CN113671188A - 一种检测贝类食品中河豚毒素的时间分辨免疫定量试纸条 - Google Patents

一种检测贝类食品中河豚毒素的时间分辨免疫定量试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测贝类食品中河豚毒素的时间分辨免疫定量试纸条，属于时间分辨免疫分析快速检测技术领域。本发明采用荧光微球替代传统胶体金，用荧光微球标记河豚毒素抗体复合物，利用竞争免疫法，将其作为荧光探针用于免疫层析，通过读取荧光免疫分析仪上检测线的荧光值，可以对贝类样品中的河豚毒素进行快速定量分析。本发明所述的时间分辨免疫定量试纸条能够实现快速定量检测各类贝类食品中河豚毒素的含量，特异性强、灵敏度高，其中当河豚毒素的浓度范围为0.5～40ng/mL时，其浓度的对数值与T/T0成线性关系，线性方程为Y＝0.57365‑0.2668LgX，R2＝0.9940，检测限可达到0.047ng/mL。

Description

一种检测贝类食品中河豚毒素的时间分辨免疫定量试纸条
技术领域
本发明涉及一种检测贝类食品中河豚毒素的时间分辨免疫定量试纸条，属于时间分辨免疫分析快速检测技术领域。
背景技术
河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种毒性最强的神经毒素之一。它是一种生物碱类小分子有毒物质。该毒素并不仅存在于河豚鱼中，还广泛分布于各种贝类海产及藻类植物中，如亚历山大藻、织纹螺等。河豚毒素的化学性质和热性质都很稳定，短时间高温下也无法使其变性脱毒，只有在高温加热30min后才能完全破坏河豚毒素的结构。该毒素进入人体后会高选择性高亲和性地阻断神经兴奋膜上的钠离子通道，阻碍动物机体内的神经兴奋与传导，导致中枢系统调控功能紊乱，从而引起肌肉麻痹、浑身瘫软、心脏搏动等现象，最终导致呼吸系统及心血管系统衰竭而亡。河豚毒素的毒性属于剧毒物质，人体的最小致死量为0.5mg。目前，已在多种海洋生物和陆地生物中检测出河豚毒素，日本、中国、泰国、巴西等多个国家发现多起河豚毒素中毒事件。为控制该毒素对食品的污染，制定了严格的限量标准。日本明确规定限量值为2.2mg/kg。欧洲食品安全局评估了双壳类动物中TTX的风险和监管，最终确定TTX低于44μg/kg不会对人类产生不利的影响。
荧光检测法是最早建立的河豚毒素定量方法。此外，常用的方法还有小鼠检测法、酶联免疫法、薄层色谱法、柱后衍生高效液相色谱检测法、气质联用法和液质联用等。国外较多地采用气质联用、液质联用的方法检测河豚毒素。GB 5009.206-2016是河豚毒素的食品安全国家标准。小鼠法、仪器法虽然是河豚鱼中河豚毒素测定的国标方法，但是操作复杂、需要专业人员进行处理的检测方法。而免疫学检测方法操作简单、灵敏可靠，可快速检测多种海产类样品，是理想的检测方法。
目前检测河豚毒素的试纸条虽有各种方法的报道，如中国专利CN109444423A的免疫荧光试纸条、CN104142394A、CN202522562U的胶体金试纸条、CN108008134A磁球试纸条、CN207752014U、CN104133063A的酶联免疫试剂盒以及CN205982284U胶体金试剂盒，但酶联免疫试剂盒作为国标方法中唯一的免疫检测，检测时间长，酶标仪等检测设备体积较大，不适宜在现场环境下使用；利用传统有机荧光染料的荧光微球作为探针，传统有机荧光染料发光寿命较短，稳定性欠佳，容易出现光漂白现象，灵敏度相对较低；采用胶体金作为识别探针，胶体金颗粒粒径均一性较差，免疫标记物不稳定，只能进行定性检测，无法快速检测河豚毒素的含量。
而且，随着气温升高，我国近海地区在每年4月～6月可能发生赤潮，一些赤潮藻类可产生海洋藻毒素，贝类因有毒赤潮蓄积毒素，被食用后发生过消费者中毒事件。食用受到生物毒素污染的贝类(贻贝、牡蛎、蛤等)可能会引起人体严重中毒。在我国，有人连续两年对福建省织纹螺中毒事件高发的莆田、宁德两个地区采样，利用所建立的检测方法对这些样品中的海洋毒素残留量进行分析测定，发现两地区织纹螺中河豚毒素均有检出。因此，建立一种更加灵敏快速并大通量地检测贝类中河豚毒素TTX的方法已成为当务之急。
发明内容
[技术问题]
