JP2016530216A - 抗体組成物及びそのための緩衝系 - Google Patents

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Abstract

単離された抗体を標識又は誘導体化試薬にコンジュゲートする方法であって、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む緩衝系中で、抗体を、活性化標識若しくは活性化誘導体化試薬と接触させるか、又は抗体を、抗体コンジュゲーション試薬が存在する状態で標識若しくは誘導体化試薬と接触させる工程を含む、方法。

Description

本発明は、コンジュゲーション反応に使用するための抗体組成物、抗体単離キット、単離された抗体を標識にコンジュゲートするための方法、及びこのような組成物、キット又は方法に使用するための緩衝系に関する。
すべての抗体は、最初に粗製形態(例えば、免疫血清、腹水、ハイブリドーマ組織培養上清)で作製される。抗体は、多くの基礎研究及び診断適用に使用する前に精製して、汚染性の非抗体タンパク質及び小分子(例えばアミノ酸)の多く(又はすべて)を除去しなければならない。
精製は、抗体を、通常「標識化抗体」若しくは「抗体コンジュゲート」と呼ばれるハイブリッド試薬を作り出すために「標識」(例えば、酵素、有機色素、蛍光性タンパク質又は着色粒子)に共有結合によって結合する場合、又は新しい官能基を導入する目的で、誘導体化試薬に共有結合によって結合する場合に、特に重要である。コンジュゲートの抗体成分は、特定の抗原(例えば、タンパク質、薬物、ペプチド又はバイオマーカー)に対する特異性を付与し、標識は測定可能性を付与し、したがってコンジュゲートは、例えばウエスタンブロット、組織切片、培養細胞、血液試料、尿等において抗原を検出し、定量化するために使用することができる。
抗体の精製において非常に重要な工程は、抗体を、抗原アフィニティーカラムに結合させるか、又は抗原の結合に直接関与しない抗体領域と相互作用する、固定化タンパク質A、タンパク質G若しくはタンパク質Lを担持しているカラムに結合させることである。抗原アフィニティーカラムによる抗体の精製は、粗製試料における無関係の抗原特異性を有する抗体が、カラムには保持されないという点で有利である。このようなアフィニティー精製の方法は、安定しており、信頼でき、血清、腹水及びハイブリドーマ組織培養上清などの粗製試料から抗体を精製するために、広く使用されている。
精製するためにどの手法が使用されるかにかかわらず、カラムに結合した抗体は、通常、低pHのバッファー(典型的にグリシン又はクエン酸を含む)を用いて溶出され、次に低pHによって誘発される抗体の損傷を最小限に抑えるために、例えばpH8.0〜9.0のトリスバッファーを用いて速やかに中和される。(例えば非特許文献1)。低pHのグリシン又はクエン酸バッファーは、低価格であり、抗体と抗原の相互作用の撹乱に必要なpH値において良好な緩衝能を有するので、これらを用いる溶出がよく用いられている。
中和された精製抗体は、保存される前に、通常(常にではない)PBS又はいくつかの他のほぼ中性pHのバッファーに対して透析される。透析された抗体には、安定化し、又は微生物の増殖を防止する目的で、しばしば他の物質(例えばBSA、ナトリウムアジド、洗浄剤)が添加される。
抗体を商業的供給源から購入する場合、精製プロセスに使用される透析工程に関する情報が与えられることは極めて稀である。したがって、精製プロセスに由来するバッファーの成分が、抗体の最終調製物に残存するかどうかは不明な場合がある。このような考察は、抗体を標識化すべき場合、アフィニティーカラムを溶出するために使用されるバッファーが標識化反応においてしばしば重大な干渉を引き起こすので、非常に重要である。
あらゆるタイプの標識が、最も一般的には抗体分子上のリシン残基に結合する。例えば、有機蛍光色素のNHSエステル、及びよく用いられているフルオレセインのイソチオシアネート誘導体(FITC)は、リシン残基と反応する。他のコンジュゲーション化学(例えばチオールとマレイミド)には、リシン残基が伴うか明らかでない場合があるが、それにもかかわらず、コンジュゲーション化学は、コンジュゲーションプロセスの初期工程において、ほぼ常にリシン修飾に依存する。例えば、マレイミド及び様々な他の官能基(例えば保護されたチオール、アジド、ヨードアセチル基)をタンパク質分子に導入するために、リシンを標的としたヘテロ二官能性NHSエステル誘導体化試薬が一般に使用される。抗体をカルボキシル化マイクロ粒子又はナノ粒子にコンジュゲートするために使用されるカルボジイミドでは、表面のカルボキシル基が抗体のリシン残基と反応して、アミド結合が形成される。
リシン残基を伴う誘導体化又はコンジュゲーション反応は、第一級アミンを含有する物質、例えば遊離アミノ酸が存在する状態では実施できないことが周知である。これは、このような物質がタンパク質のリシン残基と競合するからである。競合の問題のため、従来技術は、カルボジイミド媒介型反応(カルボキシルとアミンのカップリングを伴う)の場合、カルボキシル又は第一級アミン官能基のいずれかと共に添加剤を使用しないように強く教示している。
したがって、よく用いられている抗体溶出バッファーは、ほとんどすべてのタイプの抗体標識化方法において禁忌である。抗体と標識のカルボジイミド媒介型反応は、アミンとカルボキシル基の縮合を伴うので、このような反応にはグリシンもクエン酸も存在することができない。
例えば、非特許文献2には、「カルボキシラート含有バッファー又はアミン含有バッファー、例えばクエン酸塩、酢酸塩、グリシン、又はトリスは回避すべき」という忠告が示されている。
カルボジイミドカップリングに言及している非特許文献3は、「遊離アミンを含有するバッファー、例えばトリス又はグリシンは回避すべき」と記載している。
カルボキシル含有ミクロスフェアを使用する反応は、非特許文献4に論じられており、「遊離アミンを含有するバッファー、例えばグリシンのトリス[原文通り]は回避すべき」という注意書きが示されている。
ThermoFisher製のカルボジイミド依存ビオチン化キット(EZ−Link(登録商標)アミン−PEGn−ビオチン、製品コード26136)は、「第一級アミン(トリス、グリシン等)又はカルボキシル(酢酸塩、クエン酸塩等)を含有するバッファーは、反応をクエンチするので回避すべき」と記載している。
カルボキシルカップリング樹脂に関するG Biosciencesの手順は、「注記:EDCを使用するカップリング反応については、遊離アミン又はリン酸塩を含有するバッファーがカップリング効率に干渉するため、これらの使用は回避すべき。トリス、酢酸塩及びグリシンバッファーは、すべてEDC又はカップリング中間体と容易に反応する」と警告している。
最後に、カルボキシル化金コンジュゲーションキットと共に使用するためのプロトコルは、「タンパク質溶液(タンパク質安定剤を含む)における任意の他のアミン含有分子又はカルボキシル含有分子は、コンジュゲーション反応と競合する」(OceanNanotech、製品コードGCK)と記載している。
やはりカルボキシル修飾を伴わない、リシンを標的とした修飾反応の場合、クエン酸は許容され得るが、グリシンは常に禁忌であり、例えばDyLight(登録商標)アミン反応色素プロトコル(非特許文献5)は、「第一級アミンを含有するバッファー(例えば、トリス又はグリシン)は、NHS−エステル部分と反応するので干渉となる」と記載している。
抗体試料において潜在的に干渉する可能性がある小分子、例えばグリシン及びクエン酸は、抗体をコンジュゲーション反応において使用する前に、透析又は脱塩によって除去することができる。透析によるこのような分子の除去効率は、透析バッファーの体積に対する抗体試料の体積、透析バッファーの変更回数、及び次のバッファーに変更する前に平衡に達するかどうかに関係する。このような情報は、市販の抗体ではほとんど知らされない。
残念ながら、抗体は、典型的に少量で購入されるので(例えば抗体約1mg/mlの濃度で100ul)、材料を著しく喪失せずに市販の抗体を透析/脱塩することは困難である。更に、透析中には試料の希釈が行われ得るが、抗体標識化反応における使用に必要な最小濃度(典型的に1mg/ml)に達するためには、おそらくはその後、抗体の濃縮工程が必要となる(その結果、材料が更に喪失する)。ミリグラム量の抗体の透析は、相対的に容易であるが、そのプロセスは必然的に時間がかかり、バッファーを数回変更することが必要な場合には1〜2日かかる場合がある。透析膜、及び高い値のミリグラム尺度で必要とされる大量の透析バッファーにより、製造費用もかさむ。
Thermo Scientific Protein Purification Technical Handbook、ref 1601617 07/08 Bioconjugate Techniques、Hermanson GT、1995年、ISBN 0−12−342336−8、102頁(及び2008年の最新版である第2版ISBN 9780123705013の117頁) Bangs Labs、tech note 205 「Immobilization of Enzymes and Cells」、2006年、Guisan JM編、223頁、ISBN 1−58829−290−8 Thermo Scientific、No 2032.11
本発明の目的は、抗体を精製及び/又はコンジュゲートする方法、このような方法のためのキット、並びに従来技術の欠点を克服する抗体組成物を提供することである。
抗体標識化技術は、特にプロセスの単純化に関して、ここ数年で著しく進化している。多段階コンジュゲーション方法は、操作者側に特定の化学知識を要することのない単純な一段階プロセスで置き換えられつつある。
時間がかかり、高価であり、抗体の喪失をもたらす透析工程の介在を回避するためには、抗体精製手順と標識化反応を上手く統合することが必要である。抗体精製を行う科学者によって最初に採用されたバッファーは、ほとんどのコンジュゲーション化学と適合性がないため、「コンジュゲーションに利用しやすい溶出バッファー」(CFEB)は明らかに必要である。ここで本発明者らは、CFEBを、よく用いられているコンジュゲーション方法において干渉を引き起こさない(すなわち、抗体とカルボジイミド、NHSエステル、イソチオシアネート、マレイミド及びチオール化(thiolation)試薬の反応が最小限に抑えられる)、1及び4の間のpKaを有するバッファーと定義する。
第1の態様では、本発明は、コンジュゲーション反応に使用するための抗体組成物を提供する。該組成物は、緩衝系中に単離された抗体を含み、該緩衝系は、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む。
更なる一態様では、本発明は、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含むバッファーの、固相から抗体を溶出するための使用を提供する。
