JP5380074B2 - 複合体の生成 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の生成に関し、ならびにある方法およびその方法を実施するキットに関する。

発明の背景
複合体は、生物科学的な研究、診断薬および医薬において広く使用されている。最も単純な場合においては、複合体は、第２の化学物質（Ｂ）、例えば標識分子などに連結される、第１の化学物質（Ａ）、典型的には、例えば生体分子などの分子、ＡＢハイブリッドを形成する。式Ａ_ｊＢ_ｋ（式中、ｊおよびｋは整数である）によって表わされるオリゴマーの形態も可能である。複合体は、通常、特定の目的で設計され、しばしば、自然には生じない材料の新規な組み合わせを含む。典型的には、複合体の１つの構成要素は、他の分子（例えば抗原）と相互作用する能力を有し、例えば抗体であり、第２の構成要素は、幾つかの他の有用な特性（例えば可測性、ガン細胞を殺す能力）を付与することができ、例えば標識である。

本発明の複合体は複数の物質の組み合わせを含んでいてよく、Ａおよび／またはＢは、以下のもののうちの１つを含んでいてよい：抗体、抗体フラグメント、核酸、ビーズ、ポリマー、リポソーム、炭水化物、蛍光タンパク質および蛍光染料、ペプチド、放射性核種、毒素、金粒子、ストレプトアビジン、ビオチン、酵素、キレート化剤、ハプテン、薬剤、ならびに多くの他の分子。このリストはありとあらゆる分子を包含し、従って、複合体における可能な組み合わせの数はほとんど無限である。それゆえ、特異な特性または独特な特性を有する新規なハイブリッド分子を創出するためのかなりの余地が存在しているということになる。

免疫複合体の最も重要な用途の１つは、しばしば、表面上にある抗原の定量および／または検出におけるものである。例えば、ウェスタンブロッティング法においては、抗原はニトロセルロースのシート上に固定化され；酵素連結免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）においては、抗原はポリスチレンプレートの表面に吸着され；免疫組織化学においては、抗原は、多くの他のタンパク質と共に、組織の薄片中に包埋され、その薄片がガラススライドに付着される。これらの技術は、抗原が複合体に与えられる方法が根本的に異なっているが、検出法の選択は本質的に同じである。２つの主なタイプが存在する。直接検出法の場合には、「１次」抗体（即ち、抗原に結合する抗体）が標識に複合され、適切な測定装置を用いてその標識を測定することができる。間接検出法の場合には、標識が２次試薬を介して導入され、その２次試薬が１次抗体に結合する。ほとんどの場合、その２次試薬は、標識に複合された２次抗体を含む抗体複合体である。もっと複雑な種々の検出戦略が存在するが、それらの各検出戦略は、一般的には、上述の２つの主題のうちの１つにおける変法である。

間接的な方法の場合、１つの２次試薬を様々な非標識１次抗体と共に使用することができ、これは極めて便利であるが、直接的な方法よりも多くのインキュベーションステップおよび洗浄ステップを必要とすることが重大な欠点である。また、２次抗体と固定化抗原との望ましくない交差反応性の可能性もある。直接的な検出法は、スピード、コストおよびデータの質の観点においてかなりの利点を提供するが、間接的な方法が現在優勢である。この事実に対する説明は、ほとんどの１次抗体が、非標識形態においてのみ商業的に入手可能なことである。その上、これらの試薬は高価であり、通常、研究者は、現在のラベ
リングの方法論を用いて標識化複合体を、コスト効率のよい生産を可能にするような量で購入することができない。

複合体を生成するためには、一般的に、興味のある２つの構成要素を連結すべく、２つの反応性基を含んだ２官能性試薬が使用される。２官能性試薬における反応性基は、官能基が同一であってもよいし（「ホモ２官能性」）、または官能基が異なっていてもよい（「ヘテロ２官能性」）。ホモ２官能性試薬の最もよく知られている例は、ビス−アルデヒドグルタルアルデヒドであり、この試薬はアミン（またはヒドラジド）と反応する。ほとんどの生体分子は多数のアミンを含んでいるため、グルタルアルデヒドの使用は、通常、高分子量複合体の形成をもたらす。更に、経時的に（ｗｉｔｈ ａｇｅ）かなり変動し得るグルタルアルデヒド溶液のポリマー性状は、一般的に、グルタルアルデヒドを用いて調製された複合体は再現するのが非常に難しいことを意味している。

ヘテロ２官能性試薬は、一般的に、それらの試薬を用いることにより操作者が複合プロセスに対してより高度な制御を果たすことが可能になるため、複合体を調製するのに好適である。よく用いられるヘテロ２官能性複合戦略は、１つの分子（Ｂ）上のアミン基を、アミン反応性部分（Ｘ）およびスルフヒドリル反応性部分（Ｙ）を有するヘテロ２官能性試薬（Ｘ−Ｙ）を介して、別の分子（Ａ）上の遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）に結合することを含む。「スペーサ」が、ヘテロ２官能性試薬の反応性部分を分離していることが多い；様々に異なるスペーサ構造を有しているものの、本質的には同一の化学的反応性を共有する多くのヘテロ２官能性試薬が存在する。

典型的には、複合されるべき１つの生体分子（Ｂ）が、それのアミン基を介して、ヘテロ２官能性試薬のＸ官能基と反応させられ、結果としてＢ−Ｙ誘導体をもたらす。その後、過剰なヘテロ２官能性試薬が除去され、精製されたＢ−Ｙが別の分子（Ａ）上にあるスルフヒドリル基と反応させられる。Ｘは、一般的には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルである一方、Ｙは幾つかの部分のうちの１つであってよい。Ｙは、最終的なＡＢ複合体に組み入れられてもよいし、または組み入れられなくてもよい。Ａから誘導されたスルフヒドリル基は、ほとんど常に、安定したチオエーテル結合として、またはＡとＢとの間の可逆性（還元性）ジスルフィド架橋のうちの片方としてのいずれかで組み入れられる。Ｙは、マレイミド、エポキシド、ヨードアセチル、ブロモアセチル、ピリジルジチオール、メタンチオスルホナートなどを含むあらゆるスルフヒドリル反応性官能基であってよい。

アミンおよびスルフヒドリル反応性ヘテロ２官能性試薬の例としては、３−（２ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、延長スペーサ（ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＬＣ＝「長鎖」）および水溶解度を増大させるためのスルホ基（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）を有するＳＰＤＰの変異形、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳ、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）、スルホ−ＳＩＡＢ、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＢＰ）、スルホ−ＳＭＢＰ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、スルホ−ＧＭＢＳ、スクシンイミジル−６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノアート（ＳＩＡＸ）、およびそれの延長スペーサ形態ＳＩＡＸＸ、スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＩＡＣ）、およびそれの延長スペーサ形態（ＳＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨード酢酸（ＮＰＩＡ）を含む。多くの他の関連する例、例えばカルボニルおよびスルフヒドリル反応性リンカー、β−マレイミドプロピ
オン酸ヒドラジド（ＢＭＰＨ）などが存在する。

Ａ上のスルフヒドリル基は固有のものであってよい。しかし、より一般的には、スルフヒドリル基は、存在しておらず、複合ステップに先立ち、チオール化反応により導入する必要がある。抗体の場合には、チオール基は還元剤（例えば、ＭＥＡまたはジチオトレイトール（ＤＴＴ））により発生させられてよく、その還元剤は、抗体分子上の様々な位置におけるジスルフィド架橋を破断する。あるいは、種々の技術が知られており、それらの技術によれば、遊離スルフヒドリル基または保護スルフヒドリル基のいずれかを導入すべく他の官能性基（一般的にはアミン）を修飾することができ、その後、チオール化された生成物（即ち、Ａ−ＳＨ）を発生させるべく、還元剤を用いる処理により脱保護することができる。公知の従来技術においては、Ｂ−Ｙとの複合に先立ち、所望のチオール化された生成物Ａ−ＳＨを未反応のチオール化試薬、ならびにＢ−Ｙへの複合で競合することとなる遊離スルフヒドリル基および、おそらくは、さもなければＢ−Ｙへの複合でＡ−ＳＨと競合することとなる還元剤をも含めたあらゆる副生成物から分離するため、少なくとも１つの分離ステップが必要である。分離は、クロマトグラフィカラムでの脱塩、ゲル濾過、透析または洗浄を含む技術により実行される。１つまたは複数の分離ステップは、不可避的に、材料の損失および希釈を引き起こす。１つまたは複数の分離ステップの冗漫な性状および／またはかなりな量のＡが必要になるため、チオール化ステップは決して充分に最適化され得ないであろう。

例を挙げれば、Ｔｒａｕｔの試薬（Ｔｒａｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２、３２６６−３２７３、１９７３）としても知られている２−イミノチオラン（２ＩＴ）が、これまで、ＳＨ基をタンパク質、特に抗体に導入するために使用されてきた。試薬は、第１級アミン（例えばリジン上に存在）と反応し、開環反応において末端スルフィドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）基を発生させる。過剰なＴｒａｕｔ試薬は、結果的に生じるチオール化分子と別の分子上のチオール反応性基との複合に先立ち、典型的には脱塩により、除去される。生複合化学についての別な具合の包括的な研究（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｇ．Ｔ Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）においては述べられていないが、２ＩＴは２次反応も受け、そこでは、新生チオールが分子内反応し、非反応性のチオエステルを形成する（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＆ Ｂｕｓｃｈ．、Ｂｉｏｌ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２３、３５３−３５６、１９９４；Ｓｉｎｇｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６、１１４−１２５、１９９６）。Ｔｒａｕｔ試薬の公知の化学から、チオール反応の継続時間がその後の複合ステップの成功にとって極めて重要であり得、また、脱塩もしくは他の分離ステップが迅速に果たされる必要があることは明らかである。

チオール反応性官能基を含めるべく工学的に処理された分子との複合体の生成における２ＩＴの通常の先行技術による使用は、過剰量の２ＩＴを用い、その後、脱塩、透析または洗浄ステップを実施するものである。このタイプの手法が、２ＩＴの供給業者（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｂｕｌｌｅｔｉｎ ０４１４；ｐｒｏｄｕｃｔ ２６１０１）および生複合体の調製において使用される製品の供給業者（例えば、Ｐｒｏｚｙｍｅ ＴｅｃｈＮｏｔｅ ＃ＴＮＰＪ３００）により推奨されている。この手法を記載している他の出版物は：米国特許第６９６２７０３号、第６９３６７０１号、第６６６９９３８号、第６０１０９０２号、第５８６９０４５号、第５１６４３１１号；Ｓｔａｎｉｓｉｃら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７１、５７００−５７１３、２００３；Ｍａｎｄｌｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、９２、１５７３−１５８１、２０００；Ｈｕｗｙｌｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３、１４１６４−１４１６９を含む。

脱塩の問題に対する１つの潜在的に有望な解決策が示唆され（Ｈａｕｇｈｌａｎｄ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ｐ４９）、その解決策は、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）による保護スルフヒドリル基の還元に関する。その後の複合ステップを妨害しないため、ＴＣＥＰの除去は必要でないと主張されているが、Ｇｅｔｚら（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７３、７３−８０、１９９９）は、複合反応におけるＴＣＥＰのかなりの妨害を示した。その上、Ｓｈａｆｅｒら（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２８２、１６１−１６４、２０００）は、ＴＣＥＰがスルフヒドリル反応性のマレイミド基およびヨードアセチル基と急速に化合することを報じている。更に、生複合反応は、一般的に、ｐＨ７から８におけるリン酸塩緩衝液中において実施され、そのような条件下ではＴＣＥＰは不安定である（Ｈａｎ ＆ Ｈａｎ、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２０、５−１０、１９９４）。ＴＣＥＰは、ほとんどの生体分子と適合しない極端なｐＨにおいて（例えば、１００ｍＭのＨＣｌ中において、または１００ｍＭのＮａＯＨ中において）非常に安定している。ＴＣＥＰは特定のすき間用途を見出したが、ＴＣＥＰが有する重大な制限が、１９９２年に商業的に利用可能になって以来、生複合体を生成するための好適な方法がほとんど変わらなかったことを確かにした。ＴＣＥＰは、イオウ原子を含んでおらず、それゆえ、本目的上、「チオール発生剤」とは見なされない。

ＭｃＣａｌｌら（１９９０ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１、２２２−２２６）は、２ＩＴを用いて大環状キレート化剤を抗体に複合させるための１段階法を開示した。詳細には、ＭｃＣａｌｌらは、２ＩＴを用いて、ＢＡＴと略記される６−［ｐ（ブロモアセトアミド）ベンジル］−１，４，８，１１−テトラアザシルコテトラデカン−Ｎ，Ｎ^１，Ｎ^１１，Ｎ^１１１−テトラ酢酸または同様な化合物、２−［ｐ（ブロモアセトアミド）ベンジル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ^１，Ｎ^１１，Ｎ^１１１−テトラ酢酸（ＢＡＤと略記される）を、マウス抗体に接合した。ｓＢＡＴ／ＢＡＤ試薬は、スルフヒドリル反応性基に関して１価であり、即ち、分子１個当たり、スルフヒドリル基と反応することができる基を１つだけ有していた。ＭｃＣａｌｌらは、そこで開示している「１段階」法がその特定のＢＡＴ／ＢＡＤ試薬に対してのみ適用可能であることを示唆した（「穏やかなアルカリ性の条件下においては、ブロモアセトアミド試薬は、スルフヒドリル基とは急速に反応するが、アミノ基とはゆっくりとしか反応しないため、抗体、ＢＡＴおよび２ＩＴの溶液を単一の反応混合物において組み合わせることができた」）。この技術が一般的に適用可能であり得ることは示唆されておらず、商業的に使用される標準的な方法は、依然として、介在する脱塩、精製または洗浄段階を伴う２段階手法のままである。

発明の概要
１つの態様においては、本発明は、第１の化学物質および第２の化学物質を反応させて、第１および第２の化学物質が互いに共有結合により結合されている複合体を形成するための方法であって、第１の化学物質、第２の化学物質およびチオール発生剤を同時に接触させることを含み、チオール発生剤がチオール化反応において第１の化学物質と反応して、第１の化学物質上に遊離スルフヒドリル基の形成をもたらし、遊離スルフヒドリル基が第２の化学物質と反応して複合体を形成し、第２の化学物質が、スルフヒドリル基との反応性に関して多価である（即ち、第２の化学物質の１つの分子は、２つ以上のスルフヒドリル基と反応することができる）方法を提供する。

