CN105592860A - 抗体组合物和用于其的缓冲体系 - Google Patents

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Abstract

一种将分离的抗体缀合至标记物或衍生化试剂的方法，所述方法包括：在包含除甘氨酸以外的一元羧酸缓冲化合物(其带有处于在α或β位的氨基取代基)的缓冲体系中，使该抗体与经活化的标记物或经活化的衍生化试剂接触，或者在抗体缀合试剂的存在下使所述抗体与所述标记物或衍生化试剂接触。

Description

抗体组合物和用于其的缓冲体系
技术领域
本发明涉及用于缀合反应中的抗体组合物、抗体分离试剂盒、用于将分离的抗体与标记物缀合的方法以及用于此类组合物、试剂盒或方法的缓冲体系。
背景技术
所有抗体最初均被制成粗制品形式(例如，免疫血清、腹水、杂交瘤组织培养物上清液)。在用于许多基础研究和诊断应用中之前，必须将抗体纯化以除去许多(或全部)污染性非抗体蛋白和小分子(例如，氨基酸)。
如果要将抗体共价连接至“标记物(label)”(例如，酶、有机染料、荧光蛋白或有色颗粒)以产生杂交试剂(通常称作“标记抗体”或“抗体缀合物”)或者连接至衍生化试剂以引入新的官能团，则纯化特别重要。缀合物的抗体部分赋予针对特定抗原(例如，蛋白、药物、肽或生物标志物)的特异性，而标记物则赋予可测量性，以使该缀合物能用于对例如蛋白印迹物、组织切片、培养的细胞、血样和尿液等中的抗原进行检测和定量。
抗体纯化中的关键步骤是抗体与抗原亲和柱或者与带有固定化的蛋白A、蛋白G或蛋白L的柱的结合，所述柱与不直接参与抗原结合的抗体区相互作用。抗原亲和柱上的抗体纯化是有利的，因为粗制样品中的具有不相关抗原特异性的抗体不会保留在柱上。这种亲和纯化方法稳健可靠，且广泛用于从诸如血清、腹水和杂交瘤组织培养物上清液等粗制样品中纯化抗体。
无论使用何种纯化方式，柱结合的抗体通常用低pH缓冲液(通常包含甘氨酸或柠檬酸)洗脱，然后用例如Tris缓冲液(pH8.0至9.0)快速中和，以使低pH对抗体造成的损害最小化(例如，ThermoScientificProteinPurificationTechnicalHandbook,ref160161707/08)。用低pH甘氨酸或柠檬酸缓冲液进行洗脱被广为采用，因为其成本低且其在破坏抗体-抗原相互作用所需的pH值处具有良好的缓冲能力。
在储存之前，通常(但并非总是)在PBS或某些其它近中性的pH缓冲液中透析中和的纯化抗体。出于稳定化或避免微生物生长的目的，往往会将其它物质(例如，BSA、叠氮化钠、洗涤剂)添加至经透析的抗体。
在从商业来源购买抗体时，极少情况会得到关于纯化过程中所用的透析步骤的信息。因此，可能不清楚来自纯化过程的缓冲剂成分是否留在了最终的抗体制备物中。如果要将抗体标记，则这样的考虑至关重要，因为用于洗脱亲和柱的缓冲剂常常会在标记反应中造成严重干扰。
所有类型的标记物都最通常地与抗体分子上的赖氨酸残基连接。例如，有机荧光染料的NHS酯和流行的荧光素异硫氰酸酯衍生物(FITC)与赖氨酸残基反应。虽然其他缀合化学(例如，巯基-马来酰亚胺)可能并未明显涉及赖氨酸残基，但其几乎总是依赖于在缀合过程早期步骤中的赖氨酸修饰。例如，赖氨酸导向型异双官能NHS酯衍生化试剂常用于将马来酰亚胺和各种其它官能团(例如，受保护的巯基、叠氮基、碘代乙酰基)引入蛋白分子。碳二亚胺用于将抗体缀合至羧基化微米颗粒或纳米颗粒，其涉及表面羧基与抗体中的赖氨酸残基的反应，从而形成酰胺键。
为人熟知的是，涉及赖氨酸残基的衍生化或缀合反应不能在含伯氨基的物质(例如，游离氨基酸)的存在下进行。这是因为这类物质会与蛋白中的赖氨酸残基竞争。在碳二亚胺介导的反应(其涉及羧基与氨基的偶合)的情形中，现有技术的教导因竞争问题而强烈反对使用具有羧基或伯氨基官能团的添加剂。
因此，流行的抗体洗脱缓冲剂在几乎所有类型的抗体标记方法中都是禁忌的。甘氨酸或柠檬酸都不能出现在抗体与标记物的受碳二亚胺介导的反应中，因为该反应涉及氨基与羧基的缩合。
例如，在BioconjugateTechniques,HermansonGT,1995,ISBN0-12-342336-8,第102页(和更新的第2版中第117页，2008ISBN9780123705013)中给出了以下建议：“避免含羧基或含氨基的缓冲剂，例如柠檬酸盐、乙酸盐、甘氨酸或Tris”。
BangsLabs技术笔记205提及碳二亚胺偶联时陈述到：“应该避免含有游离氨基的缓冲剂，例如Tris或甘氨酸”。
在《ImmobilizationofEnzymesandCells》,2006,GuisanJM编,第223页,ISBN1-58829-290-8)中讨论了使用含羧基微球的反应，且给出了以下警告注释：“应该避免含有游离氨基的缓冲剂，例如Tris或甘氨酸”。
来自ThermoFisher的碳二亚胺依赖性生物素化试剂盒(Amine-PEGn-Biotin,产品编码26136)注明：“避免含有伯氨基的缓冲剂(Tris、甘氨酸等)或含有羧基的缓冲剂(乙酸盐、柠檬酸盐等)，因为它们会终止反应”。
GBiosciences的羧基偶联树脂的程序给出警告：“注意：对于使用EDC的偶联反应，避免使用含有游离氨基的缓冲剂或磷酸盐，因为它们会干扰偶联效率。Tris、乙酸盐和甘氨酸缓冲剂均易与EDC或偶联中间体反应”。
最后，用于羧基化金缀合试剂盒的规程注明：“蛋白溶液中的任何其它含氨基或羧基的分子(包括蛋白稳定剂)会与缀合反应竞争”(OceanNanotech,产品编码GCK)。
在并未同时涉及羧基修饰的针对赖氨酸的修饰反应的情形中，可以容许柠檬酸，但甘氨酸总是禁用的，例如Amine-ReactiveDyes规程(ThermoScientific,No2032.11)称：“含有伯氨基的缓冲剂(例如，Tris或甘氨酸)将会产生干扰，因为其与NHS-酯部分发生反应”。
抗体样品中的潜在干扰性小分子(例如甘氨酸和柠檬酸)可以通过透析或脱盐而除去，而后将抗体用于缀合反应中。透析去除这类分子的效率与抗体样品相对于透析缓冲液的体积、透析缓冲液的更换次数以及在下一次缓冲液更换之前是否达到动态平衡有关。这些信息对于商购抗体而言几乎总是未知的。
不幸的是，在不显著损失材料的情况下很难将商购抗体透析/脱盐，因为所述抗体通常以少量购入(例如，100μl，浓度约1mg抗体/ml)。而且，在透析期间可能发生样品的稀释，这可能需要后续的抗体浓缩步骤(导致进一步的材料损失)来实现用于抗体标记反应所需的最小浓度(通常为1mg/ml)。毫克量的抗体的透析相对容易，但过程必然较慢，且如果需要更换缓冲液数次则可能需要1至2天。高毫克级别所需的透析膜和大体积的透析缓冲液也会增加生产成本。
本发明的目的在于提供克服现有技术的不足的纯化和/或缀合抗体的方法、用于此类方法的试剂盒和抗体组合物。
发明内容
抗体标记技术在此前数年间得到了显著进展，特别是在工艺简化方面。多步缀合方法正被简单的一步工艺所取代，后者对操作者而言无需特定的化学知识。