更なる一態様では、本発明は、抗体を結合するための固相アフィニティーマトリックスと、抗体がアフィニティーマトリックスに結合した場合に抗体を溶出するためのバッファーとを含む抗体単離キットであって、バッファーが、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む、抗体単離キットを提供する。
更なる一態様では、本発明は、単離された抗体を標識にコンジュゲートする方法を提供する。該方法は、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む緩衝系中で、抗体を、抗体コンジュゲーション試薬が存在する状態で活性化標識又は標識と接触させる工程を含む。
驚くべきことに、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸化合物を含む緩衝系は、抗体コンジュゲーション反応に使用できることが見出された。このような緩衝系は、抗体精製手順とコンジュゲーション反応の両方に使用することができ、それによって望ましくない透析工程の必要性が回避される。
カルボジイミド反応における、市販の抗体に見出される可能性が高い分子(例えば、グリシン、クエン酸、アジド)の干渉度を決定するために、本発明者らは、抗体と市販のカルボキシル化ナノ粒子の反応について研究した。本発明者らは、グリシンが、高濃度でも干渉を引き起こさなかったことに驚いた。グリシンは、アミン官能基とカルボキシル官能基の両方を有しており、従来技術では明らかに禁忌である。本発明者らは、この予期しなかった知見を利用して新しい精製キットを開発し、その精製キットの抗体製品は、事前のコンジュゲーション抗体透析工程を必要とせずに、カルボジイミド反応だけでなく、よく用いられているすべての他のコンジュゲーション化学にも使用することができる。本発明を、以下により完全に記載する。
モノカルボン酸バッファー化合物は、α位又はβ位にアミン置換基を有し、コンジュゲーション反応に干渉できないという条件で、1つ又は複数の他の置換基を更に含むことができる。典型的に、更なる置換基が存在する場合、それらの置換基は、1つ又は複数の非アミン置換基である。バッファー化合物上には、更なる置換基が存在しないことが好ましい。
第二級又は第三級アミンは、典型的に、コンジュゲーション反応において第一級アミンよりも反応性が低いので、アミン置換基として好ましい。アミン置換基は、好ましくは第四級アンモニウム置換基である。特にモノカルボン酸バッファー化合物として適している好ましいクラスの化合物は、ベタインである。ベタインは、第四級アンモニウム置換基を含有する。好ましいベタインは、グリシンベタインとしても公知のN,N,N−トリメチルグリシンである。
それにもかかわらず、モノカルボン酸バッファー化合物のアミン置換基は、第一級アミンであり得る。モノカルボン酸が第一級アミノ酸である場合、モノカルボン酸は、アラニン、βアラニン又は2アミノ酪酸であり得る。典型的な第二級又は第三級アミンには、プロリン、トリシン、N−メチルグリシン、N,N−ジメチルグリシン又は2−ピコリン酸が含まれる。
モノカルボン酸バッファー化合物にアミン置換基が存在すると、電子求引効果を介してカルボン酸アニオンが安定化されることによって、カルボキシル基のpKaが低下する。典型的に、モノカルボン酸バッファー化合物のカルボキシル基は、1〜4の範囲、好ましくは1.5〜3.5の範囲のpKaを有する。モノカルボン酸バッファー化合物のアミンは、典型的に8を超える、好ましくは9を超えるpKaを有する。pH5におけるコンジュゲーション反応では、アミンは、大部分はプロトン化形態であり、したがってコンジュゲーション反応において非反応性である。
モノカルボン酸バッファー化合物は、抗体組成物中に、200mM未満、好ましくは100mM未満、より好ましくは50mM未満の濃度で存在する。
一構成では、緩衝系は、5.5を超えるpKaを有する中和バッファー化合物を更に含む。中和バッファー化合物は、抗体をどのように単離したかにより緩衝系中に存在し得る。これについて、以下に更に詳説する。抗体組成物のpHは、典型的に5〜9の範囲にある。中和バッファーは、好ましくは、より低いpHの固相から溶出した後に、組成物のpHを増大するように存在する。抗体組成物を低pHに長時間曝露することは、抗体タンパク質の損傷を誘発するおそれがあるので望ましくない。
緩衝系は、6〜8の範囲のpKaを有するキャッチバッファー化合物(catch buffer compound)を更に含むことができる。この構成では、中和バッファー化合物は、好ましくは8を超えるpKaを有し、より好ましくは8〜11の範囲にある。キャッチバッファー化合物の濃度は、好ましくは中和バッファー化合物の濃度未満である。キャッチバッファーを、以下に更に詳説する。
一構成では、単離された抗体は、標識にコンジュゲートされている。標識は、酵素、蛍光性タンパク質、有機色素、着色粒子、ビオチン、ストレプトアビジン又はポリマーを含むことができる。
一構成では、緩衝系は、抗体又は抗体コンジュゲートのための保存媒体として使用される。このように、抗体組成物は、使用前に透析工程を必要とせずに、使用できる状態で保存することができる。
モノカルボン酸バッファー化合物を含む緩衝系が、固相から抗体を溶出するために使用される場合、固相は、カラム内に配置することができる。典型的に、固相は、抗体のためのアフィニティーマトリックスを含む。バッファーのpHは、典型的に1.8〜4.8の範囲にある。この種の酸性pHは、抗体が固相に特異的に結合した場合、抗体を除去するために必要である。
中和バッファーは、相対的に酸性の溶出バッファーによるpHによって誘発される損傷を回避するために、抗体の単離において使用され得る。中和バッファーは、モルホリノ、ピペリジン又はN−シクロヘキシル化合物を含むことができる。好ましくは、中和バッファーは、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸(EPPS又はHEPPS)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(HEPPSO)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸)(HEPBS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、4−(シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸(CABS)又は3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシル−1−プロパンスルホン酸(CAPSO)を含む。
中和バッファーのpHは、好ましくは6を超える。したがって、酸性pHで溶出された抗体を含む組成物に、十分な量の中和バッファーを導入すると、抗体が相対的に安定になるレベルまでpHが増大する。
いくつかの構成では、中和バッファーのpHは、8を超え、最も好ましくは8.5〜11、例えば9〜9.5の範囲にある。中和バッファーは、典型的に、pH値1単位内のpKaを有する。中和バッファーが8を超える場合、6〜8の範囲のpKaを有するキャッチバッファーを更に使用することが好ましい。キャッチバッファーの目的は、溶出された抗体を含む組成物のpHを過度に上昇させる中和バッファーの使用を防止することである。キャッチバッファーとして使用するのに適したバッファー化合物には、MOPS又はHEPESが含まれる。キャッチバッファーは、典型的に6〜8の範囲のpHを有する溶液として添加され得る。或いは、キャッチバッファーは、中和バッファーと組み合わせることができる。この場合、組み合わせた溶液のpHは、典型的に、キャッチバッファーのpKaを十分に超え、典型的にpH8を超える。
単離された抗体を標識若しくは誘導体化試薬にコンジュゲートする方法は、緩衝系中で、抗体を活性化標識若しくは活性化誘導体化試薬を接触させるか、又は抗体を、抗体コンジュゲーション試薬が存在する状態で標識若しくは誘導体化試薬と接触させる工程を含む。抗体コンジュゲーション試薬、活性化標識又は活性化誘導体化試薬は、典型的に、以下の反応基、カルボジイミド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、イソチオシアネート又はチオール化試薬の1つ又は複数を含む。単離された抗体を標識にコンジュゲートする方法は、典型的に5〜9の範囲のpHで実施される。有利には、抗体を標識に接触させる工程の前に、抗体は、本明細書に記載の通り固相から抗体を溶出する工程によって単離される。本発明によれば、単離された抗体を標識にコンジュゲートするための緩衝系は、抗体を溶出する工程に使用されるバッファーを含む。このように、透析工程などのバッファーの任意の交換工程は必要ない。
ここで、本発明を、以下の実施例及び添付の図を参照しながら、単に例示的なものとして更に詳説する。
フルオレセインコンジュゲーション反応に対するベタインの効果を示す図である。 フィコエリトリンコンジュゲーション反応に対するトリシンの効果を示す図である。 イソチオシアネート(フルオレセイン)コンジュゲーション反応に対するベタイン、クエン酸及びグリシンの効果を示す図である。 NHSエステル(フルオレセイン)コンジュゲーション反応に対するベタイン、クエン酸及びグリシンの効果を示す図である。 イミノチオランの安定性に対するベタイン、クエン酸及びグリシンの効果を示す図である。 キャッチバッファーが存在する状態及び存在しない状態の、高pKa成分によるCFEBの中和を示す図である。
コンジュゲーション反応における、市販の抗体に一般に見出される様々な物質の干渉度を決定するための実験では、本発明者らは、従来技術における確かな証拠に反して、高濃度のグリシンが、抗体とカルボキシル化金ナノ粒子のカルボジイミド媒介型反応に干渉しないことを発見した。
反応における様々な種の濃度は、典型的に、抗体16.67nM、抗体リシン1uM(抗体分子1個当たりリシン60個と想定する)、EDC0.1mM、及びグリシン50mMであった。したがって、抗体リシン及びEDCの両方よりも膨大なモル過剰のグリシンが存在しているが、グリシンの酸基及びアミン基は、抗体上のリシン残基と金ナノ粒子上のカルボキシル基の生産的コンジュゲーション反応を防止しない。EDCは、この反応では必須であることが見出され、コンジュゲートは、カルボジイミドが存在しない状態では形成されない。
官能基の化学反応性は、しばしばそのpKa及び反応混合物のpHに関する。[下記のpKa値は、25℃の温度に関する値である]。
グリシンにおけるカルボキシル基のpKa(2.35)は、α−アミノ基の安定化(電子求引)効果の結果として、他の同等の脂肪酸(例えば酢酸、pKa4.76)と比較して、相対的に低い。ヘンダーソン−ハッセルバルヒ(Hasselbach)式を使用した算出では、グリシンのアミン基(pKa9.8)が、pH5.0でほぼ完全にその非反応性プロトン化形態であることが示され、それによって、グリシンのアミノ基がカルボジイミド反応において許容され得る理由が部分的に説明され得る。
