JP2551486B2 - 同一性および出所を確認するための化学物品の標識 - Google Patents

同一性および出所を確認するための化学物品の標識

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、同一性および出所を確認するための化学物
品の標識に関するものである。たとえば、これら化学物
品は医薬品、食品添加物、化粧品、農薬、油および石油
製品などの化学品、並びに化学品混合物とすることがで
きる。
背景技術 特定の化学式を有しかつ１つの製造業者により製造さ
れた化学物品を、同一の式を有するが他の製造業者によ
り製造された同じ化学品から区別するのは一般に困難で
ある。これは特に、２つの製造業者が同じ生産工程を用
いる場合に言える。この理由で、偽造者が組成物中の活
性成分の化学式および組成物中の各成分の相対量を確認
し、次いで自分の製品を他の製造業者の製品としてごま
かすことは困難でない。
本発明者等は、マーカーの同一性を知っているものに
は誰でもマーカー物質の存在を容易に確認しうるがマー
カーを知らない偽造者または他の人により一般に確認し
えないよう、化合物または化学組成物をマーカー物質で
標識する方法を案出した。かくして、偽造品および真正
物品を、前者ではマーカーの不存在により、また後者で
はマーカーの存在により区別することができる。
さらに、マーカーは化学物品もしくは化学組成物に関
する他の情報、たとえばその生産日、したがってその保
存寿命の最終日などを示すにも有用である。
国際特許願WO 87/06383号は、核酸もしくは蛋白質マ
ーカーによって物品もしくは基質を標識する方法を開示
している。その開示によれば、マーカー物質は一般に標
識すべき物品に取付けられた正札に含まれ、その明細書
に記載された試験はマーカーを定量することなく、この
マーカーの存在もしくは不存在を決定する。
発明の開示 しかしながら本発明によれば、化学品または化学組成
物中に存在する少なくとも１種の不活性マーカー化合物
を各不活性マーカー化合物のための各相補的結合要素に
結合させて免疫学的結合対を形成させることにより各マ
ーカー化合物の濃縮を行ない、 濃縮された各マーカーを分析にかけることにより化学品
もしくは化学組成物における各マーカー化合物の濃度を
決定する ことを特徴とする化学品または化学組成物の出所を同定
する方法が提供される。この分析には、任意適する分析
技術、たとえば免疫分析または高性能液体クロマトグラ
フィー（HPLC）を用いることができる。
一般に不活性マーカー化合物は、通常は化学品もしく
は組成物に存在しないものとすべきであり、たとえばこ
れは生産工程の副産物、すなわち通常の不純物またはこ
の薬品に対する標準添加物、或いは化学組成物でない。
マーカー化合物は、標識された組成物1kg当りμｇもし
くはそれ以下の程度の極めて低い濃度で存在する。これ
は標識する化学品と反応しない意味において不活性であ
るが、相補的結合要素に対し結合することができねばな
らない。たとえば、マーカーは好適には抗体、好ましく
はそのモノクローナル抗体により結合しうる分子であ
る。
本発明は、単一のマーカー化合物を用いて数種の異な
るバッチの化学品もしくは化学組成物の同定を容易化さ
せる。これは、単一マーカー化合物を種々異なるバッチ
において種々異なる濃度で用いて、各バッチをこのバッ
チにおけるマーカーの濃度測定により同定しうるからで
ある。
好適具体例においては、複数のマーカー化合物を化学
品もしくは組成物に含ませる。この場合、濃度およびマ
ーカーの可能な変更の数が増大し、これらバッチをマー
カーの相対濃度を測定して増大した確度で同定すること
ができる。
本発明の幾つかの具体例においては、各マーカー物質
を化学品もしくは組成物から溶剤中に抽出した後に、そ
の相補的結合要素に結合させる。好ましくは、溶剤は相
補的結合要素に対し適合しうるものである。或いは、抽
出溶剤が相補的結合要素に対し不適合である場合は、抽
出物を適合性溶剤で希釈した後に相補的結合要素に結合
させることもできる。
相補的結合要素は好ましくは抗体、特に好ましくはモ
ノクローナル抗体である。相補的結合要素は、望ましく
は免疫親和性カラムに施される。