酶联免疫试剂盒作为国标方法中唯一的免疫检测，检测时间长，酶标仪等检测设备体积较大，不适宜在现场环境下使用；利用传统有机荧光染料的荧光微球作为探针，传统有机荧光染料发光寿命较短，稳定性欠佳，容易出现光漂白现象，灵敏度相对较低；采用胶体金作为识别探针，胶体金颗粒粒径均一性较差，免疫标记物不稳定，只能进行定性检测，无法快速检测河豚毒素的含量；目前，仍缺少检测河豚毒素的时间分辨荧光微球试纸条。
[技术方案]
为了解决上述至少一个问题，本发明采用荧光微球替代传统胶体金，用荧光微球标记河豚毒素抗体复合物，利用竞争免疫法，将其作为荧光探针用于免疫层析，通过读取荧光免疫分析仪上检测线的荧光值，可以对贝类样品中的河豚毒素进行快速定量分析。
本发明第一个目的是提供一种检测河豚毒素的时间分辨免疫层析定量试纸条，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，所述检测线上包被河豚毒素完全抗原(TTX-BSA)，所述质控线包被生物素(biotin-BSA)。
在本发明的一种实施方式中，所述河豚毒素的检测浓度为0.1～1000ng/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述河豚毒素完全抗原的用量为0.3～8mg/mL，所述生物素的用量为0.1～1mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述检测线和质控线两线之间相距4～6mm。
在本发明的一种实施方式中，所述时间分辨免疫层析定量试纸条的宽度为3～5mm。
在本发明的一种实施方式中，所述检测线是将0.3～8mg/mL河豚毒素完全抗原喷涂到硝酸纤维素膜上，每厘米的硝酸纤维素膜上检测线宽度喷涂量为1～2μL；当硝酸纤维素膜宽度为0.4cm时，喷涂量为0.4～0.8μL。
在本发明的一种实施方式中，所述质控线是将0.1～1mg/mL生物素喷涂到硝酸纤维素膜上，每厘米的硝酸纤维素膜上质控线宽度喷涂量为1～2μL/cm。当硝酸纤维素膜宽度为0.4cm时，喷涂量为0.4～0.8μL。
在本发明的一种实施方式中，将喷涂好的硝酸纤维素膜置于37℃真空干燥箱中烘干备用。
在本发明的一种实施方式中，所述河豚毒素完全抗原用0.01M pH 7.4的磷酸缓冲液(PBS)稀释至终浓度为0.3～8mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述生物素用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释至终浓度0.1～1mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述时间分辨免疫层析定量试纸条中，吸水纸、硝酸纤维素膜以及样品垫依次相邻，且相邻部位部分重叠区域的长度为2～4mm；所述吸水纸、样品垫与硝酸纤维素膜分别重叠的部分位于硝酸纤维素膜的上侧。
在本发明的一种实施方式中，所述河豚毒素完全抗原(TTX-BSA)的制备方法，是由河豚毒素TTX标准品与载体蛋白偶联得到；具体步骤包括：
将0.5mg TTX溶解在1mL超纯水中，得到TTX溶液；将BSA溶解在2.0mL PBS(pH7.4)中，之后加入TTX溶液，混合均匀，得到混合溶液；之后在混合溶液中逐滴加入37％甲醛溶液至终体积(混合溶液+甲醛)分数为1.5％，混匀，得到反应溶液；之后将反应溶液在30℃水浴中缓慢震摇反应72h，然后在4℃下透析48h，以6次1L的PBS(pH7.4)变化去除残留的游离TTX；得到了TTX-BSA偶联物，即河豚毒素完全抗原，保存在-20℃下使用。
本发明的第二个目的是提供一种基于时间分辨免疫定量试纸条检测贝类中河豚毒素的方法，包括如下步骤：
(1)待测物的提取：将贝肉进行匀浆、加热处理、冷却、离心、收集上清液；之后脱脂，得到待测物；
(2)将经Eu3+-荧光微球标记的河豚毒素单克隆抗体Eu-TTX-mAb、Eu3+-荧光微球标记的链霉亲和素Eu-SA、待测物、缓冲液混合均匀孵育，得到待测溶液；
(3)将步骤(2)得到的待测溶液加入本发明所述的时间分辨免疫层析定量试纸条中的样品垫上进行层析，之后测定样品在检测线处的荧光强度值：T值；
