二化学本体与硫醇生成剂的干燥混合物中。
10.权利要求1或2的方法，其中还包括加入亲核试剂来终止缀合反应。
11.权利要求1或2的方法，其中第二化学本体是酶。
12.用于前述权利要求任一项的方法的缀合试剂盒，其中所述试剂盒包含第二化学本体的样本和硫醇生成剂的样本，以及有关进行前述权利要求任一项的方法的说明书。
13.用于权利要求1的方法的缀合试剂盒，其中所述试剂盒包括第二化学本体的样本和硫醇生成剂的样本，以及有关进行权利要求1的方法的说明书，其中所述硫醇生成剂选自硫代内酯、亚氨基硫代内酯、环硫化物和噻唑烷。
14.权利要求12的试剂盒，其中所述试剂样本还包含多元醇。
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