さらに本発明は、少なくとも１種の不活性マーカー化
合物を含有し、前記各マーカーが通常は化学品もしくは
化学組成物中に存在しない化合物であって、各マーカー
化合物が５重量ppm以下の濃度で存在すると共に、相補
的結合要素を結合して免疫学的結合対を形成しうること
を特徴とする化学品または化学組成物をも提供する。好
ましくは、各マーカーは100重量ppb以下の濃度で存在す
る。
上記説明から明らかなように、好適マーカー化合物
は、対応する抗体に結合しうるものである。好ましく
は、これらはハプテン性である小有機分子であり、すな
わちチャリヤ分子と組合せて投与することにより抗体を
発生させうる分子である。
好ましくは、数種のマーカーを化学品もしくは組成物
に含ませる。この場合、好ましくは標識された各化学品
もしくは組成物における各マーカーの濃度の比は単位比
であり、たとえば２種のマーカーが存在する場合には一
方のマーカーと他方のマーカーとの濃度の比は1:1、1:
2、1:3、1:4などとすることができる。
好ましくは、複数のマーカーを存在させる場合、これ
らは同一の相補的結合要素に結合して濃縮させうる共通
部位を有するが、その後の分析技術によって分離可能で
ある。すなわち或る種の具体例において、マーカー化合
物の少なくとも１種は相補的結合要素に対するマーカー
化合物の結合に影響を及ぼさないアミノ酸、核酸、オリ
ゴヌクレオチドもしくはオリゴペプチド置換基を有する
ことができる。この種の置換基は、マーカー化合物をた
とえばHPLCのような分析技術により互いに一層容易に識
別可能にする。
各種の物質を標識しうるが、マーカー化合物を含有す
る化学品もしくは組成物は好ましくはたとえば食品添加
物、医薬品もしくは化粧品のような高価値の製品であ
る。
本発明の他面においては、化学品もしくは化学組成物
を標識しおよび／または所定のマーカー物質を同定する
ためのキットが提供される。このキットは、好ましくは
少なくとも１種の不活性マーカー化合物と、この少なく
とも１種の不活性マーカー化合物に関する少なくとも１
種の相補的結合要素とからなり、この結合要素はマーカ
ーを結合して免疫学的結合対を形成する。
マーカー化合物は標識された化学品もしくは組成物中
にこのような低濃度で存在するため、その存在は添加し
たことを知らない者に即座には判らないことが明らかで
ある。さらに、第三者が通常技術を用いてマーカーを同
定すると共に、これを偽造組成物に含ませるのは容易で
ない。すなわち、マーカーの単離および濃縮はこれに対
し特異性の抗体の使用に依存するからであり、これはマ
ーカーの同一性を知らない者には入手しえないからであ
る。
図面の簡単な説明 以下、添付図面を参照して本発明を実施例につきさら
に説明する。
第１図はマーカーとして用いうる黴代謝物の式を示
し、 第２図は抗−RALモノクローナル抗体および抗−アフ
ラトキシン抗体に関する阻止ELISAの結果を示し、 第3A図はそれぞれ200ng/mlのゼアラレノール（ii）、
ゼアララノール（iii）およびゼアラレノン（iv）を含
有する25μｌの標準溶液に関するイソクラチック溶出経
過を示し、 第3B図はパラセタモールから抽出した後の同じ化合物
の溶出経過を示し、 第4A図はＮ−アセチル−Ｌ−リジンアフラトキシンB1
（300ng/mlの250μｌ）の抽出経過を示し、 第4B図および第4C図は２種の異なる方法によりアフタ
シェーブ剤から抽出されたＮ−アセチル−Ｌ−リジンア
フラトキシンB1の溶出経過を示している。
本発明の実施方式 諸実施例において別々の２群の黴代謝物の要素を小有
機分子の例として用い、これらを極めて低い濃度で使用
して基質を標識しうると共に免疫親和性クロマトグラフ
ィーにより特異的に抽出しかつ定量して、この基質の出
所とバッチとの両者を同定することができる。これら実
施例に用いる黴代謝物は毒物であるが、得られる結果は
この技術を医薬品および食品添加物を人間の健康に危険
がない他の小分子で標識しうるよう拡張しうることを示
している。
これら別々の２群の黴代謝物に向けられた２種のモノ
クローナル抗体をこれら実施例に使用する。第１のレゾ
ルシル酸ラクトン（RALS）に向けられた抗体は３種の分
子ゼアラレノン、ゼアラレノールおよびゼアララノール
に反応し、これらは高性能液体クロマトグラフィー（HP
