CN114878823A - 一种抗体检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体检测领域,具体而言,涉及检测方法及产品。通过使用多聚体RBD或多倍体RBD在胶乳平台实现中和抗体的检测。

Description

一种抗体检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种抗体检测方法。
背景技术
病原微生物侵染细胞过程中病毒表面受体结合蛋白是病原微生物进入细胞的关键“钥匙”,可以打开细胞受体蛋白的“锁”,从而进入细胞并启动其复制过程。
中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体,能够与病原微生物表面的抗原(配体)结合,从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体,防止侵入细胞。
目前的中和抗体检测主要在生物安全三级实验室(BSL3)内进行。利用活病毒细胞培养的中和试验检测,对实验室等级要求高,严重限制了临床大规模的推广使用。开发出可在生物安全二级实验室(BSL2)或普通实验室开展的快速中和抗体检测方法,具有重要意义。
SARS-CoV-2表面棘突S蛋白(spike protein)是冠状病毒表面重要的受体结合位点,其可与细胞表面病毒特异性受体结合、介导病毒外膜与细胞融合、病毒吸附及穿膜;冠状病毒S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBM)可使病毒与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme2,ACE2)结合,并使病毒进入宿主细胞。当SARS-CoV-2在侵入机体时,会刺激机体产生具有保护作用的中和抗体,专门阻止病原微生物进入细胞,防止感染。中和抗体的多少是疫苗免疫保护效果的一项重要指标,是疫苗评估和质控的重要依据。
个体接种疫苗后可通过免疫应答产生保护性抗体,即中和抗体,对中和抗体进行滴度测定,可以判断疫苗的临床疗效。因此对中和抗体的检测,可应用于疫苗的研发评价,以及疫苗接种后,对个体自身免疫效果的评价。另外,对于治愈后的新冠患者检测,可以判断是否存在再次感染的风险。
随着新冠疫苗的推广接种,现在急需开发方便快捷,无需在BSL3实验室条件下进行总抗体和中和抗体检测的试剂,现有开发发产品都是在Elisa和发光平台上检测的,但是Elisa和发光平台设备要求高,大部分三甲以下的医院或者社康诊所都没有配套仪器,生化比浊检测有应用普遍,成本低,检测快的优势,开发能够在免疫比浊平台实现中和抗体检测的方法和产品具有重要意义。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明提供了以下至少一种实施方式:
在一些实施方式中,本发明涉及一种在免疫比浊平台实现冠状病毒抗体检测的方法,方法包括:
1)样品与含有RBD聚体或多倍体的试剂接触;
2)再与偶联有胶乳的ACE2或其片段的试剂接触。
在一些实施方式中,所述检测方法用于检测样品中是否存在中和抗体。
在一些实施方式中,所述冠状病毒选自SARS-CoV-2或SARS-CoV。
在一些实施方式中,所述样品选自可能含有抗体的任何样品。
在一些实施方式中,所述样品选自血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液或淋巴细胞。
在一些实施方式中,,RBD聚体或多倍体可以是对RBD序列进行两个以上串联表达得到或通过化学偶联的方式将两个以上的RBD蛋白聚合。
在一些实施方式中,检测组件,所述检测组件包括:含有RBD聚体或多倍体的试剂和偶联有胶乳的ACE2或其片段的试剂。
在一些实施方式中,检测组件中含有RBD聚体或多倍体的试剂,RBD聚体或多倍体可以是对RBD序列进行两个以上串联表达得到或通过化学偶联的方式将两个以上的RBD蛋白聚合。
在一些实施方式中,检测组件是用于检测冠状病毒中和抗体,在一些实施方式中,检测的是SARS-CoV-2中和抗体,在一些实施方式中,检测的是SARS-CoV中和抗体。
在一些实施方式中,以上任一实施方式所述的检测方法、以上任一实施方式所述的检测组件在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。
附图说明
图1示出RBD聚体或多倍体的SDS-PAGE图,1:RBD单体2:RBD二聚体。
图2示出当样品中存在中和抗体时的反应示意图,结果是不能产生有效浊度。
图3示出当样品中存在结合抗体时的反应示意图,结果是产生了有效的浊度。
图4示出当样品中不存在抗体时的反应示意图,结果是产生了有效的浊度。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
本发明实施例能够在免疫比浊平台实现冠状病毒抗体检测。
本文中,术语“免疫比浊平台”是指是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是:当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时,形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下,自液相析出,形成微粒,使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出检样中抗原的含量。