本発明は、チオール発生剤と第１の化学物質との反応および第２の化学物質との反応の間に分離ステップを必要としないという点において、通常の従来技術とは異なっている。その代りに、本発明においては、上述の３つの材料が本複合手順におけるある段階で同時に接触しており、チオール発生剤が、複合されるべき両物質と接触しながら、第１の化学物質上に遊離スルフヒドリル基を生成すべく作用する。過剰なチオール発生剤から、または第２の化学物質との接触に先立って形成され得る任意の副生成物から、チオール化された第１の化学物質の分離または部分的分離は存在しない。この手法の１つの利点は、それらの新たに形成されたＳＨ基が、不安定ではあるものの、第２の化学物質とすぐに反応できることである。

本発明は、１つには、分離ステップが必要不可欠ではないという認識、また、従来技術における分離の一貫した使用が誤解に基づいているという認識に基づくものである。従来の複合手順における１つまたは複数の分離ステップを排除することにより、本発明の方法は実質的に簡単化されている。更に、材料の損失を避けられない分離ステップが存在しないため、本発明の複合反応は非常に少量の材料を用いて実行することができる。従って、本発明は、直接アッセイにおいて有用な標識化された試薬の形態における複合体の容易な形成への道、例えばあらゆる規模でのほとんどすべてのタンパク質の直接的な標識を促進する道を開き、また、イムノアッセイの簡略化、再現性の増大およびコストの低減といった更なる利点も提供する。

チオール発生剤（ＴＧ）は、１つ以上のイオウ原子を含み、（例えば、開環、再配列または別な方法により）第１の化学物質と反応して、第１の化学物質上に共有結合しているスルフヒドリル（またはチオール）基を生成し、スルフヒドリル基は、チオール発生剤からのイオウ原子を含んでいる。チオール発生剤は、都合よくは、チオラクトン（以下参照）および／またはイミノチオラクトン（以下参照）および／またはエピスルフィド、例えば１，２−エピチオプロパンなど、および／またはチアゾリジン、例えば２−［（４−ジメチルアミノ）フェニル］−１，３−チアゾリジンおよびチアゾリジンのＮ−置換類似体などを含み、ここで、上記Ｎ−置換基は開環特性を変えるために導入されてよい（Ｃａｎｉｅら、Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ ６８、８１３−８１８、１９９６）。材料の混合物も使用することができる。適切なチオラクトンは、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン（ＮＡＨＣＴ）（Ｂｅｎｅｓｃｈ ＆ Ｂｅｎｅｓｃｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４４、８４８−８５３、１９５８）を含む。適切なイミノチオラクトンは、Ｔｒａｕｔの試薬としても知られている２−イミノチオラン（２ＩＴ）を含み、Ｔｒａｕｔの試薬は２−イミノチオランヒドロクロリドとして商業的に入手可能である。置換および誘導体化された材料も使用することができ、例えば５−および４，５−アルキル置換２−イミノチオラン（ＧｏｆｆおよびＣａｒｒｏｌｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１、３８１−３８６、１９９０）を使用することができる。可能な変異形は、５−メチル−、５−ｔｅｒｔ−ブチル−、５−フェニル−、５，５−ジメチル−、５−スピロ−、および４，５−環類似体を含む。

本第１の化学物質（Ａ）は、Ａのチオール化された異形、Ａ−ＳＨを生成すべくチオール発生剤と反応する化学的な官能基を含んでいる。この官能基は、一般的には、求核基、典型的にはアミン、特には第１級アミン、またはヒドロキシル基である。典型的なチオール化反応は、以下のとおりである：

２ＩＴは、充分に水溶性であり、７から１０までのｐＨ範囲において第１級アミンと反応する。従来の複合体形成反応においては、２ＩＴは約８のｐＨで使用され、この条件下において、２ＩＴは、例えばペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に存在するリジン残基における第１級アミンと効率的、かつ、急速に反応する。第１級アミンとの反応で、今や、２ＩＴを８という従来の値よりも低いｐＨで反応させるのが好ましいことが判明している。従って、２ＩＴを使用するときには、本複合反応は、好適には８未満のｐＨで実施され、好ましくは７．８未満、より好ましくはｐＨ７．７未満で実施される。好適なｐＨ範囲は７．０から７．５である。チオールと多くのタイプのチオール反応性基Ｙとの反応がｐＨ６．５から７．５までの間で効果的に起こるため、競合する加水分解反応が不所望の遊離チオールを発生させる高いｐＨ値でＴＧを使用することは望ましくない。その上、Ｙは、以下で検討されているように、アルカリ性のｐＨでは、加水分解反応を受ける可能性もあり、または、よくあるマレイミド官能基の場合の如く、チオールに対する選択性の低減を示すこともある。もっと高いｐＨ、例えば約１０においては、２ＩＴは、脂肪族および芳香族のヒドロキシル基とも反応性である（但し、これらの基との反応速度は第１級アミンの場合の約０．０１にすぎない（Ａｌａｇｏｎ ＆ Ｋｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９、４３４１−４３４５、１９８０））。アミンの不在下においては、炭水化物、例えばアガロースまたはセルロース膜などを２ＩＴで修飾し、スルフヒドリル残基を含めることができる。この方法で修飾された多糖は、イムノアッセイ手順において使用するための抗体を共有結合により架橋するのに有効である。

第１の化学物質（一般的に、本明細書では「Ａ」と呼ばれている）は、典型的にはポリマーであり、好適には生体分子ポリマー（即ち、１つまたはそれ以上の生体系で自然に生じるポリマー分子）である。１つの好適な生体分子ポリマーはポリペプチドである。本質的にということではないが、望ましくは、第１の化学物質は、抗体もしくは抗原結合性フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖもしくは単一のドメイン抗体など、または抗体もしくはそれらの抗原結合性フラグメントのマルチマーを含み、またはそれらから構成される。Ａの他の例は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、タンパク質Ａ、ポリペプチド受容体分子およびポリペプチド配位子を含む。１つ
以上のチオール基を含む第１の化学物質をＡ−ＳＨで表わすことができる。

第１の化学物質がＴＧと反応する１つより多くの化学的官能基、例えば数個の第１級アミンを含んでいる場合には、１つより多くのスルフヒドリル基が第１の化学物質上に形成されるであろう。

第２の化学物質（一般的に、本明細書では「Ｂ」と呼ばれている）は、第１の化学物質上に形成されたスルフヒドリル基と反応して結果的に複合体の生成をもたらす複数のスルフヒドリル反応性官能基（Ｙ）を含んでいる。従って、第２の化学物質は、典型的には、Ｂ−Ｙで表わすことができる。複合反応の間、Ａ−ＳＨのイオウ原子は、通常、安定したチオエーテル結合または可逆性（還元性）ジスルフィド架橋の片方として最終的な複合体に組み入れられる。

第２の化学物質は、１つより多くのスルフヒドリル反応性官能基を含んでおり、それらの官能基は同一の化学を有していてもよいし、異なる化学を有していてもよい。スルフヒドリル反応性物質は、マレイミド、エポキシド、ヨードアセチル、ブロモアセチル、ピリジロールチオール（ｐｙｒｉｄｙｌｏｌｔｈｉｏｌ）などを含む。複数のスルフヒドリル反応性官能基（Ｙ）は、第２の化学物質に自然に存在しているものであってよいが、一般的には、これらのスルフヒドリル反応性官能基のうちの１つ以上を、第２の化学物質を生成するための予備ステップにおいて、分子Ｂに導入することが必要であろう。適切な導入技術は当業者にとって周知である。

第２の化学物質（Ｂ−Ｙ）は、典型的には、複合された第１の化学物質の結合を介して種々の材料を同定または測定するための標識、例えば酵素、蛍光物質など、または複合された第１の化学物質の結合を介する標的送給用の毒素、治療薬などからなり、またはそれらを含む。

本発明は、一般的に適用可能な方法を提供する。それでも尚、幾つかの好適な実施形態においては、第２の化学物質はポリマーであり、またはポリマーを含む。また、幾つかの好適な実施形態においては、第２の化学物質はポリペプチドを含む。

１つの好適な実施形態においては、第２の化学物質は酵素を含む。好適な酵素の例は、ＨＲＰ、アルカリ性ホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼを含む。ＨＲＰが特に好適である。

これら第１および第２の化学物質の機能は逆にされてもよい。
ＡとＴＧとの間の反応を起源としないチオールがＢ上の限られた数のＹ官能基に対してＡ−ＳＨ分子と競合し得るため、使用できる複合条件の範囲に関しては特定の制約が存在する。種々の試薬の初期純度、特にＴＧの初期純度は、これが望ましくない遊離チオール（例えば、ＴＧの加水分解物）の潜在的な供給源であるため、１つの重要な制約である。複合反応のｐＨを増大させると、Ａ上のアミンを脱プロトン化し易くなり、結果としてアミンとＴＧとの反応を速くすることになるが、ＴＧの加水分解速度も増大する可能性がある。従って、複合の効率は、あらゆる化学反応の場合と同様に、反応物の濃度に依存するであろうが、チオール汚染の初期レベル、他のチオールの場合と比較した（ＡとＴＧとの反応からの）Ａ−ＳＨの生成速度、Ｂ−Ｙとの種々の異なるチオール含有分子の相対的な反応性、および複合に利用できるＹ官能基の総量にも依存するであろう。

本発明者は、式Ｂ−Ｙ_ｎ（式中、「ｎ」は整数である）の分子とＡ−ＳＨとの複合が、「ｎ」が小さくなるにつれ、汚染チオールによる妨害を一層受けやすくなることを発見した。ｎ＝１の場合には、Ｂ−Ｙの分子とたった１つの汚染遊離チオールの分子との反応が
、その特定のＢ−Ｙ分子があらゆる他のカップリング反応に関与するのを阻止する。従って、「ｎ」が小さい場合、確実に各Ａ−ＳＨ分子がＢ−Ｙと反応できるようにするためには、大量に過剰のＢ−Ｙが必要になり得る。過剰量のＢ−Ｙを使用することは、特にＢが大きな生体分子である場合、現実的でなく、非経済的である。その上、最終的な複合体中における高レベルの遊離Ｂの存在は、特定の用途においては厄介であり得る。その代りに、本発明者は、望ましくないチオールとの不所望の競合反応に直面した状況下においてさえ複合体を調製する改善された方法は、高値の「ｎ」を有するＢ−Ｙ試薬を用いることにより、Ａ−ＳＨとＢ−Ｙ_ｎとの間での複合効率を高めることであることが分かった。

本発明の方法は、「ｎ」の値が増大するにつれ、ますます着実な成果を挙げることができるようになる。好適には、第２の化学物質は、分子１個当たり、３つより多くのスルフヒドリル反応性基を含む。より好適には、第２の化学物質は、分子１個当たり、５個以上のスルフヒドリル反応性基を含む。最も好適には、第２の化学物質は１０個以上のスルフヒドリル反応性基を含む。有利には、第２の化学物質は１０個から１５個のスルフヒドリル反応性基を含む。望ましい個数のスルフヒドリル反応性基が第２の化学物質において自然に本来備わっていない場合には、本明細書の別の個所で述べられている如く、それらのスルフヒドリル反応性基を化学的または酵素的な合成により導入することができる。本発明の目的上、「スルフヒドリル反応性基」は、複合反応条件下においてスルフヒドリル基と反応する基である。当然のことながら、その反応条件は、第１および第２の化学物質の活性を実質的に維持できるようなものでなければならない。

６個のみのリジン残基を有し、そのうちの２個だけをＹ官能基の導入に利用することができる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６、ＧＴ Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ｐ６３２）ＨＲＰの場合には、試薬が低いチオール含有量を有しており、かつ、その反応条件がＴＧの過剰な加水分解をもたらさないことが特に重要である。しかし、使用される条件にかかわりなく、望ましくない遊離チオールの生成により生じる複合効率の低減は、より多くのＹ基をＢに導入することによりもしくはＢ−Ｙを重合することにより、またはこれら２つの手法を組み合わせることにより対処することができる。必要以上のＹ基をＢに導入するために使用される方法に関しては特に制限はないが、但し、その方法は、特にＢが酵素である場合には、Ｂの生物学的活性を実質的に維持できるものであるべきである。

本発明の１つの利点は、干渉性遊離チオールの存在を克服するために第２の化学物質とチオール発生剤との大きなモル比（即ち、Ｂ：ＴＧ比）を使用する必要性が回避されていることである。従って、本発明においては、その複合反応における第２の化学物質とチオール発生剤とのモル比は、都合よくは２．０：１より大きくなく、典型的には１：１以下であり、好適には１：１から１：２０の範囲であり、最も好適には１：１０から１：１５の範囲である。

Ｙ基は、Ｂ上に既に存在する官能基に直接的に付けることができる。代替的に、またはそれに加え、新たな反応中心を導入してもよい。例えば、糖鎖を有する分子を、アルデヒド官能基を発生させるべく、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化してよい。これらの官能基は、アミンまたはヒドラジド含有化合物と容易に反応して、それぞれ、シッフ塩基またはヒドラゾン結合を形成し、それらのシッフ塩基またはヒドラゾン結合は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムまたは他の適切な還元剤を用いて安定化させることができる。従って、過剰量のジアミン化合物がアルデヒド基と反応させられた場合には、１つのアミン部分が、修飾されるそれぞれのアルデヒドに対して導入される。ジアミンが過剰に存在していない場合には、架橋反応（即ち、Ｂポリマーを与えることとなる）が起こることがあり、特定の状況（以下参照）において有用であり得る。

Ｂへのアミン基の導入は、Ｂと単純ジアミンとの反応に限定されるものではない。２つ（またはそれ以上）の官能基を有する他の分子も使用することができる。これらの官能基のうちの１つはＢと反応することができなければならず、また、他の官能基をＹ基に変換することが可能でなければならない。また、Ｙ基は、Ｂ上のアミン部分を何ら利用することなく、Ｂに直接的に導入されてもよい。例えば、Ｂが糖タンパク質である場合、過ヨウ素酸塩との反応がアルデヒド官能基を発生させ、その後、それらのアルデヒド官能基を、アルデヒドおよびスルフィドリル反応基両方を有するヘテロ２官能性試薬（例えば、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド；ＭＰＢＨ）（Ｃｈａｍｏｗ ＳＭら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２ ２６７、１５９１６−２２）と反応してもよい。ＭＰＢＨに類似の化合物（例えば、Ｍ_２Ｃ_２Ｈ）も使用することができる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６、ＧＴ Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ｐ２５０）。