为避免缓慢、增加成本且导致抗体损失的干涉性透析步骤，需要更好地整合抗体纯化程序和标记反应。对于“缀合友好型洗脱缓冲剂”(CFEB)存在明显的需求，因为最初被抗体纯化科学家采用的缓冲剂与大多数缀合化学都不相容。本发明人在这里将CFEB限定为pKa为1至4的缓冲剂，其不会对流行的缀合方法(即，最低限度地为抗体与碳二亚胺、NHS酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺和硫醇化试剂的反应)造成干扰。
在第一方面，本发明提供了用于缀合反应中的抗体组合物。所述组合物包含处于缓冲体系中的分离的抗体，其中所述缓冲体系包含除甘氨酸以外的一元羧酸缓冲化合物，该一元羧酸缓冲化合物带有处于α位或β位的氨基取代基。
在另一方面，本发明提供了包含除甘氨酸外的一元羧酸缓冲化合物的缓冲剂在从固相中洗脱出抗体中的应用，所述一元羧酸缓冲化合物带有处于α位或β位的氨基取代基。
在另一方面，本发明提供了一种抗体分离试剂盒，其包含用于结合抗体的固相亲和基质和用于洗脱结合至该亲和基质的抗体的缓冲剂，其中所述缓冲剂包含除甘氨酸外的一元羧酸缓冲化合物，该一元羧酸缓冲化合物带有处于α位或β位的氨基取代基。
在另一方面，本发明提供了一种将分离的抗体缀合至标记物的方法。所述方法包括：在缓冲体系中，使抗体与活化的标记物接触或在抗体缀合试剂的存在下与标记物接触，所述缓冲体系包括除甘氨酸外的一元羧酸缓冲化合物，该一元羧酸缓冲化合物带有处于α位或β位的氨基取代基。
令人意外地发现，可以在抗体缀合反应中使用包含带有处于α位或β位的氨基取代基的一元羧酸缓冲化合物的缓冲体系。这类缓冲体系既可用在抗体纯化程序中也可用在缀合反应中，由此避免对不希望的透析步骤的需要。
为了确定可能存在于商购抗体中的分子(例如，甘氨酸、柠檬酸、叠氮化物)在碳二亚胺反应中的干扰程度，发明人对抗体与商购羧基化纳米颗粒之间的反应进行了研究。发明人惊讶地发现，甘氨酸即使在高浓度下也不会导致干扰。甘氨酸既有氨基也有羧基官能团，且在现有技术中是明确禁用的。发明人利用该出人意料的发现开发了新的纯化试剂盒，其抗体产品不仅可以用于碳二亚胺反应，而且可以与其他流行的缀合化学一同使用而无需缀合前的抗体透析步骤。下文对本发明进行更为全面的说明。
所述一元羧酸缓冲化合物带有处于α位或β位的氨基取代基，并且可以进而包含一个或多个其它取代基，条件是其他取代基不能干扰缀合反应。通常，如果存在其它取代基，则这些取代基是一个或多个非氨基取代基。优选的是，缓冲化合物上不存在其它取代基。
仲氨基或叔氨基通常优选作为所述氨基取代基，因为它们与伯氨基相比在缀合反应中反应性更低。氨基取代基优选为季铵取代基。特别适合作为所述一元羧酸缓冲化合物的一类优选的化合物是甜菜碱。甜菜碱含有季铵取代基。优选的甜菜碱是N,N,N-三甲基甘氨酸，其也称作甘氨酸甜菜碱。
然而，一元羧酸缓冲化合物的氨基取代基可以是伯氨基。当一元羧酸是伯氨基酸(primaryaminoacid)时，其可以为丙氨酸、β-丙氨酸或2-氨基丁酸。常见的仲胺或叔胺包括脯氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸或2-吡啶甲酸。
一元羧酸缓冲化合物中的氨基取代基的存在通过吸电子效应使羧基阴离子稳定化，从而抑制了羧基的pKa。通常，一元羧酸缓冲化合物的羧基的pKa为1至4，优选为1.5至3.5。一元羧酸缓冲化合物的氨基的pKa通常大于8，优选大于9。在pH5的缀合反应中，氨基基本为质子化形式，因此其在缀合反应中不具有反应性。
一元羧酸缓冲化合物在抗体组合物中以小于200mM、优选小于100mM、更优选小于50mM的浓度存在。
在一种设定下，缓冲体系还包括pKa大于5.5的中和缓冲化合物。根据抗体是如何分离的，在缓冲体系中可以存在所述中和缓冲化合物。这将在下文进行更详细说明。抗体组合物的pH通常为5至9。优选存在中和缓冲剂，以便在从较低pH的固相洗脱出之后提高组合物的pH。长期暴露于低pH对于抗体组合物是不合需要的，因为这可能对抗体蛋白造成损害。
缓冲体系还可以包含pKa为6至8的锁定(catch)缓冲化合物。在这种设定下，中和缓冲化合物的pKa优选高于8，且更优选为8至11。锁定缓冲化合物的浓度优选低于中和缓冲化合物的浓度。所述锁定缓冲剂将在下文更详细说明。
在一种设定下，分离的抗体与标记物缀合。所述标记物可以包含酶、荧光蛋白、有机染料、有色颗粒、生物素、抗生蛋白链菌素或聚合物。
在一种设定下，所述缓冲体系用作抗体或抗体缀合物的储存介质。以这种方式，可以将抗体组合物储存待用，而无须在使用之前进行透析步骤。
当使用包含所述一元羧酸缓冲化合物的缓冲体系从固相中洗脱抗体时，固相可以安置在柱中。通常，固相包含针对抗体的亲和基质。缓冲液的pH通常为1.8至4.8。为了将与固相特异性结合的抗体移除，需要这种酸性的pH。
中和缓冲剂可以用在抗体的分离中，从而避免来自相对酸性的洗脱缓冲液的pH所诱导的损伤。中和缓冲剂可以包括吗啉、哌嗪或N-环己基化合物。优选地，中和缓冲剂包括2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS或HEPPS)、哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)；N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)(HEPBS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)。
中和缓冲剂的pH优选高于6。因此，将足量的中和缓冲剂引入包含酸性pH的洗脱抗体的组合物中将会使pH提高至使抗体相对稳定的水平。
在某些设定中，中和缓冲剂的pH高于8，最优选为8.5至11，例如9至9.5。中和缓冲剂的pKa通常在pH值的一单位上下。当中和缓冲剂高于8时，优选另外使用pKa为6至8的锁定缓冲剂。锁定缓冲剂的目的在于防止中和缓冲剂的使用导致包含洗脱抗体的组合物的pH升高过多。用作锁定缓冲剂的合适的缓冲化合物包括MOPS或HEPES。锁定缓冲剂可以作为pH通常为6至8的溶液添加。作为另一选择，锁定缓冲剂可以与中和缓冲剂组合。在这种情形下，组合溶液的pH通常明显高于锁定缓冲剂的pKa，且通常高于pH8。
将分离的抗体与标记物或衍生化试剂缀合的方法包括：在缓冲体系中，使所述抗体与活化的标记物或活化的衍生化试剂接触，或者在存在抗体缀合试剂时使所述抗体与所述标记物或衍生化试剂接触。抗体缀合试剂、活化的标记物或活化的衍生化试剂通常包括一个或多个以下反应性基团：碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、异硫氰酸酯或硫醇化试剂。将分离的抗体与标记物缀合的方法通常在pH为5至9时进行。有利的是，在使抗体与标记物接触的步骤之前，通过如本文所述的从固相洗脱抗体的步骤将所述抗体分离。根据本发明，用于将分离的抗体与标记物缀合的缓冲体系包含用于抗体洗脱步骤的缓冲剂。以这种方式，无需任何缓冲剂更换步骤，例如透析步骤。
具体实施方式
现在将参照以下实施例和附图仅举例而言更详细地描述本发明，其中：
图1显示了甜菜碱对荧光素缀合反应的影响；
图2显示了三(羟甲基)甲基甘氨酸对藻红蛋白缀合反应的影响；
图3显示了甜菜碱、柠檬酸和甘氨酸对异硫氰酸酯(荧光素)缀合反应的影响；
图4显示了甜菜碱、柠檬酸和甘氨酸对NHS酯(荧光素)缀合反应的影响；
图5显示了甜菜碱、柠檬酸和甘氨酸对亚氨基四氢噻吩稳定性的影响；和