しかし、カルボジイミド媒介型反応の第1の工程は、EDCとカルボキシル基の反応を含み、理論では、pH5ではグリシンの99.78%がイオン化されている(すなわちCOO)ことを示している。この形態は、水溶液中のプロトン化カルボジイミドを攻撃する形態であるため、pKaの考察では、グリシンによる干渉が生じないことを明確に説明することができない。むしろイオン化カルボキシル基は、カルボキシル活性化サイクルを介して、次に急速な加水分解又は任意の利用可能なアミンとの反応のいずれかによってEDCを消費すると予測することができ、したがって、抗体とカルボキシル化ナノ粒子の反応に干渉すると思われる。
抗体とナノ粒子のカルボジイミド媒介型コンジュゲーション反応におけるグリシンの効果に関する、誤解を招くおそれがある従来技術の既述を考慮すると、本発明者らは、他のアミン含有物質及びカルボキシル含有物質が、コンジュゲーションに利用しやすい潜在的に可能な物質として見落とされていたのではないかと考えた。より重要なことに、本発明者らは、カルボジイミド媒介型反応と適合性のある物質だけでなく、複数の抗体コンジュゲーション技術と適合性のある物質を同定したいと考えた。
本発明者らは、抗体アフィニティーカラムの溶出のためのバッファーとして使用するのに適している約1〜4のpKa値を有する有機酸に関する試験に焦点を合わせた。また本発明者らは、他の一般的な抗体添加剤、並びに様々な酸、アミノ酸及び他の誘導体を含む本発明者らの研究を拡張して、カルボジイミド反応においてグリシンによる干渉が生じないことの背後にある機序の理解に努めた。
最初に分子を、カルボキシル化金粒子(InnovaCoat GOLD、Innova Biosciences)とのEDC媒介型反応においてpH5で試験した。このスクリーニング実施から得た、潜在的に可能性な興味深い分子を、NHSエステル反応、イソチオシアネート反応及びイミノチオランを伴うチオール化反応において更に評価した。これらの反応のすべてが、抗体コンジュゲーション分野で広く使用されるが、すべてが、グリシンが存在する状態では干渉されるという欠点があると予測され得る。
カルボジイミド媒介型反応によるスクリーニング結果を、表1に示す。
抗体における一般的な添加剤であるリン酸塩及びナトリウムアジドは、EDCと直接反応することによって、ほぼ確実に干渉を引き起こした。一般的な第一級アミンを含有する中和バッファー又は保存バッファーであるトリスは、激しい干渉を引き起こした。
効果をほとんど又は全く示さない、アラニン、DL−2−アミノ酪酸、ベタイン(グリシンベタイン;N,N,N−トリメチルグリシン)、N,N−ジメチルグリシン、β−アラニン、N−メチルグリシン(サルコシン)、2−ピコリン酸(2−ピリジンカルボン酸)、トリシン[(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン]及びプロリンを含めたいくつかのアミノ酸及び関連分子が同定された。
GABA(γ−アミノ酪酸)及びニコチン酸を含めた他のアミノ酸は、著しい干渉を示した。
2つの酸性基を有するモノアミノ酸(例えばアスパラギン酸)は、激しい干渉を引き起こした(データ示さず)。
激しい干渉を引き起こした他の酸(すなわちアミンを含まない酸)には、クエン酸、コハク酸、トリクロロ酢酸、及び2,4,6−トリヒドロキシ安息香酸が含まれていた。
著しい干渉を引き起こしたが、コンジュゲーション反応を完全には消失させなかった酸には、シクロヘキサンカルボン酸、酢酸ナトリウム及びピバル酸が含まれていた。
まとめると、これらのデータは、カルボジイミド反応における干渉を最小限に抑えるようにCFEBバッファーに設計されなければならない構造的特徴を例示している。
1つの酸官能基を有しており、窒素原子を有していない(すなわち第一級、第二級若しくは第三級アミンを有していない、又は四級化アンモニウムイオンを有していない)あらゆる分子は、干渉を引き起こした。2つの酸官能基を有する分子も、アミンが存在しているかどうかにかかわらず干渉を引き起こした。したがって、いずれかがカルボジイミド反応において禁忌であると予測されるアミンとカルボキシル基の両方が存在すると、ある場合には一緒になって干渉を実際に防止することができる。
酸(典型的にカルボキシル)基に対するアミンの位置は、非常に重要であることが明らかである。最小限の干渉を示す化合物については、アミン官能基とカルボキシル官能基は、1つの原子によって分離されている。2つの介在原子を有するいくつかの分子は、それなりに十分に許容されるものであったが、3つの介在原子を有する化合物は、著しい干渉を引き起こす。
GABAでは、アミノ官能基とカルボキシル官能基は、3つの原子によって分離されており、アミンは、酸(pKa4.23)のpKaを低減しない。酸基のほとんど(85.5%)は、pH5では推定的な反応性COO−形態で存在し、それと比較して、グリシンについては更により多量に反応性形態で存在する(約99.8%)。しかしGABAは、カルボジイミド媒介型反応を著しく阻害する一方、グリシン(pKa2.3)は阻害しない。極めて近接している(すなわち1つの原子によって分離されている)アミノ官能基及びカルボン酸官能基を有するGABA異性体であるDL−2アミノ酪酸(pKa2.29)は、干渉を示さなかった。
類似の結果が、芳香族酸であるニコチン酸、pKa2.2について見られ、これらはカルボジイミド反応において部分的な干渉を示したが、極めて近接しているアミン窒素及びカルボキシル基を有しているその異性体であるピコリン酸(pKa1.07)は、効果がなかった。
したがって、極めて近接しているアミンが存在しない状態のカルボン酸は、特に低pKa値を有しており、pH5で著しくイオン化されている場合に干渉を引き起こす。TCA(pKa0.7)は、pH5で本質的に完全にイオン化されており、激しい干渉を引き起こす。それに対して、ピバル酸(pKa=5.03、すなわちpH5で約50%がイオン化されており、トリクロロ酢酸の塩素原子が、メチル基で置き換えられている)は、部分的にしか阻害を示さなかった。
したがって、水溶液中の本発明者らによるカルボジイミド反応においてグリシンの効果が生じないことは、負電荷及び正電荷の中心が、水素結合を介して相互作用して分子内環を形成し、カルボキシル基の反応性を低減することによるものであると、最も簡潔に説明される。またこのような相互作用には、グリシンが気相中では双性イオンを形成しないので、1つ又は複数の水分子が関与しなければならない。グリシンなどの単純なアミノ酸でも、その溶液構造は非常に複雑であり、いくつかの水分子は、グリシン双性イオンの安定化に関与すると考えられる(Xuら、J.Chem.Phys.119、10696〜10701頁、2003年)。
一般に化学では、5員又は6員環の形成は、高度に歪みを有する3員若しくは4員環、又は7個以上の原子を有する環よりも有利であるとされる傾向がある。したがって、本発明者らによるカルボジイミド反応に干渉しないモノカルボン化合物は、互いに直接的に又は架橋溶媒分子(又は場合によりイオン)を介して間接的に相互作用して低エネルギー状態の5員又は6員環を生じることができる、帯電したアミン及びカルボキシルを有している可能性が高いと思われる。しかし、帯電した基が、より離れている(すなわち3つの原子によって分離されている)場合、分子内の環は、大きすぎて熱力学的に不利になり、イオン化カルボキシル基は、プロトン化カルボジイミドと自由に反応する。
したがって、非常に重要な構造的特徴、すなわち極めて近接しているアミン及びカルボキシルを有しており(及び他の干渉基を有していない)、各基が実質的にイオン化されている任意の分子は、pH5でカルボジイミド反応において低い反応性を呈する可能性が高い。カルボキシルのpKaが十分に低い場合(<4)、分子は、抗体カラムの溶出にも適している。
非常に重要な構造的特徴を有するバッファーは、他に応用することができる。例えば、ピコリン酸(アミンのpKa5.52)は、5未満のpH値でMES(pKa6.15)よりもはるかに良好なバッファーである。これらのpH値では、2−ピコリン酸のアミンは、大部分がプロトン化され、したがってカルボキシル基を非活性化する。興味深いことに、MESは、pH4.7では有効なバッファーにはなり得ないにもかかわらず、MESバッファーは、一般にこのpHでカルボジイミド反応において使用される。このpHでMESを使用する理由は、おそらくはアミン基及びカルボキシル基を有するバッファーによる干渉が予測される懸念があることによって説明がつく。
グリシンは、約pH5で抗体とカルボキシル化粒子のカルボジイミド反応において許容され得るが、アミン基はプロトン化される可能性がそれほど高くないので、グリシンの第一級アミンは、より高いpH値で実施されるコンジュゲーション反応(例えばNHSエステル反応)の方がはるかに反応性が高くなる可能性がある。本発明者らは、第二級若しくは第三級アミン、又は四級化アンモニウム塩を組み込まれた酸分子が、第一級アミン(グリシンなどにおける)とは反対に、より高いpH値で実施されるリシンベースのコンジュゲーション反応において干渉の低減を示す場合があると同時に、約pH5ではカルボジイミド反応においてカルボキシル基の活性も抑制すると推論した。
カルボジイミド媒介型反応の初期試験から得られた推定上のCFEBを、市販のアミンベースのコンジュゲーション技術(Lightning−Link;Innova Biosciences;英国特許第2446088号明細書及び英国特許第2467041号明細書)で試験した。グリシン(データ示さず)及びプロリン(第二級アミン)は、Lightning−Linkフルオレセインコンジュゲーション反応において50mMの濃度で著しい干渉を引き起こした。2−ピコリン酸は、中程度の干渉を示した。グリシンベタイン(四級化アンモニウム塩)及びN,N−ジメチルグリシン(第三級アミン)は、ほとんど又は全く効果がなかった(50mMの濃度でそれぞれ対照値%の98%、96%)。全用量応答曲線を、グリシンベタイン対添加剤なしの対照が存在する状態で調製したコンジュゲートについて示す(図1)。図は、Lightning−Link反応において様々な濃度でベタインの濃度依存効果がないことを示している。対照(ベタインなし)、四角;1mMのベタイン、三角;10mMのベタイン、白丸;50mMのベタイン、黒丸。
トリシン(第二級アミン)を、蛍光性タンパク質であるフィコエリトリンとのLightning−Link反応において評価した。50mMの濃度によるコンジュゲーション反応では、中程度の干渉度があった(対照の91%)。用量応答曲線を図2に示す。図は、Lightning−Link反応において様々な濃度でトリシンの濃度依存効果がないことを示している。対照(トリシンなし)、四角;1mMのトリシン、三角;10mMのトリシン、白丸;50mMのトリシン、黒丸。