官能基を導入する別の方法は、（例えば、ポリペプチド鎖におけるグルタル酸残基またはアスパラギン酸残基によりもたらされる如く）カルボン酸を修飾することである。カルボン酸とのアミン含有分子のカルボジイミド媒介縮合は、化学合成において広く用いられており、Ｂにアミンを導入するため（例えば、ジアミン、トリアミンとの反応により）および他の官能基を導入するために使用することができる。例えば、エチレンジアミンとのＨＲＰのカルボジミド（ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）（ＥＤＣ）媒介縮合を用いて、アミノ化されたＨＲＰが発生させられており（ＵＳ第５，０３９，６０７号）、その縮合反応は、ＨＲＰ分子に１１個のアミン官能基を与えた。このカルボジイミドを用いる手法は、Ｂ上に糖鎖がないために過ヨウ素酸塩をベースとした方法を用いることができない場合に特に有用である。

Ｂにアミンを導入し、その後、それをＹ官能基に変換するこの方法の１つの利点は、広範囲の潜在的に有用なアミン含有分子が商業的に利用可能なことである。これらの分子において、それらのアミン基は、同じ原子に結合されていてもよいし、同じ原子に結合されていなくてもよい。Ｂ上のアミン（最終的にＹ基に変換され得る）の個数を増やすことにより、複合反応におけるチオールの干渉に対して一層抵抗性の高いＨＲＰの誘導体を発生させることができる。

１つの好適な実施形態においては、過ヨウ素酸塩活性化ＨＲＰが「ｃ」個のアミン基（ここで、ｃ＝２以上）を担持した分子Ｃと反応させられ、それぞれの修飾されたアルデヒド基に対してｃ−１個の付加的なアミンを有するＨＲＰ類似体がもたらされる。好適な実施形態においては、Ｃは、ジアミン（例えば、エチレンジアミン、プロパンジアミン、ブタンジアミン；２，２’（エチレンジオキシ）ビス−エチルアミン（ＥＤＢＡ）；リジンなど）、または３つ以上のアミン官能基を有する分子（例えば、ｌｙｓ−ｌｙｓ（ｃ＝３）、トリリジン（ｃ＝４）、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ Ｔ４０３（ｃ＝３）、アミノ化されたデキストラン、アミノ化されたデンドリマーおよび他のポリアミノ種である。

望ましくない遊離チオールが複合効率に及ぼす影響力を低減させるための１つの代替的な戦略は、ｎｑ個のマレイミド官能基を有するポリマー［（Ｂ）ｎ］ｑ（式中、「ｎ」はそのポリマー中に存在するＢの分子１個当たりのＹ官能基の個数であり、「ｑ」はそのポリマー中に存在するＢ分子の平均個数である）をもたらすＢ−Ｙの重合を誘発することである。こうすることにより、Ｂ分子が物理的に接続され、かつ、利用可能なＹ官能基のうちのいずれか１つへのＡ−ＳＨの複合がそのポリマー中に存在するすべてのＢ分子をＡに効果的に連結するため、「ｎ」が小さい状況においてさえ、遊離チオールの影響力は低減される。この手法の別の利点は、潜在的にＡに付着させ得る例えばＨＲＰ分子の数が増えるにつれ、検出感度が高められ得ることである。イムノアッセイにおいて、アッセイの感度を高めるためにポリマーＨＲＰを使用することは広く知られており、そのような形態が
商業的に利用可能である。

代替的に、遊離アミン（自然に生じたものか、または例えばジアミンとの反応により導入されたものであるかのいずれかの）を有するＢ分子（Ｂ−Ｙではなく）が、先ず、ホモ２官能性架橋剤（例えばジアルデヒド）との反応により、またはＢ上の他の官能基へのアミンの結合を促進するためのヘテロ２官能性試薬を使用することにより、重合されてよい。また、Ｂと「骨格」分子（例えばデンドリマー、デキストラン、タンパク質）との反応によりヘテロポリマーが発生されてもよく、それらのヘテロポリマーに多数のＢ分子が付け加えられてよい。これは、Ｂ上のアミンと、骨格上のアルデヒドとの反応、またはヘテロ２官能性架橋剤により媒介された他の利用可能な官能基（例えばチオール）との反応を含み得る。次に、残りの未反応表面アミン官能基をＳＭＣＣなどのヘテロ２官能性試薬との反応によりＹ基に変換することができる。もし、その重合ステップの後に残っている遊離アミンの量が不充分な場合には、Ｙ基を導入する前に、更なるアミンを付加することができる。例えば、カルボジイミド化学を用いてＢにアミンが導入され、その後、そのＢが重合反応において利用または部分的に利用される場合には、異なる化学（例えば、糖鎖の過ヨウ素酸塩活性化）を使用して、付加的なアミン（後に、Ｙ基に変換することができる）を導入することができ、または（例えばＭＰＢＨとの反応により）Ｙ基を直接的に導入することができる。また、重合されたＨＲＰを商業的なソースから入手し、本発明で使用するためにさらに修飾して多数のＹ官能基を創出することもできる。

複合体に有用な特性を付与するＢ分子は、しばしば、後で使用するために、Ｂ−Ｙの形態で調製および保存される。例えば、幾つかの標識は、マレイミド活性化誘導体（凍結乾燥されたマレイミド活性化酵素、または小さな蛍光分子のマレイミドもしくはヨードアセチル誘導体）として商業的に入手することができる。また、Ｂ−Ｙは、必要な場合には、当技術分野において公知の方法を用いて新たに調製されてもよい。Ｂの例は、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼ（Ｇｏｘ）など；蛍光分子、例えばフィコビリタンパク質（例えばアロフィコシアニン、フィコエリトリン）、低分子量染料（例えばフルオレセイン、ローダミン）など；を含む。架橋またはリンカー分子はストレプトアビジンまたはビオチンを含む。細胞殺滅剤は毒素（例えばリシンおよび放射性同位体）を含む。酵素ＨＲＰおよびアルカリ性ホスファターゼは、特に広く使用されている、抗体および他のポリペプチドに対する酵素標識であり、これらの酵素が、本第２の化学物質の好適な実施例を代表する。

本発明を実践するときには、Ａ、ＴＧおよびＢ−Ｙが組み合わされ、適切な時間の間、インキュベートされる。加える順序は、状況に合わせて様々に変えられてよい。

例えば、１つの手法においては、第１ステップでＴＧがＡと混合される。Ａ−ＳＨが発生される適切な時間の後、第２ステップでその混合物がＢ−Ｙに加えられる。適切な時間は、ＡとＢ−Ｙとの間の効果的な複合を可能にするあらゆる時間である。その時間は、典型的には１８時間（即ち、一晩）までであるが、最適な条件下においては約２から４時間以内で行われることもある。これら２つの反応ステップにおける反応条件は、適切である場合には、変えられてよく、例えば、適切な緩衝液の使用により、上述の第１ステップおよび第２ステップが異なるｐＨ値で実施されてよい。

別の手法においては、ＡがＢ−Ｙと混合され、その後、その混合物がＴＧと接触させられる。

１つの更なる手法においては、ＴＧがＢ−Ｙと混合され、その後、その混合物がＡと接触させられる。

望ましくは、ＴＧおよびＢ−Ｙのうちのいずれか一方または両方は、最初、乾燥状態にあり、例えば保存安定性を考慮してフリーズドライまたは凍結乾燥されている。好適には、第１物質の溶液（典型的には水溶液）を用いて他の成分が再構成され、こうすることにより、サンプル量の膨大化を最小限に抑えることができる。

１つの特に好適な実施形態においては、Ａは、Ｂ−ＹとＴＧとの両方を含む凍結乾燥混合物に液体の形態で加えられる。

代替的には、ＴＧおよびＢ−Ｙの凍結乾燥混合物が、Ａを含有していない混合物を与えるべく、溶媒（典型的には水）を用いて再構成され、その後、その再構成された混合物にＡが加えられる。

複合反応が起こる溶液は、場合によって、Ａ、Ｂ−ＹおよびＴＧのほかに、１つ以上の成分を含んでいてよい。これらの成分は、その複合反応の速度に影響を及ぼすものであってよく、または影響を及ぼさなくてもよい。例えば、幾つかの添加剤は、成分の凍結乾燥に先立ち、主に、それらの成分を安定化させることを目的として、または溶解し易くするために導入することができる。他の成分、特に緩衝剤は、主に、その下で好適な反応が適切な速度で起こるｐＨ条件をもたらすべく使用することができる。これらの緩衝剤は、最終的な混合物が必要とされた組成を有するように、１回以上の付加操作により、最終的な複合混合物中に導入されてよい。不可避的にということではないが、好適には、それらの緩衝物質は、本複合体を調製する上での作業量を最小化するため、１つ以上の他の成分（Ａ、Ｂ−ＹもしくはＴＧ、またはそれらの組み合わせ）と一緒に含められる。

反応混合物に付加する成分の好適な順序を決定する際には、ＴＧの安定性および複合を必要となる条件を慎重に考察すべきである。例えば、塩基不安定性のＴＧは、酸性媒質中において（またはそのような媒質から凍結乾燥された形態で）保存され、適切に緩衝された反応混合物中に最後に導入することができよう。その緩衝された混合物は、ＴＧと一緒に導入される酸を受け入れ、意図された複合反応が起こるのに適した最終的なｐＨおよび組成をもたらすように設計することができる。

本複合反応での適切な条件、例えば温度、ｐＨおよび濃度などは、それらの試薬の性状に依存するであろう。適切な条件は、当業者であれば、ルーチン的な試行錯誤により容易に決定することができる。

また、本発明の方法は複合キットの原理も提供する。ＴＧおよびＢ−Ｙは、好適には、適切な容器内における乾燥された成分、例えばフリーズドライ（凍結乾燥）成分として、別々に、または混合物として、場合によってはそこにＡを溶解することができる適切な緩衝液と共に提供される。代替的に、特にＡの調合物が複合反応を妨害しかねない成分を含んでいる場合には、Ａが上述の緩衝液中に脱塩または透析されてもよい。

従って、１つの更なる態様においては、本発明は、本発明の方法において使用するための複合キットを提供し、そのキットは、第１の化学物質、第２の化学物質およびチオール発生剤から選択される試薬の少なくとも１つのサンプル、ならびに本発明の方法を実施するための取り扱い説明書を含む。

本キットは、望ましくは、第１の化学物質、第２の化学物質およびチオール発生剤から選択される少なくとも２つの試薬のサンプルを含む。

本キットは、好適には、第２の化学物質のサンプルおよびチオール発生剤のサンプルを含む。これら２つの試薬は、別々に提供されてもよいし、または混合物の形態であっても
よい。チオール発生剤は、好適には、第２の化学物質に関して過剰に存在し、例えば約２０倍までのモル過剰で存在する。

好適には、試薬または試薬混合物の複数のアリコートまたはサンプルが、適切な容器に入った形態で提供され、例えば個別のチューブ、バイアルに入った形態で、またはマルチウェル（例えば９６ウェル）マイクロタイタープレートのウェルに入った形態で提供される。サンプルは、処理されるべき材料（例えば第１成分）を考慮してユーザが適切なサンプルサイズを選択することができるように、様々な異なる予め定められた量で提供されてよい。１つの好適な実施形態は、例えば様々な異なる分子を標識化するため、例えば直接イムノアッセイにおいて使用されるべき抗体を標識化するために、１つ以上の異なる第１の化学物質（おそらく、エンドユーザにより提供される）を複合する際に使用することを目的とした、様々な異なる量における第２の化学物質とチオール発生剤との混合物の複数のサンプルを含む。

試薬または試薬混合物のサンプルは、場合によって、反応に適した状態を提供するべく、他の材料、例えば緩衝剤などを含んでいてよい。

チオール発生剤が２ＩＴを含む場合、２ＩＴのそれらのサンプルは、好適には８以下のｐＨ、より好適には７．８以下、更に一層好適には７．７以下のｐＨである。ｐＨの好適な範囲は７．０から７．５である。

本キットは、任意の構成要素、例えば溶媒、緩衝溶液などを含んでいてよい。
それらの試薬サンプルは、望ましくは、乾燥状態にあり、例えば保存安定性を考慮してフリーズドライ（凍結乾燥）された形態を成している。望ましくは、それらの試薬サンプルは、５から６．５の範囲、好適には５．０から６．０の範囲のｐＨでリン酸ナトリウム緩衝剤を含む水溶液から凍結乾燥される。また、望ましくは、それらの試薬サンプルは、Ｍｇ^２＋イオンを含む水溶液、特に１から１０ｍｍの範囲のＭｇ^２＋濃度においてＭｇ^２＋イオンを含む水溶液からも凍結乾燥される。また、通常の凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）および溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）も存在していてよく、例えばポリオール、特にトレハロースまたはデキストランなどが存在していてよい。

１つの好適な実施形態においては、凍結乾燥試薬は、小さなポリプロピレン製のチューブ（例えば、０．５ｍｌまたは１．５ｍｌ用のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）、ポリプロピレン製のクリオバイアルまたはバイアル、ガラス製のバイアル、９６−ウェルのポリプロピレン製またはポリスチレン製のマイクロプレート、および意図されている複合反応にとって適したサイズに成された他の容器に入った形態で提供される。好適には、その容器の材料は、凍結乾燥前または適切な溶媒を用いるその後の再構成時のどちらにおいても、チオール基を放出させるべくＴＧと有意に反応しない。その容器の性状は、上で述べられている例に特に限定されるものではない。

本発明において使用するのに適した緩衝成分は、リン酸塩緩衝剤、特にリン酸ナトリウム、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、重炭酸塩、およびＴＧと反応しない他の緩衝剤、またはＴＧとＡ上の官能基との反応速度に比べて相対的にゆっくりと反応する他の緩衝剤を含む。従って、このリストは、適切にゆっくりとした速度で反応するアミン含有緩衝剤を含み得る。

複合反応混合物の他の成分は、それらの反応に直接的に関与しないが、成分を安定化さ
せ、もしくはある別な方法で所望の反応を促進させ、または例えば容器の表面での損失を最小化する、適切な環境をもたらす塩（例えばＮａＣｌ）および他の無機または有機成分を含み得る。