LC）により容易に分離される。第２の抗体は数種のアフ
ラトキシン（他の群の黴代謝物）と反応する。これらの
アフラトキシンもHPLCにより分離することができる。
各モノクローナル抗体は、この抗体における抗原結合
部位が特定群の全黴代謝物の間にて共通である化学物質
に向けられるので、数種の同様な黴代謝物と反応する。
さらに、抗体に対するその結合を阻害することなく代謝
物の所定部分を誘導化することもできる。たとえば、Ｎ
−アセチルリジンアフラトキシンB1は抗−アフラトキシ
ン抗体により結合される。この試験で用いた小有機分子
の構造を第１図に示す。
構築ブロックとしてアミノ酸を用いることにより極め
て多種の有力なマーカー化合物を発生させ、これにより
高価値製品を標識することができる。したがって、モデ
ルとして本出願人はＮ−アセチルリジンと称する１種の
アミノ酸誘導体をアフラトキシンB1に結合させてこの手
順を例示すると共に、化粧品の標識におけるこの誘導体
の使用を示した。
材料および方法 A.共役結合反応 Ａ（ｉ）Ｎ−アセチルリジン−アフラトキシンB1の作成 アフラトキシンB1（16.7mg）をジクロルメタン（1m
l）に溶解させた。塩素ガスをこの溶液中に５分間バブ
リングさせた後、減圧蒸発させた。8,9−ジヒドロ−8,9
−ジクロル−アフラトキシンB1を包含する得られた化合
物の混合物を0.6mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に
溶解し、かつ20mlの0.1M燐酸塩緩衝液（pH7.4）に溶解
された500mgのＮ−アセチルリジンと混合した。これら
試薬を室温にて48時間混合した後、S5−ODS 2カラムに
おける高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）精製を行
ない、次のような水中のアセトニトリル濃度勾配にて溶
出させた： 時間 ％アセトニトリル：水（v/v） ０ 0 ６ 30 12 100 15 100 17 0 27 0 Ａ（ii）アフラトキシン−蛋白結合体の作成 要するに、アフラトキシンB1を直接に塩素化して8,9
−ジヒドロ−8,9−ジクロルアフラトキシンB1を生成さ
せ（サビオニ等、1987）、次いで0.1M燐酸塩緩衝液（pH
7.4）におけるオバルブミンとの反応および透析によ
り、ネズミに接種するためにアフラトキシンB1−オバル
ブミンを作成した（下記参照）。得られた抗原は、オバ
ルブミンに共有結合した10〜15分子のアフラトキシンB1
で構成された。
アフラトキシンB1を同様に牛血清アルブミン（BSA）
にカップリングさせて、ELISAプレートを被覆した（下
記参照）。
Ａ（iii）ゼアラレノン−蛋白結合体の作成 要するに、カルボキシメトキシアラニンによるゼアラ
レノンのヒドロキシル基のカルボキシル化に続く新たな
カルボキシル基と蛋白におけるアミノ基との間のカルボ
ジイミド反応（ソルベノットおよびモルフィン、1983）
での反応により、ネズミに接種するためゼアラレノン−
オバルブミンを作成した。得られた抗原は、１分子のオ
バルブミンに共有結合した10〜15分子のゼアラレノンで
構成された。
さらに、ゼアラレノンを同様にして牛血清アルブミン
（BSA）にカップリングさせて、ELISAプレートを被覆し
た。
B.モノクローナル抗体の作成 Ｂ（ｉ）ネズミの接種 抗原（上記のように蛋白結合体として作成）を、燐酸
塩緩衝塩水におけるフロイント完成アジュバントの50％
（v/v）エマルジョンの1mg/ml溶液として作成した。こ
のエマルジョンを10匹のC57黒色×balb c f−１雌ネズ
ミの腹腔内に接種した。数回の接種（300μｇ抗原／接
種）を約３週間の間隔で行なった後、これらネズミを洞
窩内出血させた。アフラトキシン／ゼアラレノンの特異
的結合を伴う抗体に関する間接的分析および間接的阻止
酵素結合免疫収着分析（ELISA）により抗血清レベルを
監視した。
Ｂ（ii）ネズミ脾臓融合技術 HT培地を、（20％v/v）胎児牛血清と0.05mMの２−メ
ルカプトエタノールと1mMのピルビン酸ナトリウムと100
mMのヒポキサンチンと100mMのチミジンと100μg/mlのゲ
ンタマイシンと2.5μg/mlのフンギゾンとを含有するＬ