图6显示了在存在和不存在锁定缓冲剂时用高pKa组分中和CFEB的结果。
在确定通常见于商购抗体中的各种物质在缀合反应中的干扰程度的实验中，发明人发现，与现有技术中的海量证据相反，高浓度的甘氨酸并不会干扰碳二亚胺介导的抗体和羧基化金纳米颗粒之间的反应。
反应中的各种物质的浓度通常为：抗体，16.67nM；抗体赖氨酸，1μM(假设60个赖氨酸/抗体分子)；EDC，0.1mM；和甘氨酸，50mM。因此，甘氨酸相对于抗体赖氨酸和EDC均存在极大的摩尔过量，但甘氨酸的酸基和氨基不会阻止抗体上的赖氨酸残基与金纳米颗粒上的羧基之间的生产性缀合反应。据发现，EDC在该反应中是必需的；在不存在碳二亚胺时不会形成缀合物。
官能团的化学反应性往往与其pKa*有关，且与反应混合物的pH有关[*下文给出的pKa值是温度为25℃时的值]。
甘氨酸中的羧基的pKa(2.35)与其它相似的脂肪族酸(例如，乙酸，pKa4.76)相比相对较低，这是由于α-氨基的稳定化(吸电子)效应。利用Henderson-Hasselbach方程进行的计算显示，甘氨酸的氨基(pKa9.8)在pH5.0时几乎完全处于其非反应性质子化形式，这可能部分地解释了为何甘氨酸的氨基在碳二亚胺反应中能够得到容许。
然而，碳二亚胺介导的反应中的第一步涉及EDC与羧基的反应，据理论显示，羧基在pH5时在甘氨酸中达到99.78％离子化(即，COO-)。这是在水溶液中攻击质子化碳二亚胺的形式，因此，考量pKa显然无法解释为何不存在甘氨酸干扰。相反，离子化的羧基据预期会消耗EDC(通过如下循环来消耗：羧基活化以及随后的快速水解或与任何可利用的氨基的反应)，因此本会干扰抗体与羧基化纳米颗粒的反应。
考虑到现有技术中关于甘氨酸在碳二亚胺介导的抗体-纳米颗粒缀合反应中的影响的误导性言论，本发明人疑惑是否可能忽视了作为潜在的缀合友好性物质的其它含氨基和含羧基物质。更为重要的是，发明人希望鉴定出与多种抗体缀合技术相容的物质，而不仅仅是与碳二亚胺介导的反应相容的那些。
发明人集中测试了可能适合用作抗体亲和柱洗脱用缓冲剂的pKa值约为1至4的有机酸。发明人还将研究扩展至包括其它常见抗体添加剂和各种酸、氨基酸和其它衍生物，以试图理解甘氨酸在碳二亚胺反应中不产生干扰的背后机理。
起初，在pH5下在EDC介导的与羧基化金纳米颗粒(InnovaCoatGOLD,InnovaBiosciences)的反应中对分子进行测试。进而，在NHS酯反应、异硫氰酸酯反应和涉及亚氨基四氢噻吩的硫醇化反应中，评估来自该筛选测试的潜在可关注分子。所有这些反应都广泛用于抗体缀合领域，且据预期会受甘氨酸的存在的干扰。
采用碳二亚胺介导的反应进行筛选的结果如表1所示。
作为抗体中的常见添加剂的磷酸盐和叠氮化钠引起了干扰，这可能是因为直接与EDC反应。作为常见的含伯氨基中和缓冲剂或储存缓冲剂的Tris导致了严重的干扰。
鉴定出了几乎没有或没有影响的几种氨基酸和相关分子，包括丙氨酸、DL-2-氨基丁酸、甜菜碱(甘氨酸甜菜碱；N,N,N-三甲基甘氨酸)、N,N-二甲基甘氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、2-吡啶甲酸(2-吡啶羧酸)、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine,(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸))和脯氨酸。
其它氨基酸显示出显著的干扰，包括GABA(γ-氨基丁酸)和烟酸。
具有两个酸性基团的一元氨基酸(例如，天冬氨酸)导致了严重的干扰(数据未示出)。
导致严重干扰的其它酸(即，缺乏氨基的那些)包括柠檬酸、琥珀酸、三氯乙酸和2,4,6-三羟基苯甲酸。
导致显著干扰但不会完全破坏缀合反应的酸包括环己烷甲酸、乙酸钠和新戊酸。
综上，这些数据指明了必须设计到CFEB缓冲剂中以使对碳二亚胺反应的干扰最小化的结构特征。
所有具有一个酸官能团且没有氮原子(即，没有伯氨基、仲氨基或叔氨基；或者没有季铵化铵离子)的分子都导致了干扰。具有两个酸官能团的分子不论是否还存在氨基均导致了干扰。因此，同时存在氨基和羧基(其各自据预期在碳二亚胺反应中是禁用的)在某些情形中可以实际上共同防止干扰。
显然地，氨基相对于酸基(典型地，羧基)的位置至关重要。对于显示出最小干扰的化合物，氨基和羧基官能团被一个原子隔开。具有两个间隔原子的某些分子被合理地良好容许，但具有三个间隔原子的化合物会导致显著干扰。
在GABA中，氨基与羧基官能团被三个原子隔开，且氨基不会抑制酸的pKa(pKa4.23)。在pH为5时大多数酸基(85.5％)处在推定的反应性COO-形式，相比之下对于甘氨酸而言更大的量为反应性形式(约99.8％)。然而，GABA显著抑制碳二亚胺介导的反应，而甘氨酸(pKa2.3)则不会。作为氨基和羧基官能团邻近(即，间隔1个原子)的GABA异构体，DL-2-氨基丁酸(pKa2.29)没有显示出干扰。
对于芳香酸烟酸(pKa2.2)观察到了类似的结果，其显示出在碳二亚胺反应中的部分干扰，而其异构体吡啶甲酸(pKa1.07)(其中氨基氮与羧基邻近)则没有影响。
因此，邻近处没有氨基的羧酸导致干扰，尤其是如果其具有低pKa值且在pH5时被显著离子化。TCA(pKa0.7)在pH5时基本完全被离子化，并导致严重干扰。相比之下，新戊酸(pKa＝5.03，即在pH5时约50％被离子化，其中三氯乙酸的氯原子被甲基替代)仅显示出部分抑制。
因此，对于甘氨酸在本发明的水溶液中的碳二亚胺反应中没有影响的最为稳妥的解释是，带负电荷的中心与带正电荷的中心通过氢键而相互作用，形成分子内环，从而导致羧基反应性的降低。这种相互作用必须还涉及一个或多个水分子，因为甘氨酸在气相不会形成两性离子。即使是简单的氨基酸(例如甘氨酸)，其溶液结构也是非常复杂的，认为有若干个水分子参与对甘氨酸两性离子的稳定化(Xu等，J.Chem.Phys.119,10696-10701,2003)。
通常，在化学中，五元环或六元环的形成相对于高度受限的三元环或四元环或者具有7个以上原子的环更为有利。因此，可能的是不干扰本发明的碳二亚胺反应的一元羧酸化合物具有带电荷的氨基和羧基，其能够彼此直接相互作用，或通过桥接性溶剂分子(或可能的离子)而间接相互作用，以获得低能量状态的五元环或六元环。然而，当带电荷基团更为遥远时(即，间隔三个原子)，分子内环过大以至于不能在热力学上有利，且离子化的羧基可自由地与质子化的碳二亚胺反应。
因此，具有关键结构特征(即，氨基和羧基邻近(且没有其它干扰性基团)且各基团基本离子化)的任何分子都很可能在pH5的碳二亚胺反应中展示出低反应性。当羧基的pKa足够低(<4)时，分子也可能适于洗脱抗体柱。
具有所述关键结构特征的缓冲剂可以具有其它应用。例如，在pH值低于5时，吡啶甲酸(氨基pKa5.52)是远好于MES(pKa6.15)的缓冲剂。在这些pH值时，2-吡啶甲酸的氨基将基本质子化，并因此会使羧基失活。令人感兴趣的是，MES缓冲剂常用在pH4.7的碳二亚胺反应中，虽然事实上MES在该pH不可能是有效的缓冲剂。在该pH时使用MES的解释可能是，对于具有氨基和羧基的缓冲剂的预期干扰作用有顾虑。