ＴＧが反応性であるため、ＴＧは、複合混合物における他の求核試薬と反応することができる。水は弱い求核試薬であるが、高濃度で存在し、また、加水分解反応は、特にｐＨ７より有意に高いｐＨ値においては、共有結合によってＡと連合していないチオールの濃度を増大させることができよう。

好適には、ＴＧは、遊離チオール基を殆どまたは全く含まず、そのレベルは、適切にはモル表現で５％以下であり、好適にはモル表現で３％以下、より好適にはモル表現で１％以下である。

商業的な供給源からのＴＧは有意な量の遊離チオールを含んでいることがあり、また、遊離チオールは、保存期間中、時間の経過とともに発生することもある。遊離チオールは、Ｂ−Ｙ上のＹ基に対してＡ−ＳＨと競合し、複合効率を低減させることが考えられる。２−イミノチオランの場合、ある供給業者は、遊離チオールの汚染は「５％まで」であると述べている。ここで述べられている研究で使用されたバッチは、モル表現で約１％のチオール含有量において測定された。

ＴＧ中におそらく存在している少量の遊離チオールが複合効率に有意に影響を及ぼさないように、反応物のモル比を慎重に選択することが好適である。Ｔｒａｕｔの試薬は、チオールまたは保護チオールを導入するために使用される他の分子よりも安定であり、大量のモル過剰で使用する必要はない。ＮＨＳ基を有する幾つかのアミン反応性のヘテロ２官能性試薬は、水溶液中において短い半減期を有しており、急速な加水分解を補償するため、大量に過剰な量で使用される。典型的には、ＴＧは、適当な過剰で使用され、例えば、第１の化学物質のすべての分子が確実にチオール化されるように、関連する化学的官能基、例えば第１の化学物質上に存在するアミンなどの１０倍のモル過剰で使用される。しかし、ＴＧの適切な濃度を選択する際には、ユーザは、起こり得る反応速度について考察しなければならず、この反応速度は、溶液のｐＨによって影響を受ける。固定ｐＨにおけるＴＧの適切な濃度は、ＴＧの濃度を様々に変えることによって結果として生じる複合体の性能に及ぼされる影響を調べることにより、容易に決定することができる。反応条件はＡの効率的なチオール化を可能にすることが好適であるが、Ａの生物学的活性を損なわないように、過剰なチオール化を避けることが好適である。同様に、過剰量の第２の化学物質がＡ−ＳＨに複合されるべきではなく、さもなければ、これは、複合体の次善の性能をもたらすことになる。第２の化学物質は、典型的には、すべての第１の化学物質が確実に複合されるように、チオール化された第１の化学物質に関して適度な過剰で、例えば、約５倍の過剰で存在する。反応後、過剰な材料は任意の適切な技術により除去することができる。

本発明で教示されている方法を使用すれば、複合反応はちょうど１０μｇのＩｇＧ抗体（Ｍｒ １５０，０００）を含むことができよう。典型的には、分子１個当たり約５個のチオール基が導入される。従って、１０μｌの体積（６．７μＭの抗体）において、（修飾されるべき）アミンの濃度は〜３３μＭである。脱塩ステップが存在しないため、新生チオールがＢ−Ｙと即座に反応する。標識、例えばマレイミド活性化ＨＲＰ（分子量４０，０００）などの場合、すべての新生チオールを標識化するには〜３３μＭの酵素を必要とすることとなり、これは、１０μｌの反応体積中における〜１３μｇのＨＲＰに相当する。もし２５倍のモル過剰のＴＧを使用した場合、ＴＧ溶液中における１％のチオール汚染は、約８μＭの濃度、または存在しているマレイミド活性化ＨＲＰの（モル表現で）１／４を表わすことになる。その上、ＨＲＰが分子１個当たり平均で２個以上のＹ基で標識
化された場合、ＨＲＰ分子と１つの汚染遊離チオールとの反応は、必ずしも分子がＢ−Ｙと複合するのを妨げることにならない。このことから、過剰なＢ−Ｙ、または多数のＹ基を有するＢ−Ｙの使用は、汚染遊離チオールおよび複合反応の間にＴＧの加水分解により発生した遊離チオールの負の影響を改善することができるということになる。幾つかの用途、特に表面に固定化された抗原を用いる用途においては、過剰なＢ−Ｙを使用することは、イムノアッセイの間に余剰の試薬（即ち、Ａに連結されなかった試薬）を簡単に洗い落とすことができるため、問題にはならない。更に、ＡＢと競合し、アッセイの感度を低減させることとなる未反応のＡ−ＳＨの量を最小化するために過剰なＢ−Ｙを使用することは広く知られている。

幾つかのイムノアッセイの用途、特に抗原が自由溶液中において測定されるイムノアッセイの用途においては、複合されるＢの量を最大化し、遊離Ｂ−Ｙを最小化することが望ましい場合がある。これは、当技術分野において公知の方法を用いて複合混合物からＡＢを精製することにより、または反応条件を慎重に制御することにより達成することができる。本発明においては、特に複合ステップへ迅速に進行させる必要がある場合、そこから材料の収率を決定するのが困難な脱塩ステップの回避は、反応物の正確な比率を確立する上で大いに役立ち、また、特定の実験目的に合わせて条件を最適化する上でも大いに役立つ。

遊離Ｂ−Ｙの濃度を低く保つ必要がある場合には、望まれていないチオールがＢを、特にＹで軽度に修飾されているＢ（即ち、Ｂ−Ｙ_ｎにおけるｎの値が低く、例えばｎが１であるか、１に近い場合）をＡ−ＳＨに複合できないようにしかねないため、遊離チオールのレベルが一層重要になる。複合後の遊離Ｂ−Ｙの分離が困難であるか、または望ましくない場合には、非Ａ依存性のチオール放出を引き起こさない条件（即ち、低いｐＨ、アミンを含まない緩衝剤）を用いて副反応を最小化することが好適である。

遊離チオールは、ＴＧがＡをチオール化する目的で使用される前に、取り除くことができ、または大部分を取り除くことができる。例えば、遊離チオールは、固体支持体に対してＴＧと遊離チオールの形態とが異なる親和性を示し、これにより、比較的純粋なＴＧの選択的な溶出が可能になるような固体支持体を用いて精製することにより、取り除くことができる。固体支持体への結合は、共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。

１つの手法においては、ＴＧの溶液がＹ基が取り付けられている固体支持体と接触させられる。そのような材料は、ヨードアセチルセファロース（Ｐｉｅｒｃｅ）（セファロースは商標である）の形態などとして、商業的に入手可能であり、またはアミン担持アガロースビーズへのハロ酢酸のカルボジイミド媒介複合により、当技術分野において公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５ ３０５９−３０６５（１９７０））を用いて作ることもできる。１つの好適な実施形態においては、固体支持体が、共有結合を介してすべてまたは実質的にすべての望まれていない遊離チオールを捕捉することができるように、Ｙ基の数は遊離チオールの数を上回っている。好適には、固体支持体に結合していないＴＧが直ちに使用され、またはほとんど手つかずの状態のまま材料を保存すべく迅速に凍結および凍結乾燥される。

別の手法は、例えば周知の５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾアート）（ＤＴＮＢ）法または遊離チオールを測定するのに適した他の方法を用いて、ＴＧのサンプル中における遊離チオールの濃度を測定することである。この後、Ｙ担持分子を含有し、かつ、その後の複合ステップを妨害しかねない官能基を含んでいない溶液が、好適には僅かなモル過剰で、また、好適には（ａ）更なるチオールが発生されないか、または非常にゆっくりと発生される条件下または（ｂ）汚染チオールがＹと迅速に反応して安定なチオエーテ
ルを形成し、これにより、サンプルからチオールが排除されるような条件下で加えられる。この戦略は、もちろん、それらの供給源にかかわらずチオールを取り除くために使用することができる。

Ｙ担持分子は、適切には、ほとんどの遊離チオールがＹと反応することができる時間の間、ＴＧと接触する。前述の時間の後、ＴＧサンプルはＡおよびＢ−Ｙと接触させられる。遊離チオールを取り除くために使用される分子は、以下のもののうちの１つであってよい：Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、ブロモアセトアミド、ブロモ酢酸、クロロ酢酸、水銀化合物など。Ｎ−エチルマレイミドが特に好適である。

本発明に従ってＡ、ＴＧおよびＢ−Ｙを同時に接触させることにより、ＴＧは、Ａばかりでなく、Ｂ−Ｙ上に存在するアミンとも反応する機会が与えられる。Ｂが大きな生体分子である場合には、たとえＹ基が利用可能なアミンの化学的修飾を介して既に導入されていたとしても、遊離アミンが尚も存在していることが非常にありがちである。生複合体化学において非常によく用いられる標識であるＨＲＰの場合には、分子１個当たりのアミンの数は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の場合の０．８８／ｋＤａおよびオボアルブミンの場合の０．４４／ｋＤａと比べて、通常、低い（１ｋＤａ当たり０．１５）。従って、ＴＧとＢ−Ｙとの反応の程度は、（ｉ）使用されるＢのタイプ、（ｉｉ）（残存する遊離アミンに関する）Ｂ上のＹ基の密度および（ｉｉｉ）試薬を付加する順序を変えることにより制御することができる。

Ｂ上のアミンのレベルが高く、かつ、使用された実験条件下でＴＧとの有意な反応が起こる場合には、Ｂは部分的に重合され得よう（即ち、Ｂ−Ｙと新生Ｂ−ＳＨとの反応が起こり得よう）。これが望ましくないと考えられる場合には、単に２段階複合戦略を採用することにより、この問題を回避することができよう。初めにＴＧをＡと接触させ、Ａ−ＳＨが生成される適切な時間の後、混合物がＢ−Ｙと接触させられる。こうすることにより、有意な量のＢポリマーが生成され得る前に、ＡＢ複合体を形成することが可能になる。

Ｂ−Ｙの部分的な重合は幾つかの状況においては有利であり得る。イムノアッセイの感度を高めるための１つの簡単な手法は、Ａ分子１個当たりもっと多くのＢを付着させることである。Ｂ−Ｙの重合はこの目標を達成するために用いられてきた。試薬の濃度（ＴＧ、Ａ）および第１ステップ（Ａ−ＳＨの生成）の持続時間を慎重に選択し、遊離アミンおよびＢ上のＹ基の個数を考慮することにより、その場でのＢポリマー生成の程度を要求どおりにコントロールすることができる。

本発明の１段階複合法は、すべての試薬が単一のステップで一緒に混ぜ合わされ、格別に魅力的であるが、２段階変異形（例えば、１回ではなく、２回の試薬付加操作を必要とする）は、尚も、ほとんどの現存する複合方法と比べて著しく簡単であり、必要な場合には、特定の用途に合わせて複合体を最適化するための更なる選択肢を提供することができるという利点を有している。

例えば、１つの実施形態においては、反応は、（Ａ−ＳＨおよびＢ−Ｙからの）ＡＢ複合体の生成を支持する条件下で始められる。別の反応においては、Ｂ−ＳＨを含有する溶液を発生させるべく、ＢがＴＧと反応させられ、その後、その溶液が予め形成されたＡＢ複合体に加えられ、複合体は未反応のＹ基を含み得る。Ｂ−ＳＨを導入することにより、複合体の分子量における制御された増大を、ＡＢ−Ｙ分子上のＢ−ＳＨの被覆を通じて得ることができる。Ｂ−Ｙの投入量およびＹ基の密度について慎重に考察することにより、初期の複合体を、Ｂ−ＳＨの分子と様々に異なる程度にまで反応するように巧みに操作することができる。

幾つかの用途は、比較的低い分子サイズの複合体を必要とすることがある。抗原含有サンプル内への試薬の浸透を必要とする用途（例えば免疫組織化学）は、通常、低分子量複合体の場合に最良に機能する。しかし、抗原が表面（例えば、ウェスタンブロッティング法の場合などのニトロセルロース）に堆積および露出される場合には、大きな分子の複合体であればある程、それだけ高い感度を示し得る。従って、意図的用途の考察が複合体を展開させるための好適な手法を決定する。

チオールをベースとした戦略を用いる免疫複合体の調製においては、任意の未使用のチオールを取り除くため、複合反応の終わりに「ブロッキング」ステップを用いるのが一般的である。幾つかの場合においては、このステップは、実際には必要とならないが、ルーチンとして実施される。本発明において、ＴＧが２−イミノチオランである場合には、カップリングに関与するチオールが２次分子内反応のために自己制御式であることにより、ブロッキングステップが必要になることはまずない。しかし、開環反応は、２次分子内反応による減衰（ｄｅｃａｙ）、または通常のチオールブロッキング戦略によるあらゆる減衰に先行しなければならないため、過剰なＴＧの開環を加速すべく、単純な不活性化ステップが用いられてよい。

複合を休止させ、かつ、ＴＧを不活性化するための最も迅速な方法は、適切な緩衝液中における求核試薬（Ｎｕ）、例えばグリシンを加えることである。不活性化の速度はｐＨ、ならびにＮｕのタイプおよび濃度の関数である。ＴＧを不活性化するために使用される条件はその複合体と適合するものでなければならず、また、好適には、その複合体が使用されることとなる用途とも適合すべきであり、さもなければ、精製ステップが必要になる。このように、ＴＧから放出されたチオールは、分子内的に、またはＢ−ＹもしくはＡＢ−Ｙ上の過剰なＹ基と反応する。従って、Ｎｕの付加は、ＴＧと間接的にＹ基との両方を不活性化することができる。放出されたチオールはＡＢとの共有結合を形成し得るため、Ｎｕの選択は、Ｎｕ由来の望ましくない基（例えば嵩高い置換基）が複合体に導入されないように、慎重に考察する必要がある。しかし、必要な場合には、ＴＧの開環に先立ち、低分子量チオール（例えばメルカプトエタノール）を用いる混合物の処理を実施し、Ｙ基を不活性化することができる。

複合反応は、都合よくは、過剰なＴＧを攻撃すべくＮｕ、例えばグリシンを付加し、また、チオールブロッキング試薬（ＴＢＲ）、例えばＮ−エチルマレイミドなども付加することにより終結させることができ、そのようなチオールブロッキング試薬は、この特定の目的で、生複合体化学において一般的に使用されている。しかし、ＮｕとしてのグリシンおよびＴＢＲとしてのＮ−エチルマレイミドの組み合わせは限定的であることを意味するものではなく、当業者にとっては、多くの他の可能なＮｕ材料およびチオールブロッカーが明らかであろう。

