JPH03502487A

JPH03502487A - 同一性および出所を確認するための化学物品の標識

Info

Publication number: JPH03502487A
Application number: JP1502209A
Authority: JP
Inventors: ガーナー，ロナルド・コーリン; マーテイン，カール・ナイジエル
Original assignee: シエル・インターナシヨネイル・リサーチ・マーチヤツピイ・ベー・ウイ
Priority date: 1988-02-08
Filing date: 1989-02-08
Publication date: 1991-06-06
Anticipated expiration: 2011-11-06
Also published as: GB9017364D0; DE68922606D1; EP0409842B1; DE68922606T2; WO1989007272A1; ATE122466T1; EP0409842A1; GB2234588B; HK207796A; GB8802838D0; JP2551486B2; GB2234588A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】同−性および出所を確認するための化学物品の標識伎五立互本発明は、同一性および出所を確認するための化学物品の標識に関するものである。たとえば、これら化学物品は医薬品、食品添加物、化粧品、農薬、油および石油製品などの化学品、並びに化学品混合物とすることができる。

１景艮歪特定の化学式を有しかつ１つの製造業者により製造された化学物品を、同一の式を有するが他の製造業者により製造された同じ化学品から区別するのは一般に困難である。これは特に、２つの製造業者が同じ生産工程を用いる場合に言える。

この理由で、偽造者が組成物中の活性成分の化学式および組成物中の各成分の相対量を確認し、次いで自分の製品を他の製造業者の製品としてごまかすことは困難でない。

本発明者等は、マーカーの同一性を知っているものには誰でもマーカー物質の存在を容易にｌｉＩ！認しうるがマーカーを知らない偽造者または他の人により一般に確認しえないよう、化合物または化学組成物をマーカー物質で標識する方法を案出した。

かくして、偽造品および真正物品を、前者ではマーカーの不存在により、また後者ではマーカーの存在により区別することができる。

さらに、マーカーは化学物品もしくは化学組成物に関する他の情報、たとえばその生産臼、したがってその保存寿命の最終日などを示すにも有用である。

国際特許出願Ｗ０　８７１０６３８３号は、核酸もしくは蛋白質マーカーによって物品もしくは基質を標識する方法を開示している。その開示によれば、マーカー物質は一般に標識すべき物品に取付けられた正札に含まれ、その明細書に記載された試験はマーカーを定量することなく、このマーカーの存在もしくは不存在を決定する。

光里夏皿水しかしながら本発明によれば、化学品または化学組成物中に存在する少なくとも１種の不活性マーカー化合物を各不活性マーカー化合物のための各相補的結合要素に結合させて免疫学的結合対を形成させることにより各マーカー化合物の濃縮を行ない、濃縮された各マーカーを分析にかけることにより化学品もしくは化学組成物における各マーカー化合物の濃度を決定することを特徴とする化学品または化学組成物の出所を同定する方法が提供される。この分析には、任意適する分析技術、たとえば免疫分析または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。

−ｉに不活性マーカー化合物は、通常は化学品もしくは組成物に存在しないものとすべきであり、たとえばこれは生産工程の副産物、すなわち通常の不純物またはこの薬品に対する標準添加物、或いは化学組成物でない。マーカー化合物は、標識された組成物１ｋｇ当りμｇもしくはそれ以下の程度の極めて低い濃度で存在する。これは標識する化学品と反応しない意味において不活性であるが、相補的結合要素に対し結合することができねばならない、たとえば、マーカーは好適には抗体、好ましくはそのモノクローナル抗体により結合しうる分子である。

本発明は、単一のマーカー化合物を用いて数種の異なるバッチの化学品もしくは化学組成物の同定を容易化させる。これは、単一マーカー化合物を種々異なるバッチにおいて種々異なる濃度で用いて、各バッチをこのバッチにおけるマーカーの濃度測定により同定しうるからである。

好適具体例においては、複数のマーカー化合物を化学品もしくは組成物に含ませる。この場合、濃度およびマーカーの可能な変更の数が増大し、これらバッチをマーカーの相対濃度を測定して増大した確度で同定することができる。

本発明の幾つかの具体例においては、各マーカー物質を化学品もしくは組成物から溶剤中に抽出した後に、その相補的結合要素に結合させる。好ましくは、溶剤は相補的結合要素に対し適合しうるちのである。或いは、抽出溶剤が相補的結合要素に対し不適合である場合は、抽出物を適合性溶剤で希釈した後に相補的結合要素に結合させることもできる。

相補的結合要素は好ましくは抗体、特に好ましくはモノクローナル抗体である。

相補的結合要素は、望ましくは免疫親和性カラムに施される。

さらに本発明は、少なくとも１種の不活性マーカー化合物を含有し、前記各マーカーが通常は化学品もしくは化学組成物中に存在しない化合物であって、各マーカー化合物が５重置ｐｐｍ以下の濃度で存在すると共に、相補的結合要素を結合して免疫学的結合対を形成しうることを特徴とする化学品または化学組成物をも提供する。好ましくは、各マーカーは１００重量１）ｌ）ｂ以下の濃度で存在する。