(4)将得到的T值代入定量曲线中，得到待测溶液中河豚毒素的浓度。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述待测物的提取是按照GB/T5009进行提取，包括：
采集5g贝肉分别添加25mL 0.1％冰醋酸溶液并进行匀浆，匀浆后100℃水浴10min；静置冷却，10000r/min离心5min，收集上清液，对沉淀再添加适量0.1％冰醋酸混匀水浴5min，静置冷却，10000r/min离心5min，收集上清液，沉淀重复上述步骤一次；收集三次上清液定容至50mL；之后添加5mL氯仿脱脂30min，期间摇晃混匀4～6次，10000r/min离心3min分离水相和氯仿，收集水相，重新脱脂一次，水相使用NaOH调节pH至7.0，得到待测物；若不直接检测则可放入4℃保存(无须调节pH)(GB/T5009)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中经Eu3+-荧光微球标记的河豚毒素单克隆抗体Eu-TTX-mAb、Eu3+-荧光微球标记的链霉亲和素Eu-SA、待测溶液、缓冲液的体积比为2：10：45：35。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中Eu3+-荧光微球是纳米级的聚苯乙烯微球中包裹了成千上万个经过螯合后的Eu3+荧光，而且聚苯乙烯微球表面修饰有羧基化基团用以偶联蛋白，提高蛋白(抗原或抗体)的荧光标记效率，从而有效地提高分析的灵敏度。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中Eu3+-荧光微球的粒径100～300nm，Eu3+-荧光微球通常分散在缓冲液中使用，Eu3+-荧光微球溶液中固含量1％～10％，所述百分比为质量百分比。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中经Eu3+-荧光微球标记的河豚毒素单克隆抗体Eu-TTX-mAb是通过EDC和NHS介导活化作用与抗体分子的氨基结合，形成酰胺键而制备获得的。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的孵育是20～30℃孵育10～20min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中待测溶液的添加量为80～95μL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中层析是37℃层析15～20min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中荧光强度值的测定是用HG-98免疫定量分析仪进行测试。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中定量曲线是Y＝0.57365-0.2668LgX，R2＝0.9940，IC50＝1.713ng/mL检测限可达到0.047ng/mL；其中Y为T/T0，X为河豚毒素的浓度。
本发明的第三个目的是本发明所述的方法在食品检测领域的应用。
本发明的第四个目的是本发明所述的时间分辨免疫层析定量试纸条在食品检测领域的应用。
[有益效果]
(1)本发明所述的方法能够实现快速定量检测各类贝类食品中河豚毒素的含量，特异性强、灵敏度高，其中当河豚毒素的浓度范围为0.5～40ng/mL时，其浓度的对数值与T/T0成线性关系，线性方程为Y＝0.57365-0.2668LgX，R2＝0.9940，检测限可达到0.047ng/mL。本发明提供的检测方法的检测范围广，其定量的线性范围能够达到0.5～40ng/mL，该检测方法稳定可靠，样品添加回收率为97.07％～101.48％，变异系数均小于4.70％。
(2)本发明所述的方法以河豚毒素单克隆抗体作为识别靶点，以时间分辨荧光微球为信号源，荧光微球的体积远大于荧光染料分子的体积，不但可以有效消除非特异性荧光干扰，粒径均一，与TTX-mAb相连后，粒径增加至300～400nm，表明荧光微球和单抗形成一种新的复合物。