本文中,术语“中和抗体”指的是B淋巴细胞产生的某些抗体,能够与病原微生物表面的抗原结合,从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体,防止侵入细胞。
本文中,“RBD聚体或多倍体”指的是具有多个RBD结构域的蛋白,可以是通过基因重组技术构建多拷贝RBD载体,表达得到串联有多个RBD结构域的重组蛋白;也可以通过重组技术得到单个RBD蛋白在通过化学偶联的方式得到多聚体形式的蛋白;其特点是新形成的分子结构中具有两个以上的RBD结构域。
本文中,“样品”可理解为可能含有抗体的任何样品,在一些实施方式中,样品来自于感染或主动免疫后的样品;在一些实施方式中,样品选自体液、排泄物、细胞;例如血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液、淋巴细胞等,但不限于此。
本文中,术语“片段”指的是至少含有结合区段的氨基酸片段。
本文中,“接触”可理解为允许其发生结合。接触时间不作具体限定,不同的实施方式和检测平台,接触时间有所差异,但属于本领域技术人员可以理解的范畴。
本文中,ACE2不限定物种,根据待检样品的物种来源可以选择不同物种的ACE2,例如哺乳动物,非冷血飞行动物,蝙蝠和鸟类等,在一些实施方式中,使用人的ACE2,进行人样品的冠状病毒中和抗体检测。
在一些实施方式中,本发明提供在免疫比浊平台实现冠状病毒抗体检测的方法,包括:
1)样品与含有RBD聚体或多倍体的试剂接触;
2)再与偶联有胶乳的ACE2或其片段的试剂接触。
在一些实施方式中,上述方法检测的是中和抗体。
在一些实施方式中,所述冠状病毒是指SARS-CoV-2或SARS-CoV。所述SARS-CoV-2包括其野生型及变异型。所述SARS-CoV-2包括其野生型及变异型。
在一些实施方式中,所述RBD聚体或多倍体可以是对RBD序列进行两个以上串联表达得到或通过化学偶联的方式将两个以上的RBD蛋白聚合。
在一些实施方式中,RBM的序列可参考文献Wrapp Daniel,Wang Nianshuang,Corbett Kizzmekia S,et al.Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in theprefusion conformation,以及与其序列一致性至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列,且这些氨基酸序列仍具有配体结合受体和/或抗体的功能。
在一些实施方式中,“ACE2”是指任何物种的ACE2,且包括得自任何物种的ACE2亚型、片段、变体(包括突变体)、或同系物。在一些实施方式中,ACE2是哺乳动物(例如,兽亚纲、真哺乳亚纲、真兽亚纲、原兽亚纲、统兽总目、灵长目(猴、非人灵长类、或人)的ACE2。在一些实施方式中,ACE2是人、蝙蝠、穿山甲、麝猫、或猪的ACE2。在一些实施方式中,ACE2是人的ACE2,序列可参考Gene ID:59272,以及与其序列一致性至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列,且这些氨基酸序列仍具有受体结合配体的功能。
在一些实施方式中,本发明还涉及检测组件,所述检测组件包括:含有RBD聚体或多倍体的试剂和偶联有胶乳的ACE2或其片段的试剂。
在一些实施方式中,检测组件中RBD聚体或多倍体可以是对RBD序列进行两个以上串联表达得到或通过化学偶联的方式将两个以上的RBD蛋白聚合。
在一些实施方式中,所述检测组件用于检测样品中是否存在中和抗体。
在一些实施方式中,检测组件是用于检测冠状病毒中和抗体,在一些实施方式中,检测的是SARS-CoV-2中和抗体,在一些实施方式中,检测的是SARS-CoV中和抗体。
本发明还涉及以上任一实施方式所述的检测方法,或以上任一实施方式所述的检测组件在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。
以检测SARS-COV-2中和抗体为例说明本发明的原理:
(1)样品与含有RBD聚体或多倍体的试剂接触,样品中的中和抗体和总抗体分别与RBD结合形成中和抗体-RBD复合物以及总抗体-RBD复合物;
(2)加入偶联有胶乳的ACE2的试剂,ACE2能够与总抗体-RBD复合物进一步结合形成复合物而不与中和抗体-RBD复合物结合。
结合有中和抗体的RBD多聚体或多倍体不能够再结合偶联有胶乳的ACE2,从而不能够发生浊度反应,当样品中没有中和抗体时,RBD多聚体或多倍体能够与偶联有胶乳的ACE2结合,发生浊度反应,样品中的中和抗体含量与浊度反应信号值成反比关系,从而可以定量样品中的中和抗体。
本申请的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。尽管本申请已经结合示例性实施方式进行了描述,很多等同修改和变化在给出本申请时对于本领域技术人员是清楚的。因而,本申请的示例性实施方式是示例性的,非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化,而不脱离本申请的宗旨和范围。以下实施例中使用到的重组人ACE2、重组RBD抗原(RBD多聚片段)、重组RBD抗原(RBD单体片段)、新冠中和抗体标准品(G3)、胶乳微球均购自广东菲鹏生物有限公司。仪器:全自动生化分析仪为市面上任意的常规生化分析仪。