上記説明から明らかなように、好適マーカー化合物は、対応する抗体に結合しうるちのである。好ましくは、これらはハブテン性である小有機分子であり、すなわちキャリヤ分子と組合せて投与することにより抗体を発生させうる分子である。

好ましくは、数種のマーカーを化学品もしくは組成物に含ませる。この場合、好ましくは標識された各化学品もしくは組成物における各マーカーの濃度の比は単位比であり、たとえば２種のマーカーが存在する場合には一方のマーカーと他方のマーカーとの濃度の比は１：１．１：２．１：３．１：４などとすることができる。

好ましくは、複数のマーカーを存在させる場合、これらは同一の相補的結合要素に結合して濃縮させうる共通部位を有するが、その後の分析技術によって分離可能である。すなわち成る種の具体例において、マーカー化合物の少な（とも１種は相補的結合要素に対するマーカー化合物の結合に影響を及ぼさないアミノ酸、核酸、オリゴヌクレオチドもしくはオリゴペプチド置換基を有することができる。この種の置換基は、マーカー化合物をたとえばＨＰＬＣのような分析技術により互いに一層容易に識別可能にする。

各種の物質を標識しうるが、マーカー化合物を含有する化学品もしくは組成物は好ましくはたとえば食品添加物、医薬品もしくは化粧品のような高価値の製品である。

本発明の他面においては、化学品もしくは化学組成物を標識しおよび／または所定のマーカー物質を同定するためのキットが提供される。このキットは、好ましくは少なくとも１種の不活性マーカー化合物と、この少なくとも１種の不活性マーカー化合物に関する少なくとも１種の相補的結合要素とからなり、この結合要素はマーカーを結合して免疫学的結合対を形成する。

マーカー化合物は標識された化学品もしくは組成物中にこのような低濃度で存在するため、その存在は添加したことを知らない者に即座には判らないことが明らかである。さらに、第三者が通常技術を用いてマーカーを同定すると共に、これを偽造組成物に含ませるのは容易でない、すなわち、マーカーの単離および濃縮はこれに対し特異性の抗体の使用番こ依存するからであり、これはマーカーの同一性を知らない者には入手しえないからである。

図ｍｔ笠説亙以下、添付図面を参照して本発明を実施例につきさらに説明する。

第１図はマーカーとして用いうる黴代謝物の式を示し、第２図は抗−ＲＡＬモノクローナル抗体および抗−アフラトキシン抗体に関する阻止ＥＬＩＳＡの結果を示し、第３Ａ図はそれぞれ２００ｎｇ／−のゼアラレノール（ｉｉ　）、ゼアクラノール（ｉｊ）およびゼアラレノン（ｉｖ　）を含有する２５μｌの標１！溶液に関するイソクラチック溶出経過を示し、第３Ｂ図はパラセタモールから抽出した後の同じ化合物の溶出経過を示し、第４Ａ図はＮ−アセチル−し−リジンアフラトキシンＢ１（３００ｎｇ／ｄの２５０μｆｆ１）の抽出経過を示し、第４Ｂ図および第４Ｃ［Ｆは２種の異なる方法によりアフタシェーブ剤から抽出されたＮ−アセチル−Ｌ−リジンアフラトキシンＢ、の溶出経過を示している。

本光研辺〕Ｊ１１式諸実施例において別々の２群の黴代謝物の要素を小有機分子の例として用い、これらを極めて低い濃度で使用して基質を標識しうると共に免疫親和性クロマトグラフィーにより特異的に抽出しかつ定量して、この基質の出所とバッチとの両者を同定することができる。これら実施例に用いる黴代謝物は毒物であるが、得られる結果はこの技術を医薬品および食品添加物を人間の健康に危険がない他の小分子で標識しうるよう拡張しうろことを示している。

これら別々の２群の黴代謝物に向けられた２種のモノクローナル抗体をこれら実施例に使用する。第１のレゾルシル酸ラクトン（ＲＡＬＳ）に向けられた抗体は３種の分子ゼア−レノン、ゼアラレノールおよびゼアクラノールに反応し、これらは高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により容易に分離される。第２の抗体は数種のアフラトキシン（他の群の黴代謝物）と反応する。これらのアフラトキシンもＨＰＬＣにより分離することができる。

各モノクローナル抗体は、この抗体における抗原結合部位が特定群の全黴代謝物の間にて共通である化学物質に向けられるので、数種の同様な黴代謝物と反応する。さらに、抗体に対するその結合を阻害することなく代謝物の所定部分を誘導化することもできる。たとえば、Ｎ−アセチルリジンアフラトキシンＢ１は抗− アフラトキシン抗体により結合される。この試験で用いた小有機分子の構造を第１図に示す。