グリシンベタインを、イソチオシアネート(図3)及びNHS−エステル(図4)反応において、抗体精製作業で使用される2つの最も一般的なバッファーであるグリシン及びクエン酸と比較して、更に評価した。図3は、様々な添加剤が存在する状態で蛍光イソチオシアネート(FITC)を用いて調製した抗体色素コンジュゲートに関する、色素とタンパク質のモル比を示している。ベタイン及びクエン酸によって、対照(添加剤なし)の結果に類似した結果が得られた。グリシンは、著しい干渉を示した。図4は、様々な添加剤が存在する状態でフルオレセインNHSエステルを用いて調製した抗体色素コンジュゲートに関する、色素とタンパク質のモル比を示している。ベタイン及びクエン酸によって、対照(添加剤なし)の結果に類似した結果が得られた。グリシンは、実質的な干渉を示した。カルボジイミド反応におけるグリシンの強力な阻害効果とは対照的に(表1)、クエン酸は、アミン依存反応において許容され得る。予想通り、グリシンは、特にNHSエステルの場合に著しい干渉を引き起こした。グリシンベタインは、両方の試験において十分に許容されるものであった。
グリシンの第一級アミンが存在しなければ、NHSエステル又はイソチオシアネートの反応において抗体リシンとの任意の競合が防止され得るが、酸基のpKa(4.76)が高すぎるので、得られる分子(すなわち酢酸)は、アフィニティーカラムの溶出には適しておらず、したがって必要なpH範囲においてバッファーとして作用することができない。更に、酢酸は、非反応性プロトン化形態では著しい割合のカルボキシルを有しているにもかかわらず、カルボジイミド反応においてグリシンよりも大きい干渉を示す。
実施できる可能な誘導体化反応の範囲を拡大するために、新しい官能基(例えば保護されたチオール)が、抗体(及び他のアミン含有物質)にしばしば導入される。これらの修飾では、ほとんど常に、一方の端部にNHSエステル基を有するヘテロ二官能性分子が使用される。NHS誘導体は、すべて、第一級アミンと本質的に同じ反応性を示すので、ベタインは、よく用いられている非常に広い範囲のNHSコンジュゲーション反応と適合性がある。
チオールは、非NHSエステル依存技術を使用して、抗体に直接組み込むこともできる。例えば、2−イミノチオランを使用してリシン残基を修飾して、チオール基を組み込むことができる。図5は、グリシンが2−イミノチオランと急速に反応し、したがって、抗体又は他のアミン含有物質と2−イミノチオランの反応においては許容できないことを示している。クエン酸は、予想通り、この特定のアミン依存反応に対して効果を及ぼさず、第四級アンモニウム化合物であるグリシンベタインも効果がなかった。
他の第四級アンモニウム化合物、例えばプロリンベタインも、グリシンベタインと同様に適切なCFEBである。
好ましくは第一級アミンは、>9若しくは>10のpKa値を有しており、又はそのpKa値は、アミンは大部分がプロトン化され、相対的に非反応性になるように、所期のコンジュゲーション反応のpHを少なくとも1単位若しくは好ましくは2単位超えるべきである。第二級アミンは、第一級アミンよりも好ましく、第三級アミンは、第二級アミンよりも好ましい。窒素原子は、pHのすべての値で正電荷を保持するので、第四級アンモニウム塩が特に好ましい。
アフィニティークロマトグラフィーでは、高い回収率を達成するために、カラムは一般にpH2.3及びpH3.5の間で溶出される。最も一般的には、pHは、pH2.3、pH2.8、又はpH3.0である。溶出された抗体は、pHによって誘発される損傷を回避するために速やかに中和されなければならない。CFEBの場合、単にコンジュゲーションの前に溶液を中和すればよく(すなわち非常に重要なことに、透析が必要ない)、その後更に、対象となる特定のコンジュゲーション反応の要件を満たすために、必要に応じてpHを単に調節すればよい。
好ましくは、CFEBは、アフィニティーカラムの溶出に使用されるpH未満のpKaを有するべきである。
従来、pKa値に近いpH値のバッファーが使用されているが、本発明では、中和工程中にpH変化に対するCFEBの最大抵抗点を移動させなくてもよく、すなわちpHがpKa値に等しくなる点を移動させなくてもよいという明白な利点がある。それにもかかわらず、CFEBは、使用されることになるpH値でも有効なバッファーでなくてはならない。一般に、有用な緩衝化範囲は、pKa+/−1単位であるとみなされる。有用な緩衝化範囲の上端近くのpHを使用することによって、より少量の中和バッファーで済み、次に中和された抗体は、可能な限り低い全体的緩衝能を有する。このことは、その後のコンジュゲーション反応を多くの異なるpH値で実施することができ、抗体が精製され中和される場合には抗体の所期の使用がわからない場合があるため、重要である。抗体が配合される溶液が、低い緩衝能を有する場合、抗体は、より強力なバッファーを添加することによって任意の新しいpH値に容易に調節することができる。
CFEBの濃度は、抗体の結合を撹乱するのに十分な濃度にすべきであるが、その後の中和工程を容易にするために、絶対的に必要な濃度程度が使用されるべきである。CFEBの濃度は、好ましくは200mM未満、より好ましくは100mM未満、更により好ましくは50mM未満である。
溶出前のカラムは、非抗体タンパク質を除去するために典型的に約pH7.5のバッファーを用いて洗浄されるので、アフィニティーカラムからの溶出効率は、CFEBの濃度によって部分的に決定される。したがって、洗浄バッファーが50mMである場合、新しいバッファーが導入されるときにカラムの上部でバッファーが必然的にいくらか混合されるので、例えば10mMのCFEBを用いる低pHへの移行は、50mMのCFEBを用いる場合ほど急激ではない。
したがって理想的には、CFEBを添加する前に、少量の約pH7の弱いバッファーを使用して、より強力な平衡化/洗浄バッファーを置き換えるのがよい。或いはより好ましくは、低pHで溶出する前にカラムを平衡化し、相対的に低い緩衝能を有する単一溶液で洗浄すべきである。イオン強度は、バッファー濃度を低減した後でも、非緩衝化塩(例えば、強酸及び強塩基の塩)、例えばNaClを添加することによって必要に応じて維持することができる。
小規模の抗体精製の場合、カラム洗浄バッファーは、液体を除去するためにアフィニティーカラムマトリックスを遠心分離処理することによって大部分が排除され得るが、乾燥は、結合した抗体に損傷を与えるおそれがあるので、マトリックスが乾燥しないように注意を払うべきである。
本発明の特に好ましい一実施形態では、CFEBは、第四級アンモニウム化合物であるグリシンベタインであり、これはアフィニティーカラムを溶出するために通常使用されるpH(例えばpH2.3及びpH2.8)を著しく下回るpKa1.8を有する。
カラムを、より高いpH(例えばpH3.0)で溶出すべき場合、それよりわずかに高いpKaを有する溶出バッファーを選択することができ、例えばカルボキシル基についてグリシンのpKa値(pKa2.3)と同等のpKa値を有するトリシンを選択することができる。或いは、それよりわずかに高い濃度のベタイン、例えばグリシンベタインを使用すると、通常の緩衝化範囲外(すなわち先の例では、pH=pKa+1.0ではなくpKa+1.2)であっても必要な緩衝能を維持することができる。
また、抗体の精製に使用される他の物質(カラム平衡化バッファー、洗浄バッファー及び中和物質)は、溶出のためにCFEBを使用することによる利益を打ち消さないように、所期のコンジュゲーション反応と適合性がなければならない。
TBS(トリス緩衝食塩水)及びPBS(リン酸緩衝食塩水)は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて平衡化/洗浄バッファーとして一般に使用されるが、事前に溶出バッファーを置き換える戦略が使用されない限り、これらのいずれもCFEBベースの抗体精製手順において好ましくない。トリスは、アミン依存反応に干渉し、PBSは、カルボジイミド反応に干渉する。
しかし、生物学で使用される、6を超えるpKa値を有する多くのバッファーは、コンジュゲーション反応において使用するのに適している。スルホナート基及びピペラジン環又はモルホリノ環のいずれかを有するバッファーが一般に使用されており、これらはほとんどのコンジュゲーション反応と適合性があるが、これは、潜在的に干渉する可能性がある他の官能基がこのバッファーに含まれていないからであると推定される。これらのバッファーは、メチレン基又はヒドロキシル置換基の数及び位置だけがクラス内でしばしば変わる。
ピペラジンクラスのバッファーには、(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)(pKa7.5)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸(EPPS又はHEPPS)(pKa8.0)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)(pKa6.76)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(HEPPSO)(pKa7.8)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸)(HEPBS)(pKa8.3)が含まれるが、これらに限定されない。
モルホリノクラスのバッファーには、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)(pKa6.9)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)(pKa6.1)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)(pKa7.2)が含まれるが、これらに限定されない。
相対的に高いpKa値を有する別のクラスのバッファーには、N−シクロヘキシル誘導体であるN−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)(pKa9.5)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)(pKa10.4)、4−(シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸(CABS)(pKa10.7)、3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシル−1−プロパンスルホン酸(CAPSO)(9.6)が含まれるが、これらに限定されない。
先のバッファーには、他の構造的変動が存在し、より詳細な一覧は、Goldbergら(J.Phys.Chem.Ref.Data、Vol.31、No.2、2002年)に見られる。
一般に、先のバッファーのすべては、潜在的に有用な中和物質及び/又は緩衝化物質であり、ほとんどのコンジュゲーション反応において許容される。1種又は複数のバッファーの選択は、抗体の所期の使用、特に最終的な溶液に必要とされるpHに応じて変わる。