(3)本发明的试纸条具有灵敏度高、成本低廉、操作简便、快速定量检测、稳定性好、适合工商部门、第三方检测机构、各级政府监管部门、贝类食品企业等使用，市场前景广阔，易推广使用。
附图说明
图1为河豚毒素抗体偶联荧光微球的透射电镜图；其中A为低倍镜下抗体偶联微球电镜图，B为高倍镜下抗体偶联微球电镜图。
图2为河豚毒素完全抗原的紫外验证。
图3为河豚毒素免疫试纸条结构图。
图4为标记荧光微球免疫层析法检测河豚毒素的标准曲线A、定量曲线B及紫外灯下的试纸条图C。
图5为河豚毒素免疫层析法的检测线(T线)完全抗原浓度的优化。
图6为河豚毒素免疫层析法的T线免疫动力学曲线；以荧光强度值及T/C为纵坐标，反应时间为横坐标绘制免疫反应动力学曲线(A)；不同免疫反应时间下，荧光强度值的变化(B)。
图7为检测贝类中河豚毒素的标准曲线A、定量曲线B。
图8为河豚毒素特异性实验。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。实施例中采用的链霉亲和素-荧光微球购自苏州为度生物科技有限公司，固含量为1％，采用自制微球复溶液稀释500倍后使用，其中自制微球复溶液为含有5％蔗糖、1％牛血清白蛋白、1％Tween-20的pH7.0 0.05M的Tris-HCl。
实施例1河豚毒素完全抗原(TTX-BSA)的制备
1、河豚毒素完全抗原(TTX-BSA)的制备
河豚毒素标准品与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到人工抗原
取0.5mg河豚毒素溶解于1mL超纯水中，搅拌澄清，记为反应液A；称取BSA 4mg，使之溶解在2.0mLPBS(pH7.4)中，得到蛋白溶液；将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，混合均匀，记为反应液B；将37％甲醛溶液缓慢逐滴加入反应液B至终体积分数为1.5％，混匀；得到混合溶液；再将混合溶液在30℃水浴中缓慢震摇反应72h，用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析2d，每天换3次透析液，以去除残留的游离TTX；得到了TTX-BSA偶联物，即河豚毒素完全抗原(TTX-BSA)，保存在-20℃下使用。
2、河豚毒素抗原的鉴定
将河豚毒素标准品、载体蛋白与河豚毒素完全抗原进行紫外(200～300nm)扫描测定，比较三者之间差异。
结果如图2，从图2可以看出：河豚毒素完全抗原的波谱形状或是峰值大小与河豚毒素标准品、载体蛋白的波谱形状或是峰值大小相比发生了明显的变化，表明河豚毒素完全抗原的合成是成功的。
实施例2 Eu3+-荧光微球标记河豚毒素单克隆抗体的荧光探针制备
相关溶液的制备：
活化缓冲液：pH6.0 0.05M的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，C6H13NO4S·H2O)溶液；
偶联缓冲液：pH 7.0 0.01M的磷酸缓冲液(PBS)(避免使用存在游离胺的溶剂)；
活化剂：2mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，C8H17N3·HCl)溶液以及2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，C4H5NO3)溶液；
封闭缓冲液：含1％BSA、0.05％Tween-20的pH 6.0 0.01M的磷酸缓冲液(PBS)；
抗体基础保护液：含5％海藻糖、0.1％PVPK-30、0.5％BSA、0.1％TritonX-100的pH7.0 0.05M的Tris-HCl；
标记洗涤液：含0.1％Tween-20的pH 7.0 0.05M的Tris-HCl；
微球复溶液/反应缓释液：含有5％蔗糖，1％牛血清白蛋白，1％Tween-20的pH7.00.05M的Tris-HCl；
Eu-TTX-mAb具体制备方法如下：