−グルタミン（ギブコ・ヨーロッパ・リミテッド社）を
含むRPMI培地で構成した。X63骨髄腫細胞（フロー・ラ
ボラトリース社、UK）を、ヒポキサンチンとチミジンと
の代わりに８−アザグアニン（100mM）を含むHT培地で
増殖させた。１個の免疫化したネズミ脾臓からの脾細胞
（108個）をX63骨髄腫細胞（５×106、対数期）と融合
させ、その際20％（v/v）ジメチルスルホキシド（DMS
O）を含有する血清フリーの培地におけるGC級のポリエ
チレングリコール4000（メルク社）50％（w/v）を60秒
間かけて徐々に添加し、次いで室温にて90秒間にわたり
静置した。この混合物を10mlGKN（水１）における8g
のNaClと0.4gのKClと1.42gのNa2HPO4と0.78gのNaH2PO4
・2H2Oと2gのグルコースと0.1gのフェノールレッド）で
５分間にわたり徐々に希釈し、次いで室温にて10分間静
置した。細胞を穴１個当り約104個のネズミ腹腔大食細
胞を含有する10×96−穴コスター組織培養プレート（ノ
ーサンブリア・バイオロジカルス社、UK）に分配すると
共に、HAT培地（アミノプテリンを含有するHT培地）に
てハイブリドーマを選択した。約２週間後、酵素結合免
疫収着分析（ELISA）により上澄液を特異的抗体産生に
つきスクリーニングし、かつ下記するように阻止ELISA
により特異性を確認した。制限希釈により陽性のハイブ
リドーマをクローン化した。
Ｂ（iii）ELISA技術 溶液および緩衝剤:PBS（11.3mMのKCl、0.7mMのKH2P
O4、8.2mMのNa2HPO4、8.2mMのNa2HPO4、138mMのNaCl、p
H7.2）。溶液A:1.5mMのMgCl2と2mMの２−メルカプトエ
タノールと0.05％（v/v）のツイーン20と含有するPBS。
溶液B:10mMのK2HPO4、150mMのNaCl、１％w/vの牛血清ア
ルブミン（pH7.2）。溶液C:100mMのクエン酸三ナトリウ
ムと100mMの酢酸ナトリウムとでH2O2により新たに作成
した3,31,5,51−テトラメチルベンチジン（100μg/ml）
（溶液100ml当り100容量の20μｌ）。
技術：間接的ELISAと阻止ELISA技術とを上記（ホラー
等、1979）のように用いて、モノクローナル抗体をスク
リーニングすると共に定量した。これら手順には５種の
改変を行なった：（ｉ）PBS中のアフラトキシンB1−牛
血清アルブミンもしくはゼアラレノン−牛血清アルブミ
ン抗原（50ng/穴１個）のいずれかを37℃にて24時間に
わたり透明なポリ塩化ビニル96−穴コスター・ミクロ測
定板（ノーサンブリア・バイオロジカルス社、UK）上に
て被覆の際に乾燥させた；（ii）溶液Ａを用いてプレー
トを培養工程の間に洗浄した（４回）；（iii）第１お
よび第２抗体を溶液Ｂで希釈し、かつプレート上で１時
間にわたり室温にて振とうしながら培養した；（iv）競
合阻止ELISAに関し、抗原と抗体との混合物を洗浄およ
びその後の工程に先立ちプレート上にて室温で１時間培
養した（全容積75μｌ）；（ｖ）基質（溶液Ｃ）と共に
培養する前に、プレートを溶液Ａで６回および蒸留水で
２回洗浄した。基質と共に培養してから15分間後、反応
を等容積の2M H2SO4で停止させた。
C.免疫親和性カラムの作成 臭化シアノゲン・セファロースCL−4B樹脂（ファルマ
シア・リミテッド社）をモノクローナル抗体と反応させ
ることにより（2.5mgの抗体に対し1mlの樹脂の比）、免
疫親和性樹脂を作成した。75ml/gの1mM HCl中で膨潤さ
せることにより、臭化シアノゲン・セファロースCL−4B
を活性化させた。次いで、この樹脂を5ml/gのカップリ
ング緩衝液（100mMの炭酸水素ナトリウム、500mMの塩化
ナトリウム、pH8.3）で洗浄した。抗体をPBSにより1.56
mg/mlまで希釈し、次いで等容積のカップリング緩衝液
で希釈した。この混合物を、膨潤しかつ洗浄された樹脂
と室温にて１時間にわたり混合しながら反応させた。樹
脂を濾過し、かつエタノールアミン（pH8.0にて1M）と
室温にて１時間混合した。樹脂を洗浄し、0.05％w/vの
ナトリウムアジドを含有するPBS（pH7.4）にて貯蔵し