構築ブロックとしてアミノ酸を用いることにより極めて多種の有力なマーカー化合物を発生させ、これにより高価値製品を標識することができる。したがって、モデルとして本出願人はＮ−アセチルリジンと称する１種のアミノ酸誘導体をアフラトキシンＢ、に結合させてこの手順を例示すると共に、化粧品の標識におけるこの誘導体の使用を示した。

アフラトキシンＢ＋　　（１６，７ｍｇ）をジクロルメタン（ｌｄ）に溶解させた。塩素ガスをこの溶液中に５分間バブリングさせた後、減圧蒸発させた。８，９−ジヒドロ−８，９−ジクロル−アフラトキシンＢ、を包含する得られた化合物の混合物を０，６−のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、かつ２０ｄの０．１　Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）に熔解された５００ｍｇのＮ−アセチルリジンと混合した。これら試薬を室温にて４８時間混合した後、５５−ＯＤＳ　２カラムにおける高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製を行ない、次のような水中のアセトニトリル濃度勾配にて溶出させた：時１．１　　　　　　％アセトニトリル：　水（Ｖ／Ｖ）Ａ（ｉｉ）７７丑源ン−人の要するに、アフラトキシンＢ、を直接に塩素化して８．９−ジヒドロ−８，９− ジクロルアフラトキシンＢ１を生成させ（サビオニ等、１９８７Ｌ次いでｏ、１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）におけるオバルブミンとの反応および透析により、ネズミに接種するためにアフラトキシンＢ１−オバルブミンを作成した（下記参照）。得られた抗原は、オバルブミンに共有結合した１０〜１５分子のアフラトキシンＢ、で構成された。

アフラトキシンＢ、を同様に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）にカップリングさせて、ＥＬＩＳＡプレートを被覆した（下記参照）。

Ａ　（ｉｉｉ）ゼア−レノン−人　の要するに、カルボキシメトキシアラニンによるゼアラレノンのヒドロキシル基のカルボキシル化に続く新たなカルボキシル基と蛋白におけるアミノ基との間のカルボジイミド反応（ソルベノットおよびモルフイン、１９８３）での反応により、ネズミに接種するためゼアラレノンーオバルブミンを作成した。得られた抗原は、１分子のオバルブミンに共有結合した１０〜１５分子のゼアラレノンで構成された。

さらに、ゼアラレノンを同様にして牛血清アルブミン（ＢＳＡ）にカンブリングさせて、ＥＬＩＳＡプレートを被覆した。

Ｂ、モ　ロール　のＢ（ｉ）迷ヌコ〕阻【榎抗原（上記のように蛋白結合体として作成）を、燐酸塩緩衝塩水におけるフロイント完成アジュバントの５０％（Ｖ／Ｖ）エマルジョンの１ｍｇ／ａｅ溶液として作成した。このエマルジョンを１０匹のＣ５７黒色Ｘｂａｌｂｃｆ−１雌ネズミの腹腔内に接種した。数回の接種（３００μｇ抗原／接種）を約３週間の間隔で行なった後、これらネズミを測高内出血させた。アフラトキシン／ゼアラレノンの特異的結合を伴う抗体に関する間接的分析および間接的■止酵素結合免疫収着分析（ＥＬＩＳＡ）により抗血清レベルを監視した。

Ｂ（ｉｉ）　　ズミ　　　ム　′ ＨＴ培地を、（２０％ｗ　／　ｖ　）胎児牛血清と０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールと１ｍＭのピルビン酸ナトリウムと１００ｍＭのヒボキサンチンと１００ｍＭのチミジンと１００μｇ／ｘｒｌのゲンタマイシンと２．５μｇ／Ｉｄのフンギシンとを含有するし一グルタミン（ギブコ・ヨーロッパ・リミテッド社）を含むＲＰＭＩ培地で構成した。Ｘ６３骨髄腫細胞（フロー・ラボラドリース社、ＵＫ）を、ヒボキサンチンとチミジンとの代わりに８−アザグアニン（１００ｍＭ）を含むＨＴ培地で増殖させた。１個の免疫化したネズミ牌臓からの肺細胞（１０”個）をＸ６３骨髄腫細胞（５Ｘ１０’、対数期）と融合させ、その際２０％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する血清フリーの培地におけるＧＣ級のポリエチレングリコール４０００　（メルク社）５０％（Ｗ／Ｖ）を６０秒間かけて徐々に添加し、次いで室温にて９０秒間にわたり静置した。この混合物を１０ＭＩＧＫＮ（水１１における８ｇのＮａＣ１と０．４ｇのＫＣｊ２と１．４２　ｇのＮ　ａ　ｚＨＰ　Ｏ，と０．７８　ｇのＮａＨ，ＰＯ２・２Ｈ２０と２ｇのグルコースと０．１　ｇのフェノールレンド）で５分間にわたり徐々に希釈し、次いで室温にて１０分間静置した。細胞を穴１個当り約１０４個のネズミ腹腔大食細胞を含有する１０Ｘ９６−穴コスター組織培養プレート（ノーサンプリア・バイオロジカルス社、ＵＫ）に分配すると共に、ＨＡＴ培地（アミノプテリンを含有するＨＴ培地）にてハイブリドーマを選択した。約２週間後、酵素結合免疫収着分析（ＥＬＩＳＡ）により上澄液を特異的抗体産生につきスクリーニングし、かつ下記するように阻止ＥＬＩＳＡにより特異性を確認した。