(1)取4℃放置的内部包裹Eu3+、表面修饰有羧基官能团的荧光微球溶液(购于泰州百纳泰科新材料技术有限公司，粒径300nm)10μL(1％固形物含量)，超声分散，加入900μL浓度为活化缓冲液，15000rpm于4℃离心5min；
(2)弃上清，加入600μL活化缓冲液，超声重悬，重复离心清洗3次；
(3)弃上清，加入200μL活化缓冲液超声重悬，加入5μL 2mg/mL EDC溶液、5μL 2mg/mL的NHS溶液作为活化剂，室温摇床500rpm避光振荡活化30min；
(4)活化完成后离心，弃上清，加入PBS缓冲液清洗3次；
(5)弃上清，加入400μL偶联缓冲液超声重悬，再加入10μg河豚毒素单克隆抗体(制备方法参考文献：([1]丛蕾.河豚毒素特异性单克隆抗体的制备[D].上海海洋大学,2011.)，室温避光振荡标记3h；
(6)标记结束后加入10％(v/v)的封闭缓冲液和100μL抗体基础保护液，室温避光振荡40min；
(7)封闭后离心弃上清，用900μL的标记洗涤液清洗3次；
(8)弃上清，加入200μL荧光微球复溶液，得到Eu3+-荧光微球标记的河豚毒素单克隆抗体Eu-TTX-mAb(透射电镜图如图1)，4℃保存备用。
从图1可以看出：Eu-TTX-mAb表面功能基团稳定可控，实验重复性较好，检测特异性强，可实现快速定量检测，且灵敏度高、误差小，为即时检测提供了极大的便捷。
实施例3基于标记荧光微球的河豚毒素免疫试纸条的制备
一种制备检测河豚毒素的时间分辨免疫层析定量试纸条的方法，包括如下步骤：
(1)在硝酸纤维膜(NC膜)上分别喷涂河豚毒素完全抗原(TTX-BSA)溶液(0.4mg/mL)、生物素溶液(0.3mg/mL)作为检测线(T线)和质控线(C线)，喷涂量均为1μL/cm(仪器参数，指喷头每移动1cm，即在NC膜上喷涂1μL的对应溶液)，T线和C线的宽度取决于喷膜仪管路的直径为2mm，T线和C线之间相距约5mm，37℃干燥3h；喷涂采用美国BioDot公司XYZ3050型三维喷点平台；
将样品垫，硝酸纤维素膜和吸水纸粘贴在PVC底板上组装成试纸条，试纸条组装的关键是要保证各部分之间具有一致的传递性，其中，T线距离样品垫约5mm，C线距离吸水纸约为5mm，样品垫叠在硝酸纤维素膜上，二者重叠约3mm，类似地，吸水纸叠在硝酸纤维素膜上，二者重叠约3mm；
用切条机将粘贴好的板切成约4mm宽的试纸条，用塑料底座和卡壳组装，得到免疫层析定量试纸条，4℃密封保存备用。
免疫层析定量试纸条的结构图如图3所示，底板上从左到右依次为样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。
实施例4河豚毒素免疫层析定量试纸条的标准曲线绘制
标准曲线的绘制方法是：
取河豚毒素标准品加入磷酸盐缓冲液(pH7.0 0.01M)中配制成河豚毒素TTX浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、4、8、20、40、100、200、800、1000ng/mL的标准溶液用于荧光试纸条检测；
将实施例2制得的Eu3+-荧光微球标记的河豚毒素单克隆抗体(Eu-TTX-mAb)作为荧光探针，将45μL的标准溶液、2μL的荧光探针(Eu-TTX-mAb溶液：0.05μg/μL荧光微球标记的河豚毒素单克隆抗体，含有5％蔗糖，1％牛血清白蛋白，1％Tween-20的pH7.5 0.1M的Tris-HCl溶液)、10μL的链霉亲和素-荧光微球和35μL标准品缓冲液(标准品缓冲液为含5％甲醇(v：v)的0.01M pH 7.4的PBS溶液)混合均匀后室温孵育10min，得到92μL待测溶液；
之后将92μL待测溶液缓慢滴入实施例3的免疫层析定量试纸条的样品垫，37℃层析20min后用HG-98免疫定量分析仪记录试纸条的T线荧光值，每个浓度测定六个平行，设定浓度为0ng/mL标准溶液的T线荧光值为T0，其他标准溶液浓度的T线荧光值为T，以各个河豚毒素标准品浓度的对数值为横坐标，T/T0×100(％)为纵坐标绘制标准曲线，竞争抑制率设为(1-T/T0)×100％。