虽然在抗体与羧基化颗粒之间的在约pH5下的碳二亚胺反应中能够容许甘氨酸，但在更高pH值下进行的缀合反应(例如，NHS酯反应)中甘氨酸的伯氨基的反应性可能会高得多，因为氨基更不易被质子化。发明人推测，与伯氨基(例如在甘氨酸中)相反，包含仲氨基或叔氨基或者季铵化铵盐的酸分子在较高pH值下进行的基于赖氨酸的缀合反应中可能显示出减少的干扰，同时仍会抑制在约pH5的碳二亚胺反应中的羧基的活性。
在商购的基于氨基的缀合技术(Lightning-Link；InnovaBiosciences；英国专利2446088号和2467041号)中，对从在碳二亚胺介导反应的初始测试中得到的推定CFEB进行测试。在Lightning-Link荧光素缀合反应中，浓度为50mM的甘氨酸(数据未示出)和脯氨酸(仲胺)导致了显著干扰。2-吡啶甲酸显示出轻度的干扰。甘氨酸甜菜碱(一种季铵化铵盐)和N,N-二甲基甘氨酸(叔胺)几乎没有或者没有影响(在50mM浓度，占对照值的％分别为98％、96％)。示出了在存在甘氨酸甜菜碱时制备的缀合物相对于没有添加剂的对照的全剂量响应曲线(图1)。该图显示出，在Lightning-Link反应中，处于各种浓度的甜菜碱不存在浓度依赖性效应。对照(无甜菜碱)，正方形；1mM甜菜碱，三角形；10mM甜菜碱，空心圆形；50mM甜菜碱，实心圆形。
用荧光蛋白(藻红蛋白)在Lightning-Link反应中对三(羟甲基)甲基甘氨酸(一种仲胺)进行了评估。在浓度为50mM时，在缀合反应中存在轻度的干扰(对照的91％)。图2示出了剂量响应曲线。该图显示出，在Lightning-Link反应中，处于各种浓度的三(羟甲基)甲基甘氨酸不存在浓度依赖性效应。对照(无三(羟甲基)甲基甘氨酸)，正方形；1mM三(羟甲基)甲基甘氨酸，三角形；10mM三(羟甲基)甲基甘氨酸，空心圆形；50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸，实心圆形。
还在异硫氰酸酯反应(图3)和NHS酯反应(图4)中评估了甘氨酸甜菜碱，并将其与抗体纯化研究中两种最常用的缓冲剂(甘氨酸和柠檬酸)进行比较。图3示出了在存在各种添加剂时用荧光异硫氰酸酯(FITC)制备的抗体染料缀合物的染料摩尔数与蛋白摩尔数之比。甜菜碱和柠檬酸给出了与对照(无添加剂)类似的结果。甘氨酸显示出了显著的干扰。图4显示了在存在各种添加剂时用荧光素NHS酯制备的抗体染料缀合物的染料摩尔数与蛋白摩尔数之比。甜菜碱和柠檬酸给出了与对照(无添加剂)类似的结果。甘氨酸显示出了较大的干扰。与柠檬酸在碳二亚胺反应中的强抑制效应不同(表1)，柠檬酸在氨基依赖性反应中可得到容许。如所预期的，甘氨酸导致了显著干扰，特别是在用NHS酯时。甘氨酸甜菜碱在两个测试中均得到良好容许。
虽然甘氨酸的伯氨基的缺失将在NHS酯或异硫氰酸酯反应中避免与抗体赖氨酸的任何竞争，但所产生的分子(即，乙酸)并不适于亲和柱的洗脱，因为该酸基的pKa(4.76)过高，因此其不能在所需pH范围内充当缓冲剂。而且，乙酸在碳二亚胺反应中显示出比甘氨酸更大的干扰，虽然事实上乙酸有显著比例的羧基处于非反应性的质子化形式。
常常在抗体中(和在其它含氨基物质中)引入新的官能团(例如，受保护的巯基)以扩大能够进行的可能的衍生化反应的范围。这些修饰几乎总是使用在一个末端具有NHS酯基的异双官能性分子。由于NHS衍生物均显示出与伯胺基本相同的反应性，因此甜菜碱与极宽范围的流行NHS缀合反应相容。
也可以利用不依赖NHS酯的技术将巯基直接引入抗体。例如，可以使用2-亚氨基四氢噻吩来修饰赖氨酸残基以引入巯基。图5显示出甘氨酸与2-亚氨基四氢噻吩快速反应，因此在抗体或其它含氨基物质与2-亚氨基四氢噻吩的反应中不能被容许。如所预期的，柠檬酸对于这种特定的氨基依赖性反应没有影响，且季铵化合物甘氨酸甜菜碱仍然没有影响。
其它季铵化合物也是合适的CFEB，例如，与甘氨酸甜菜碱类似的脯氨酸甜菜碱。
优选地，伯氨基的pKa值大于9或大于10，或者pKa值应该在期望的缀合反应的pH值之上至少1个单位或优选2个单位，以使该氨基基本质子化且相对无反应性。仲氨基比伯氨基更为优选，叔氨基比仲氨基更为优选。季铵盐特别优选，因为氮原子在所有的pH值均保有正电荷。
在亲和色谱中，为了实现高回收率，通常在pH2.3至pH3.5洗脱柱；最常用的pH是pH2.3、pH2.8或pH3.0。必须快速地将洗脱的抗体中和以避免pH造成的损害。在CFEB的情形中，仅需在缀合前将溶液中和(即，极为重要的是无需透析)，随后必要时进行进一步的简单pH调节，以满足所关注的特定缀合反应的要求。
优选地，CFEB的pKa应该低于亲和柱的洗脱所用的pH。
虽然传统上使用pH值接近pKa值的缓冲剂，但在本发明中，不必经过CFEB对pH变化的最大抗性点(即，pH等于pKa值的点)，这是中和步骤过程中的明显优点。然而，CFEB仍必须在使用其的pH值处是有效的缓冲剂。通常，认为有用的缓冲范围是pKa±1单位。利用趋向有用的pH缓冲范围的上限的pH，将需要更少量的中和缓冲剂，于是中和的抗体具有尽可能最低的全局缓冲能力。这很重要，因为后续的缀合反应可能在许多不同的pH值下进行，而且在抗体被纯化和中和时抗体的期望用途可能并不是已知的。如果用抗体配制成的溶液具有低缓冲能力，则可以通过添加更强力的缓冲剂而容易地将抗体调节为任何新的pH值。
CFEB的浓度应该足以破坏抗体的结合，但为了便于进行后续的中和步骤，所使用的浓度不应超过绝对必须的浓度。CFEB的浓度优选小于200mM、更优选小于100mM且进而更优选小于50mM。
从亲和柱洗脱的效率部分地由CFEB的浓度决定，因为柱在洗脱之前通常用约pH7.5的缓冲液洗涤以除去非抗体蛋白。因此，如果洗涤缓冲液是50mM，则用例如10mMCFEB变至低pH将不如用50mMCFEB时那样突然，因为在引入新的缓冲液时在柱的顶部将不可避免地存在缓冲液的某种混合。
因此，理想的是，在添加CFEB之前，可以使用少量的约pH7的弱缓冲液来置换更强力的平衡/洗涤缓冲液。作为另一选择，或者更为优选地，在低pH洗脱之前，应该用具有相对低的缓冲能力的单一溶液来平衡和洗涤柱。必要时，即使在缓冲剂浓度有任何降低时，也可以通过添加例如NaCl等非缓冲性盐(例如，强酸和强碱的盐)来保持离子强度。
在小规模抗体纯化的情形中，借助将亲和柱基质离心以驱除液体，可以基本消除柱洗涤缓冲液，但应该小心不要让基质变干，否则可能会损害结合的抗体。
在本发明的特别优选的实施方式中，CFEB是季铵化合物甘氨酸甜菜碱，其pKa为1.8，显著低于通常用于洗脱亲和柱的pH(例如，pH2.3和pH2.8)。
如果要在更高的pH(例如，pH3.0)洗脱柱，可以选择具有略微更高的pKa的洗脱缓冲剂；例如，三(羟甲基)甲基甘氨酸，其羧基的pKa值与甘氨酸的羧基pKa值相当(pKa2.3)。作为另一种选择，可以使用略微更高浓度的甜菜碱(例如甘氨酸甜菜碱)来维持所需的缓冲能力，即使超出正常缓冲范围(即，在以上实例中，pH＝pKa+1.2，而不是pKa+1.0)。
可以用于抗体纯化中的其它物质(柱平衡缓冲剂、洗涤缓冲剂和中和性物质)也必须与期望的缀合反应相容，从而不会抵消使用CFEB进行洗脱的益处。