１つの好適な実施形態においては、ＮｕおよびＴＢＲは逐次的に導入される。好適には、ＮｕはＴＢＲの前に加えられる。また、好適には、ＴＢＲは、放出された遊離チオールを上回る僅かに過剰な量で加えられる。遊離チオールのレベルは、例えばＤＴＮＢを用いて決定することができる。チオールのレベルを測定することができない場合においては、ＴＢＲは、ＴＧが遊離チオールの唯一の供給源である場合には、チオールのレベルはＴＧの初期濃度を超えることができないため、ＴＧのその既知のレベルを上回る僅かに過剰な量で加えられる。

１つの実施形態においては、複合混合物は、単にＮｕ（例えば、リン酸塩緩衝液またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ８．０）中における５０ｍＭのグリシン）と接触させられる。場合によって、混合物は、更に、チオールブロッキング試薬（例えばＮ−エチルマレイミド）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、オボアルブミンまたは他のタンパク性成
分；グリセロール）および抗菌性試薬（例えばナトリウムアジド）または他の保存剤が補足されていてよい。複合体は、複合体の性状、ならびに複合体の温度安定性および凍結融解に対する感受性に依存して、４℃で保管されてよく、または小さなアリコートにおいて−２０℃で凍結されてよく、または−２０において液体の形態（即ち、５０％のグリセロールを伴った状態）であってよく、または−７０℃で凍結されてよい。

本発明の１つの応用分野は、免疫付与のための複合体の生成である。有意な数の１次抗体試薬が小さなペプチドに対して調製され、それらの小さなペプチドは、通常、担体タンパク質に複合されている。適切な担体は、マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＢＳＡ、オボアルブミンなどを含む。末端システイン残基を有する化学的に合成されていないペプチド抗原の場合、およびアミンのみを含有する他の小さな分子の場合、本発明は、例えばマレイミド活性化担体にカップリングするためのチオール基のその場での発生を可能にする。ここで、脱塩ステップの回避は、単に手順が一層便利になるという理由だけでなく、低分子量の分子の場合、チオール化後の精製は、しばしば、困難または不可能であるという理由からも、大きな意義を有する。そのような応用分野においては、過剰なＢの存在は問題にならず、担体上のすべてのマレイミド官能基にカップリングさせるべく過剰な新生チオールが存在することを確実化するため、モル表現で、ＢはＡを大幅に上回っていてよい。

生複合体の別の応用分野は抗毒素療法であり、その治療法は、特定の細胞型（例えば、癌性状態の診断的特徴である抗原を発現する細胞）を殺滅することができる物質の抗体媒介送給を必要とする。これらのうちの幾つかの毒素は極めて危険性が高く、治療薬の製造にかかわっている人々に重大な危険をもたらす。本発明の固有の簡潔性が、脱塩カラムまたは透析ステップから危険な液状廃棄物を発生させることなく、強力な毒素を抗体に複合させる機会を提供する。例えば、リシンのサンプルを適切な容器内に収容し、複合手順全体を同じ容器内で実施することができる。この状況においては、その抗体は、好適には、マレイミド活性化されていて、また、毒素が結合されており、それが複合反応でのチオールを放出するためのＴＧによりその場で処理される。

別の用途は、蛍光性アミンを含有した小さな分子を含むＢ分子での標識化に関係する。ほとんどの場合、蛍光染料はＮＨＳ活性化されており、Ａ上のアミンと反応させられる。そのような試薬は水溶液中において非常に不安定であり、乾燥状態で保存されていない場合には急速に劣化する。従って、好適な手法は、しばしば、過剰な試薬を使用し、その後、ＢからＡＢを精製することである。しかし、１つの代替的な手法は、安定したアミン含有発蛍光団を凍結乾燥マレイミド活性化担体と混合し、ＴＧを用いてその場で反応性チオールを発生させることである。このようにすれば、過剰に高度に不安定な発蛍光団は必要でなく、その染料は、保存時に加水分解され得る反応性基を含まない。

本発明の方法は、実証済みのヘテロ２官能性化学を使用して、但し、作業量を増大させ、かつ、その応用を比較的大量に利用可能な成分に限定することとなる面倒な脱塩ステップを伴うことなく、如何にして複合体を生成し得るかを教示する。僅かな量の材料を用いて多数のチオール化実験を実施し、複合体の性能を迅速かつ費用効果的に最適化することができる。本発明において開述されている方法は、それらの方法自体を容易に自動化することができる。例えば、マイクロタイタープレートにおける９６種類の異なるチオール化条件の調査は、現在のロボット技術を利用すれば簡単である。この規模でのチオール化手順の最適化は、脱塩または透析ステップを含んだプロセスでは完全に非現実的である。

本発明の主要な用途の１つは、１次抗体の標識化である。現存する抗体試薬は、直接的な標識化を考察することなく調合されている可能性があるため、数多くの添加剤は抗菌性物質、例えばナトリウムアジドなどを含み、安定剤、例えばＢＳＡまたはグリセロールな
ども存在している。その上、抗体保存用の緩衝剤は、複合反応にとって好適な緩衝剤ではないかもしれない。別の場合においては、抗体は、凍結血清または腹水の粗製サンプルとして提供されている可能性もある。

添加剤、例えばＢＳＡまたは、組織培養プロセスからの物質（例えば、ウシ胎児血清）を含め、動物性流体由来の他のタンパク質などを含んでいるサンプルの場合、その抗体は微量成分であって、選択的に標識するのが困難なことがあり得る。幸いなことに、抗体を精製するための方法が広く知られており、それらの方法は、支持マトリックス上での生体特異的親和性クロマトグラフィを含み、その支持マトリックスには抗原が付着されている。他の適切な方法は、哺乳類のＩｇＧｓのＦｃ領域との相互作用を利用することにより複雑な混合物からＩｇＧを精製するために使用することができる、カップリングされたタンパク質Ａ、タンパク質Ｇなどを有する支持マトリックスを含む。溶出緩衝液は、その後の複合反応を促進することができるように慎重に選択されるべきである。例えば、親和性クロマトグラフィでは、溶出は、しばしば、低いｐＨの緩衝液（例えば、ｐＨ２．３のグリシン）を用いて実行され、これは、適切ではないと考えられ、少なくともその材料が複合混合物に直接的に加えられるべきであった場合には適切でない。もっと好適な他の低いｐＨの緩衝液は、クエン酸塩／クエン酸およびＨＣｌ／ＮａＣｌ混合物をベースとしたものを含む。

ＢＳＡなどの物質を取り除くための別の手法は、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などの樹脂でのクロマトグラフィである。この手法の利点は、抗体が樹脂を通過し、幾分かの抗体に損傷を及ぼしかねない低値のｐＨ処理に晒されないことである。Ｐｉｅｒｃｅからの新製品Ｍｅｌｏｎ（Ｍｅｌｏｎは商標である）ゲルが、最近、商業的に利用できるようになり、このゲルは、どうやら、抗体サンプルから広い範囲のタンパク質を除去するようである。しかし、これらの方法などの減法的方法は、望ましくない低分子量物質を除去しない。

支持マトリックス上の抗原またはタンパク質に結合させることにより興味ある抗体を精製することを含む方法は、すべての望ましくない分子が洗い流されるという利点を有している。おそらくはそれらの成分のうちの一方に損傷を及ぼす危険性があるという理由から、抗体：抗原相互作用を妨害するために低いｐＨでの溶出を利用することができない場合には、代替的な溶出戦略、例えば低張性溶出法（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ）（例えば、Ｇｅｅ ＆ Ｋｅｎｎｙ，ＢｉｏＣｈｅｍ Ｊ．２３０、７５３−７６４、１９８５）などを利用することができる。

様々な応用例を例証してきたが、それらの応用例は、本発明により、一般的には高価であり、かつ、研究者らにとっては少量で利用可能な１次抗体および他の試薬が容易に標識化できるようになることを示している。これは、他の間接的な抗原検出法に優る数多くの利点を有している直接的な検出法の大幅に高められた使用をもたらす可能性が高い。

疑念を回避するため、本明細書で「好適な」、「望ましい」、「都合のよい」、「有利な」などと述べられている特徴は、文脈が別な具合に指示していない限り、本発明において、単独で、またはそのように述べられているいずれか１つ以上の他の特徴と組み合わせて用いられ得ることを、言明する。

次に、例証として、添付図面を参照する以下の実施例において本発明を更に説明する。

<実施例１>
０．５ｍｌの１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中におけるＨＲＰ（５ｍｇ
）（Ｓｉｇｍａ、Ｐ６７８２）（Ｂ）を、スルホ−ＳＭＣＣ（４ｍＭ）（Ｐｉｅｒｃｅ、２２３２２）を用いて２５℃で１時間活性化した。マレイミド活性化ＨＲＰ（「ｍａｌ−ＨＲＰ」）（Ｂ−Ｙ）を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．０３）で平衡化されたＰＤ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で脱塩した。活性化されたタンパク質（２．５ｍｇ／ｍｌ）は、直ちに使用され、または凍結乾燥された後に使用された。

<実施例２>
０．５ｍｌの１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中におけるグルコースオキシダーゼ（５ｍｇ）（Ｂｉｏｚｙｍｅ ＧＯ３Ｂ３）を、スルホ−ＳＭＣＣ（２ｍＭ）を用いて２５℃で３０分間活性化した。マレイミド活性化Ｇｏｘ（ｍａｌ−Ｇｏｘ）を実施例１で説明されているように、脱塩および処理した。

<実施例３>
ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｉ５００６）を、１ｍｇ／ｍｌにおいて、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（５０ｍＭのＴｒｉｓ／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中に溶解し、小さなアリコートにおいて−７０℃で保存した。被覆されたＥＬＩＳＡプレートを調製するため、ＩｇＧを解凍し、ＴＢＳ中において１ｍｌ当たり２０μｇにまで希釈した。Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（透明、９６−ウェル）（コード０７１８３２）を、１つのウェル当たり５０μｌ（１μｇ）のＩｇＧと共にインキュベートした。プレートは、室温で＞１時間被覆され、その後、フォイルでくるまれ、貯蔵用に４℃に移された。被覆されたプレートは１０日以内に使用された。使用する直前に、プレートはＴＢＳ／０．１％のＢＳＡ（ｐＨ８．０）を用いて＞３０分間ブロッキングされた。ＥＬＩＳＡにより複合体を試験するため、２重または３重に複製されたウェルをＴＢＳ／０．１％のＢＳＡ中において適切に希釈された５０μｌの複合体と共にインキュベートした。２５℃で６０分後、プレートをＴＢＳで５回洗った。適切な基質（以下参照）を加え、適切な波長（使用した標識に依存する）において２分または１０分後、Ｖｉｃｔｏｒ３モデル１４２０マルチラベルカウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて吸光度を測定した。ＨＲＰ活性は、１ｍｌの試薬当たり１μｌのＨ_２Ｏ_２を含有する、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中における１ｍＭの２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）基質を用いて測定された。Ｇｏｘ活性は、ＨＲＰ（５０μｇ／ｍｌ）および２ｍＭのＡＢＴＳを含有する、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのグルコース（ｐＨ５．０）を用いるカップリングアッセイシステムにおいて測定された。アルカリ性ホスファターゼ活性は、１ｍＭのＭｇＣｌ_２および０．５ｍＭのＺｎＳＯ_４を含有する、５０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ９．６）中における５ｍＭのリン酸ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰＰ）を用いて測定された。

<実施例４>
凍結乾燥された抗−ウサギＩｇＧ抗体（１ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ Ｒ２００４）（「Ａｂ１」）を１ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ中に再懸濁させ、４℃で保存した。１．２ｍＭのＨＣｌ中における２−イミノチオラン（２ＩＴ）の以下のストックを調製した：１０００ｍＭ、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭおよび０．０１ｍＭ。Ａｂ１（Ａ）、ｍａｌ−ＨＲＰ（Ｂ−Ｙ）（実施例１で説明されているとおりにして調製されたもの）および緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を１：１：２の比で混ぜ合わせ、２０μｌに小分けした部分を１．５ｍｌ用のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに分注した。それらのチューブは、２００ｍＭ（Ｃ７）、２０ｍＭ（Ｃ８）、２ｍＭ（Ｃ９）、０．２ｍＭ（Ｃ１０）、０．０２ｍＭ（Ｃ１１）および０．００２ｍＭ（Ｃ１２）の最終的な２ＩＴ濃度を与えるべく、５μｌの２ＩＴ（ＴＧ）を受け入れた。対照チューブ（ｎｅｇ）は、２ＩＴの代わりに１．２ｍＭのＨＣｌを受け入れた。「Ｐｏｓ」は、１／１０００に希釈された陽性対照抗体である（Ｓｉｇｍａ Ａ６６６７）。９０
分後、サンプルＣ７からＣ１２をＴＢＳ／０．１％のＢＳＡで希釈し、（不希釈Ａｂ１に関して）１／２００の希釈度で、実施例３の手順を用いてＥＬＩＳＡにより試験した。結果が図１に示されている。

図１から分かるように、吸光度対２ＩＴ濃度との間にはベル形の依存性がある。２ＩＴの低濃度域におけるこの影響は、おそらく、効率的な複合を可能にするＡｂ１のチオールが不充分であったことにより説明付けられる。高濃度域におけるこの影響は、他の説明付けも可能であるが、おそらく、リジン基の過剰な修飾によるＡｂ１の損傷によって説明付けられる。例えば、商業的に入手可能な２ＩＴは小さな比率の遊離チオールで汚染されており、これらの遊離チオールは、２ＩＴの高濃度域において、ｍａｌ−ＨＲＰとの反応に対して、チオール化されたＡｂ１と競合することになる。２ＩＴが不在（ｎｅｇ）の場合、僅かな吸光度しかない。対照ウェルでの吸光度値は、Ｃ７での場合（〜０．２５）を除き、低かった（＜０．１）。（抗原が被覆されていない）対照ウェルで得られたデータを抗原被覆ウェルで得られたデータから差し引くことにより、図１に示されている値が与えられた。この実験は、２ＩＴ、Ａｂ１およびおｍａｌ−ＨＲＰを単一のチューブ内において混ぜ合わせ、活性な複合体を発生させることが可能であることを示している。

