CN117866102A - 一种抗人tIgE单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗人tIgE单克隆抗体及其制备方法与应用,属于体外诊断领域。通过人IgE抗体重链末端蛋白免疫小鼠后进行鼠单克隆抗体的筛选,将筛选到的阳性克隆细胞进行基因测序,得到抗体的基因序列之后构建至真核表达载体,进行体外重组表达及纯化。将此重组抗体应用于本公司微阵列化学发光平台,具有高通量、高灵敏等优点,能够实现对tIgE的定量检测,同时结合特异性IgE检测,能够实现对过敏性疾病的精准诊断,能够对过敏性疾病的检测和治疗起到很好的辅助作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗人tIgE单克隆抗体及其制备方法与应用,属于体外诊断领域。
背景技术
免疫球蛋白E(IgE)是一类免疫球蛋白(Ig),分子量约为188kDa,血清中含量极低,仅占血清总Ig的0.002%,在个体发育中合成较晚。免疫球蛋白分子的基本结构Ig分子由四肽链组成,其中二条相同的分子量较小的肽链称为轻链,二条相同的分子量较大的肽链称为重链,轻链与重链由二硫键连接。Ig单体中四条肽链两端游离的氨基或羧基的方向是一致的,分别命名为氨基端(N端)和羧基端(C端)。ε链有4个CH(Cε1~Cε4),无铰链区,含有较多的半胱氨酸和甲硫氨酸,对热敏感,56℃、30分钟可使IgE丧失生物学活性。IgE主要由鼻咽部、扁桃体、支气管、胃肠等粘膜固有层的浆细胞产生,这些部位常是变应原入侵和I型变态反应发生的场所。IgE为亲细胞抗体,Cε2和Cε3功能区可与嗜碱性粒细胞、肥大细胞膜上高亲和力FcεRⅠ结合。变应原再次进入机体与已固定在嗜碱性粒细胞、肥大细胞上IgE结合,可引起Ⅰ型变态反应。寄生虫感染或过敏反应发作时,局部的外分泌液和血清中IgE水平都明显升高,因此检测血清总IgE和特异性IgE对Ⅰ型变态反应的诊断和过敏原的确定很有价值。
现在基于PhadiaTM平台的ImmunoCAPTM检测被认为是公认的标准,其它任何一种方法都要与其进行比较。它可以对IgE抗体进行准确的定量测定。ImmunoCAPTM系统已获得国际临床实验室标准委员会的确认。但是ImmunoCAPTM系统需要购买昂贵的检测设备,并且试剂及耗材成本较高,且国外供货面临货期稳定等风险。过敏原的检测还有其它方法,但是这些方法都不够准确。其中,皮肤点刺试验(SPT)将待检过敏原提取液滴于患者皮肤上,用点刺针穿过液滴刺入皮肤。如果患者有针对该过敏原的特异性lgE抗体,则在点刺局部出现过敏反应。SPT容易操作,但结果很难评价。其结果高度依赖于试验用过敏原提取液的质量和操作者的经验,即使是有经验的操作者,SPT的精确性也很差。亟需一种精确性强、易操作且成本较低的体外诊断试剂对特异性IgE介导的Ⅰ型变态反应进行诊断。
发明内容
本发明将人IgE抗体重链末端蛋白免疫BALB/c小鼠,当免疫效价达到融合标准时取免疫小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,融合之后通过有限稀释法分离到单克隆细胞,ELISA方法筛选到阳性克隆的细胞,将阳性的单克隆细胞进行抗体基因测序,将抗体编码基因克隆至真核表达载体,通过HEK293细胞瞬转表达的方式,抗体在胞内表达后通过信号肽的引导分泌至细胞培养上清中,通过亲和层析工艺纯化到高纯度的重组抗体,将重组抗体包被至硬基质蛋白芯片,然后通过梯度抗体或阳性样本研究该抗体的生物学活性。本公司用于体外诊断试剂盒开发的高通量化学发光微阵列蛋白芯片平台,具有高灵敏、高通量等优点,但是所述平台需要结合IgE检测抗体,才能够实现对IgE介导的过敏反应进行快速精准诊断。目前市面上的抗人IgE抗体多为小鼠腹水来源或杂交瘤细胞来源的天然抗体,而本发明通过基因工程技术和蛋白质工程技术获取重组的抗人IgE抗体,重组抗体具有批间差异小、稳定性良好、易于放大、特异性良好等优点。
本发明提供了一种抗人IgE的重组抗体,所述重组抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
在一种实施方式中,编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了制备权利要求1或2所述重组抗体的方法,包括以下步骤:
(1)将SEQ ID No.1所示核苷酸序列和SEQ ID No.5所示核苷酸序列连接至载体pCDNA3.1,获得重组载体1,将SEQ ID No.2所示核苷酸序列和SEQ ID No.6所示核苷酸序列连接至载体pCDNA3.1,获得重组载体2;
(2)将步骤(1)所述重组载体1和重组载体2转染至HEK 293细胞。