虽然TBS(Tris缓冲盐水)和PBS(磷酸盐缓冲盐水)常用作亲和色谱中的平衡/洗涤缓冲液，但其在基于CFEB的抗体纯化程序中均不是优选的，除非使用洗脱前缓冲液置换策略。Tris干扰氨基依赖性反应，而PBS干扰碳二亚胺反应。
然而，生物学中使用的许多pKa值高于6的缓冲剂都适合用于缀合反应。具有磺酸基和哌嗪或吗啉环的缓冲剂是常用的且与大多数缀合反应相容，前提是缓冲剂中不存在其它可能的干扰性官能团。在一类中，这些缓冲剂仅在亚甲基或羟基取代基的数目和位置方面有所不同。
哌嗪类缓冲剂包括但不限于：(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)(pKa7.5)；3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS或HEPPS)(pKa8.0)；哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)(PIPES)(pKa6.76)；N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)(pKa7.8)；N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)(HEPBS)(pKa8.3)。
吗啉类缓冲剂包括但不限于：3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)(pKa6.9)；2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)(pKa6.1)；3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)(pKa7.2)。
另一类具有相对较高的pKa值的缓冲剂包括但不限于N-环己基衍生物：N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)(pKa9.5)；N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)(pKa10.4)；4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)(pKa10.7)；3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)(9.6)。
以上缓冲剂存在其它结构变化形式，更具体的列表可见于Goldberg等，(J.Phys.Chem.Ref.Data,第31卷，第2期,2002)。
通常，所有以上的缓冲剂都是潜在可用的中和性物质和/或缓冲性物质，且在大多数缀合反应中会被容许。一种或多种缓冲剂的选择将取决于抗体的预期用途，尤其是所需的最终溶液pH。
在本发明的一个实施方式中，上文提及的pKa值在pKa＝8±1单位范围内的缓冲剂是优选的平衡和洗涤缓冲剂。这些缓冲剂包括MOPS、HEPES、EPPS，但该选择并非限制性。
就中和缓冲剂而言，上文提及的任何缓冲剂都是潜在的合适的缓冲剂。然而，缓冲剂(或多种缓冲剂，见下文)的选择必须考虑到所需的最终pH和缓冲剂的pKa值的适当性。
在本发明的优选实施方式中，中和缓冲剂的pH高于其pKa值，从而需要尽可能低的量的缓冲物质来中和含CFEB的抗体溶液。例如，EPPS缓冲剂(pKa8.0)的溶液可以在pH9.0制备。通过向特定体积的洗脱抗体的CFEB溶液中添加特定体积的处于特定浓度的中和缓冲剂，可以将最终pH设计为在生理pH附近，这仍在EPPS缓冲剂的可用缓冲范围内。
也可以将中和缓冲剂在其可用缓冲范围之外使用。例如，Hepes缓冲剂(pKa7.5)可以在约pH9使用，前提是要非常小心地避免在缓冲能力极低的区域中调节pH时的过调节(overshoot)风险。因此，将缓冲剂拉出其正常缓冲范围(即，pKa±1单位)的过量碱(例如，NaOH)中和了洗脱的抗体中的部分酸而形成盐，由此使实际的中和性缓冲物质(即，在该情形中为Hepes)的质量和最终浓度最小化。
大多数抗体缀合反应在pH5至pH9进行，因为大多数普通反应涉及NHS酯(通常在约pH8反应)、马来酰亚胺(约6.5-7.5)、碳二亚胺(通常约pH5-6)和硫醇化试剂(通常约pH8-8.5)。
在本发明的优选实施方式中，中和缓冲剂包括两种缓冲性物质，一种(“高pKa组分”)的pKa高于8，例如优选约pKa9或pKa10，而另一种(“锁定缓冲剂”)的pKa为约7。
中和缓冲剂的两种组分可以分别添加或作为混合物添加。
当这两种组分分别添加时，优选将锁定缓冲剂在高pKa组分之前添加，以避免在添加高pKa组分时过调节至高pH值。
在采用新型CFEB的探索性研究中，分开添加是有优点的，因为可以逐份地添加高pKa组分并在每次添加后测定pH。随后，可以单次添加组合的高pKa组分/锁定缓冲溶液，从而通过以所需的量预混这两种物质来实现的相同的终点。
作为选择，可以将已知体积的几种潜在CFEB(或者处于不同pH值的一种CFEB)与一系列潜在中和缓冲剂中的每一种(以不同的体积)混合，且可在每种情形中确定最终pH并制表。在后续实验中，根据抗体在CFEB中的溶液的测定体积，可以参考表来确定使用何种中和缓冲剂和添加多少来得到所需的最终pH。
添加两种缓冲剂组分导致洗脱的抗体的中和，其后创建包含CFEB、高pKa组分和锁定缓冲剂(忽略抗体和任何其它的以极低浓度存在的缓冲物质)的三重缓冲体系。
高pKa组分倾向于来自通常具有相对较高的pKa值的N-环己基系列缓冲剂，但这并非意在进行限制。
中和缓冲剂的pH优选高于pH7，更优选高于8，进而更优选为pH8.5至pH11。约pH9-9.5的pH特别有用，该pH不太可能在接触CFEB混合物时损害抗体。对于对高pH敏感的抗体，当然可以使用更低的pH。
如果使用高pKa组分，理想的是中和性溶液的pH在pKa值的一个单位上下。如果pH高于pKa值，将比pH低于pKa时需要更少量的缓冲物质来中和CFEB。然而，由于高pKa组分在近中性pH几乎没有缓冲能力，用于中和CFEB的量并非特别重要，且必要时使pH远离pH7将不会受到高pKa组分的阻碍。
当中和性缓冲剂被添加至经CFEB洗脱的抗体(通常处于pH2.3-3.0附近)时，混合物将变得更为中性。在审慎选择抗体(处于CFEB中)和中和性缓冲液的体积后，锁定缓冲剂将能使pH保持(即，“锁定”)在pH6至8(即，锁定缓冲剂pKa±1pH单位)。
锁定缓冲剂理想地以尽可能低的浓度存在，但其必须以足以容许CFEB溶液与中和缓冲液的体积比的轻微变化(该变化可能由于例如移液或测量的不准确性而发生)的量存在，以确保pH处在储存抗体所希望的范围内。期望的是最终浓度约为10mM，但这并不作为限制。
如果锁定缓冲剂在高pKa组分之前添加，则后者必须快速添加，因为锁定缓冲剂通常并非主要的中和性物质。
在抗体样品被中和后，源自中和性溶液的高pKa组分不再是有效的缓冲剂。类似地，pKa大体上约为(但优选低于)柱洗脱pH(即，在约pH2.5的区域)的CFEB在pH7时也不是有效的缓冲剂。相反，以相对较低的浓度存在的“锁定”缓冲剂(pKa约为7)提供了所有的有效缓冲能力，但可以通过添加第四缓冲剂(或者酸或碱)来使溶液的pH相对容易地移动到pH5至pH9范围内的新pH值。即使在这个宽的取值范围内，高pKa缓冲组分(假定pKa>9，优选为9.5以上)和CFEB在抵抗任何所需的pH变化方面均不是特别有效。