本発明の一実施形態では、pKa=8+/−1単位の範囲のpKa値を有する前述のバッファーは、好ましい平衡化バッファー及び洗浄バッファーである。これらには、MOPS、HEPES、EPPSが含まれるが、この選択に限定されない。
中和バッファーに関して、前述のバッファーのいずれも、潜在的に適切なバッファーである。しかし、1種のバッファー(又は複数のバッファー、以下参照)の選択には、必要な最終pH及びバッファーのpKa値(複数可)の適切性を考慮しなければならない。
本発明の好ましい一実施形態では、中和バッファーは、そのpKa値を超えるpHを有しており、それによって、CFEBを含有する抗体溶液を中和するのに、可能な限り少量のバッファー物質で済む。例えば、EPPSバッファー(pKa8.0)の溶液は、pH9.0で調製することができる。特定体積の中和バッファーを、CFEB中特定濃度で、特定体積の溶出された抗体に添加することによって、最終pHを、やはりEPPSバッファーの有用な緩衝化範囲内にある生理的pHに近くなるように設計することができる。
有用な緩衝化範囲外の中和バッファーを使用することも可能である。例えば、Hepesバッファー(pKa7.5)は、約pH9で使用される場合があるが、これは、pHを非常に低い緩衝能領域内に調節する場合にオーバーシュートの危険性を回避するために、細心の注意が払われるからであると推定される。したがって、バッファーを、その通常の緩衝化範囲(すなわちpKa+/−1単位)外に上昇させた過剰の塩基(例えばNaOH)は、溶出された抗体における酸の一部を中和し、塩を形成し、したがって実際の中和バッファー物質(すなわちこの場合、Hepes)の質量及び最終濃度を最小限に抑える。
最も一般的な反応は、NHSエステル(典型的に約pH8で反応)、マレイミド(約6.5〜7.5)、カルボジイミド(通常、約pH5〜6)及びチオール化試薬(典型的に約pH8〜8.5)を伴うので、ほとんどの抗体コンジュゲーション反応は、pH5及びpH9の間で行われる。
本発明の好ましい一実施形態では、中和バッファーは、2種の緩衝化物質を含み、一方(「高pKa成分」)は8を超えるpKa、例えば好ましくは約pKa9又はpKa10を有しており、他方(「キャッチバッファー」)は、約7のpKaを有する。
中和バッファーの2種の成分は、別個に又は混合物として添加され得る。
2種の成分が別個に添加される場合、好ましくは高pKa成分の前にキャッチバッファーを添加して、高pKa成分が添加されるときに高pH値にオーバーシュートするのを回避する。
新しいCFEBを用いた予備研究には、高pKa成分を徐々に添加することができ、pHを各添加後に測定できる通り、別個に添加できるという利点がある。その後、組み合わせた高pKa成分/キャッチバッファーの溶液を1回添加すると、必要量の2種の物質を事前に混合することによって得られるのと同じ終点を達成することができる。
或いは、公知の体積の潜在的に可能ないくつかのCFEB(又は異なるpH値の1種のCFEB)を、様々な体積の一連の潜在的に可能な中和バッファーのそれぞれと混合することができ、各場合の最終pHを決定し、作表することができる。その後の実験では、表を参照して、CFEB中の測定された抗体の体積に応じてどの中和バッファーを使用するか、及び必要な最終pHを達成するためにどれ程添加するかを決定することができる。
溶出された抗体を中和する2種のバッファー成分を添加すると、CFEB、高pKa成分及びキャッチバッファー(抗体及び非常に低濃度で存在する任意の他の緩衝化種を無視する)を含む三重緩衝系が作り出される。
高pKa成分は、一般に相対的に高いpKa値を有するN−シクロヘキシルシリーズのバッファーに由来する可能性が高いが、それに限定されることを意味しない。
中和バッファーのpHは、好ましくはpH7を超え、より好ましくは8を超え、更により好ましくはpH8.5及びpH11の間である。約pH9〜9.5のpHが特に有用であり、このpHは、CFEB混合物の接触時に抗体に損傷を与える可能性が低い。より低いpHは、当然のことながら、高pHに対して感度が高い抗体の場合に使用することができる。
高pKa成分が使用される場合、中和溶液のpHは、理想的には、pKa値の1単位以内にある。pHがpKa値を超える場合、CFEBを中和するのに、pHがpKa未満である場合よりも少量のバッファー物質で済む。しかし、高pKa成分は、中性pHの近くでは緩衝力をほとんど備えていないので、CFEBを中和するのに使用される量は、特に重要ではなく、必要に応じてpHがpH7から更に移行しても、高pKa成分によって抵抗されない。
中和バッファーが、CFEBによって溶出された典型的に約pH2.3〜3.0の抗体に添加されると、混合物は、より中性になる。抗体の体積(CFEBにおける)及び中和バッファーの賢明な選択により、キャッチバッファーは、pH6及び8の間の範囲のpH(すなわちキャッチバッファーのpKa+/−1pH単位)を保持(すなわち「キャッチ」)することができる。
それにもかかわらず、理想的には可能な限り低い濃度で存在するキャッチバッファーは、CFEB溶液と中和バッファーの体積比のわずかな変動が、例えばピペット操作又は測定の不正確さに起因して生じ得る場合には、その変動に耐容性を示すのに十分な量で存在して、pHが抗体の保存にとって望ましい範囲内にあるようにしなければならない。最終濃度は約10mMであることが望ましいが、これに限定されない。
キャッチバッファーは、普通は主要な中和物質ではないので、キャッチバッファーが高pKa成分よりも前に添加される場合、高pKa成分は速やかに添加されるべきである。
抗体試料が中和された後、中和溶液に由来する高pKa成分は、もはや有効なバッファーではない。同様に、カラム溶出pH(すなわち約pH2.5の領域)の近くに広がる(ただし好ましくはそれ未満の)pKaを有するCFEBは、pH7では有効なバッファーではない。その代わりに、相対的に低い濃度で存在する「キャッチ」バッファー(pKa約7を有する)は、有効な緩衝力のすべてを発揮するが、溶液のpHは、第4のバッファー(又は酸若しくは塩基)を添加することによって、pH5〜pH9の範囲内の新しいpH値まで、相対的に容易に移行させることができる。この広範囲の値以内であっても、高pKaバッファー成分(pKa>9、好ましくは9.5以上と想定)もCFEBも、pHの任意の所望の変化に抵抗するのに特に有効ではない。
キャッチバッファーの構造的特徴は、理想的には約pH7のpKa値を有するべきであることを除いて、中和バッファーに求められる構造的特徴に類似している。好ましくはpKaは、pH6及び8の間であるべきであり、最終pHは約7〜7.5であるべきであるが、選択された最終pH値において抗体が安定であると想定される、この範囲外で操作することが可能な場合がある。
好ましいキャッチバッファーには、MOPS(pKa7.2)及びHEPES(pKa7.5)が含まれるが、これらに限定されない。類似のpKa値を有する他のバッファーを、キャッチバッファーとして使用することもできる。
高pKa成分とキャッチバッファーの好ましい組合せ(別個に添加されようと又は一緒に添加されようと)には、CHESとMOPS又はHEPESのいずれかが含まれる。やはり、これらの組合せに限定されない。
最後に、適切なpH値のいくつかのアミン含有カルボン酸バッファーを、CFEB又は中和バッファー(例えばトリシン、及び関連分子であるビシン)のいずれかとして使用することができる。
約pH7の多くの可変多成分の低緩衝能溶液は、異なるCFEBを、高pKa成分及びキャッチバッファーを含む中和溶液と組み合わせることによって作り出すことができることが、バッファーの理論から明らかとなろう。中和バッファーにおける特定の成分は、所期のコンジュゲーション反応に干渉する官能基をいずれも明らかに有していてはならないことを除いて、制限されない。
本発明の方法を使用するコンジュゲーション反応は、適切なpHの抗体/CFEB混合物を、活性化標識(又は標識と活性化化学物質)、バッファー、及び必要に応じて他の添加剤を含む成分混合物と接触させることからなる。ある場合には、標識ではなく、有用な官能基を担持している小分子が結合して、典型的に官能基を介して小分子が標識に結合する。正確な添加順は、コンジュゲーション反応の性質に応じて変わり得るが、最終的にCFEB、キャッチバッファー及び/又は中和バッファー(複数可)、標識(又は誘導体化試薬)及び抗体(又は標識されるタンパク質)は、コンジュゲーション反応の開始時に互いに同時に接触させられ、これは、本発明の手法の独特の態様である。この概念は、ある特定の環境においてグリシンなどのアミノ酸が、抗体とナノ粒子のカルボジイミド(carbodimide)媒介型反応において許容され得るという予期しなかった知見を得た後に展開された。
任意の標識化反応において、中和された抗体の溶液を反応に添加しても、混合物のpHが所望のコンジュゲーションpHから移行しないことが重要である。抗体が全反応体積のうち少ない割合を占め、抗体溶液の緩衝能が低い場合、著しいpH変化が生じる確率は低い。したがって、CFEB及び適切な中和バッファーと配合され、適切な体積で添加された抗体は、多くの異なる緩衝化コンジュゲーション反応と適合性がある。
中和された抗体が、ある程度希釈され、その添加体積が、全アッセイ体積のうち著しい分率を占めることができる場合、コンジュゲーション反応における主要な緩衝化種は、任意の著しいpH変化なしに抗体試料を受け入れるのに十分に濃縮されなければならない。或いは、添加される体積は、当技術分野で周知の簡単な技術(例えばマイクロ濃縮(microconcentration))を使用して抗体濃度を増大することによって、低減することができる。
しかし、わずか1つのタイプのコンジュゲーション反応の実施を目的とする場合、CFEBにおける抗体を中和し、必要なコンジュゲーションpHまで直接調節することができる。この場合、pHを他の値に調節する柔軟性は必要なく、事前のコンジュゲーション透析工程を回避できるという大きな利益も損なわれない。
例えば、コンジュゲーション反応をpH9で実施すべき場合、抗体は、pH9に簡単に調節することができる。この想定では、約7のpKaを有するキャッチバッファーを使用することは必須ではなく、むしろpH9をわずかに上回る(及び理想的には約9のpKaを有する)バッファーを、必要な体積比で溶出された抗体と混合して、必要な最終pHを達成することができる。
抗体の一部だけをpH9でコンジュゲートすべき場合、単に抗体の一部をpH9に調節するか、又は高pKa中和バッファーと組み合わせた適切なキャッチバッファーを使用して、CFEB抗体溶液全体を約pH7に中和することが好ましいと思われる。次に、中和された溶液の一部のpHを、必要に応じて、また必要な場合にはpH9に上昇させることができる。