如图4中A可以看出，随着河豚毒素浓度的增大，试纸条T线条带上的荧光会越来越浅，所以T/T0会越来越小，如图4中B为T/T0随河豚毒素浓度的变化曲线(定量曲线)，当河豚毒素的浓度为0.5～40ng/mL时，河豚毒素浓度的对数值与T/T0成线性关系，线性方程为Y＝0.57365-0.2668LgX，R2＝0.9940，IC50＝1.713ng/mL检测限可达到0.047ng/mL。
实施例5
一种基于时间分辨免疫定量试纸条检测贝类中河豚毒素的方法，包括如下步骤：
(1)待测物的提取：
采集5g贝肉分别添加25mL 0.1％冰醋酸溶液并进行匀浆，匀浆后100℃水浴10min；静置冷却，10000r/min离心5min，收集上清液，对沉淀再添加适量0.1％冰醋酸溶液混匀水浴5min，静置冷却，10000r/min离心5min，收集上清液，沉淀重复上述步骤一次；收集三次上清液定容至50mL；之后添加5mL氯仿脱脂30min，期间摇晃混匀5次，10000r/min离心3min分离水相和氯仿，收集水相，重新脱脂一次，水相使用NaOH调节pH至7.0，得到待测物；若不直接检测则可放入4℃保存(无须调节pH)(GB/T5009)；
(2)将2μL的Eu3+-荧光微球标记的河豚毒素单克隆抗体Eu-TTX-mAb、10μL Eu3+-荧光微球标记的链霉亲和素Eu-SA、45μL的待测物、35μL缓冲液混合均匀孵育，室温孵育10min，得到92μL待测溶液；
(3)将步骤(2)得到的待测溶液加入实施例3所述的时间分辨免疫层析定量试纸条中的样品垫上，在37℃层析20min，之后采用HG-98免疫定量分析仪记录测定待测溶液在检测线的荧光强度值：T值；
(4)将得到的T值代入实施例4的定量曲线中，得到待测溶液中河豚毒素的浓度。
实施例6条件优化
(1)河豚毒素完全抗原用量的优化
为了提高时间分辨免疫定量试纸条检测的灵敏度，研究了实验过程中不同河豚毒素完全抗原稀释浓度对阴性对照组与河豚毒素含量为0.25μg/L的样本之间的竞争抑制率的影响。
具体的实验探究过程如下：
调整实施例3中在检测线T处喷涂河豚毒素完全抗原(TTX-BSA)溶液的浓度，具体是将TTX-BSA稀释倍数为5、10、15、20、25，浓度具体为1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.5mg/mL、0.4mg/mL、0.3mg/mL；其他和实施例3保持一致，得到不同河豚毒素完全抗原浓度的时间分辨免疫定量试纸条；
选取阴性对照组(5％甲醇-PBS溶液)和阳性试验组(TTX浓度为0.25μg/L)进行分析，进而评价不同浓度的TTX-BSA对检测方法的影响。
从图5可以看出：随着T线处TTX-BSA浓度的增加，阴性对照组(5％甲醇-PBS溶液)与阳性试验组(TTX＝0.25μg/L)之间的荧光强度逐渐增加后趋于稳定，当TTX-BSA的稀释倍数为20，河豚毒素完全抗原(TTX-BSA)溶液的浓度为0.4mg/mL时，阴阳样本之间的竞争抑制率(1-T/T0)达到最大值0.3。且此时检测线处也有相对较强的荧光信号值，分别为343000a.u.(阴性对照荧光强度：499171a.u.)。因此20倍稀释为T线处TTX-BSA完全抗原的较佳稀释倍数，浓度为0.4mg/mL为T线处TTX-BSA完全抗原的的较佳浓度。
(2)时间分辨免疫定量试纸条质控线的优化
调整实施例3中质控线的生物素溶液为羊鼠抗IgG溶液，其他和实施例3保持一致，得到时间分辨免疫定量试纸条。
在经过UPLC-MS/MS确证为阴性的三种样本进行加标，选择两种质控线的时间分辨免疫定量试纸条，分别检测浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL和2ng/mL(TTX)的阳性样本，计算其平均浓度值、标准偏差及变异系数，评价时间分辨免疫定量试纸条的准确度和精密度。
表1不同质控线的时间分辨免疫定量试纸条精密度和稳定性实验对比
Figure BDA0003204300090000101
结果见表1，质控线为biotin-BSA的测定结果CV均小于4.70％，回收率在97.08％～101.48％。而传统的羊抗鼠IgG质控线试纸条的回收率波动范围大，介于95.84％～150.53％之间。
(3)层析时间的优化
调整实施例5步骤(3)的层析时间为0～20min，其他和实施例5保持一致。