锁定缓冲剂的结构特征与对于中和缓冲剂所要求的结构特征相似，区别在于理想的是锁定缓冲剂的pKa值应当为约pH7。优选地，该pKa应为pH6至8，且最终pH约为7～7.5，但也可以在该范围之外工作，前提是抗体在所选的最终pH值处稳定。
优选的锁定缓冲剂包括MOPS(pKa7.2)和HEPES(pKa7.5)，但这并非限制性。具有类似pKa值的其它缓冲剂也可以用作锁定缓冲剂。
高pKa组分和锁定缓冲剂的优选组合(不论分开添加还是一起添加)包括CHES以及MOPS或HEPES。同样，这些组合并非限制性。
最后，可以在适当的pH值使用某些含氨基的羧基缓冲剂，其作为CFEB或作为中和缓冲剂(例如，三(羟甲基)甲基甘氨酸和相关分子N,N-二羟乙基甘氨酸)。
从缓冲剂理论出发，显而易见的是，通过将不同的CFEB与包含高pKa组分和锁定缓冲剂的中和性溶液组合，可以创建约pH7的各种各样的多组分低缓冲能力溶液。除了显然不能有具有会干扰预期缀合反应的官能团的组分外，中和缓冲剂中的具体组分不受限制。
使用本发明的方法的缀合反应包括：使处于合适pH的抗体/CFEB混合物与包含活化的标记物(或标记物和活化性化学物质)、缓冲剂和必要的其它添加剂的组分混合物相接触。在某些情形中，连接的是带有有用的官能团的小分子而非标记物，通常是为了允许稍后通过该官能团来连接标记物。确切的添加顺序可以根据缀合反应的性质而有所不同，但最终在缀合反应开始时使得CFEB、锁定缓冲剂和/或中和缓冲剂、标记物(或衍生化试剂)和抗体(或待标记的蛋白)同时彼此相接触，这是本发明的方法的独特之处。这一概念是在以下的出人意料的发现之后建立的：在某些情形中，如甘氨酸等氨基酸在碳二亚胺介导的抗体和纳米颗粒之间的反应中可以被容许。
在任何标记反应中，重要的是，当将中和的抗体的溶液添加至反应时，其不会使混合物的pH远离所需的缀合pH。当抗体占总反应体积的一小部分且抗体溶液的缓冲能力低时，发生显著pH变化的概率较低。因此，用CFEB和合适的中和缓冲剂配制并以合适的体积添加的抗体将会与许多不同的受缓冲的缀合反应相容。
如果中和的抗体较稀且体积添加量将占总测试体积的较大比例，则必须将缀合反应中的主要缓冲性物质充分浓缩，以便接纳抗体样品且不发生任何显著的pH变化。作为另一选择，可以利用本领域熟知的简单技术(例如，微浓缩)提高抗体浓度来减少所要添加的体积。
然而，如果目的是仅进行一种类型的缀合反应，可以将CFEB中的抗体中和并直接调节至所需的缀合pH。在这种情况下，无需将pH调节至其它值的灵活性，但在避免缀合前的透析步骤这一点上仍是巨大的益处。
例如，如果缀合反应将在pH9进行，则可以简单地将抗体调节至pH9。在这一情景中，不必使用pKa约为7的锁定缓冲剂；而是可以将略高于pH9(且理想的是pKa约为9)的缓冲剂与洗脱的抗体以所需的体积比混合以实现所需的最终pH。
如果仅要将一部分抗体在pH9缀合，则优选仅将一部分抗体调节至pH9，或者使用合适的锁定缓冲剂和高pKa的中和缓冲剂的组合将整个CFEB抗体溶液调节至约pH7。然后可以根据需要并在需要时将经中和的溶液的一部分的pH提高至pH9。
当处理大体积(即，数毫升甚至数升)的抗体时，对于用精确体积的中和缓冲剂来中和CFEB中的洗脱抗体的需求不那么重要，因为此时能将pH探针插入抗体溶液中。理想地，将具有适当pKa的碱性缓冲剂(或处于合适的pH的锁定缓冲剂和高pKa组分的组合)快速添加至CFEB而无需考虑确切的最终pH，除了该pH必须被提高至足以使pH引起的抗体损害最小化的程度，并且优选地使pH停留在低于最终所需的pH的点。其后，如果在中和步骤中pH发生过调节，可以利用pH计并添加合适的碱(例如，NaOH溶液或缓冲液)或酸(例如，稀HCl)来最终调节至正确的pH。
通过谨慎地选择洗脱缓冲剂、其浓度、其可离子化基团的pKa和洗脱缓冲液的pH(尤其是相对于其pKa值)，可以用较高pH的缓冲剂或者缓冲剂组合(其具有谨慎选择的pKa值)来容易地中和抗体，而不以任何方式限制抗体在未来的不同类型的缀合反应中的应用。
还可以用高pH溶液(pH>10)而不是低pH溶液来洗脱抗原亲和柱。相同的CFEB要求也适用于此处；洗脱缓冲剂必须与期望的缀合反应类型相容。采用从低pH至高pH转变的洗脱策略时，选择出合适的中和(即，酸性)缓冲剂变得更具挑战性，因为显见的缓冲剂(甘氨酸、柠檬酸)对于许多流行的缀合化学是不允许的。然而，如果计划进行非氨基依赖性反应，则或许可以使用柠檬酸作为中和缓冲剂。如果考虑碳二亚胺反应，则中和缓冲剂可以是低pH甘氨酸，其可与合适的锁定缓冲剂一同使用，但优选的是使用低pH甘氨酸甜菜碱和锁定缓冲剂。
N,N-二甲基甘氨酸(氨基pKa为9.8)是在高pH洗脱亲和柱时的良好候选物。在此情形中，中和缓冲剂可以具有约7的pKa并作为pH6的溶液添加。缓冲剂必须经充分浓缩以中和高pHCFEB，或者可以添加酸(但大多数情况下不是柠檬酸、乙酸或低pH甘氨酸)来调节pH，并在可能时借助pH计进行监测。pKa约为7的缓冲剂则充当锁定缓冲剂，以避免过调节至极低的pH值。合适浓度的盐酸将是中和性酸的显而易见的选择，但并非限制性选择。作为另一选择，可以使用低pH甘氨酸甜菜碱(优选与上述pKa约为7的锁定缓冲剂组合)来中和用于洗脱亲和柱的高pH溶液。
利用本发明的方法，将具有谨慎选择的浓度和pKa值的缓冲剂的混合物与洗脱的抗体在CFEB缓冲剂中的制备物简单组合，从而提供了用于抗体储存的多组分中性溶液，其pH随后可以在pH5至9范围内容易地改变以适于几乎任何缀合反应，即，涉及NHS酯反应的反应、异硫氰酸酯反应、涉及硫醇化试剂的反应以及碳二亚胺介导的抗体与纳米颗粒的缀合。
实施例
实施例1.侧向流检测
从用山羊抗兔IgG(测试线)和生物素-BSA(对照线)划线的硝酸纤维素膜(MilliporeHiFlowplus90)制备了侧向流测试条带(宽4mm)。将条带装入塑料盒中并向样品板添加金缀合剂样品(80μl)。使塑料盒静置30分钟，然后用ESE-QuantGOLD读取器(QIAGEN)读数。每个样品都添加有固定量的与对照线结合的抗生蛋白链菌素-金(Innovabiosciences–产品编码:250-0200)，以检验每个测试条带已正确地运行且测试线数据有效。
实施例2.荧光检测
将黑色96孔板(GreinerBio-One(编码655077))与50μl兔IgG(1μg/孔)在4℃过夜温育。将板用TBS/0.1％BSA在室温封闭1小时，并用TBS(洗涤缓冲液)洗涤5次。将荧光抗体缀合物在TBS/0.1％BSA中连续稀释，并将50μl的等分试样一式三份地添加至孔内。在室温温育1小时后，将板洗涤5次，并使用带有i-Control1.4软件的TecanInfiniteM200平板读取器以适当的激发/发射设定(荧光素，490nm/535nm；藻红蛋白，535nm/575nm)读取荧光发射。将荧光数据作为缀合物稀释度的函数作图。为了比较在不同实验中测试的添加剂的结果，将数据转换为占对照值(即，在没有任何测试添加剂存在的情况下制备的缀合物的信号)的百分比。
实施例3.与羧基化金的缀合反应