制限希釈により陽性のハイブリドーマをクローン化した。

Ｂ（溢）旦上土Σへ肢圭 ”　　’、ｋＵ　　−：　　ＰＢＳ　（１１，３ｍＭのＫ（１！、０．７ｍＭのＫＨｚＰＯｎ、８．２ｍＭのＮ　ａ　ｚ　ＨＰ　Ｏａ、８．２　ｍ　ＭのＮａ。

ＨＰＯ，，１３８ｍＭのＮａ　Ｃｊ２、ｐ　Ｈ７，２）。　溶液Ａ：１゜５ｍＭのＭｇＣｆ、と２ｍＭの２−メルカプトエタノールと０゜０５％（Ｖ／Ｖ）のツイーン２０とを含有するＰＢＳ、　　溶液Ｂ：１０ｍＭのに、ＨＰ　Ｏ，，１５０ｍＭのＮａ　Ｃ１，，１％Ｗ／Ｖの牛血清アルブミン（ｐＨ７，２）。　溶液Ｃ：１００ｍＭのクエン酸三ナトリウムと１００ｍＭの酢酸ナトリウムとでＨ２Ｏｔにより新たに作成した３、３’、５．５’−テトラメチルベンチジン（１００μｇ／ｄ）（溶液１０〇−当り１００容量の２０μ２）。

肢歪：　　間接的ＥＬ　Ｉ　ＳＡと阻止ＥＬ　Ｉ　ＳＡ技術とを上記（ホラ−等、１９７９）のように用いて、モノクローナル抗体をスクリーニングすると共に定量した。これら手順には５種の改変を行なった：（ｉ）ＰＢＳ中のアフラトキシンＢ、−生血清アルブミンもしくはゼアラレノンー牛血清アルブミン抗原（５０ｎｇ／穴１個）のいずれかを３７°Ｃにて２４時間にわたり透明なポリ塩化ビニル９６−穴コスタ−・ミクロ測定板（ノーサンプリア・バイオロジカルス社、ＵＫ）上にて被覆の際に乾燥させた；（ｉｉ）溶液Ａを用いてプレートを培養工程の間に洗浄した（４回）；　　（ｉｉｉ）第１および第２抗体を溶液Ｂで希釈し、かつプレート上で１時間にわたり室温にて振とうしながら培養した；（ｉｖ）競合阻止ＥＬ　Ｉ　ＳＡに間し、抗原と抗体との混合物を洗浄およびその後の工程に先立ちプレート上にて室温で１時間培養した（全容積７５μｊり；　　（ｖ）基質（溶液Ｃ）と共に培養する前に、プレートを溶液Ａで６回および蒸留水で２回洗浄した。基質と共に培養してから１５分間後、反応を等容積の２Ｍ　Ｈ２ＳＯ４で停止させた。

Ｃ０カームの臭化シアノゲン・セファロースＣＬ−４Ｂ樹脂（ファルマシア・リミテッド社）をモノクローナル抗体と反応させることにより（２゜５■の抗体に対しｌｌｌ１の樹脂の比）、免疫親和性樹脂を作成した。７５ＩＩｌ／ｇの１ｍＭ　　ＨＣｌ中で膨潤させることにより、臭化シアノゲン・セファロースＣＬ−４Ｂを活性化させた０次いで、この樹脂を５ｄ／ｇのカップリング緩衝液（１００ｍＭの炭酸水素ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐ　Ｈ８，３）で洗浄した。抗体をＰＢＳにより１．５６■／Ｍｉまで希釈し、次いで等容積のカップリング緩衝液で希釈した。この混合物を、膨潤しかつ洗浄された樹脂と室温にて１時間にわたり混合しながら反応させた。樹脂を濾過し、かつエタノールアミン（ｐＨ８，０にてＩＭ）と室温にて１時間混合した。樹脂を洗浄し、０．０５％ｗ　／　ｖのナトリウムアジドを含有するＰＢＳ（ｐＨ７，４）にて貯蔵した。