实施例1ACE2偶联胶乳微球
1)390uL交联液(50mM HEPES,pH6.1),加入100uL胶乳微球(JSR),在摇床上震荡混匀,为胶乳微球液;
2)胶乳微球液中加入13uL的EDAC溶液,37摄氏度震荡活化1小时;
3)加入50ul ACE2/RBD(2mg/ml)到胶乳微球液中,37摄氏度震荡交联4小时;
4)加入50ul的TW-20溶液,37摄氏度震荡封闭1小时;
5)将交联液体加入到离心管中,离心后,小心用移液枪弃上清;
6)加入2mL清洗液(50mM甘氨酸+0.1%NaN3,pH8.0),旋涡震荡,再离心一次,小心弃上清;
7)加入5mL胶乳微球悬浮液(50mM甘氨酸+0.1%BSA+10%蔗糖+0.1%NaN3,pH8.0),超声分散处理。
实施例2标准品制备
用基质血清将中和抗体标准品稀释成以下不同浓度:0、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、4000ng/ml、8000ng/ml。
实施例3样品稀释液制备
RBD多聚片段和RBD单体片段均购置广东菲鹏生物,其SDS-PAGE电泳结果如图1所示,从分子量上可以确定泳道2是RBD多聚体片段。
3.1用重组RBD抗原(RBD多聚片段)配置如下不同浓度的样品稀释液,稀释液基本配方是:Tris缓冲液
稀释液1 稀释液2 稀释液3
抗原浓度 40ug/ml 25ug/ml 10ug/ml
3.2用重组RBD抗原(RBD单体片段)配置如下不同浓度的样品稀释液,稀释液基本配方是:Tris缓冲液
稀释液4 稀释液5 稀释液6
抗原浓度 40ug/ml 25ug/ml 10ug/ml
实施例4上机测试
仪器:全自动生化分析仪
检测流程:吸取样本盘上的样本5ul,同时吸取R1 135ul,加入比色杯中,机械搅拌,37℃下孵育5分钟;在比色杯中加入R2 15ul,机械搅拌,37℃下孵育8分钟;在比色杯中加入R3 50ul,机械搅拌,37℃下孵育10分钟。仪器记录下从加入样本开始算起的15分30秒和25分钟30秒的吸光度值,差值就是样本的反应吸光度,吸光度和样本中中和抗体浓度在特定条件下负相关。
加样比S:R1:R2=5:135:15:50
波长:570nm
空白时间:104-104
反应时间:172-172
R1:Tris缓冲液
R2:样品稀释液
R3:ACE2偶联胶乳微球试剂
表1:检测标准品中的中和抗体
Figure BDA0002936587440000091
Figure BDA0002936587440000101
表2中和抗体抑制率计算结果
Figure BDA0002936587440000102
分析表1和表2数据,使用RBD聚体配置的稀释液1-稀释液3可以产生明显的浊度反应,且浊度反应与中和抗体的量成相关关系,而用RBD单体配置的稀释液4-稀释液6不能产生浊度反应。
本申请人进一步研究了采用本发明方法的检测原理,RBD多聚片段至少包含有2个以上的位点可以结合ACE2,当检测样品中不存在中和抗体时,RBD多聚片段和ACE2结合发生浊度反应(图4);当检测样品中仅有结合抗体但是没有中和抗体时,RBD多聚片段和ACE2结合发生浊度反应(图3);当检测样品中存在中和抗体时,中和抗体与RBD多聚片段结合,阻断了RBD多聚片段与ACE2的结合,从而抑制浊度反应的发生(图2)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种在免疫比浊平台实现冠状病毒抗体检测的方法,所述方法包括:
1)样品与含有RBD聚体或多倍体的试剂接触;
2)再与偶联有胶乳的ACE2或其片段的试剂接触。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述检测方法用于检测样品中是否存在中和抗体。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述冠状病毒选自SARS-CoV-2或SARS-CoV。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,样品选自可能含有抗体的任何样品;
可选的,所述样品选自血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液或淋巴细胞。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,RBD聚体或多倍体可以是对RBD序列进行两个以上串联表达得到或通过化学偶联的方式将两个以上的RBD蛋白聚合。
6.检测组件,所述检测组件包括:含有RBD聚体或多倍体的试剂和偶联有胶乳的ACE2或其片段的试剂。
7.根据权利要求6所述的检测组件,其特征在于,RBD聚体或多倍体可以是对RBD序列进行两个以上串联表达得到或通过化学偶联的方式将两个以上的RBD蛋白聚合。
8.根据权利要求6所述的检测组件,其特征在于,检测组件用于检测样品中是否存在中和抗体。
9.根据权利要求6所述的检测组件,其特征在于,所述检测组件用于检测冠状病毒中和抗体;
可选的,检测组件用于检测SARS-CoV-2中和抗体或SARS-CoV中和抗体。
10.权利要求1-5任一项所述的检测方法、权利要求6-9任一项所述的检测组件在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。
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