た。
次いで、仕上樹脂の１部（0.04mlの沈降床容積）をプ
ラスチックカラムにおける多孔質フリットの間に支持し
た。これらカラムを、マイコトキシン標準をこれらが50
mlのPBS中に加えてアセトニトリル（2ml）で溶出させた
際に、マイコトキシン標準を結合する能力につき検査し
た。定量はHPLC分析により行なった。
D.抽出法 Ｄ（ｉ）医薬品からのレゾルシリン酸ラクトン（RALS）
の抽出 標準RAL溶液の濃度をλmaxにおける吸光度測定値と特
定RALに関する吸光係数とその分子量とから決定した。
磨砕したパラセタモール錠剤の１部（１部当り6g）に2.
4μｇのRALS、ゼアラレノン、ゼアラレノールおよびゼ
アラうノールのそれぞれを第１表に示した種々異なる組
合せにて添加した。次いで、各試料を12mlの30％（v/
v）アセトニトリル：水を配合して２分間にわたり抽出
した。各試料を1400g（av）にて２分間にわたり遠心分
離し、4mlを取出して蒸留水により4mlまで希釈した後、
上記2.Cで作成されたカラムにて免疫親和性クロマトグ
ラフィーにかけた。カラムを10mlの蒸留水で洗浄した
後、2mlのアセトニトリルで溶出させ、2mlのHPLC級の水
を添加すると共に容積を測定した。
試料（250μｌ）をイソクラチック溶出（50％（v/v）
アセトニトリル：水）によりS5 ODS 2 HPLCカラム上に
てクロマトグラフにかけ、次いで吸光度を236nmにて測
定した。比較しうるピーク面積の標準を試料操作の反復
前後にクロマトグラフにかけて、各溶出液に存在するRA
Lの濃度を定量化した。
Ｄ（ii）医薬品からのアフラトキシンの抽出 アフラキトシンG1およびG2標準の濃度を分光光度法に
より測定し、それぞれ200ngを用いて10gの磨砕パラセタ
モールを処理し、次いで20mlの30％（v/v）アセトニト
リル：水と２分間にわたり配合した。次いで、これを14
00g（av）にて２分間遠心分離した。4mlの上澄液を取出
し、44mlのPBSに添加し、次いでRALSにつき記載したよ
うに免疫親和性クロマトグラフィーにかけた。溶出した
アフラトキシンをS5 ODS 2カラムにてクロマトグラフに
かけ、水中の４％（v/v）の（5.4v/v）アセトニトリ
ル：メタノールでイソクラチック溶出させると共に、そ
の後のカラムにて飽和沃素水溶液でアフラトキシンを誘
導化した後に蛍光測定した。試料操作を反復する前後に
標準をクロマトグラフにかけて、溶出液におけるアフラ
トキシンの濃度を定量化した。
Ｄ（iii）化粧品からの誘導化リジンの抽出 Ｎ−アセチルリジン−アフラトキシンB1を重量で1mg/
mlの割合にて水中に溶解させ、この保存溶液を用いてア
ラミス・アフタシェーブ剤を処理し、これを２種の方法
により抽出した。
Ｎ−アセチル−リジン−アフラトキシンB1（２μｇ）
を2mlのアラミス・アフタシェーブ剤に添加した。約30
分間後、HPLC水（1ml）を添加すると共に、混合物を約1
mlの容積まで回転蒸発させた。これを50mlのPBSで希釈
した後に、免疫親和性クロマトグラフィーにかけた。カ
ラムに結合したＮ−アセチルリジン−アフラトキシンB1
を2:1（v/v）アセトニトリル：水で溶出させ、次いで約
600μｌまで回転蒸発させた。この試料をHPLC水で希釈
した後、溶出に関し上記Ａ（ｉ）に記載したような濃度
勾配を用いてS5 ODS 2HPLCカラムでクロマトグラフィー
にかけた。試料のピーク面積を、Ｎ−アセチル−リジン
−アフラトキシンB1の定量に関する既知濃度の標準のピ
ーク面積と比較した。
方法B: Ｎ−アセチル−リジン−アフラトキシンB1（500g）を
0.5mlのアラミス・アフタシェーブ剤に添加した。この
混合物をPBSで50mlまで希釈した後に、免疫親和性クロ
マトグラフィーにかけた。溶出およびHPLC分析を方法Ａ
に記載したと同様に行なった。
結果および検討 Ａモノクローナル抗体の特異性 数種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞ラインを、各群の黴代謝物につき作成した（上記部
Ｂにおけると同様）。これら細胞ラインの生産性は、細
胞が死滅するまで増殖した後に上澄培地の間接的ELISA