次いで、仕上樹脂の１部（０，０４ｍの沈降法容積）をプラスチックカラムにおける多孔質フリットの間に支持した。これらカラムを、マイコトキシン標準をこれらが５０−のＰＢＳ中に加えてアセトニトリル（２ｄ）で溶出させた際に、マイコトキシン標準を結合する能力につき検査した。定量はＨＰＬＣ分析により行なった。

Ｄ、執上広Ｄ（ｉ）　　パＩ：ＩＡ゛のレゾルシ１ン　−　　ン　ＲＡＬ　Ｓ　　の葺上標準ＲＡＬ溶液の濃度をλｍａににおける吸光度測定値と特定ＲＡＬに関する吸光係数とその分子量とから決定した。磨砕したパラセタモール錠剤の１部（１部当り６ｇ）に２．４μｇのＲＡＬＳ、ゼアラレノン、ゼアラレノールおよびゼアラレノールのそれぞれを第１表に示した種々異なる組合せにて添加した。

次いで、各試料を１２Ｈ１の３０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル：水と配合して２分間にわたり抽出した。各試料を１４００ｇ（ａｖ）にて２分間にわたり遠心分離し、４ｄを取出して蒸留水により４ｉまで希釈した後、上記２．Ｃで作成されたカラムにて免疫親和性クロマトグラフィーにかけた。カラムを１０ｄの蒸留水で洗浄した後、２Ｉｄのアセトニトリルで溶出させ、２ｄＯＨＰＬＣ級の水を添加すると共に容積を測定した。

試料（２５０μｊ２）をイソクラチック溶出（５０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル：水）により　Ｓ５　０ＤＳ　　２　　ＨＰＬＣカラム上にてクロマトグラフにかけ、次いで吸光度を２３６０醜にて測定した。比較しうるビーク面積の標準を試料操作の反復前後にクロマトグラフにかけて、各溶出液に存在するＲＡＬの濃度を定量化した。

Ｄ（ｉｉ）Ｋ１屈１′のアフラトキシンのアフラトキシンＧ、およびＧ２標準の濃度を分光光度法により測定し、それぞれ２００ｎｇを用いてｌｏｇの磨砕パラセタモールを処理し、次いで２０ｄの３０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル：水と２分間にわたり配合した。次いで、これを１４００ｇ（ａｖ）にて２分間遠心分離した。４ＩＲ１の上澄液を取出し、４４ｄのＰＢＳに添加し、次いでＲＡＬＳにつき記載したように免疫親和性クロマトグラフィーにかけた。溶出したアフラトキシンを３５　０ＤＳ　　Ｚ　　カラムにてクロマトグラフにかけ、水中の４％（Ｖ／Ｖ）の（５，４Ｖ／Ｖ）アセトニトリル：メタノールでイソクラチック溶出させると共に、その後のカラムにて飽和沃素水溶液でアフラトキシンを誘導化した後に蛍光測定した。試料操作を反復する前後に標準をクロマトグラフにかけて、溶出液におけるアフラトキシンの濃度を定量化した。

Ｄ　（ｉｊ）　化五遇土うｊば１１Ｌ九ｚＺ■狛皿Ｎ−アセチルリジン−アフラトキシンＢ１を重量で１ｍｇ／ｄの割合にて水中に溶解させ、この保存溶液を用いてアラミス・アフタシェーブ剤を処理し、これを２種の方法により抽出した。

Ｎ−アセチル−リジン−アフラトキシンＢ１（２μｇ）を２雌のアラミス・アフタシェーブ剤に添加した。約３０分間後、ＨＰ　Ｌ　Ｃ水（］、　ｉｆ　）を添加すると共に、混合物を約１　ｍｌの容積まで回転蒸発させた。これを５０ｄのＰＢＳで希釈した後に、免疫親和性クロマトグラフィーにかけた。カラムに結合したＮ　−アセチルリジン−アフラトキシンＢ１を２　：　１　（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル：水で溶出させ、次いで約６００μｌまで回転蒸発させた。この試料をＨＰ　Ｌ　Ｃ水で希釈した後、溶出に関し上記Ａ（１）に記載したような濃度勾配を用いてＳ５０ＤＳ　　２ＨＰＬＣカラムでクロマトグラフィーにかけた。

試料のピーク面積を、Ｎ−アセチル−リジン−アフラトキシンＢ１の定量に関する既知濃度の標準のピーク面積と比較した。

方法Ｂ：Ｎ−アセチル−リジン−アフラトキシンＢ＋（５００ｇ）を０、５　ｄのアラミス・アフタシェーブ剤に添加した。この混合物をＰＢＳで５０ｄまで希釈した後、免疫親和性クロマトグラフィーにかけた。溶出およびＨＰＬＣ分析を方法Ａに記載したと同様に行なった。