在一种实施方式中,将所述HEK293细胞在37℃,6%CO2,110rpm培养5-7天。
在一种实施方式中,将培养上清用proteinA亲和层析进行纯化。
本发明还提供了一种提高抗人IgE体外诊断准确性的方法,以HEK 293细胞为宿主,重组表达IgE抗体;所述抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.3所示,轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
在一种实施方式中,编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了所述的重组抗体,或制备所述重组抗体的方法,或提高抗人IgE体外诊断准确性的方法在制备抗人IgE的重组抗体或含抗人IgE的重组抗体的产品中的应用。
在一种实施方式中,所述产品包括抗人IgE体外诊断平台。
在一种实施方式中,所述体外诊断平台为高通量微阵列化学发光平台。
[有益效果]
本发明提供了一种抗人IgE的重组抗体,所述重组抗体来源清晰,批间差异小,无动物来源,易于放大,纯度大于90%;
将所述重组抗体应用于高通量微阵列化学发光平台,能够开发出一款高灵敏的过敏性疾病诊断试剂盒,通过双抗体夹心法能够实现对血清样本中的tIgE进行定量检测,同时结合特异性IgE检测,能够实现对过敏性疾病的精准诊断。
附图说明
图1重组IgE1-66 SDS-PAGE图;
图2重组IgE1-66抗体检测阳性样本相关性。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解实施例是为了更好地解释本发明,不用于限制本发明。
[相关术语解释]
“重组蛋白”是指应用重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质。重组蛋白工程先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因,连接到适合的表达载体,导入到特定的宿主细胞,利用宿主细胞的遗传系统,表达出有功能的蛋白质分子。
“重组抗体”以编码抗体的基因作为起始材料,利用重组DNA技术,在体外生产的抗体,超出了免疫系统的限制。通过获得抗体的基因序列,构建表达载体,并将其转入至表达宿主中(如酵母、哺乳动物细胞或细菌中)。利用这种方式,生产的抗体是特定种类(IgG/IgA/IgE/IgD/IgM)的抗体。同时,不仅可以生产全长抗体,也可以生产各类抗体片段,如scFv,Fab等。
“抗体”是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。一般地,抗体以一个或者多个Y字形单体存在,每个Y字形单体由4条多肽链组成,包含两条相同的重链和两条相同的轻链,轻链和重链是根据它们的分子量大小来命名的。Y字形结构的顶端是可变区,为抗原结合部位。每个重链有两个区即恒定区和可变区,所有同一型的抗体其恒定区都是相同的,不同型的抗体之间则存在差异。每条轻链也有两个前后相连的结构域,即一个恒定区和一个可变区。
“表达载体”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
“蛋白芯片”是指一种玻璃材料的硬基质芯片,蛋白质、抗体等生物分子稀释至点样液中之后能够通过仪器包被至该蛋白芯片的表面,从而可以应用于芯片阅读仪进行待测样本的定量分析,如用特殊方式处理的硬基质玻璃材料、酶联板等。
“高通量微阵列化学发光平台”是利用“蛋白芯片”的技术原理将多种指标的蛋白或抗体包被于“蛋白芯片”,然后利用抗原抗体特异性识别以及化学发光技术从而实现同一张“蛋白芯片”检测多种靶标的技术。
实施例1IgE单克隆抗体的制备
产品制备过程:
1.1免疫原制备:
首先,构建包含信号肽序列(Seq ID No.10)和人IgE抗体重链末端C3-C4域蛋白(Seq IDNo.12)(由江苏赛索飞生物科技有限公司完成)的质粒,所述人IgE抗体重链末端C3-C4域蛋白羧基端融合了6×组氨酸肽段用于蛋白质纯化(Seq ID No.14),能够便于重组蛋白的检测和纯化:
人工合成由SEQ ID No.9所示编码信号肽的核苷酸序列、SEQ ID No.11所示编码人IgE重链末端C3-C4域蛋白的核苷酸序列和SEQ ID No.13所示编码6×组氨酸的核苷酸序列,并以信号肽、C3-C4域蛋白和组氨酸的顺序依次连接,得到目的片段。将目的片段分别用BamH I和Xho I限制性内切酶切割,然后和相同酶切并胶回收的pCDNA3.1载体进行连接,连接产物转化至TOP10感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司,DL1010)之后,37℃培养15h,挑取单克隆菌落进行电泳PCR鉴定,阳性克隆送样品至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定,测序正确的表达载体(命名为pCDNA3.1-IgE-C3-C4)进行质粒大提(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,DC202-01),提取之后的质粒经过0.22μm滤膜(广州洁特生物过滤股份有限公司,FPE204025)过滤除菌,然后-20℃保存。