在50mM最终浓度的添加剂存在下，对于每毫升的具有羧基官能团的经涂布的40nm纳米颗粒(InnovaCoatGOLD,InnovaBiosciences)，使用10.0OD的10μg山羊抗兔IgG(GAR)。通常，进行以下添加来设置反应：将40μl的40nmInnovaCoat(羧基化)金纳米颗粒与4μl0.1mg/mlGAR、20μl水和80μl的含100mM添加剂的100mMMES缓冲液(pH5.0)一起温育5分钟。随后，添加16μ的1mMEDC，在22℃温育10分钟后，添加20μl的10XTBS/1％Tween20和20μl水以得到2OD缀合物。
在需要时将金缀合物与兔IgG(最终浓度为50ng/ml)于22℃混合。缀合物为0.2OD终浓度(即，储备缀合物的1/10稀释物)。将样品如实施例1所述在侧向流测试条带上一式三份运行。
实施例4.不同添加剂对Lightning-Link荧光素缀合反应的影响
反应根据制造商的标准规程来进行，不同之处在于：在使用荧光素Lightning-Link试剂盒(产品编码707-0010,InnovaBiosciences,英国)进行的山羊抗兔IgG的缀合反应中，以至多50mM浓度的包括添加剂。根据实施例2中所述的规程对缀合物进行测试。图1中示出了在甘氨酸甜菜碱存在时制备的缀合物的剂量响应曲线，并且，在以下化合物存在时制备的缀合物(1/100稀释)的占对照值的％(括号中的值)为：与无添加剂的对照(100％)相比，脯氨酸(53％)，甘氨酸甜菜碱(98％)，N,N-二甲基甘氨酸(96％)，2-吡啶甲酸(83％)。
实施例5.三(羟甲基)甲基甘氨酸在Light-Link藻红蛋白缀合反应中的效果
方法如实施例4中所述，不同之处在于利用Lightning-LinkPE缀合试剂盒(703-0005)将山羊抗兔IgG与荧光蛋白藻红蛋白(PE)缀合。在三(羟甲基)甲基甘氨酸存在时制备的藻红蛋白缀合物的剂量响应曲线如图2所示。三(羟甲基)甲基甘氨酸在所测试的浓度范围内对Lightning-LinkPE缀合反应几乎没有影响。在此情形中，以最高浓度的三(羟甲基)甲基甘氨酸(50mM)制备的缀合物给出了占对照值(没有添加剂存在时)的91％的信号。
实施例6.添加剂对异硫氰酸酯反应的影响
将40μg的10mg/ml兔IgG与在含50mM添加剂(甘氨酸甜菜碱、柠檬酸或甘氨酸中的一种)的80mMCHES缓冲液(pH9.0)中的50μMFITC在暗处于22℃温育过夜。将缀合物在PD10柱(GEHealthcare)上于TBS缓冲液中脱盐，并在280nm和495nm确定洗脱出的溶液的吸光度值。图3中显示了在不同的添加剂的存在下抗体染料缀合物的染料摩尔数与蛋白摩尔数之比。甘氨酸显示出显著的干扰，而甘氨酸甜菜碱和柠檬酸则给出与对照(即，没有添加剂)类似的结果。
实施例7.添加剂对NHS酯反应的影响
将40μg的10mg/ml兔IgG与在含50mM的不同添加剂中的一种(来自甘氨酸甜菜碱、柠檬酸或甘氨酸)的80mM磷酸钠溶液(pH8.0)中的50μM荧光素-NHS染料在暗处于22℃温育30分钟。将缀合物在用TBS缓冲液平衡的PD10柱上脱盐，并在280nm和495nm确定洗脱出的溶液的吸光度值。图4中显示了在不同添加剂存在下抗体染料缀合物的染料摩尔数与蛋白摩尔数之比。甘氨酸甜菜碱和柠檬酸给出了与对照(无添加剂)类似的结果，而甘氨酸则显示出显著的干扰。
实施例8.添加剂对于硫醇化试剂2-亚氨基四氢噻吩的影响
将含80μg/mlDTNB和50mM添加剂(甘氨酸甜菜碱、柠檬酸或甘氨酸)的100mM磷酸钠溶液(pH8.0)的200μl样品一式三份添加至透明96孔板(GreinerBio-One，编码655077)中。向各孔添加20μl的2mM2-亚氨基四氢噻吩并快速混合，使用TecanInfiniteM200平板读取器用i-Control1.4软件持续30分钟每分钟读取405nm处的吸光度值。来自2-亚氨基四氢噻吩的巯基释放如图5中所示。该图显示出2-亚氨基四氢噻吩的开环反应中的巯基释放。在对照反应中，吸光度随着试剂被水所水解而稳定地线性增加。在甜菜碱或柠檬酸的存在下该速率未增加(曲线与对照曲线叠加)。在甘氨酸存在下，发生快速水解和2-亚氨基四氢噻吩的开环。甘氨酸甜菜碱和柠檬酸的释放巯基的速度均不比对照反应(无添加剂)中所观察到的更快。升高的基线可能是由于已知的2-亚氨基四氢噻吩在碱性pH值下对水解的敏感性。
实施例9.使用锁定缓冲剂和高pKa组分来中和CFEB样品
向3ml甘氨酸甜菜碱(pH2.25)中添加“锁定”缓冲剂(30μl的1MHepes,pH7.5)，随后反复添加10μl的高pKa组分(0.5MCHES缓冲液，pH9.5)。每次添加后测定pH。在添加70μl、80μl和90μl的CHES缓冲液(pH9.5)后，混合物的pH值为7.25、7.45和7.6。图6显示出采用和不采用锁定缓冲剂时的完全pH曲线。该图显示出在采用(实心圆)或不采用(空心圆)锁定缓冲剂(30μl的1MHepes,pH7.5)并随后反复添加10μl的0.5MCHES缓冲液(pH9.5)时对3mlCFEB(甜菜碱，pH2.25)的中和情况。添加锁定缓冲剂将pH升高了约1个pH单位，因此曲线具有不同的起始位置。更重要的是，虽然添加了pH9.5的中和缓冲液，但锁定缓冲剂(pKa7.5)在pH7至pH8之间抵抗pH变化，使得易于将pH调节至pH7.5附近的任意值。在不存在锁定缓冲剂时，在单次添加10μl的CHES缓冲液(从90μl至100μl)时观察到从pH4.87到pH8.19的急遽变化。
实施例10.展示柱
将山羊抗小鼠Sepharose珠装填于一次性柱中(0.5ml装填体积)。在与TBS中的小鼠IgG样品温育2小时后，将柱用10mM磷酸钠/150mMNaCl(pH8.0)洗涤，然后用10mM甜菜碱(pH2.3)洗脱。收集100μl的级分，并立即用11.1μl的含有50mMHepes(锁定缓冲剂)和90mMCHES(高pKa组分)的10X缓冲液A来中和。所述10X缓冲液A通过将适当体积的1MHepes(pH7.5)、0.5MCHES(pH9.5)和水混合而制备。抗体(处于甜菜碱中)与中和缓冲液的体积比产生了最终为5mM的锁定缓冲剂浓度和7.1的pH。作为另一选择，可以用11.1μl的10X缓冲液B(30mMHepes和105mMCHES缓冲液)来中和洗脱的级分，以得到最终pH为7.55的更弱缓冲的抗体制备物(即，锁定缓冲剂3mM)。
在50mMMES缓冲液(pH5.0)中将纯化的抗体(1μg)缀合至羧基化的InnovaCoatGold纳米颗粒(InnovaBiosciences)，并使用山羊抗小鼠IgG作为桥连试剂，在用小鼠IgG划线的侧向流膜上进行测试(与实施例1类似，但在测试线上采用不同的抗体)。来自不同实验的缀合物的侧向流信号为165至277单位，相比之下，没有经过色谱处理的小鼠IgG的值为193单位，而不存在桥连试剂的对照的值为0单位。
缀合反应中使用的50mMMES缓冲液(pH5.0)(终浓度)处于其可用缓冲范围的极限，但能轻易地克服浓度为3mM和5mM的锁定缓冲剂；事实上，约40mMMES就足以将两个样品的pH降低至pH5.0。在最终锁定缓冲剂浓度为仅1mMHepes(且CHES为10.5mM)时，仅需要22mMMES来将pH降低至最终反应pH5.0。
表1.