により確認し、さらにこれらモノクローナル抗体の感度
および特異性の測定を阻止ELISA（上記Ｂ（iii））によ
って行なった。選択された抗−RALモノクロナール抗体
および抗−アフラトキシン抗体に関する阻止ELISAの結
果を第２図に示す。両者をその50％阻止濃度（IC50）値
に基づいて選択し、これらの数値は両者ともピコモル範
囲であって、この基準に基づき効率的な免疫親和性樹脂
の製造を可能にする。
B RALSおよびアフラトキシンを結合する免疫親和性カラ
ムの能力 上記部Ｃにおけるように作成した特定の免疫親和性カ
ラムを、増加量の黴代謝物をPBSから結合するその能力
につき検査した。
抗−RAL免疫親和性カラムは、50mlのPBSから7.0μｇ
以上のゼアラレノンを結合する能力を有した。これはPB
S 50mlに加えられた5000ngまでのRALの85〜95％を結合
した。
抗−アフラトキシン免疫親和性カラムは、２μｇ以上
のアフラトキシンB1を50mlのPBSから結合した。これら
は、常に1000ngまでのアフラトキシンB1、B2、G1もしく
はG2の90％以上を結合した。
免疫親和性カラムに結合するアフラトキシンの量はRA
Lの量と同程度に多い必要はない。何故なら、アフラト
キシンはRALよりもずっと低いレベルで検出しうるから
である。次の説明は、これら免疫親和性カラムを用いて
黴代謝物の誘導体を２種の高価値製品からどのように抽
出するかを示している。
Ｃ製品を同定するための小有機分子の使用 パラセタモール錠剤中に種々異なる組合せで添加した
３種のRAL（400ng/g）および２種のアフラトキシン（20
ng/g）は、この医薬品から70％より大きい効率で抽出さ
れた（第１表）。各黴代謝物を３回のピーク面積の試料
測定値の平均と、試料前後にクロマトグラフにかけた標
準溶液のピーク面積と比較して定量化した。例えば第3A
図は、それぞれ200ng/mlのゼアラレノール（ii）、ゼア
ララノール（iii）およびゼアラレノン（iv）を含有す
る250μｌの標準溶液に関するイソクラチック溶出経過
を示している。第3B図は、上記部Ｄ（ｉ）に記載したパ
ラセタモールからの溶出後におけるRALの溶出経過を示
している。しかしながら、或る種の極性物質（ピーク
（ｉ））が抽出物を汚染し、これはRALの定量化を阻害
するので適切でない。保持時間（min）を積分ピークの
頂部で示す。添加物として用いたRALおよびアフラトキ
シンの種々異なる組合せを用いて、種々異なる製品バッ
チ間を区別することができる。これら黴代謝物の抽出は
２つの相で行なった。
相1.パラセタモールからの初期溶剤抽出の成功は、30％
（v/v）アセトニトリル：水における黴代謝物の溶解度
だけでなく、パラセタモールの他の化学成分の溶解度に
も依存する。この相における抽出は10、50および70％
（v/v）と比較して30％（v/v）アセトニトリル：水にて
最適であると判明した。
相2:第２抽出相は、免疫親和性カラムに対する第１抽出
物の添加を含む。最初に溶剤を水溶液にて、抗体が抗原
を結合しうるレベルまで希釈した（何故なら、有機溶剤
はこの能力を破滅するからである）。この段階における
黴代謝物の溶解度は、免疫親和性カラムに対するその結
合に影響を及ぼす。
アフラトキシン抽出物を2.5％（v/v）未満のアセトニ
トリル:PBSまで希釈すると共に、RAL抽出物を10％（v/
v）未満のアセトニトリル：水まで希釈した後、カラム
に施した。
免疫親和性樹脂から抗原を除去する溶出液の効率も、
溶出液における抗原の溶解度だけでなく、抗原を変性さ
せる溶出液の能力に依存する。後者は多くの作用に依存
する。恐らく、これら作用の最も重要な因子は、溶出液
における抗体の水和に影響を及ぼす因子である。最適な
溶出液は100アセトニトリルであると判明した。これはR
ALとアフラトキシンとの両者の充分な回収率を与えると
共に、HPLCによる直接定量のためHPLC水で50％（v/v）
アセトニトリルまで希釈することができた。
抽出溶剤および溶出溶剤の性質は、個々の基質を強化
すべく選択される化学品の性質に依存すると思われる。
しかしながら、ここに記載した結果は、低濃度の小有機
分子を医薬品に添加すると共に免疫親和性クロマトグラ
フィーを用いて各バッチ間の製品を同定すると共に区別