以荧光强度值为纵坐标，反应时间为横坐标绘制免疫反应动力学曲线，观察T线和C线荧光强度随时间的变化，以T线荧光值达到稳定的时间作为较佳检测时间。
图6为河豚毒素免疫层析法的T线免疫动力学曲线，从图6中A可以看出，两条线的荧光强度在0～20min内均随着时间的延长呈现增强的趋势。在20min后，T线和C线的荧光强度值不再明显变化，趋于平稳，由图6中B可以看出，阴性对照组(5％甲醇-PBS溶液)与阳性试验组(TTX＝0.5μg/L,2μg/L)之间的荧光强度在20min趋于稳定，因此层析时间选择20min较为合适。
实施例7
1、精密度试验
从同一批次内取出8个TTX时间分辨免疫定量试纸条分别检测阴性对照组(5％甲醇-PBS)检测线处的荧光强度值(T0)和阳性试验组(TTX 0.25μg/L)T线处的荧光强度值(T)分析批内差异。
通过8个不同批次的TTX时间分辨免疫定量试纸条分别检测阴性对照组(5％甲醇-PBS)检测线处的荧光强度值(T0)和阳性试验组(TTX 0.25μg/L)T线处的荧光强度值(T)分析批间差异。
由表2可知，通过变异系数计算公式分析得到T0、T和T/T0(％)的批内变异系数分别为7.61％、7.51％和2.37％，T0、T和T/T0(％)的批间变异系数分别为6.53％、6.90％和2.81％，表明时间分辨免疫定量试纸条的批内和批间变异系数小，精密度高，准确性好，基本符合定量检测试纸条的要求。
表2河豚毒素时间分辨免疫定量试纸条的精密度检测结果
Figure BDA0003204300090000111
2、准确度试验
样品处理：
对于贝类产品的样品前处理方式，采用采集5g贝肉分别添加25mL 0.1％冰醋酸并进行匀浆，匀浆后100℃水浴10min，静置冷却，10000r/min，收集上清，对沉淀再添加适量0.1％冰醋酸混匀水浴5min，静置冷却10000r/min离心5min，收集上清，沉淀重复上述步骤一次，收集三次上清定容至50mL，添加5mL氯仿脱脂30min，期间摇晃混匀5次，10000r/min离心3min分离水相和氯仿，收集水相，重新脱脂一次，水相使用NaOH调节pH至7.0，得到待测物，若不直接检测则可放入4℃保存(无须调节pH)(GB/T5009)
为了验证河豚毒素试纸条的准确性与灵敏度，对几种贝类样本(花甲、蛤蜊、文蛤)分别进行加标回收试验，每种样本的添加浓度均设置高、中、低三组不同的加标浓度，每组浓度梯度均设置三组平行试验。以加标回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差(RSD％)作为精密度评价指标。加标回收率和相对标准偏差的计算公式如下式(1)、式(2)：
Figure BDA0003204300090000112
Figure BDA0003204300090000121
经确证为阴性的样本分别按照0.1μg/L、0.5μg/L和2μg/L三个浓度梯度进行河豚毒素加标回收实验。每个浓度重复10次，取T/T0的平均值并计算变异系数。
结果如表3所示，测定结果CV均小于4.70％，表明在线性范围内，时间分辨免疫定量试纸条具有较好的准确性。整个探究方法以含0.05％吐温-20的PBS溶液作为样品稀释液以确保该方法的性能。
采集5g花甲、蛤蜊、文蛤分别添加25mL 0.1％冰醋酸并进行匀浆，匀浆后100℃水浴10min，静置冷却，10000r/min离心5min，收集上清，对沉淀再添加适量0.1％冰醋酸混匀水浴5min，静置冷却10000r/min离心5min，收集上清，沉淀重复上述步骤一次，收集三次上清定容至50mL；添加5mL氯仿脱脂30min，期间摇晃混匀5次，10000r/min离心3min分离水相和氯仿，收集水相，重新脱脂一次，水相使用NaOH调节pH至7.0，分别稀释15(花甲)、5(蛤蜊)、5(文蛤)倍后用于免疫层析检测。
表3河豚毒素时间分辨免疫定量试纸条的准确度检测结果
Figure BDA0003204300090000122
由表3可知，将时间分辨免疫定量试纸条用于检测加标的贝类样品中，最终得出贝类的加标回收率在97.07％～101.85％之间，变异系数低于4.70％，表明时间分辨免疫定量试纸条能够用于现场快速筛查与检测。