監果腿よび捜計Ａ　モ　クロー　ルー　の数種のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞ラインを、各群の黴代謝物につき作成した（上記部Ｂにおけると同様）。これら細胞ラインの生産性は、細胞が死滅するまで増殖した後に上澄培地の間接的ＥＬＩＳＡにより確認し、さらにこれらモノクローナル抗体の感度および特異性の測定を阻止ＥＬＴＳＡ（上記Ｂ（ｉｉｉ））によって行なった。選択された抗−ＲＡＬモノクローナル抗体および抗−アフラトキシン抗体に関する阻止ＥＬＩＳＡの結果を第２回に示す。両者をその５０％阻止濃度（ＩＣ，。）値に基づいて選択し、これらの数値は両者ともピコモル範囲であって、この規準に基づき効率的な免疫親和性樹脂の製造を可能にする。

Ｂ　　ＲＡＬＳおよびアフー　キシン　　人“渇挽兼弧乗且左立人夏脩力上記部Ｃにおけるように作成した特定の免疫親和性カラムを、増加量の黴代謝物をＰＢＳから結合するその能力につき検査した。

抗−ＲＡ　Ｌ免疫親和性カラムは、５０ｄのＰＢＳから７．０μｇ以上のゼアラレノンを結合する能力を有した。これはＰＢＳ５０ｓＲに加えられた５０００ｎｇまでのＲＡＬの８５〜９５％を結合した。

抗−アフラトキシン免疫親和性カラムは、２μｇ以上のアフラトキシンＢ、を５０ｄのＰＢＳから結合した。これらは、常に１１０００ｎまでのアフラトキシンＢ０、Ｂ２、Ｇ、もしくばＧ。

の９０％以上を結合した。

免疫親和性カラムに結合するアフラトキシンの量はＲＡＬＯ量と同程度に多い必要はない。何故なら、アフラトキシンはＲＡＬよりもずっと低いレベルで検出しうるからである。次の説明は、これら免疫親和性カラムを用いて黴代謝物の誘導体を２種の高価値製品からどのように抽出するかを示している。

Ｃ１司淀−す（Ｘ吹二小１１芳予辺使■パラセタモール錠剤中に種々異なる組合せで添加した３種のＲＡＬ　（４００ｒｉｇ／　ｇ　）および２種のアフラトキシン（２０ｎｇ／ｇ）は、この医薬品から７０％より大きい効率で抽出された（第１表）、各黴代謝物を３回のピーク面積の試料測定値の平均と、試料前後にクロマトグラフにかけた標準溶液のピーク面積と比較して定量化した０例えば第３Ａ図は、それぞれ２００ｎｇ／ｄのゼアラレノールい１）、ゼアラレノール（ｉｊ）およびゼアラレノン（ｉｖ　）を含有する２５０μｌの標準溶液に関するイソクラチック溶出経過を示している。第３Ｂ図は、上記部Ｄ（１）に記載したパラセタモールからの溶出後におけるＲＡＬの溶出経過を示している。しかしながら、成る種の極性物質（ピーク（１））が抽出物を汚染し、これはＲＡＬの定量化を阻害するので適切でない。保持時間（ｌｌｉｎ）を積分ピークの頂部で示す。添加物として用いたＲＡＬおよびアフラトキシンの種々異なる組合せを用いて、種々異なる製品バッチ間を区別することができる。これら黴代謝物の抽出は２つの相で行なった。

相１．　バラセタモールからの初期溶剤抽出の成功は、３０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル：水における黴代謝物の溶解度だけでなく、パラセタモールの他の化学成分の溶解度にも依存する。この相における抽出は１０．５０および７０％（ｖ／ｖ）と比較して３０％（Ｖ／Ｖ）’アセトニトリル：水にて最適であると判明した。

相２．　第２抽出相は、免疫親和性カラムに対する第１抽出物の添加を含む。最初に溶剤を水溶液にて、抗体が抗原を結合しろるレベルまで希釈した（何故なら、有機溶剤はこの能力を破滅するからである）。この段階における黴代謝物の溶解度は、免疫親和性カラムに対するその結合に影響を及ぼす。

アフラトキシン抽出物を２．５％（Ｖ／Ｖ）未満のアセトニトリル：　ＰＢＳまで希釈すると共に、ＲＡＬ抽出物を１０％（Ｖ／Ｖ）未満のアセトニトリル：水まで希釈した後、カラムに施した。

免疫親和性樹脂から抗原を除去する溶出液の効率も、溶出液における抗原の溶解度だけでなく、抗体を変性させる溶出液の能力に依存する。後者は多くの作用に依存する。恐らく、これら作用の最も重要な因子は、溶出液における抗体の水和に影響を及ぼす因子である。最適な溶出液は１００アセトニトリルであると判明した。これはＲＡＬとアフラトキシンとの両者の充分な回収率を与えると共に、ＨＰＬＣによる直接定量のためＨＰＬＣ水で５０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルまで希釈することができた。