<実施例５>
ｐＨを様々に変えることにより複合効率に及ぼされる影響を、様々な割合で０．２ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４および０．２ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４を混合することにより調製された一連のリン酸塩緩衝液を用いて調べた：１０：０（緩衝液Ｐ１、ｐＨ９．２９）；９：１（緩衝液Ｐ２、ｐＨ７．７２）；４：１（緩衝液Ｐ３、ｐＨ７．３８）；７：３（緩衝液Ｐ４、ｐＨ７．１４）；３：２（緩衝液Ｐ５、ｐＨ６．９４）；１：１（緩衝液Ｐ６、ｐＨ６．７５）；２：３（緩衝液Ｐ７、ｐＨ６．５８）；３：７（緩衝液Ｐ８、ｐＨ６．３９）；１：４（緩衝液Ｐ９、ｐＨ６．１２）；１：９（緩衝液Ｐ１０、ｐＨ５．８１）；０：１０（緩衝液Ｐ１１、ｐＨ４．２９）。Ａｂ１（実施例４で説明されているように、調製されたもの）およびｍａｌ−ＨＲＰ（２．５ｍｇ／ｍｌ）（実施例１から；水で再構成された凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ））を１：１で混合し、２０μｌのアリコートをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに分注した。その後、各チューブは、緩衝液（Ｐ１からＰ１１のうちの１つ）（２０μｌ）を受け入れ、続いて１０μｌの５ｍＭのＴＧ（即ち、１ｍＭの最終濃度）を受け入れた。６０分後、９５０μｌのＴＢＳ／０．１％のＢＳＡ（ｐＨ８．０）を加え、それらのサンプルをウサギＩｇＧ−被覆プレート（実施例３参照）を用いてＥＬＩＳＡにより分析した。その結果が図２に示されている。

図２から分かるように、広範囲の様々な条件の下で活性な複合体を生成することができたが、ｐＨが極端な場合にのみ、その反応はどちらかといえば非効率的であった。興味深いことに、最適なｐＨ（〜７）は、実質的に、２ＩＴを用いる生体分子のチオール化で典型的に使用されるｐＨ以下であった。現在、一般的には、アミンを脱プロトン化し、かつ、２ＩＴとの反応速度を増大させる傾向がある、８．０以上のｐＨが使用されている。しかし、マレイミド活性化生体分子の存在下における２ＩＴでのその場でのチオール化の場合、これらの条件は明らかに最適ではなかった。これは、比較的高いｐＨ値におけるｍａｌ−ＨＲＰ上に存在するマレイミド官能基の加水分解の増大および／または２ＩＴの加水分解の増大により説明付けすることができよう。これらのプロセスはどちらも、ｍａｌ−ＨＲＰとチオール化Ａｂ１との間の複合反応の効率を低減させることになる。

<実施例６>
ｐＨを様々に変えることによりｍａｌ−ＧＯＸを用いる複合効率に及ぼされる影響を、サンプルの量が半分であったことと、反応が９７５μｌのＴＢＳ／０．１％のＢＳＡを加えることにより停止させられた点を除き、実施例５で説明されているように、調べた。サンプルは、ウサギＩｇＧ−被覆プレート（実施例３）を用いてＥＬＩＳＡにより分析され
た。その結果が図３に示されている。

図から分かるように、Ａｂ１とＧｏｘとを複合させるためのｐＨの最適状態は、ＨＲＰ標識（実施例５）でみられたのと同様であった。

<実施例７>
ｐＨ値を７．４に固定した状態で緩衝液の種類を様々に変えることによる影響について調べた。緩衝液（２００ｍＭ）およびＡｂ１を１：１で混合し、１０μｌのアリコートをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに分注し、続いて、５μｌの２．５ｍｇ／ｍｌのｍａｌ−ＨＲＰ（実施例１）および５μｌの５ｍＭの２ＩＴを分注した。対照の反応は、２ＩＴの代わりに１．２ｍＭのＨＣｌを用いて開始された。各緩衝液（Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳまたはリン酸ナトリウム）の最終濃度は５０ｍＭであった。その結果が図４に示されている。

図４から分かるように、リン酸塩またはＨＥＰＥＳ緩衝液のいずれかの存在下における複合は、ＥＬＩＳＡによる同様な性能を示す複合体をもたらした。２ＩＴを４０倍のモル過剰のＴｒｉｓを使用したにもかかわらず、Ｔｒｉｓの存在下において調製された複合体に対する吸光度値は、〜２のファクター（ｆａｃｔｏｒ）だけ低減した。２ＩＴを省いた場合には、低い吸光度値が見られた。別に行われた類似の実験において、ＭＯＰＳ緩衝液中においてｐＨ７．０で調製された複合体は、同じｐＨにおいてリン酸ナトリウム緩衝液を用いて調製された複合体と同様なＥＬＩＳＡの結果を与えた（図示せず）。従って、複合反応は、アミン官能基を含んでいない幾つかの緩衝液中において実行されてよく、Ｔｒｉｓの存在下においてさえ限られた性能の低下を伴って実施することができる。Ｔｒｉｓのこの影響は、おそらく、２ＩＴのアミン誘発開環（実施例８参照）および発生された遊離チオールとチオール化Ａｂ１との間でのｍａｌ−ＨＲＰに対する競合により説明付けられる。

<実施例８>
２ＩＴからのチオールの放出に及ぼすｐＨの影響を、一連のリン酸塩緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液を用いて調査した。９０μｌの各緩衝液のサンプルを１０μｌの１００ｍＭの２ＩＴと混合し、複製したアリコート（２０μｌ）を透明なマイクロプレート内において２５℃で４５分間インキュベートした。２００μｌのＤＴＮＢ（２００ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中における８０μｇ／ｍｌのストックから）を加え、１分後、プレートをＡ_４０５で読み取った。結果が図５に示されている。

図５から分かるように、リン酸塩緩衝液の場合、チオールの放出はｐＨが上昇するに連れて一層顕著になり、これは、２ＩＴの加水分解によるものと考えることができる。現在、２ＩＴによる生体分子のチオール化では、しばしば、ｐＨ８以上のｐＨ値が使用されている。低いｐＨにおいて、２ＩＴは非常に安定している。ｐＨ値がある値に固定されている場合には、チオールの生成速度は、リン酸塩の存在下における場合と比べ、Ｔｒｉｓの存在下の場合の方が高く、これは、Ｔｒｉｓの存在下における複合効率の低減を示した実施例７の結果と一致する。

<実施例９>
リン酸塩緩衝液中における複合体形成の速度を３つの異なるｐＨ値で調べた。５０μｌの反応物は、１０μｌのＡｂ１（実施例４）、２０μｌの緩衝液、１０μｌのｍａｌ−ＨＲＰ（実施例１）（２．５ｍｇ／ｍｌ）および１０μｌの１ｍＭの２ＩＴを含んだ。特定の時点（５分、２０分、６０分および２時間）で５μｌのサンプルを回収し、ＴＢＳ／０．１％のＢＳＡ中において１／２００に希釈した後、ウサギＩｇＧ被覆プレート（実施例３）を用いるＥＬＩＳＡにより試験した。結果が図６に示されている。

図６から分かるように、複合体の生成速度はｐＨ依存性である。ｐＨ６．３９におけるインキュベーションおよびｐＨ７．１４におけるインキュベーションで、それぞれ、最初の４時間および最初の２時間にわたり、時間の経過に伴う吸光度の着実な増大が観測されている。吸光度の初期増大速度はｐＨ８．１５の場合が最大であるが、その速度は２０分後に遅速化し、１時間後には、ｐＨ７．１４におけるインキュベーションでの吸光度値がｐＨ８．１５におけるインキュベーションの吸光度値を追い越している。最終的に、低いｐＨにおけるインキュベーションでの吸光度値もｐＨ８．１５におけるインキュベーションでの吸光度値を上回っている（データ図示せず）。

<実施例１０>
ＨＲＰ（２．５ｍｇ／ｍｌ）と緩衝液（Ｐ４；実施例５）（サンプル１から４）またはＡｂ１（実施例４）とＰ４緩衝液（サンプル９から６）を混合（１：１）し、１０μｌの小分けした部分を、時間０分（この時点で、いずれかの抵抗性（ｏｕｔｓｔａｎｄｉｎｇ）材料（Ａｂ１またはｍａｌ−ＨＲＰのどちらか）が加えられた）に関して相対的に−３０分、−１５分、−５分および−１分の時点における２ＩＴの互い違い（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）付加による５μｌの２ＩＴ（１ｍＭ）と混合した。これは、この実験の半分において、ｍａｌ−ＨＲＰの付加に先立つチオール化Ａｂ１の形成を可能にし、この実験のもう一方の半分において、Ａｂ１の導入に先立つｍａｌ−ＨＲＰの潜在的な重合を可能にした。参照サンプル（チューブ５）は、時間０分において、Ａｂ１およびＨＲＰを２ＩＴに同時に加えることにより作成された。更に６０分のインキュベーションの後、９７５μｌのＴＢＳ／０．１％のＢＳＡを加え、サンプルを、ウサギＩｇＧ被覆プレート（実施例３）を用いるＥＬＩＳＡにより試験した。結果が図７に示されている。

図７から分かるように、複合体は、必ずしも物理的には同一ではないにもかかわらず、すべてがＥＬＩＳＡによる非常に似通った吸光度値を与え、これは、この特定の実験においては、付加の順序が臨界的ではないことを示唆している。重要なことに、負の影響を伴うことなく、有意な時間の間、ｍａｌ−ＨＲＰおよび２ＩＴを混ぜ合わせられるこの能力は、単純な１段階複合手順を可能にするため、これら２つが容易に混合および凍結乾燥され得ることを示唆しており、１段階複合手順においては、標識化されるべき分子の溶液が凍結乾燥された混合物を再構成するために使用される。

<実施例１１>（ＥＤＢＡ修飾およびエタノールアミン修飾酵素の調製）
１６０μｌの過ヨウ素酸ナトリウム（０．１Ｍ）を２ｍｌのＨＲＰ（０．１Ｍのリン酸Ｎａ（ｐＨ７．２）中において１２．５ｍｇ／ｍｌ）に加え、暗所において、２５℃で２５分間インキュベートした。結果として生じたアルデヒド−ＨＲＰをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５で脱塩して過剰な過ヨウ素酸塩を除去し、０．５Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．２）中における２，２’（エチレンジオキシ）ビス−エチルアミン（１ｖｏｌ％の「ＥＤＢＡ」最終濃度）と反応させた。室温で１時間後、シッフ塩基を安定化させるため、（５Ｍストックからの）５０ｍＭにシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。更に１時間後、そのＥＤＢＡ修飾ＨＲＰサンプルを０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中に脱塩し、５ｍｇ／ｍｌに調整した。

また、ＨＲＰの小分けした部分を、本質的に同じ手順を用いて、エタノールアミン（アミンではなく、末端ヒドロキシルを発生させる）でも修飾し、対照材料、ＯＬＡ−ＨＲＰを生成した。典型的には、ＥＤＢＡ修飾ＨＲＰおよびＯＬＡ修飾ＨＲＰは、それぞれ、１３個および２個のＴＮＢＳ反応性アミンを含んだ（即ち、ｎの値が、それぞれ、１３および２であるＢ−Ｙ_ｎ分子がもたらされた）。グルコースオキシダーゼ（Ｇｏｘ）の類似の誘導体が同じ手順を用いて調製された。

ＥＤＢＡ修飾ＨＲＰおよびＯＬＡ修飾ＨＲＰ（５ｍｇ／ｍｌ）を、（実施例１で説明さ
れている如く）４ｍＭのスルホ−ＳＭＣＣを用いてマレイミド活性化し、それぞれ、ｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰおよびｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰを発生させた。サンプルを弱い緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中に脱塩し、もっと濃縮された緩衝溶液を付加することによる以降のｐＨ調節を容易化した。

幾つかの実験において、４ｍＭのヨード酢酸スクシンイミジルエステルを用いて、ＥＤＢＡ−ＨＲＰで類似の活性化反応を実施し、マレイミド官能基ではなくヨードアセチルをＨＲＰに導入した。

<実施例１２>（複合反応におけるｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰとｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰとの比較）
ｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰ（ＥＤＢＡ−ＨＲＰの２つの異なるバッチから調製）およびｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰ（実施例１１から）（１０μｌ；２５μｇ）をそれぞれ２μｌの５ｍｇ／ｍｌのヤギ抗−ウサギＩｇＧ（２００ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中における）および１．３μｌの８ｍＭのＴＧ１と複合させた。２５℃で４時間後、サンプルをＴＢＳ／０．１％のＢＳＡで１ｍｌに希釈し、そこから段階希釈液を調製し、ウサギＩｇＧ被覆プレートまたは対照プレート（ウサギＩｇＧなし）のいずれかを用いてＥＬＩＳＡで試験した。結果が図８に示されている。

ｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰから導出された複合体に対する滴定曲線は１／１０，０００の希釈度における１．５過剰でのＯＤ値と互いに非常に似通っていた。それとは対照的に、ｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰを用いて調製された複合体は、同様な吸光度値を達成するのに〜１０倍高い濃度を必要とした。対照プレート（即ち、抗原なし）でのデータが互いに重ね合わされており、試験された希釈度の全範囲にわたってベースライン読み取り値を示している。従って、マレイミド活性化に先立ってもっと多くのアミン官能基を導入するこの戦略は、ＥＬＩＳＡにおける複合体の性能を有意に増強する。

<実施例１３>（ｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰを用いる複合でのｐＨ最適条件の評価）
上で説明されているように、調製されたｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰ（１０μｌ）を、５μｌの２ｍｇ／ｍｌのヤギ抗−ウサギＩｇＧ（２０ｍＭのリン酸Ｎａ／１５０ｍＭのＮａＣｌ）、２μｌのＴＧ１（８ｍＭ）および３μｌの以下の１Ｍ緩衝液のうちの１つ：ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）、ＭＯＰＳ（ｐＨ７）、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）またはＥＰＰＳ（ｐＨ８）と混合した。２５℃で一晩インキュベーション後、段階希釈液を調製し、ウサギＩｇＧ被覆プレートまたは対照プレート（ウサギＩｇＧなし）のいずれかを用いてＥＬＩＳＡで試験した。結果が図９に示されている。

ｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰ（ｐＨ６．５から７．５）を用いる反応において、非常に広いｐＨ最適条件が観測され、ｐＨ７で調製された複合体が、ｐＨ６．５またはｐＨ７．５のいずれかで調製された複合体よりも僅かに辛うじて優れていた。従って、余分なマレイミド官能基の付加は、非ジアミン処理ＨＲＰを用いて実施された反応と比較して、それらの複合反応をｐＨの変化に対して一層頑強にする効果を有している（実施例５を比較参照のこと）。