Claims (87)

1.一种将分离的抗体缀合至标记物或衍生化试剂的方法，所述方法包括：在包含除甘氨酸以外的一元羧酸缓冲化合物的缓冲体系中，使所述抗体与经活化的标记物或经活化的衍生化试剂接触，或者在抗体缀合试剂的存在下使所述抗体与所述标记物或衍生化试剂接触；所述一元羧酸缓冲化合物带有处于在α或β位的氨基取代基。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体缀合试剂或经活化的标记物包含碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、异硫氰酸酯或硫醇化试剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物还包含一个或多个非氨基取代基或者不包含其它取代基。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述一元羧酸的氨基取代基是仲氨基或叔氨基，或者是季铵。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述氨基取代基是季铵取代基。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物是甜菜碱。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述甜菜碱是N,N,N-三甲基甘氨酸。
8.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物是伯氨基酸。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述伯氨基酸是丙氨酸、β-丙氨酸或2-氨基丁酸。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物是脯氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸或2-吡啶甲酸。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的羧基的pKa为1至4。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的羧基的pKa为1.5至3.5。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的氨基的pKa大于8。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的氨基的pKa大于9。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物以小于200mM的浓度存在。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的浓度小于100mM。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的浓度小于50mM。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述缓冲体系还包含pKa大于5.5的中和缓冲化合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述中和缓冲化合物包含吗啉、哌嗪或N-环己基化合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述中和缓冲化合物是2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS或HEPPS)、哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)(HEPBS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)。
21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中，所述缓冲体系还包含pKa为6至8的锁定缓冲化合物，其中，所述中和缓冲化合物的pKa高于8。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述中和缓冲化合物的pKa为8至11。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中，锁定缓冲剂是MOPS或HEPES。
24.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其中，所述锁定缓冲化合物的浓度小于所述中和缓冲化合物的浓度。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述标记物包括酶、荧光蛋白、有机染料、有色颗粒、生物素、抗生蛋白链菌素或聚合物。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法在5至9的pH下执行。
27.包含除甘氨酸外的一元羧酸缓冲化合物的缓冲液在从固相中洗脱出抗体中的应用，所述一元羧酸缓冲化合物带有处在α位或β位的氨基取代基。
28.如权利要求27所述的应用，其中，所述固相安置在柱中。
29.如权利要求27或28所述的应用，其中，所述固相包含针对所述抗体的亲和基质。
30.如权利要求27至29中任一项所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物还包含一个或多个非氨基取代基或者不包含其它取代基。
31.如权利要求27至30中任一项所述的应用，其中，所述一元羧酸的氨基取代基是仲氨基或叔氨基，或者是季铵。
32.如权利要求31所述的应用，其中，所述氨基取代基是季铵取代基。
33.如权利要求32所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物是甜菜碱。
34.如权利要求33所述的应用，其中，所述甜菜碱是N,N,N-三甲基甘氨酸。
35.如权利要求27至30中任一项所述的方应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物是伯氨基酸。
36.如权利要求35所述的应用，其中，所述伯氨基酸是丙氨酸、β-丙氨酸或2-氨基丁酸。
37.如权利要求31所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物是脯氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸或2-吡啶甲酸。
38.如权利要求27至37中任一项所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的羧基的pKa为1至4。
39.如权利要求38所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的羧基的pKa为1.5至3.5。
40.如权利要求25至37中任一项所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的氨基的pKa大于8。
41.如权利要求40所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的氨基的pKa大于9。
42.如权利要求27至41中任一项所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物以小于200mM的浓度存在。
43.如权利要求42所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的浓度小于100mM。
44.如权利要求43所述的应用，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的浓度小于50mM。
45.如权利要求27至44中任一项所述的应用，其中，所述缓冲液的pH是1.8至4.8。
46.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，在使所述抗体与所述标记物、衍生化试剂、活化的标记物或活化的衍生化试剂接触的步骤之前，通过如权利要求28至45中任一项所述从固相中洗脱出所述抗体的步骤来分离所述抗体，且其中，所述缓冲体系包含用于所述洗脱出所述抗体的步骤的缓冲剂。
47.一种抗体分离试剂盒，所述试剂盒包含：用于结合抗体的固相亲和基质，和用于在所述抗体结合至所述亲和基质时洗脱所述抗体的缓冲液，其中，所述缓冲液包含除甘氨酸外的一元羧酸缓冲化合物，所述一元羧酸缓冲化合物带有处于α位或β位的氨基取代基。
48.如权利要求47所述的抗体分离试剂盒，其中，所述缓冲液如权利要求30至45中任一项所定义。
49.如权利要求47或48所述的抗体分离试剂盒，其还包含pKa大于5.5的中和缓冲液。
50.如权利要求49所述的抗体分离试剂盒，其中，所述中和缓冲液包含吗啉、哌嗪或N-环己基化合物。
51.如权利要求50所述的抗体分离试剂盒，其中，所述中和缓冲液包含2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS或HEPPS)、哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)(HEPBS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)。
52.如权利要求49至51中任一项所述的抗体分离试剂盒，其还包含pKa为6至8的锁定缓冲液，其中，所述中和缓冲液的pKa高于8。
53.如权利要求52所述的抗体分离试剂盒，其中，所述中和缓冲液的pKa为8至11。
54.如权利要求52或53所述的抗体分离试剂盒，其中，所述锁定缓冲液是MOPS或HEPES。
55.如权利要求52至54中任一项所述的抗体分离试剂盒，其中，所述锁定缓冲液的浓度小于所述中和缓冲液的浓度。
56.如权利要求52至55中任一项所述的抗体分离试剂盒，其中，所述锁定缓冲液的pH为6至8。
57.如权利要求49至56中任一项所述的抗体分离试剂盒，其中，所述中和缓冲液的pH高于6。
58.如权利要求57所述的抗体分离试剂盒，其中，所述中和缓冲液的pH高于8。
59.如权利要求58所述的抗体分离试剂盒，其中，所述中和缓冲液的pH为8.5至11。
60.如权利要求59所述的抗体分离试剂盒，其中，所述中和缓冲液的pH为9至9.5。
61.一种用于缀合反应中的抗体组合物，所述组合物包含处于缓冲体系中的分离的抗体，其中，所述缓冲体系包含除甘氨酸外的一元羧酸缓冲化合物，所述一元羧酸缓冲化合物带有处在α位或β位的氨基取代基。
62.如权利要求61所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物还包含一个或多个非氨基取代基或者不包含其它取代基。
63.如权利要求61或62所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸的氨基取代基是仲氨基或叔氨基，或者是季铵。
64.如权利要求63所述的抗体组合物，其中，所述氨基取代基是季铵取代基。
65.如权利要求64所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物是甜菜碱。
66.如权利要求65所述的抗体组合物，其中，所述甜菜碱是N,N,N-三甲基甘氨酸。
67.如权利要求61或62所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物是伯氨基酸。
68.如权利要求67所述的抗体组合物，其中，所述伯氨基酸是丙氨酸、β-丙氨酸或2-氨基丁酸。
69.如权利要求63所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物是脯氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸或2-吡啶甲酸。
70.如权利要求61至69中任一项所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的羧基的pKa为1至4。
71.如权利要求70所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的羧基的pKa为1.5至3.5。
72.如权利要求61至71中任一项所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的氨基的pKa大于8。
73.如权利要求71所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的氨基的pKa大于9。
74.如权利要求61至73中任一项所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物以小于200mM的浓度存在。
75.如权利要求74所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的浓度小于100mM。
76.如权利要求75所述的抗体组合物，其中，所述一元羧酸缓冲化合物的浓度小于50mM。
77.如权利要求61至76中任一项所述的抗体组合物，其中，所述缓冲体系还包含pKa大于5.5的中和缓冲化合物。
78.如权利要求77所述的抗体组合物，其中，所述中和缓冲化合物包含吗啉、哌嗪或N-环己基化合物。
79.如权利要求78所述的抗体组合物，其中，所述中和缓冲化合物是2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS或HEPPS)、哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)(HEPBS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)。
80.如权利要求77至79中任一项所述的抗体组合物，其中，所述缓冲体系还包含pKa为6至8的锁定缓冲化合物，其中，所述中和缓冲化合物的pKa高于8。
81.如权利要求80所述的抗体组合物，其中，所述中和缓冲化合物的pKa为8至11。
82.如权利要求80或81所述的抗体组合物，其中，锁定缓冲剂是MOPS或HEPES。
83.如权利要求80至82中任一项所述的抗体组合物，其中，所述锁定缓冲化合物的浓度小于所述中和缓冲化合物的浓度。
84.如权利要求61至83中任一项所述的抗体组合物，所述抗体组合物的pH为5至9。
85.如权利要求61至84中任一项所述的抗体组合物，其中所述分离的抗体与标记物缀合。
86.如权利要求85所述的抗体组合物，其中，所述标记物包括酶、荧光蛋白、有机染料、有色颗粒、生物素、抗生蛋白链菌素或聚合物。
87.权利要求77至80中任一项所定义的缓冲体系作为抗体或抗体缀合物的储存介质的应用。
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