抽出溶剤および溶出溶剤の性質は、個々の基質を強化すべく選択される化学品の性質に依存すると思われる。しかしながら、ここに記載した結果は、低濃度の小有機分子を医薬品に添加すると共に免疫親和性クロマトグラフィーを用いて各バンチ間の製品を同定すると共に区別しうることを示している。

Ｄ　　　　　　　口・　　　　　　の　　ミ　　　の高価値物品の各バッチを同定すると共に、それらの間を区別する目的で小有機分子を使用する能力の拡張として多数の異なるアミノ酸を抗体が作成されている所定の小有機分子に共役結合させることができる。これはこれら共役結合した小有機分子の免疫親和性クロマトグラフィーを変化させずに、たとえばＨＰＬＣのような検出法により一層容易に分離することを可能にする。事実、ＨＰＬＣにより種々異なるアミノ酸および／またはこれらアミノ酸の異なる配列を容易に分離することができる。

可能な組合せの個数は、この種の方法に用いうる２０種の天然アミノ酸および多くの合成化学品が存在するので極めて大である。結合体の選択は、「結果および検討」の部Ｃに記載したように、免疫親和性クロマトグラフィーにつき使用した溶剤におけるその溶解度に依存する。

この方法のモデルとして、本出願人はＮ−アセチル−リジンをアフラトキシンＢ１に共役結合させると共に、これをアフラトキシンに向けられた免疫親和性カラムを用いるアフタシェープ剤からの抽出の条件を検査した。共役結合は材料および方法のＡ（ｉ）の部に記載したように行ない、Ｎ−アセチル−Ｌ−リジンアフラトキシンＢ、として分光光度法で確認した。この結合体は、液体化粧品から容易に抽出することができる。たとえば、Ｎ−アセチル−し−リジン−アフラトキシンＢ、（５００ｎｇ）が添加されたアラミス・アフタシェーブ剤（５００μりを、（ａ）回転蒸発させ或いは（ｂ）ＰＢＳにより１％（Ｖ／Ｖ）まで希釈して、この製品のアルコール含有量を低下させた。

これは、６７％（Ｖ　／　Ｖ　）アセトニトリル：　ＨＰＬＣ級の水をカラムに施すことにより選択的に溶出された結合体を免疫親和性カラムが結合することを可能にした。アセトニトリル（非水性）は効果的溶出液でなく、極めて貧弱な収率を与えた。何故なら、結合体は水性アセトニトリルにおけるよりもこれに溶解度が低いからである。

第４図は、「材料および方法」の部Ａ（ｉ）におけるように作成されかつ「材料および方法」の部Ｄ　（ｉｊ）に記載したような条件下でクロマトグラフにかけたＮ−アセチル−し−リジン−アフラトキシンＢｔ　　（３００ｎｇ／ｍの２５０μ／りの溶出経過を示している。溶出濃度勾配（Ｙ軸）を溶出経過とし、溶出時間（ｗｉｎ）をＸ軸とする。第４Ｂ図は、アラミス・アフタシェープ剤から抽出するための方法Ａ（ｒ材料および方法」の部Ｄ（ｉｎ））（すなわちアルコールを除去するための初期の回転蒸発）を用いた結果を示している。抽出が１００％効率になれば、この試料は２４２ｎｇ／ｍｅのＮ−アセチル−し−リジン−アフラトキシンＢ１を含有するであろう、実際の効率は７９％であった。第４Ｃ図は、アラミスからの抽出（すなわちアフタシェーブ剤の直接的希釈）につき方法Ｂ（ｒ材料および方法」の部Ｄ（ｉｉ））を用いた結果を示している。抽出が効率１００％となれば、この試料はａ　２５ｎｇ／ｄのＮ−アセチル−Ｌ−リジン −アフラトキシンＢ１を含有するであろう。実際の効率は７３％であった。Ｎ− アセチル−し−リジン−アフラトキシンＢ、マーカーを含有しないアラミスは、溶出に際しクロマトグラフビークを示さなかった。

（以下余白）引用文献１．Ｇ、サボニ、Ｐ、　　Ｌ、スキンパー、Ｇ、プツチ、Ｓ、　　Ｒ。

タネンバウム（１９８７）。　ラットにてインビボでアフラトキシンＢ１により生成された主血清アルブミンアダクトの単離および特性化。　カルジノゲネシス、第８（６）巻、第８１９〜８２４頁。

２、Ｄ、ソウベノットおよびＲ，Ｆ、モルフイン（１９８３）。

ヒト血清におけるゼアラレノンおよびゼアラレノールの放射性免疫分析。　アプライド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー、第４５　（１）巻、第１６〜２３頁。