CFEB中の溶出された抗体を、正確な体積の中和バッファーで中和する必要性は、大量の抗体を取り扱う場合(すなわち数ml又は更には数リットル)、後にpHプローブが抗体溶液に挿入され得るので、あまり重要ではない。望ましくは、適切なpKaを有するアルカリバッファー(又はキャッチバッファーと高pKa成分の適切なpHの組合せ)は、pHによって誘発される抗体への損傷を最小限に抑えるのに最終pHを十分上昇させなければならないことを除いては正確な最終pHに関する懸念を伴わずに、CFEBに速やかに添加され、好ましくはそのpHは、最終的に必要とされるpH未満の点で止まる。次に、pHメータを使用し、pHが中和工程中にオーバーシュートする場合には適切な塩基(例えばNaOH溶液又はバッファー)又は酸(例えば希HCl)を添加して、正確なpHに最終調節することができる。
溶出バッファー、その濃度、そのイオン化できる基のpKa、及び溶出バッファーのpH(特にそのpKa値に対する)を注意深く選択することによって、異なるタイプのコンジュゲーション反応において将来的な抗体の使用をいかなる方式でも制限せずに、より高いpHを有する(及び注意深く選択されたpKa値を有する)バッファー又はバッファーの組合せを用いて、抗体を容易に中和することができる。
低pH溶液の代わりに高pH溶液(pH>10)を用いて抗原アフィニティーカラムを溶出することも可能である。ここで、CFEBの同じ要件が適用されるが、溶出バッファーは、所期のタイプのコンジュゲーション反応と適合性がなくてはならない。低pHから高pHにおける溶出に戦略を切り替えると、明白なバッファー(グリシン、クエン酸)が、よく用いられている多くのコンジュゲーション化学に許容されないので、適切な中和(すなわち酸性)バッファーの選択はより困難になる。しかし、非アミン依存反応が予定される場合には、クエン酸を中和バッファーとして使用することが可能な場合がある。カルボジイミド反応が想定される場合には、中和バッファーは、おそらくは適切なキャッチバッファーと共に使用される低pHグリシンになり得るが、低pHグリシンベタインとキャッチバッファーが、好ましいと思われる。
N,N−ジメチルグリシン(アミンのpKa9.8)は、高pHにおけるアフィニティーカラムの溶出にとって良好な候補である。この場合、中和バッファーは、約7のpKaを有し、pH6の溶液として添加され得る。いずれのバッファーも、高pHのCFEBを中和するのに十分に濃縮されなければならず、又は可能ならばpHメータを用いることによってモニタしながら酸(ただし多くの場合、クエン酸、酢酸又は低pHのグリシンではない)を添加して、pHを調節することができる。次に、約7のpKaを有するバッファーをキャッチバッファーとして作用させて、非常に低いpH値にオーバーシュートするのを防止する。適切な濃度の塩酸は、限定的ではないが明白な中和酸の選択肢となり得る。或いは、好ましくはpKa約7のキャッチバッファーと組み合わされた低pHのグリシンベタインは、前述の通り、アフィニティーカラムの溶出に使用される高pH溶液を中和するために使用することができる。
本発明の方法を使用すると、注意深く選択された濃度及びpKa値を有するバッファー混合物を、CFEBバッファーにおける溶出された抗体の調製物と組み合わせるだけで、抗体を保存するための多成分中性溶液を提供し、その後その溶液のpHを、pH5〜9の範囲内に容易に変化させて、ほとんどいかなるコンジュゲーション反応にも、すなわちNHSエステル反応、イソチオシアネート反応、チオール化試薬を伴う反応、及び抗体とナノ粒子のカルボジイミド媒介型コンジュゲーションを含む反応にも適したものにすることができる。
実施例:
実施例1.ラテラルフローアッセイ
ラテラルフロー試験ストリップ(4mm幅)を、ヤギ抗−ウサギIgG(試験ライン)及びビオチン−BSA(対照ライン)でスジ状としたニトロセルロース膜(Millipore Hi Flow plus 90)から調製した。ストリップをプラスチックカートリッジに収容し、金コンジュゲート試料(80ul)を、試料パッドに添加した。カートリッジを30分間静置し、次にESE−Quant GOLDリーダー−QIAGENを使用して読み取った。各試料に、対照ラインに結合する一定量のストレプトアビジン−金(Innova biosciences−製品コード:250−0200)を添加(spiked)して、各試験ストリップの動作が正確であること、及び試験ラインデータが有効であることをチェックした。
実施例2.蛍光アッセイ
黒色96ウェルプレート(Greiner Bio−One(コード655077))を、ウサギIgG50ul(1ug/ウェル)と共に4℃において一晩インキュベートした。プレートをTBS/0.1%BSAで室温で1時間ブロッキングし、TBS(洗浄バッファー)で5回洗浄した。蛍光性抗体コンジュゲートを、TBS/0.1%BSAで連続希釈し、一定分量50ulをウェルに三連で添加した。室温で1時間インキュベートした後、プレートを5回洗浄し、蛍光発光を、Tecan Infinite M200プレートリーダーとi−Control 1.4ソフトウェアを使用して、適切な励起/発光設定(フルオレセイン、490nm/535nm;フィコエリトリン(phycoeythrin)、535nm/575nm)で読み取った。蛍光データを、コンジュゲート希釈関数としてプロットした。異なる実験で試験した添加剤に関する結果を比較するために、データを対照値(すなわち任意の試験添加剤が存在しない状態で調製したコンジュゲートのシグナル)の百分率に変換した。
実施例3.カルボキシル化金とのコンジュゲーション反応
ヤギ抗−ウサギIgG(GAR)10μgを、10.0ODにおいてカルボキシル官能基を有するコーティングされた40nmのナノ粒子(InnovaCoat GOLD、Innova Biosciences)1ml当たり、最終濃度50mMの添加剤が存在する状態で使用した。典型的に、以下の添加剤を用いて反応を引き起こした。40nmのInnovaCoat(カルボキシル化)金ナノ粒子(nanopartcles)40μlを、0.1mg/mlのGAR4μl、水20μl、及び100mMの添加剤、pH5.0を含有する100mMのMESバッファー80μlと共に5分間インキュベートした。次に、1mMのEDC16μlを添加し、22℃で10分間インキュベーションした後、20μlの10×TBS/1%Tween20及び水20μlを添加して、2ODのコンジュゲートを得た。
必要な場合には、金コンジュゲートをウサギIgG(最終濃度50ng/ml)と22℃で混合した。コンジュゲートは、0.2ODの最終濃度(すなわち原液コンジュゲートの1/10希釈)であった。試料を、実施例1に記載の通り、ラテラルフロー試験ストリップで三連で作動させた。
実施例4.Lightning−Linkフルオレセインコンジュゲーション反応に対する様々な添加剤の効果
反応は、添加剤がヤギ−抗ラビットIgGのコンジュゲーション反応では最大50mMの濃度で含まれていたことを除いて、製造者の標準プロトコルに従って、フルオレセインLightning−Linkキット(製品コード707−0010、Innova Biosciences、UK)を使用して実施した。コンジュゲートを、実施例2に記載のプロトコルに従って試験した。グリシンベタインが存在する状態で調製したコンジュゲートの用量応答曲線を図1に示す。以下の化合物が存在する状態で調製したコンジュゲート(1/100希釈)の対照値に対する%(括弧内の値)は、添加剤を含まない対照(100%)と比較して、プロリン(53%)、グリシンベタイン(98%)、N,N−ジメチルグリシン(96%)、2ピコリン酸(83%)であった。
実施例5.Light−Linkフィコエリトリンコンジュゲーション反応におけるトリシンの効果
この方法は、ヤギ抗−ウサギIgGを、Lightning−Link PEコンジュゲーションキット(703−0005)を使用して蛍光性タンパク質フィコエリトリン(PE)にコンジュゲートしたことを除いて、実施例4に記載した通りであった。トリシンが存在する状態で調製したフィコエリトリンコンジュゲートの用量応答曲線を、図2に示す。トリシンは、試験濃度範囲では、Lightning−Link PEコンジュゲーション反応に対してほとんど効果がない。この場合、最高濃度のトリシン(50mM)で調製したコンジュゲートにより、添加剤が存在しない状態の対照値の91%というシグナルが得られた。
実施例6.イソチオシアネート(isothicyanate)反応に対する添加剤の効果
10mg/mlのウサギIgG40μgを、50mMの添加物(1つはグリシンベタイン、クエン酸又はグリシンから)を含有する80mMのCHESバッファーpH9.0中、50μMのFITCと共に、暗室中22℃で一晩インキュベートした。コンジュゲートを、TBSバッファー中、PD10カラム(GE Healthcare)で脱塩し、溶出された溶液の吸光度値を、280nm及び495nmで決定した。様々な添加剤が存在する状態の抗体色素コンジュゲートに関する色素とタンパク質のモル比を、図3に示す。グリシンは、著しい干渉を示したが、グリシンベタイン及びクエン酸は、対照(すなわち添加剤なし)の結果に類似した結果を示した。
実施例7.NHSエステル反応に対する添加剤の効果
10mg/mlのウサギIgG40μgを、50mMの様々な添加物の1つ(グリシンベタイン、クエン酸又はグリシンから)を含有する80mMのリン酸ナトリウムpH8.0中、50μMのフルオレセイン−NHS色素と共に、暗室中22℃で30分間インキュベートした。コンジュゲートを、TBSバッファー中で平衡化したPD10カラムで脱塩し、溶出された溶液の吸光度値を、280nm及び495nmで決定した。様々な添加剤が存在する状態の抗体色素コンジュゲートに関する色素とタンパク質のモル比を、図4に示す。グリシンベタイン及びクエン酸は、対照(添加剤なし)の結果に類似した結果を示したが、グリシンは、実質的な干渉を示した。
実施例8.チオール化試薬である2−イミノチオランに対する添加剤の効果
80ug/mlのDTNB及び50mMの添加剤(グリシンベタイン、クエン酸又はグリシン)を含有する100mMのリン酸ナトリウムpH8.0、200μlの試料を、透明96ウェルプレート(Greiner Bio−One、コード655077)に三連で添加した。2mMの2−イミノチオラン20μlを各ウェルに添加し、速やかに混合し、吸光度値を、Tecan Infinite M200プレートリーダーとi−Control 1.4ソフトウェアを使用して、405nmで30分間かけて毎分読み取った。2−イミノチオランからのチオールの放出を、図5に示す。図は、2−イミノチオランの開環反応におけるチオールの放出を示している。対照反応では、試薬が水によって加水分解されるので、吸光度は着実に線形増加する。ベタイン又はクエン酸が存在する状態では、この比率は増大しない(対照の曲線と重ね合わせた曲線)。グリシンが存在する状態では、急速な加水分解及び2−イミノチオランの開環が生じる。グリシンベタインもクエン酸も、対照反応(添加剤なし)ほど急速にチオールを放出しなかったことが観測された。ベースラインの上昇は、アルカリpH値における加水分解に対する2−イミノチオランの公知の感度に寄与し得る。