准备OPM-293CD05培养基(上海奥浦迈生物科技股份有限公司,81075-001)培养的悬浮HEK293细胞(37℃110rpm 6%CO2),转染前24小时将细胞用新鲜的OPM-293CD05培养基接种至1000mL透气盖培养瓶(784011,无锡耐思生物科技有限公司)体积240mL,细胞密度2×106个/mL。转染当天37℃预热16mL的OPM-293CD05培养基,然后加入240μg的pCDNA3.1-IgE-C3-C4表达载体,轻轻混匀后加入480μg的PEI转染试剂(Polysciences,23966,1mg/mL),颠倒混匀之后室温静置20min,然后将所得载体和PEI混合物缓缓加入培养的细胞中,计为第1天。于培养第2和第4天分别同时补加终浓度50mM的葡萄糖(生工生物工程(上海)股份有限公司,A610219-0500,2M)和终浓度4mM的谷氨酰胺溶液(Thermo FisherScientific,25030149,200mM),培养6-7天时收集细胞表达上清,进行蛋白纯化。
首先将Ni-TED亲和层析柱(嘉兴千纯生物科技有限公司,A42302-06)连接于AKTApure150L蛋白纯化仪上,用5CV的平衡缓冲液(1*PBS,pH 7.4)进行柱平衡,然后用细胞表达上清进行上样,上样结束后继续用平衡缓冲液平衡至UV基线平稳。用洗脱液(1*PBS,250mM咪唑,pH 7.4)洗脱层析柱上的蛋白,收集洗脱峰,然后用7kDa透析袋(北京经科宏达生物技术有限公司,300858026)将蛋白的缓冲Buffer进行置换,置换至pH7.4的PBS中,然后检测纯化后蛋白浓度为1.95mg/mL,SDS-PAGE分析蛋白纯度大于90%。
1.2动物免疫:将步骤1.1得到的重组的人IgE抗体重链末端C3-C4域蛋白稀释至0.5mg/mL后与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich,F5881)等体积混合,用一次性乳化注射器充分乳化,然后按照0.2mL每只小鼠的剂量皮下注射BALB/c小鼠(每只小鼠注射0.05mg),小鼠由赛业(苏州)生物科技有限公司提供饲养服务,其中小鼠为6~8周龄,每组5只,每隔两周进行加强免疫,加强免疫时,将与等体积弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich,F5506)混合的0.5mg/mL人IgE抗体重链末端C3-C4域蛋白注射小鼠,每只小鼠每次免疫0.05mg,第3次加强免疫之后,采集鼠尾血进行效价检测,直至达到融合效价(小鼠血清100倍稀释ELISA检测OD450≥2.5)。
融合前3天,按照0.05mg人IgE抗体重链末端C3-C4域蛋白/每只小鼠的剂量注射小鼠,进行冲击免疫(固定动物,消毒皮肤,在左或右侧腹部将针头刺入皮下,沿皮下向前推进约0.5cm,再使针头与皮肤呈45°夹角刺入腹腔,回抽无肠液、尿液后,缓缓注射),完成冲击免疫两周后进行细胞融合实验。
1.3、饲养层细胞的准备:采用BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞,在融合前一天,1.2中免疫后的BALB/c小鼠被脱颈处死置于75%酒精中消毒5min,在洁净工作台内用眼科剪刀剪开腹腔,暴露腹膜,用注射器向腹腔内注射RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清,北京四季青生物科技有限责任公司,11011-8611)5mL并进行反复冲洗,回收冲洗液之后1000rpm离心5min,弃掉上清,细胞沉淀用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)重悬,调整细胞密度为1×105个/mL,150μL/孔加入96孔细胞培养板中,37℃,5%CO2培养箱培养。