3、贝类食品标准曲线
为了进一步确保实施例5的方法的准确性，以经LC-MS确证阴性样品作为基底，向贝肉中加入TTX标准品配制含有河豚毒素0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的贝肉样品，并绘制贝肉标准曲线，适合贝类食品的现场即时检测。
结果如图7所示，当河豚毒素的浓度范围为0.1ng/mL～100ng/mL时，其浓度的对数值与T/T0成线性关系，线性方程为Y＝-0.22LgX+0.690，R2＝0.9976，检测限可达到0.141ng/mL。
4、交叉反应试验
选取其他常见的贝类毒素(OA、DA、BTX、ATX、MC-LR)进行评价时间分辨免疫定量试纸条的特异性。
通过用实施例3的时间分辨免疫定量试纸条检测阴性样本(5％甲醇-PBS溶液)和各个毒素不同浓度的阳性样本(0ng/mL、0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL)，记录其T线荧光强度值。
由图8和表4可以看出，河豚毒素与其他贝类毒素的交叉反应较低，表明时间分辨免疫定量试纸条性能稳定，符合市场需求，具有广阔的市场前景。
表4交叉反应试验结果
Figure BDA0003204300090000131
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种检测河豚毒素的时间分辨免疫层析定量试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线上包被河豚毒素完全抗原，所述质控线包被生物素；其中所述河豚毒素完全抗原的用量为0.3～8mg/mL，所述生物素的用量为0.1～1mg/mL。
2.根据权利要求1所述的时间分辨免疫层析定量试纸条，其特征在于，所述河豚毒素的检测浓度为0.1～1000ng/mL。
3.根据权利要求1或2所述的时间分辨免疫层析定量试纸条，其特征在于，所述河豚毒素完全抗原的制备方法，是由河豚毒素TTX标准品与载体蛋白偶联得到。
4.一种基于时间分辨免疫定量试纸条检测贝类中河豚毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)待测物的提取：将贝肉进行匀浆、加热处理、冷却、离心、收集上清液；之后脱脂，得到待测物；
(2)将经Eu3+-荧光微球标记的河豚毒素单克隆抗体Eu-TTX-mAb、Eu3+-荧光微球标记的链霉亲和素Eu-SA、待测物、缓冲液混合均匀孵育，得到待测溶液；
(3)将步骤(2)得到的待测溶液加入本发明所述的时间分辨免疫层析定量试纸条中的样品垫上进行层析，之后测定样品在检测线的荧光强度值：T值；
(4)将得到的T值代入定量曲线中，得到待测溶液中河豚毒素的浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中经Eu3+-荧光微球标记的河豚毒素单克隆抗体Eu-TTX-mAb、Eu3+-荧光微球标记的链霉亲和素Eu-SA、待测溶液、缓冲液的体积比为2：10：45：35。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的孵育是20～30℃孵育10～20min。
7.根据权利要求4～6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中层析是37℃层析15～20min。
8.根据权利要求4～7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中定量曲线是Y＝0.57365-0.2668LgX，R2＝0.9940，IC50＝1.713ng/mL检测限可达到0.047ng/mL；其中Y为T/T0，X为河豚毒素的浓度。
9.权利要求1～3任一项所述的时间分辨免疫层析定量试纸条在食品检测领域的应用。
10.权利要求4～8任一项所述的方法在食品检测领域的应用。
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