実施例9.CFEB試料を中和するためのキャッチバッファー及び高pKa成分の使用
グリシンベタイン3ml、pH2.25に、「キャッチ」バッファー(1MのHepes30ul、pH7.5)を添加した後、高pKa成分(0.5MのCHESバッファー、pH9.5)10ulの添加を反復した。pHを、各添加後に測定した。pH9.5のCHESバッファー70ul、80ul及び90ulを添加した後、混合物のpH値は、7.27、7.45、及び7.6であった。図6は、キャッチバッファーが存在する場合及び存在しない場合の完全なpHプロファイルを示している。図は、キャッチバッファー(1MのHepes30ul、pH7.5)が存在する状態(黒丸)又は存在しない状態(白丸)のいずれかで、CFEB(ベタイン、pH2.25)3mlを中和した後、0.5MのCHESバッファー10ul、pH9.5の添加を反復したことを示している。キャッチバッファーを添加すると、pHは約1pH単位上昇したので、曲線は異なる出発位置を有している。より重要なことに、キャッチバッファー(pKa7.5)は、pH7及びpH8の間のpH変化に抵抗するので、pH9.5の中和バッファーを添加しても、pHをpH7.5近くの任意の値に調節することが容易になる。キャッチバッファーが存在しない状態では、CHESバッファー10ulを1回増やすと(90ulから100ulまで)、pH4.87からpH8.19への急激な移行が見られる。
実施例10.提示用カラム
ヤギ抗−マウスセファロースビーズを、使い捨てのカラムに充填した(充填体積0.5ml)。TBS中、マウスIgGを含有する試料と共に2時間インキュベートした後、カラムを10mMのリン酸ナトリウム/150mMのNaCl、pH8.0で洗浄し、次に10mMのベタイン、pH2.3で溶出した。100ulの画分を収集し、50mMのHepes(キャッチバッファー)及び90mMのCHES(高pKa成分)を含む10×バッファーA11.1ulですぐに中和した。10×バッファーAは、適切な体積の1MのHepes、pH7.5、0.5MのCHES、pH9.5、及び水を混合することによって調製した。抗体(ベタイン中)と中和バッファーの体積比によって、最終キャッチバッファー濃度5mM、及びpH7.1が得られる。或いは、溶出された画分を、10×バッファーB(30mMのHepes及び105mMのCHESバッファー)11.1ulで中和して、最終pHが7.55の、より弱く緩衝化された抗体調製物(すなわち3mMのキャッチバッファー)を得た。
精製した抗体(1ug)を、50mMのMESバッファー、pH5.0中でカルボキシル化InnovaCoat金ナノ粒子(Innova Biosciences)にコンジュゲートし、マウスIgG(実施例1に類似しているが、試験ラインでは異なる抗体を用いた)を剥がしたラテラルフロー膜で、ヤギ抗−マウスIgGを架橋試薬として使用して試験した。ラテラルフローシグナルは、クロマトグラフィー処理しなかったマウスIgGの値である193単位、及び架橋試薬なしの対照の値である0と比較して、異なる実験によるコンジュゲートについて165〜277単位であった。
コンジュゲーション反応に使用した50mMのMESバッファー、pH5.0(最終濃度)は、その有用な緩衝化範囲の極大値であるが、3mM及び5mMの濃度のキャッチバッファーを容易に克服することができた。実際、約40mMのMESは、2つの試料のpHをpH5.0に低減するのに十分であった。最終キャッチバッファー濃度がちょうど1mMのHepes(及び10.5mMのCHES)を用いると、pHを最終的な反応pH5.0に低減するのに、わずか22mMのMESで済む。



Claims (87)

  1. 単離された抗体を標識又は誘導体化試薬にコンジュゲートする方法であって、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含む緩衝系中で、前記抗体を、活性化標識若しくは活性化誘導体化試薬と接触させるか、又は前記抗体を、抗体コンジュゲーション試薬が存在する状態で前記標識若しくは誘導体化試薬と接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 前記抗体コンジュゲーション試薬又は活性化標識が、カルボジイミド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、イソチオシアネート又はチオール化試薬を含む請求項1に記載の方法。
  3. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、1つ以上の非アミン置換基を更に含むか、又は更なる置換基を含まない請求項1から2のいずれかに記載の方法。
  4. 前記モノカルボン酸のアミン置換基が、第二級若しくは第三級アミン、又は第四級アンモニウムである請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記アミン置換基が、第四級アンモニウム置換基である請求項4に記載の方法。
  6. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、ベタインである請求項5に記載の方法。
  7. 前記ベタインが、N,N,N−トリメチルグリシンである請求項6に記載の方法。
  8. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、第一級アミノ酸である請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第一級アミノ酸が、アラニン、β−アラニン又は2−アミノ酪酸である請求項8に記載の方法。
  10. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、プロリン、トリシン、N−メチルグリシン、N,N−ジメチルグリシン又は2−ピコリン酸である請求項9に記載の方法。
  11. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のカルボキシル基が、1〜4の範囲のpKaを有する請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のカルボキシル基が、1.5〜3.5の範囲のpKaを有する請求項11に記載の方法。
  13. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のアミンが、8を超えるpKaを有する請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のアミンが、9を超えるpKaを有する請求項12に記載の方法。
  15. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、200mM未満の濃度で存在する請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記モノカルボン酸バッファー化合物の濃度が、100mM未満である請求項15に記載の方法。
  17. 前記モノカルボン酸バッファー化合物の濃度が、50mM未満である請求項16に記載の方法。
  18. 前記緩衝系が、5.5を超えるpKaを有する中和バッファー化合物を更に含む請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記中和バッファー化合物が、モルホリノ、ピペラジン又はN−シクロヘキシル化合物を含む請求項18に記載の方法。
  20. 前記中和バッファー化合物が、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸(EPPS又はHEPPS)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(HEPPSO)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸)(HEPBS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、4−(シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸(CABS)又は3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシル−1−プロパンスルホン酸(CAPSO)である請求項19に記載の方法。
  21. 前記緩衝系が、6〜8の範囲のpKaを有するキャッチバッファー化合物を更に含み、前記中和バッファー化合物が、8を超えるpKaを有する請求項18から20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記中和バッファー化合物のpKaが、8〜11の範囲にある請求項21に記載の方法。
  23. 前記キャッチバッファーが、MOPS又はHEPESである請求項21から22のいずれかに記載の方法。
  24. 前記キャッチバッファー化合物の濃度が、前記中和バッファー化合物の濃度未満である請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記標識が、酵素、蛍光性タンパク質、有機色素、着色粒子、ビオチン、ストレプトアビジン又はポリマーを含む請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 5〜9の範囲のpHで実施される請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 固相から抗体を溶出するための、バッファーの使用であって、前記バッファーが、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含むことを特徴とする使用。
  28. 前記固相が、カラム内に配置されている請求項27に記載の使用。
  29. 前記固相が、前記抗体のためのアフィニティーマトリックスを含む請求項27から28のいずれかに記載の使用。
  30. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、1つ以上の非アミン置換基を更に含むか、又は更なる置換基を含まない請求項27から29のいずれか一項に記載の使用。
  31. 前記モノカルボン酸のアミン置換基が、第二級若しくは第三級アミン、又は第四級アンモニウムである請求項27から30のいずれか一項に記載の使用。
  32. 前記アミン置換基が、第四級アンモニウム置換基である請求項31に記載の使用。
  33. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、ベタインである請求項32に記載の使用。
  34. 前記ベタインが、N,N,N−トリメチルグリシンである請求項33に記載の使用。