1.4、小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备:融合前36h,将公司保存培养的小鼠骨髓瘤细胞(中国科学院细胞库,TCM18)用RPMI 1640培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.,11875119)+10%FBS扩大培养,融合当天,用移液器将细胞从培养皿中轻轻吹下,收集于无菌的50mL离心管。1000r/min离心5min,弃去上清。加入30mLRPMI 1640培养基(含10%胎牛血清),同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10mLRPMI 1640培养基(含10%胎牛血清),混匀。取骨髓瘤细胞悬液,加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。
1.5、脾淋巴细胞的准备:取1.2中已经免疫的BALB/c小鼠,摘除眼球采血,并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过脱颈处死小鼠,置于75%酒精中消毒5min,于解剖台板上固定后用眼科剪刀剪开腹腔。取出脾脏置于已盛有10mLRPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)培养皿中,轻轻洗涤,并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10mLRPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)的培养皿中,用1mL注射器吸取培养基注射到脾脏内,反复多次吹打,收集细胞悬液1000r/min离心5min,用RPMI 1640培养基离心洗涤2次,然后将细胞重悬于10mLRPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)中,取上述悬液,加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。
1.6、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养:将1×108个步骤1.5获得的脾淋巴细胞与2×107个步骤1.4获得的骨髓瘤细胞SP2/0(国家实验细胞资源共享平台,1101MOU-PUMC000054)混合于一支50mL融合管中,补加RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)至30mL,充分混匀。1000r/min离心5min,将上清尽量吸净。在手掌上轻击融合管底,使沉淀细胞松散均匀。加入1mL预热至37℃的50%PEG(pH 8.0)溶液,在90s内加25mL预热至37℃的RPMI1640培养基(含10%胎牛血清);37℃静置10min,1000r/min离心5min;弃去上清。加入5mLRPMI 1640培养基(含HAT),轻轻吹吸沉淀细胞,使细胞混匀。分装细胞悬液于1.3中培养饲养层细胞的96孔细胞培养板,每孔0.10mL,细胞接种密度约为105/孔;然后将培养板置37℃,5%CO2培养箱内培养。培养7d后更换为含2%的HT培养基补充物(Sigma-Aldrich,H0137)的RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)。观察杂交瘤细胞生长情况,待细胞长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
1.7、杂交瘤细胞的筛选:用50mM(pH9.5)的碳酸盐缓冲液稀释1.1中重组表达的人IgE抗体重链末端蛋白至2μg/mL。每孔0.1mL加入96孔酶标板,在4℃冰箱包被过夜,次日每孔加入200μL 2%浓度的BSA封闭液置于37℃封闭2h;细胞融合培养第7d,取细胞培养上清0.1mL加入上述已包被的96孔板中,37℃孵育90min,PBST缓冲液洗板6次之后加入100μL 1:10000稀释的HRP-Goat anti Mouse IgG二抗(Jackson ImmunoResearch,115-035-146),37℃孵育30min,PBST缓冲液洗板6次之后加入TMB显色液100μL,避光显色10min,加入50μL 2M硫酸溶液,在紫外分光光度计上测定450nm处的吸光值。用RPMI 1640培养基作为阴性对照,以测定值与对照组的OD比值≥2为阳性孔。
选取阳性克隆孔中细胞利用有限稀释法进行单克隆细胞株的筛选,筛选到的阳性单克隆细胞经过扩大培养,用40%RPMI 1640培养基+50%胎牛血清+10%二甲基亚砜(Sigma-Aldrich,D1435)冻存,冻存密度为1×106个/mL。如表1所示,总共筛选到4株亲和力较好的单克隆细胞。
表1杂交瘤细胞上清检测结果
1.8、抗体小量生产和纯化