<実施例１４>（複合反応におけるｍａｌ−ＥＤＢＡ−Ｇｏｘおよびｍａｌ−ＯＬＡ−Ｇｏｘの比較）
複合体の性能を増強することにおけるＥＤＢＡ処理の適切性が、生来、ＨＲＰよりももっと利用可能なアミンであるグルコースオキシダーゼを用いて更に例証される。とは言うものの、ＥＤＢＡ処理と組み合わせた過ヨウ素酸塩酸化は、アミンではなくヒドロキシルが付け加えられている対照複合体（エタノールアミンで処理されたもの）よりも実質的に良好な複合体をもたらす。

実施例１１および１２で説明されているように、ＥＤＢＡ−Ｇｏｘ−Ｉｇ複合体およびＯＬＡ−Ｇｏｘ−Ｉｇ複合体を調製し、ＥＬＩＳＡで試験した。それらの結果が図１０に表わされている。

<実施例１５>（ヨードアセチル−ＨＲＰを用いる複合反応）
ヨードアセチル−ＥＤＢＡ−ＨＲＰ（実施例１１で説明されているように、調製）（１０μｌ；２５μｇ）を２μｌの５ｍｇ／ｍｌのヤギ抗−ウサギＩｇＧ（２００ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中における）および１．３μｌの８ｍＭのＴＧ１と複合させた。暗所において２５℃で一晩（〜１６時間）インキュベーションした後、複合体をＴＢＳ／０．１％のＢＳＡで１ｍｌに希釈し、そこから段階希釈液を調製し、ウサギＩｇＧ被覆プレートまたは対照プレート（ウサギＩｇＧなし）のいずれかを用いてＥＬＩＳＡで試験した。結果が図１１に示されている。

これは、本発明の方法が、マレイミドにより例証される如き求電子付加型反応に限定されるものではなく、ハロアセチル誘導体を用いる置換反応をも含むことを示している。

<実施例１６>（Ａｂ：酵素の比率を変えることによる影響）
ｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰまたはｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰ（１０μｌ；２５μｇ）のいずれかを、１０μｌの様々な濃度（２００ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中における）のヤギおよびウサギＩｇＧ、ならびに２μｌのＴＧ１（８ｍＭ）と混合した。２５℃で４時間のインキュベーションの後、サンプルを１ｍｌ当たり２５０ｎｇの抗体濃度に希釈し、ウサギＩｇＧ被覆プレートまたは対照プレート（ウサギＩｇＧなし）のいずれかを用いてＥＬＩＳＡで試験した。結果が図１２に表わされている。

図１２から分かるように、すべての抗体：ＨＲＰ比率において、ｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰを用いて調製された複合体は、ｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰを用いて調製された複合体よりもずっと高い吸光度値を示している。これらの吸光度値は、抗体とＨＲＰとの比率が高い場合には僅かに低くなり、これは、おそらく、付着されるＨＲＰ分子の数が１つの抗体分子当たり２個を超えることができず（２：１の重量比＝〜１：２のモル比）、一方、抗体とＨＲＰとの比率がもっと低い場合には、もっと高い個数が付着され得るためである。従って、組織内への浸透が必要となる用途（例えば、免疫組織化学の場合など）では有利であり得る低分子量の複合体は、比較的高い抗体：ＨＲＰ比にとって好都合である。

図１２から、ｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰとＡｂとの比率を（各反応における抗体の量を減らすことにより）増大させても、複合体の性能にささやかな影響しかないことは明らかである。ｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰが実質的に過剰（重量で１６：１；〜６４：１のモル比）な場合においてさえ、その複合効率は決してｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰで観測された複合効率には及ばない。あらゆる固定のＡｂ−ＨＲＰ比におけるチオール化抗体の生成速度が両タイプのＨＲＰと同じであるため、幾つかの他のプロセスが、過剰なｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰの場合における複合効率を制限するように作用しているに違いない。Ｂ−Ｙと反応するＡのもっと一般的な場合について考察すれば、ＴＧ１はＡ上のアミンと反応してＡ−ＳＨを発生させる。また、ＴＧ１は、競合加水分解反応（この反応は、ｐＨが高くなるに連れて、特にｐＨ７以上でますます速くなる）において水とも反応し、望ましくない遊離チオールを発生させる。

図１２において、大量に過剰なｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰは、明らかに次善の性能を示す複合体を与えているため、すべてのＡｂ−ＮＨ_２の分子がＡｂ−ＳＨに変換される前に、望ましくない遊離チオールの濃度が臨界点（即ち、複合効率が劣質化される）に達しているに違いない。本実施例では、チオール発生剤（ＴＧ）の濃度は８００μＭである。アミ
ン反応物の濃度は〜６μＭ（即ち、１ｍｇ／ｍｌの抗体に対して）であり、効果的には６０μＭのアミン（約１０個のリジンがＴＧと反応することができるものと仮定して）である。ｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰの場合においては、マレイミド官能基の濃度はＳＭＣＣ処理前の初期アミン含有量よりも何ら大きくなり得ず、従って、〜５０から１００μＭより大きくない。アミンは、生理学的ｐＨ値において、水分子よりも求核性は高いが、典型的な複合反応においては、反応物および溶媒（即ち、水）の濃度が好適ではない。

従って、ＨＲＰとＡｂとの比を単に増大させるだけでは、望ましくない競合反応を克服するのに充分ではない。その複合反応におけるＡ−ＳＨの生成よりももっと急速な遊離チオールの放出（即ち、ＴＧの加水分解）に対処するのに充分なマレイミドが存在していなければならない。Ａ上のアミンは水分子のヒドロキシル基よりも反応性は高いが、非常に高濃度の水（５５Ｍ）はＴＧを攻撃するのに利用可能である。これは、多価のＨＲＰが特に効果的である理由を明確に示しており、多価のＨＲＰは、２〜３時間の複合反応の間中ずっと発生される不所望のチオールと反応することができ、更にその上、Ａ−ＳＨとも反応することができるためである。

<実施例１７>
必要な場合に複合反応を休止させるために使用され得る潜在的なクエンチ剤として種々のアミンを調査するため、本発明者らは、標準的なＤＴＮＢアッセイを用いて、２ＩＴからのチオール放出を調べた。グリシン、エタノールアミンまたは１，３−ジアミノプロパン（ＤＡＰ）の５ｍＭの溶液を１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中において調製した。各緩衝液の９８０μｌのアリコートを１．２ｍＭのＨＣｌ中における２０μｌの１００ｍＭの２ＩＴと混合した。新たに調製されたＤＴＮＢ試薬（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中における２００μｌの８０μｇ／ｍｌの溶液）を、あるタイムコースにわたって、各反応混合物の２０μｌのアリコートに加えた。ＤＴＮＢを付加してから１分以内にサンプルを読み取った。結果が図１３に示されている。

選択されたアミン、エタノールアミン、グリシンおよびＤＡＰは、それぞれ、中性、酸性および塩基性の基を付加的に含んでいる。図１４に示されているデータは、潜在的に、２つの対立する経路：（ｉ）２ＩＴからのチオール放出；および（ｉｉ）放出されたチオールの分子内反応の正味の影響を表していることに留意することが重要である。これは、特に、チオールの量が１時間後に低下し始めるグリシンの場合に当てはまる。最も高い「見掛け」速度はＤＡＰの場合であるが、グリシンまたはエタノールアミンと比べたそれの余分なアミン官能基にもかかわらず、これは、より大量のチオール放出（実施例１８参照）を説明するものではなく、むしろ、分子内反応の遅速化を説明するものと思われ、その分子内反応の遅速化は、おそらく、最初の開環反応の生成物に導入される余分な正電荷と結び付いている。

<実施例１８>
潜在的な失活剤を用いた場合の初期チオール放出速度についてのより良い認識を得るため、実施例１７の実験が、放出された任意のチオールをＤＴＮＢとの反応により即座に「捕捉」することができるように変更された。ｐＨ８でＤＴＮＢ反応を測定する必要があるため、実施例１７と同じｐＨを使用することは不可能であったが、同じ３種類のアミンについて調べた。ＤＴＮＢ（８０μｇ／ｍｌ）を０．２Ｍのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中において新たに調製し、透明な９６−ウェルプレート内に分注した（１つのウェル当たり２００μｌ）。２０μｌの１００ｍＭの２ＩＴを加え、自動プレート循環機能を用い、２分毎にＡ_４０５で吸光度を読み取った。結果が図１４に示されている。

図１４から分かるように、これら３種類のアミンは、グリシンが最も速いが、非常に似通った速度でのチオールの放出を誘発する。グリシンは、チオールの消散をもたらす比較的速い分子内反応をも支持しているように思われるため（実施例１７）、これら３種類のアミンの中で、複合反応を休止させることに関して最も有望である。生体分子のチオール化で通常使用される条件（即ち、この実験における対照反応）下における有意なチオールの放出も明らかである。

<実施例１９>
凍結乾燥は、タンパク質をベースとした製品を安定化させ、かつ、貯蔵寿命を延ばすため、広く用いられている。活性成分の安定化を助けるためにしばしば使用される賦形剤は、それの主要な機能が凍結ステップ中の保護をもたらすことである凍結保護剤、およびそれの機能が凍結乾燥中および／または保管中の劣質化を防止することである溶解保護剤を含む。任意の新しいサンプルに対する凍結乾燥のための最良の調合物は経験によってのみ決定され得る。本発明者らの知る限りにおいては、ＴＧの凍結乾燥またはＢ−Ｙ分子の存在下におけるＴＧの凍結乾燥に関する先例は存在しない。ＴＧおよびＢ−Ｙの混合物の凍結乾燥は、Ｙ官能基（例えばマレイミド）、ＴＧ（例えば２−ＩＴ）およびＢの生物学的活性（例えばＨＲＰ、アルカリ性ホスファターゼ）を安定化させるための単一調合物の開発を必要とする。明らかなことに、１つの活性成分に有意な損傷が存在する場合には、たとえそれ以外の成分が満足に保存されていたとしても、あらゆるそれ以降の複合反応は劣質化することになるであろう。

組成およびｐＨを様々に変えた様々な緩衝液を用いた当初の実験において、凍結乾燥中における２−ＩＴ（単独）の望ましくない開環の程度が、ＤＴＮＢ試薬を用いて、凍結乾燥された材料の遊離チオール含有量を測定することにより評価された。遊離チオールの放出は、凍結乾燥する前の溶液のｐＨに依存性であるように思われた。希塩酸（１．２ｍＭ〜１２ｍＭ）、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＜６．５）および２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を含む酸性溶液は、凍結乾燥された材料に低い含有量の遊離チオールをもたらし、これは、先に記された、低いｐＨで２−ＩＴの高い溶液安定性（実施例８）と一致する。複合反応で一般的に使用されてきた緩衝液（即ち、リン酸塩、ＮａＣｌおよびＥＤＴＡの中性または僅かに塩基性の溶液に基づく緩衝液）は、ｐＨ＞６．５の他の緩衝液がそうであったのと同様に、凍結乾燥における２−ＩＴの比較的乏しい安定剤であった。

凍結乾燥された２−ＩＴサンプルをＤＴＮＢ試薬と共に数時間インキュベートしたままの状態に放置したときに、予想外のことが観測された。通常であれば、２−ＩＴはＤＴＮＢ反応（ｐＨ８）で使用されるｐＨにおいては不安定であるため、時間依存性のチオールの放出が存在し、従って、バックグラウンド信号の上昇が存在する。酢酸ナトリウム中における２−ＩＴの明らかな安定化（即ち、自由乾燥（ｆｒｅｅ−ｄｒｙｉｎｇ）後のチオールの不在）にもかかわらず、期待されたバックグラウンド信号の時間依存性の増大はほとんど存在しなかった。この観測結果は、ＤＴＮＢとチオールとの反応に及ぼす酢酸塩のどんな直接的な阻害作用によっても説明できなかった。チオール基の放出を防いだこの推定されるＴＧ１の化学変換についてはそれ以上調べなかったが、非反応性チオエーテルの形成をもたらすＴＧ１に対する他の条件（ｐ４参照）下において観測される２次反応と同様なものであり得る。４ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）の存在下において凍結乾燥されたｍａｌ−ＨＲＰ／ＴＧ１混合物を用いて調製された複合体は、ＥＬＩＳＡにおいて、５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）の存在下において凍結乾燥された場合よりもはるかに強い信号を与えた。総合すれば、これらの結果は、凍結乾燥中にＴＧ１を安定化させるため（従って、僅かにアルカリ性のｐＨでその後に実施される効率的な複合体形成のため）には低いｐＨが必要であるが、低いｐＨだけでは、ＴＧ１の完全性を保持するのに充分ではないことを示している。

本発明の１つの好適な実施形態においては、Ｂ−Ｙ／ＴＧ１の混合物を凍結乾燥するための緩衝液はリン酸ナトリウムを含む。その緩衝液のｐＨは、好適には６．５以下であり、より好適には６．０以下である。

生複合反応に最適な条件をもたらすために、Ａの緩衝液での再構成時には凍結乾燥混合物のｐＨを高くする必要があるため、弱く緩衝された凍結乾燥混合物が好適である。好適には、緩衝液の濃度は２００ｍＭ以下であり、より好適には５０ｍＭ以下、最も好適には２０ｍＭ以下である。

本発明の１つの好適な実施形態においては、凍結乾燥されたＴＧ／Ｂ−Ｙ／リン酸塩緩衝液は、ポリオール、例えば糖もしくはデキストランなど、または種々のポリオールの組み合わせも含んでいる。最も好適には、ポリオールはトレハロースである。トレハロースの濃度は、好適には＞１％であり、最も好適には約５％（ｗ／ｖ）である。

Ｂ−ＹがＨＲＰまたはアルカリ性ホスファターゼのいずれかである１つの特に好適な実施形態においては、混合物は、１つまたは複数の金属イオンも含んでいる。１つの特に好適な実施形態においては、金属イオンはＣａ^２＋またはＭｇ^２＋（典型的にはＭｇＣｌ_２として加えられる）であり、好適には１〜１０ｍＭの範囲、望ましくは約５ｍＭのＭｇ^２＋である。