３、Ａ、ホラ−１Ｄ、Ｅ、　ピントウェル、Ａ、バートレット（１９７９）、　　酵素結合免疫吸着分析（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）、　　ダイナチク・ヨーロッパ社、バラ−・ハウス、ル・デ・ブレ、ゲルンシーから入手しうるマイクロプレート用途の要約を含む指針。

１　　　Ｈｆｉｌ　　　ｌｖ　　　　　　　　　　　　Ｉ　　ＨＩＮ　　　　＋ｖ国際調査報告噛・ｍｓ＋−・ｗｌ＾峠””””’　　　ＰＣＴ／ＧＢ　　８９１００１２１国際調査報告　　　ＧＢ　８９００１２１Ｔｈ−拳一自を買−ｍｐｓ電Ｃ―電Ｉｗａ＠作−９−Ｉけ貫ｍ璽ロ豹ス雷・ｔｈｅｐ齢ａｍ−−Ｃ「−一清瞠藁ｍｙ＝１１４−・！−−−Ｃ|ｉ・−−Ｃｒ詭１０ｍａ−修ｅ３ｒｅｈｔｖｐｗ’Ｌη− −−−カｗｅ　ａｇ　ｃ＊ｍｍ１ｅｅｄ　ｉａ　ｍ　Ｅｗ＊ｐｎａ　Ｐｍｔｍ　０ｆｆｉｃｅ　ＥＤＰ　ｆｌｉｔ　＊ａ　０ＱＪ６６１翌X ＴｍＥｗ＠−山繻Ｏｆｆｗ　ｍ　ｍ　Ｉｎ　ｍｙ　１ｉａｂｋ　ｌｅｒ−ｐＷ− ｗ−■−ｙ　ｇｉｖｅｓ　ｌ＋＋ｒ−ｐｗｒｐ帽ｍｌ　ｍａ窒高唐§X

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも１種の不活性マーカー化合物を含有し、前記各マーカーが通常は化学品もしくは化学組成物中に存在しない化合物であって、各マーカー化合物が５重量ｐｐｍ以下の濃度で存在すると共に、相補的結合要素を結合して免疫学的結合対を形成しうることを特徴とする化学品または化学組成物。
２．前記各マーカーの濃度が１００重量ｐｐｂ以下である請求の範囲第１項記載の化学品または化学組成物。
３．各マーカーが対応の抗体に結合しうる請求の範囲第１項または第２項記載の化学品または化学組成物。
４．複数のマーカー化合物を含有する請求の範囲第１項〜第３項のいずれか一項に記載の化学品または化学組成物。
５．マーカー化合物のそれぞれが同一の相補的結合要素に結合しうる請求の範囲第４項記載の化学品または化学組成物。
６．少なくとも１種のマーカー化合物が、相補的結合要素に対するマーカー化合物の結合に影響を与えないアミノ酸、核酸、オリゴペプチドもしくはオリゴヌクレオチド置換基を包含する請求の範囲第１項〜第５項のいずれか一項に記載の化学品または化学組成物。
７．医薬品、食品添加物もしくは化粧品である請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一項に記載の化学品または化学組成物。
８．少なくとも２種の不活性マーカー化合物を含有し、各マーカーが通常は化学品もしくは化学組成物中に存在しない化合物であると共に、同じ相補的結合要素に結合して免疫学的結合対を形成しうることを特徴とする化学品または化学組成物。
９．化学品または化学組成物中に存在する少なくとも１種の不活性マーカー化合物を各不活性マーカー化合物用の各相補的結合要素に結合させて免疫学的結合対を形成させることにより各マーカー化合物の濃縮を行ない、濃縮された各マーカーを分析にかけることにより薬品もしくは化学組成物における各マーカー化合物の濃度を決定することを特徴とする化学品または化学組成物の出所を同定する方法。
１０．出所を同定する化学品または化学組成物が請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一項に記載の化学品または化学組成物である請求の範囲第９項記載の方法。
１１．各マーカー一を、その相補的結合要素に結合させる前に前記化学品もしくは化学組成物から抽出する請求の範囲第９項または第１０項記載の方法。
１２．各不活性マーカー化合物を、免疫親和性カラム上に存在する各相補的結合要素により結合させる請求の範囲第９項〜第１１項のいずれか一項に記載の方法。
１３．各相補的結合要素が、その不活性マーカー化合物に対し特異性のモノクローナル抗体である請求の範囲第９項〜第１２項のいずれか一項に記載の方法。
１４．請求の範囲第９項〜第１３項のいずれか一項に記載の方法により化学品もしくは化学組成物を標識しおよび／または標識された化学品もしくは組成物の出所を同定するキットにおいて、少なくとも１種の不活性マーカー化合物と、この少なくとも１種の不活性マーカー化合物に対する少なくとも１種の相補的結合要素とからなることを特徴とするキット。