先腹腔注射BALB/c小鼠0.3mL液体石蜡处理腹腔10d左右,将筛选出来亲和力较强的4株杂交瘤细胞株扩大培养后接种1×106个到BALB/c小鼠腹腔内,注射杂交瘤细胞7d左右小鼠腹部会开始肿胀,此时每日都应进行观察,当小鼠出现进食困难,行走不便,毛色暗沉时将小鼠处死,进行一次性腹水的提取;小鼠脱颈椎处死,于75%酒精浸泡消毒5min,用手术剪将小鼠腹部剪开一个小口,剥离周围皮肤露出腹腔,随后将腹腔剪开一个小口,将胶头滴管伸入腹腔内将积液吸取至干净的15mL离心管内,然后离心管中加入等体积的饱和硫酸铵进行沉淀;将沉淀12000rpm离心10min,然后用pH 7.4的PBS缓冲液重悬沉淀,12000rpm离心10min后备用;首先将rProteinA亲和层析柱连接于AKTApure 150L设备上,用5个柱体积(CV)的平衡缓冲液(PBS,pH 7.4)进行柱平衡,然后抗体离心上清进行上样,上样结束后继续用平衡缓冲液平衡至UV基线平稳;用pH 3.0的柠檬酸溶液洗脱层析柱上的抗体,收集洗脱峰,用pH 9.0的Tris-HCl调节洗脱液pH至7.4,然后用透析袋将抗体的缓冲Buffer进行置换,置换至pH 7.4的PBS中。
1.9、抗体性能研究
将上步骤筛选到的4株鼠单克隆抗体(IgE1-3、IgE1-66、IgE1-324和IgE1-349)用点样液(20mM Tris-HCl,30%甘油,pH8.0)稀释至0.5mg/mL,然后用点样仪点样抗体至硬基质芯片(南通国光光学玻璃有限公司,SL-1),点样完成后用2%的BSA进行封闭,完成后包装成成品蛋白芯片用于实验。全自动生物芯片阅读仪SLXP-001B(Sunlant)被用于芯片的检测,将上一步骤准备好的芯片装载于芯片盘,用2%的BSA将IgE阳性样本3倍稀释后加入样品盘,将HRP标记的鼠抗人IgE抗体(Peroxidase IgG Fraction Monoclonal MouseAnti-Human IgE(ME.114)),209-032-241)用2%的BSA稀释至0.05mg/mL,和ECL鲁米诺化学发光试剂(常州天地人和生物科技有限公司,S32020)同时载入相应位置,仪器自检后即可开始全自动的分析实验,本次实验重复进行三次,求取平均值。筛选实验结果显示,所述4株抗体均具有较好的信噪比,同时空白对照背景值也较低,可以进一步研究其实际的应用性。如表2所示,IgE1-66用于检测IgE抗体具有较好的相关性,较高的信噪比对检测灵敏度、检测区间范围等方面有优势,阳性符合率和阴性符合率均为100%,因此本案例中选择克隆号为IgE1-66的抗体进行深入研究。
表24株鼠单克隆抗体对比研究结果
实施例2IgE1-66重组抗体的制备
产品制备过程:
2.1抗体可变区基因序列的获取
将IgE1-66单克隆细胞培养至24孔板中,待24孔板中细胞生长至汇合达70%以上时收集细胞,1000rpm离心5min,弃掉上清,细胞沉淀用RNA提取试剂盒提取总RNA,然后反转录为总cDNA,用VH-F和VH-R扩增抗体重链可变区序列,用mL-F和mL-R扩增抗体轻链可变区序列,扩增完成后将重轻链可变区基因序列分别通过TOPO克隆试剂盒连接到2个pCE2 TA/Blunt-Zero载体上(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,C601-01),用M13F的引物序列测序,所用引物序列具体如表2所示。
表3引物序列表
引物名称 | 序列 |
VH-F | GGGGATCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTCT |
VH-R | GGCTCGAGAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC |
mL-F | GGGGATCCGAYATTGTGMTRACMCARKMTCAA |
mL-R | GGCTCGAGACTGGATGGTGGGAAGATGGA |
M13F | GTAAAACGACGGCCAGT |
对测序结果进行分析得出抗体可变区序列,重链可变区基因序列如SEQ ID No.1所示,轻链可变区基因序列如SEQ ID No.2所示。其中重组载体委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
2.2重组IgE1-66抗体的表达