しうることを示している。
Ｄ構築用ブロックとしてのアミノ酸の使用 高価値物品の各バッチを同定すると共に、それらの間
を区別する目的で小有機分子を使用する能力の拡張とし
て多数の異なるアミノ酸を抗体が作成されている所定の
小有機分子に共役結合させることができる。これはこれ
ら共役結合した小有機分子の免疫親和性クロマトグラフ
ィーを変化させずに、たとえばHPLCのように検出法によ
り一層容易に分離することを可能にする。事実、HPLCに
より種々異なるアミノ酸および／またはこれらアミノ酸
の異なる配列を容易に分離することができる。可能な組
合せの個数は、この種の方法に用いうる20種の天然アミ
ノ酸および多くの合成化学品が依存するので極めて大で
ある。結合体の選択は、「結果および検討」の部Ｃに記
載したように、免疫親和性クロマトグラフィーにつき使
用した溶剤におけるその溶解度に依存する。
この方法のモデルとして、本出願人はＮ−アセチル−
リジンをアフラトキシンB1に共役結合させると共に、こ
れをアフラトキシンに向けられた免疫親和性カラムを用
いるアフタシェーブ剤からの抽出の条件を検査した。共
役結合は材料および方法のＡ（ｉ）の部に記載したよう
に行ない、Ｎ−アセチル−Ｌ−リジンアフラトキシンB1
として分光光度法で確認した。この結合体は、液体化粧
品から容易に抽出することができる。たとえば、Ｎ−ア
セチル−Ｌ−リジン−アフラトキシンB1（500ng）が添
加されたアラミス・アフタシェーブ剤（500μｌ）を、
（ａ）回転蒸発させ或いは（ｂ）PBSにより１％（v/v）
まで希釈して、この製品のアルコール含有量を低下させ
た。これは、67％（v/v）アセトニトリル:HPLC級の水を
カラムに施すことにより選択的に溶出された結合体を免
疫親和性カラムが結合することを可能にした。アセトニ
トリル（非水性）は効果的溶出液でなく、極めて貧弱な
収率を与えた。何故なら、結合体は水性アセトニトリル
におけるよりもこれを溶解度が低いからである。
第４図は、「材料および方法」の部Ａ（ｉ）における
ように作成されかつ「材料および方法）の部Ｄ（iii）
に記載したような条件下でクロマトグラフにかけたＮ−
アセチル−Ｌ−リジン−アフラトキシンB1（300ng/mlの
250μｌ）の溶出経過を示している。溶出濃度勾配（Ｙ
軸）を溶出経過とし、溶出時間（min）をＸ軸とする。
第4B図は、アラミス・アフタシェーブ剤から抽出するた
めの方法Ａ（「材料および方法」の部Ｄ（iii））（す
なわちアルコールを除去するための初期の回転蒸発）を
用いた結果を示している。抽出が100％効率になれば、
この試料は242ng/mlのＮ−アセチル−Ｌ−リジン−アフ
ラトキシンB1を含有するであろう。実際の効率は79％で
あった。第4C図は、アラミスからの抽出（すなわちアフ
タシェーブ剤の直接的希釈）につき方法Ｂ（「材料およ
び方法」の部Ｄ（iii））を用いた結果を示している。
抽出が効率100％となれば、この試料は325ng/mlのＮ−
アセチル−Ｌ−リジン−アフラトキシンB1を含有するで
あろう。実際の効率は73％であった。Ｎ−アセチル−Ｌ
−リジン−アフラトキシンB1マーカーを含有しないアラ
ミスは、溶出に際しクロマトグラフピークを示さなかっ
た。
引用文献 1.G.サボニ、P.L.スキッパー、G.ブッチ、S.R.タネンバ
ウム（1987）。ラットにてインビボでアフラトキシンB1
により生成された主血清アルブミンアダクトの単離およ
び特性化。カルシノゲネシス、第８（６）巻、第819〜8
24頁。
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性免疫分析。アプライド・エンバイロンメンタル・マイ
クロバイオロジー、第45（１）巻、第16〜23頁。
3.A.ホラー、D.E.ビッドウェル、A.バートレット（197
9）。酵素結合免疫吸着分析（ELISA）。ダイナテク・ヨ
ーロッパ社、バラー・ハウス、ル・デ・プレ、ゲルンシ
ーから入手しうるマイクロプレート用途の要約を含む指