  35. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、第一級アミノ酸である請求項27から30のいずれか一項に記載の使用。
  36. 前記第一級アミノ酸が、アラニン、β−アラニン又は2−アミノ酪酸である請求項35に記載の使用。
  37. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、プロリン、トリシン、N−メチルグリシン、N,N−ジメチルグリシン又は2−ピコリン酸である請求項31に記載の使用。
  38. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のカルボキシル基が、1〜4の範囲のpKaを有する請求項27から37のいずれか一項に記載の使用。
  39. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のカルボキシル基が、1.5〜3.5の範囲のpKaを有する請求項38に記載の使用。
  40. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のアミンが、8を超えるpKaを有する請求項25から37のいずれか一項に記載の使用。
  41. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のアミンが、9を超えるpKaを有する請求項40に記載の使用。
  42. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、200mM未満の濃度で存在する請求項27から41のいずれか一項に記載の使用。
  43. 前記モノカルボン酸バッファー化合物の濃度が、100mM未満である請求項42に記載の使用。
  44. 前記モノカルボン酸バッファー化合物の濃度が、50mM未満である請求項43に記載の使用。
  45. 前記バッファーのpHが、1.8〜4.8の範囲にある請求項27から44のいずれか一項に記載の使用。
  46. 前記抗体を、前記標識、誘導体化試薬、活性化標識又は活性化誘導体化試薬と接触させる工程の前に、前記抗体が、請求項28から45のいずれか一項に記載の固相から前記抗体を溶出する工程によって単離され、前記緩衝系が、前記抗体を溶出する前記工程で使用された前記バッファーを含む請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
  47. 抗体を結合するための固相アフィニティーマトリックスと、前記抗体が前記アフィニティーマトリックスに結合した場合に前記抗体を溶出するためのバッファーとを含む抗体単離キットであって、前記バッファーが、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含むことを特徴とする抗体単離キット。
  48. 前記バッファーが請求項30から45のいずれか一項に記載されている通りである請求項47に記載の抗体単離キット。
  49. 5.5を超えるpKaを有する中和バッファーを更に含む請求項47から48のいずれかに記載の抗体単離キット。
  50. 前記中和バッファーが、モルホリノ、ピペラジン又はN−シクロヘキシル化合物を含む請求項49に記載の抗体単離キット。
  51. 前記中和バッファーが、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸(EPPS又はHEPPS)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(HEPPSO)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸)(HEPBS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、4−(シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸(CABS)又は3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシル−1−プロパンスルホン酸(CAPSO)を含む請求項50に記載の抗体単離キット。
  52. 6〜8の範囲のpKaを有するキャッチバッファーを更に含み、前記中和バッファーが8を超えるpKaを有する、請求項49から51のいずれか一項に記載の抗体単離キット。
  53. 前記中和バッファーのpKaが、8〜11の範囲にある請求項52に記載の抗体単離キット。
  54. 前記キャッチバッファーが、MOPS又はHEPESである請求項52から53のいずれかに記載の抗体単離キット。
  55. 前記キャッチバッファーの濃度が、前記中和バッファーの濃度未満である請求項52から54のいずれか一項に記載の抗体単離キット。
  56. 前記キャッチバッファーのpHが、6〜8の範囲にある請求項52から55のいずれか一項に記載の抗体単離キット。
  57. 前記中和バッファーのpHが、6を超える請求項49から56のいずれか一項に記載の抗体単離キット。
  58. 前記中和バッファーのpHが、8を超える請求項57に記載の抗体単離キット。
  59. 前記中和バッファーのpHが、8.5〜11の範囲にある請求項58に記載の抗体単離キット。
  60. 前記中和バッファーのpHが、9〜9.5の範囲にある請求項59に記載の抗体単離キット。
  61. 緩衝系中に単離された抗体を含む、コンジュゲーション反応に使用するための抗体組成物であって、前記緩衝系が、グリシン以外の、α位又はβ位にアミン置換基を有するモノカルボン酸バッファー化合物を含むことを特徴とする抗体組成物。
  62. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、1つ以上の非アミン置換基を更に含むか、又は更なる置換基を含まない請求項61に記載の抗体組成物。
  63. 前記モノカルボン酸のアミン置換基が、第二級若しくは第三級アミン、又は第四級アンモニウムである請求項61から62のいずれかに記載の抗体組成物。
  64. 前記アミン置換基が、第四級アンモニウム置換基である請求項63に記載の抗体組成物。
  65. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、ベタインである請求項64に記載の抗体組成物。
  66. 前記ベタインが、N,N,N−トリメチルグリシンである請求項65に記載の抗体組成物。
  67. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、第一級アミノ酸である請求項61から62のいずれかに記載の抗体組成物。
  68. 前記第一級アミノ酸が、アラニン、β−アラニン又は2−アミノ酪酸である請求項67に記載の抗体組成物。
  69. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、プロリン、トリシン、N−メチルグリシン、N,N−ジメチルグリシン又は2−ピコリン酸である請求項63に記載の抗体組成物。
  70. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のカルボキシル基が、1〜4の範囲のpKaを有する請求項61から69のいずれか一項に記載の抗体組成物。
  71. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のカルボキシル基が、1.5〜3.5の範囲のpKaを有する請求項70に記載の抗体組成物。
  72. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のアミンが、8を超えるpKaを有する請求項61から71のいずれか一項に記載の抗体組成物。
  73. 前記モノカルボン酸バッファー化合物のアミンが、9を超えるpKaを有する請求項71に記載の抗体組成物。
  74. 前記モノカルボン酸バッファー化合物が、200mM未満の濃度で存在する請求項61から73のいずれか一項に記載の抗体組成物。
  75. 前記モノカルボン酸バッファー化合物の濃度が、100mM未満である請求項74に記載の抗体組成物。
  76. 前記モノカルボン酸バッファー化合物の濃度が、50mM未満である請求項75に記載の抗体組成物。
  77. 前記緩衝系が、5.5を超えるpKaを有する中和バッファー化合物を更に含む請求項61から76のいずれか一項に記載の抗体組成物。
  78. 前記中和バッファー化合物が、モルホリノ、ピペラジン又はN−シクロヘキシル化合物を含む請求項77に記載の抗体組成物。
  79. 前記中和バッファー化合物が、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸(EPPS又はHEPPS)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(HEPPSO)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸)(HEPBS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、4−(シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸(CABS)又は3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシル−1−プロパンスルホン酸(CAPSO)である請求項78に記載の抗体組成物。
  80. 前記緩衝系が、6〜8の範囲のpKaを有するキャッチバッファー化合物を更に含み、前記中和バッファー化合物が、8を超えるpKaを有する請求項77から79のいずれか一項に記載の抗体組成物。
  81. 前記中和バッファー化合物のpKaが、8〜11の範囲にある請求項80に記載の抗体組成物。
  82. 前記キャッチバッファーが、MOPS又はHEPESである請求項80から81のいずれかに記載の抗体組成物。
  83. 前記キャッチバッファー化合物の濃度が、前記中和バッファー化合物の濃度未満である請求項80から82のいずれか一項に記載の抗体組成物。
  84. 5〜9の範囲のpHを有する請求項61から83のいずれか一項に記載の抗体組成物。
  85. 前記単離された抗体が、標識にコンジュゲートされている請求項61から84のいずれか一項に記載の抗体組成物。
  86. 前記標識が、酵素、蛍光性タンパク質、有機色素、着色粒子、ビオチン、ストレプトアビジン又はポリマーを含む請求項85に記載の抗体組成物。
  87. 抗体又は抗体コンジュゲートのための保存媒体としての請求項77から80のいずれか一項に記載の緩衝系の使用。
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