<実施例１９．１> ２−ＩＴを有するマレイミド活性化酵素の凍結乾燥
５ｍＭのＴｒｉｓ／５ｍＭのＭｇＣｌ_２／０．１ｍＭのＺｎＣｌ_２（ｐＨ７．０）中におけるアルカリ性ホスファターゼ（１６．２ｍｇ／ｍｌ：ＢｉｏｚｙｍｅコードＡＬＰ１１２Ｇ）を０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）を用いて５ｍｇ／ｍｌに希釈し、４ｍＭのスルホ−ＳＭＣＣを用いて２５℃で１時間活性化した。この後、サンプルを１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）中に脱塩することにより、３．１２５ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。２．必要に応じて賦形剤を加え、最後に、典型的には４００μＭまたは８００μＭの濃度で２−ＩＴを加えた。凍結乾燥する前の酵素の最終的な濃度は２．５ｍｇ／ｍｌであった。サンプルを、ポリプロピレン製チューブまたはガラス製バイアルに入った液体窒素中において急速に凍らせた後、２４時間サイクルを用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＥＳ凍結乾燥器内において凍結乾燥させた。ステップ１：−４０℃の棚温度で１３２０分間；ステップ２：−１０℃の棚温度で６０分間；およびステップ３：＋２０℃の棚温度で６０分間。凍結乾燥後、サンプルは、−２０℃または３７℃のいずれかで数日間貯蔵された。

実施例１１の場合のように、ＥＤＢＡ修飾ＨＲＰを調製し、上で説明されている如くにしてＳＭＣＣで活性化した。サンプルを、上で説明されているように、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）中に脱塩し、更に、アルカリ性ホスファターゼに関して説明されているように、凍結乾燥用に調製した。

<実施例２０> 凍結乾燥されたｍａｌ−ＨＲＰ／２−ＩＴ混合物の安定性
マレイミド活性化ＥＤＢＡ修飾ＨＲＰを（実施例１９において上で説明されている如く）ｐＨ５．８の緩衝液中に脱塩し、ＴＧ１を加えて最終濃度を８００μＭにした後、４０μｌ（１００μｇのＨＲＰ）の小分けした部分を凍結乾燥した。２０ｍＭのリン酸ナトリウム／１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）中における３２０μｌの１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体に３２μｌの２ＭのＨｅｐｅｓ／１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２５）を補給した。１００μｌのこの材料を用いて各バイアルの凍結乾燥混合物を再構成した。２５℃で、一晩、複合が進められ、結果として生じた複合体が、実施例３で説明されているように、調製されたマウスＩｇＧ被覆プレートでのＥＬＩＳＡにより試験された。

結果が図１５に示される。図１５は、対数目盛の複合体の希釈度に対する（任意単位における）４０５ｎｍでの吸光度のグラフである。このグラフは、複合に先立ち、−２０℃（黒塗りの円形）、２５℃（白抜きの円形）または３７℃（黒塗りの四角形）において一晩インキュベートされた凍結乾燥混合物を用いる、この実施例で説明されているとおりにして調製された複合体の滴定を示している。

図から分かるように、凍結乾燥混合物が増大する温度にさらされると、結果として生じる複合体の性能の著しい損失がある。１／１０，０００の希釈度において、３７℃で一晩貯蔵された混合物を用いて調製された複合体に対する吸光度信号は、−２０℃で貯蔵された混合物を用いて調製された複合体に対する吸光度信号の〜２０％であり、また、１．０の吸光度を与えるのに必要な複合体の希釈度は１桁（ａｎ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）シフトする。

<実施例２１．>凍結乾燥されたｍａｌ−酵素／２−ＩＴの安定化
糖類は、しばしば、凍結乾燥および／または貯蔵中のタンパク質を安定化させるのに役立ち、３７℃でマレイミド−ＥＤＢＡ−ＨＲＰ／ＴＧおよびマレイミド−アルカリ性ホスファターゼ／ＴＧの凍結乾燥混合物へのトレハロースの包含は、（混合物から調製された複合体のＥＬＩＳＡにおける性能によって測定したときに）糖を含んでいないサンプルに比べて安定性を有意に高めた（以下の表および実施例２０を参照のこと）。アルカリ性ホスファターゼは、一般的に、Ｍｇ^２＋およびＺｎ^２＋イオンの存在下において分析されるため、本発明者らは、金属イオンが、凍結乾燥または貯蔵中のこの酵素を安定化させる上で更に役立っていたのかもしれないという可能性について考察した。しかし、金属イオンは、凍結乾燥中に他の成分（例えば、２−ＩＴ）に及ぼす損傷効果を有している可能性があり、またはその後の複合反応を妨害する心配があるため、本発明者らは、アルカリ性ホスファターゼよりも安上がりのＨＲＰを用いて幾つかの初期試験を実施した。

１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）中におけるマレイミド活性化ＥＤＢＡ修飾ＨＲＰ、これに加えて５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、金属イオン（以下に記されているとおり）および２−ＩＴ（４００μＭ）を含有する凍結乾燥混合物を、実施例１９で説明されているように、調製した。混合物は、複合に先立ち、３７℃で貯蔵された。驚いたことに、５ｍＭのＭｇＣｌ_２（ＨＲＰの活性にとっては必要でない）が混ぜられ、その後に凍結乾燥されたＨＲＰサンプルの場合、混合物を用いて調製されたヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ複合体のＥＬＩＳＡにおける性能によって判定したときに、また、実施例３で説明されているように、試験したときに、この凍結乾燥混合物の３７℃で安定性が著しく改善された。トレハロース／２−ＩＴ／マレイミド−アルカリ性ホスファターゼ混合物を用いたその後の研究において、本発明者らは、ＭｇＣｌ_２が、高温での貯蔵中におけるアルカリ性ホスファターゼに及ぼす保護作用を有しているだけではなく、凍結保護作用も有していることを見出した。これらの結果および他の金属イオンでの結果が以下の表にまとめられている。

ＥＬＩＳＡでの複合体の性能によって測定したときの、３７℃でｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰ／２−ＩＴおよびｍａｌ−アルカリ性ホスファターゼ／２−ＩＴ混合物の安定化

凍結乾燥混合物は、３７℃で６日間（ＨＲＰ）または５日間（アルカリ性ホスファターゼ）インキュベートされ、その後、ヤギ抗−ウサギ複合体を調製するために使用され、複合体がウサギＩｇＧ ＥＬＩＳＡにおいて試験された。これらの％活性値は、別な具合に述べられていない限り、３７℃で貯蔵された材料から調製された複合体の１／１０，０００の希釈度でのＥＬＩＳＡによる吸光度値を、−２０℃で貯蔵された材料から調製されたトレハロース調合物（即ち、金属イオンを伴わない）で得られた吸光度値で割り算することにより決定された。

明らかなように、トレハロースは、高温に対するその混合物の安定性を改善する（６日間にわたる７５％の活性の消失［表の１行目］が、トレハロースを伴わない場合の１日での活性の消失と概して同様である；実施例２０参照）。Ｍｇ^２＋は、ｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰ／２−ＩＴ／トレハロース混合物の安定性を更に有意に改善し、複合体を調製するために使用されたこの凍結乾燥混合物の３７℃での６日間のインキュベーション後における活性の消失は２３％にすぎない。凍結乾燥された材料を含む複合キットに関して言えば、トレハロースおよびＭｇ^２＋を有する調合物は、環境温度での輸送を大いに促進する。カルシウム（５ｍＭ）もｍａｌ−ＥＤＢＡ−ＨＲＰ／２−ＩＴ／トレハロース混合物を安定化させるが、アルカリ性ホスファターゼ（０．５ｍＭ）の分析において一般的に用いられる濃度でのＺｎ^２＋は、ほとんど保護効果がなかった。

ｍａｌ−アルカリ性ホスファターゼ／２−ＩＴ混合物がトレハロースおよびＭｇ^２＋の存在下において凍結乾燥される場合には、アルカリ性ホスファターゼでも同様なパターンが出現し、結果として生じる複合体のＥＬＩＳＡ反応性における著しい改善が見られる。トレハロースだけを含有する調合物を−２０℃で貯蔵した場合と比べ、３７℃で５日間の貯蔵後、明らかに、活性の消失は存在しない。しかし、凍結乾燥中よりむしろ高温において賦形剤の有益な効果が見られるＨＲＰの場合とは異なり、ｍａｌ−アルカリ性ホスファターゼ／２−ＩＴ混合物は、凍結／凍結乾燥中にも賦形剤により保護される。従って、Ｍｇ^２＋の存在下において凍結乾燥されたサンプルは、その金属イオンの不在下において凍結乾燥されたサンプルよりも、凍結乾燥の直後、実質的にもっと活性である。

図１は、実施例４において試験されたとおりのＡｂ１−ＨＲＰ複合体のＥＬＩＳＡの結果を示す、吸光度対２ＩＴの濃度の棒グラフである。 図２は、実施例５で試験されたとおりの複合効率に及ぼす様々なｐＨの影響を示す、吸光度対ｐＨのグラフである。 図３は、実施例６で試験されたとおりのＡｂ１−ＧＯＸ複合に対するｐＨの最適条件を示す、吸光度対ｐＨのグラフである。 図４は、実施例７で試験されたとおりの複合効率に及ぼす緩衝剤のタイプの影響を示す、種々の異なる緩衝剤に対する吸光度の棒グラフである。 図５は、実施例８で試験されたとおりのリン酸塩緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液での吸光度対ｐＨの１対のグラフである。 図６は、実施例９で試験されたとおりの複合体形成のタイムコースを示す、吸光度対時間のグラフである。 図７は、実施例１０で試験されたとおりの試薬の様々な付加順序の影響を示す、種々の異なるサンプルに対する吸光度の棒グラフである。 図８は、ＯＬＡ−ＨＲＰ−ＩｇＧ複合体（四角形）の場合と比較した、２つの異なるバッチのＥＤＢＡ−ＨＲＰ−ＩｇＧ複合体（黒塗りの円形および白抜きの円形）のＥＬＩＳＡにおける性能を示す、複合体希釈度（対数目盛）に対する吸光度（任意（ａｒｂｉｔａｒｙ）単位、４０５ｎｍ）のグラフである。抗原不含のマイクロタイタープレートで発生された対照データがベースラインに重ね合わせて表示されている 図９は、ｐＨ６．５（白抜きの円形）、ｐＨ７．０（黒塗りの円形）、ｐＨ７．５（四角形）またはｐＨ８．０（三角形）において調製されたＥＤＢＡ−ＨＲＰ−Ｉｇ複合体のＥＬＩＳＡにおける性能を示す、複合体希釈度（対数目盛）に対する吸光度（任意単位、４０５ｎｍ）のグラフである。 図１０は、ＥＤＢＡ−Ｇｏｘ−Ｉｇ複合体（黒塗りの円形）およびＯＬＡ−Ｇｏｘ−Ｉｇ複合体（白抜きの円形）のＥＬＩＳＡにおける性能を示す、複合体希釈度（対数目盛）に対する吸光度（任意単位、４０５ｎｍ）のグラフである。 図１１は、ヨードアセチル活性化ＥＤＢＡ−ＨＲＰ−Ｉｇ複合体のＥＬＩＳＡにおける性能を示す、複合体希釈度（対数目盛）に対する吸光度（任意単位、４０５ｎｍ）のグラフである（対照に対するデータがベースラインに重ね合わせて表示されている）。 図１２は、ｍａｌ−ＥＢＤＡ−ＨＲＰ（黒塗りの棒）またはｍａｌ−ＯＬＡ−ＨＲＰ（陰影付きの灰色の棒）とのＩｇの重量による比に対する吸光度（４０５ｎｍ）の棒グラフである。 図１３は、実施例１７で試験されたとおりの様々なアミンによる２ＩＴからのチオールの放出を示す、吸光度対時間のグラフである。 図１４は、実施例１８で試験されたとおりのＤＴＮＢを用いたチオールの捕捉を示す、図１３と同様なグラフである。 図１５は、種々の異なる温度で貯蔵した後に、凍結乾燥試薬がＥＬＩＳＡにおいて活性な複合体を形成する能力を示す、複合体の希釈係数に対する吸光度（４０５ｎｍ）のグラフである。

Claims (15)

1. タンパク質である第１の化学物質および酵素または蛍光物質である第２の化学物質を反応させて、第１および第２の化学物質が互いに共有結合により結合されている複合体を形成する方法であって、
   前記方法は、第１の化学物質、第２の化学物質およびチオール発生剤を水溶液条件中で同時に接触させることを含み、
   チオール発生剤が、チオール化反応において第１の化学物質と反応して、第１の化学物質上に遊離スルフヒドリル基の形成をもたらし、
   遊離スルフヒドリル基が、第２の化学物質と反応して、複合体を形成し、
   第２の化学物質が、スルフヒドリル基との反応性に関して多価であり、
   さらに、第２の化学物質：チオール発生剤のモル比は１：１以下である、形成方法。
2. チオール発生剤が２−イミノチオランを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２の化学物質とチオール発生剤とのモル比が、１：１から１：２０の範囲である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記モル比が、１：１０から１：１５の範囲である、請求項３に記載の方法。
5. 前記第１の化学物質、前記第２の化学物質および前記チオール発生剤が１段階手順において同時に混ぜ合わされる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記チオール発生剤および前記第１の化学物質が混ぜ合わされる第１ステップ、ならびに前記第２の化学物質が前記チオール発生剤および前記第１の化学物質と混ぜ合わされる第２ステップを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第１および第２の化学物質が混ぜ合わされる第１ステップ、ならびに前記チオール発生剤が第１および第２の化学物質と混ぜ合わされる第２ステップを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記チオール発生剤および前記第２の化学物質が混ぜ合わされる第１ステップ、ならびに前記第１の化学物質が前記チオール発生剤および前記第２の化学物質と混ぜ合わされる第２ステップを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記第１の化学物質が、前記第２の化学物質および前記チオール発生剤を含む乾燥混合物に液状の形態で加えられる、請求項８に記載の方法。
10. 更に、複合反応を終結させるために求核試薬を加えることを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記第２の化学物質が酵素を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法において使用するための複合キットであって、
    前記第１の化学物質、前記第２の化学物質および前記チオール発生剤から選択される少なくとも１つの試薬のサンプル、ならびに請求項１に記載の方法を実施するための取り扱い説明書を含む、複合キット。
13. 前記第２の化学物質のサンプルおよび前記チオール発生剤のサンプルを含む、請求項１２に記載のキット。
14. チオラクトン、イミノチオラクトン、エピスルフィドおよびチアゾリジンから選択されるチオール発生剤の少なくとも１つのサンプルを含む、請求項１２または１３に記載のキット。
15. 前記少なくとも１つの試薬のサンプルが付加的にポリオールを含む、請求項１２から１４のいずれか１項に記載のキット。

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