針。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−269069（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−170769（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−45454（ＪＰ，Ａ) ＩＡＲＣ Ｓｃｉ．Ｐａｂｌ．，59, 313−21，（1984) Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｓｔｎ，33 （12），Ｐ555−７，（1983)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】化学物品または化学組成物の出所を同定す
    る方法であって、 （ａ）１種またはそれ以上の不活性マーカー化合物を、
    出所を同定すべき化学物品または化学組成物に添加して
    標識化学物品または標識化学組成物を調製し、 （ｂ）出所を同定すべき試験化学物品または試験化学組
    成物中に含まれる上記不活性マーカー化合物を、不活性
    マーカー化合物に対して相補的な各結合要素に結合させ
    て、免疫学的結合対の形成及びマーカー化合物の濃縮を
    行い、 （ｃ）濃縮されたマーカー化合物を分析することによ
    り、試験化学物品または試験化学組成物中に含まれるマ
    ーカー化合物の濃度を検出または決定する ことからなる上記方法。
  2. 【請求項２】化学物品または化学組成物が、医薬品、食
    品添加物、化粧品もしくは農薬である請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】マーカー化合物の濃度が５重量ppm以下と
    なるようマーカー化合物を添加する請求の範囲第１項ま
    たは第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】マーカー化合物の濃度が100重量ppb以下と
    なるようマーカー化合物を添加する請求の範囲第３項に
    記載の方法。
  5. 【請求項５】段階（ａ）にて複数のマーカー化合物を添
    加する請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一項に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】上記各マーカー化合物が、同一の相補的結
    合要素に結合可能であり、かつ段階（ｂ）での結合に用
    いられる請求の範囲第５項に記載の方法。
  7. 【請求項７】段階（ｂ）におけるマーカー化合物の相補
    的結合要素が、対応する抗体である請求の範囲第１項〜
    第６項のいずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】段階（ａ）が、相補的結合要素に対するマ
    ーカー化合物の結合に影響を与えないアミノ酸、核酸、
    オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチド置換基を有す
    る少なくとも１種のマーカー化合物を添加することから
    なる請求の範囲第１項〜第７項のいずれか一項に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】マーカー化合物を、その相補的結合要素に
    結合させる前に上記化学物品または化学組成物から抽出
    する請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一項に記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】マーカー化合物を、免疫親和性カラム上
    に存在する各相補的結合要素により結合させる請求の範
    囲第１項〜第９項のいずれか一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】各相補的結合要素が、その不活性マーカ
    ー化合物に対して特異的なモノクローナル抗体である請
    求の範囲第１項〜第10項のいずれか一項に記載の方法。
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