按照信号肽编码序列(SEQ ID No.9)、重链可变区基因(SEQ ID No.1)、重链恒定区编码基因(SEQ ID No.5)的顺序人工合成基因片段,通过BamHI和XhoI限制性内切酶线性化的pCDNA3.1连接,构建载体pCDNA3.1-IgE1-66-HC;按照信号肽编码序列(SEQ ID No.9)、轻链可变区基因(SEQ ID No.2)、轻链恒定区编码基因(SEQ ID No.6)的顺序人工合成基因片段,通过BamHI和XhoI限制性内切酶线性化的pCDNA3.1连接,构建载体pCDNA3.1-IgE1-66-LC(由江苏赛索飞生物科技有限公司完成),构建完成后用无内毒素质粒大提试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,DC202)进行质粒大量抽提。
准备OPM-293CD05培养基(上海奥浦迈生物科技股份有限公司,81075-001)培养的悬浮HEK293细胞(37℃110rpm 6%CO2),转染前24小时将细胞用新鲜的OPM-293CD05培养基接种至1000mL透气盖培养瓶(784011,无锡耐思生物科技有限公司)体积240mL,细胞密度2×106个/mL。转染当天37℃预热16mL的OPM-293CD05培养基,然后加入120μg的pCDNA3.1-IgE1-66-HC表达载体和120μg的pCDNA3.1-IgE1-66-LC表达载体,轻轻混匀后加入480μg的PEI转染试剂(Polysciences,23966,1mg/mL),颠倒混匀之后室温静置20min,然后将所得DNA和PEI混合物缓缓加入培养的细胞中,计为第1天。于培养第2和第4天分别同时补加终浓度50mM的葡萄糖(生工生物工程(上海)股份有限公司,A610219-0500,2M)和终浓度4mM的谷氨酰胺溶液(Thermo Fisher Scientific,25030149,200mM),培养6-7天时收集细胞表达上清,进行蛋白纯化。
2.3重组IgE1-66抗体的纯化
首先将rProteinA亲和层析柱(GLK-gel proteinA,无锡加莱克色谱科技有限公司)连接于AKTApure 150L(Cytiva)设备上,用5CV的平衡缓冲液(PBS,pH 7.4)进行柱平衡,然后细胞培养上清进行rProteinA亲和层析填料结合,上样结束后继续用平衡缓冲液平衡至UV基线平稳。用20mM的柠檬酸(pH 3.0)的洗脱层析柱上的抗体,收集洗脱峰,用pH 9.0的Tris-HCl调节洗脱液pH至7.4,然后用7kDa透析袋(北京经科宏达生物技术有限公司,300858026)将抗体的缓冲Buffer进行置换,置换至pH 7.4的PBS中。
将本案中所述的重组IgE1-66抗体,以及其他厂商的抗人IgE抗体如10A10(Jackson ImmunoResearch Inc.209-022-244)、M-322(罗氏诊断产品(上海)有限公司,11543393103)、M-7H8(罗氏诊断产品(上海)有限公司,11988204103)。将上述的4种抗人IgE抗体用点样液(20mM Tris-HCl,30%甘油,pH8.0)稀释至0.5mg/mL,然后用点样仪点样抗体至硬基质芯片,点样完成后用2%的BSA进行封闭,完成后包装成成品蛋白芯片用于实验。全自动生物芯片阅读仪SLXP-001B(Sunlant)被用于芯片的检测,将上一步骤准备好的芯片装载于芯片盘,用2%的BSA将IgE阳性样本3倍稀释后加入样品盘,将HRP标记的鼠抗人IgE抗体(Peroxidase IgG Fraction Monoclonal MouseAnti-Human IgE(ME.114)),209-032-241)用2%的BSA稀释至0.05mg/mL,和ECL鲁米诺化学发光试剂(常州天地人和生物科技有限公司,S32020)同时载入相应位置,仪器自检后即可开始全自动的分析实验,本次实验重复进行三次,求取平均值。如表3所示,IgE1-66用于检测样本中不同浓度的IgE含量均具有较好的检出率和阴性符合率,分别为100%和98%,而作为对照试剂的10A10分别为99%和97%,M-322为99%和94%,M-7H8为98%和95%。4种抗体总体的检出率均较高,差异主要存在于参考值附件的样本检出率差异。
在0.35≤IgE<0.7IU/mL参考值附近时,IgE1-66、10A10、M-322、M-7H8的阳性率分别是100%、93%、93%、87%,3种外购抗体的检出率均低于本案中所开发的抗体,存在一定的低值样本漏检。
表4不同抗人IgE抗体对比测试
为了进一步研究本案中的重组IgE1-66抗体的效价及活性,将IgE1-66、10A10、M-322、M-7H84种抗人IgE抗体用点样液(20mM Tris-HCl,30%甘油,pH8.0)稀释至0.05mg/mL,其余包被及检测步骤参考2.3。如表4所示,当包被的浓度降低10倍至0.05mg/mL之后,本案抗体IgE1-66的表现和正常使用浓度时(0.05mg/mL)的表现接近,仅在低值样本区有一例样本漏检,阴性符合率较之前提升2个百分点,浓度的降低减少了假阳性的产生;其他3种抗体的阴性符合率虽然均有所提升,但其在低值区间的漏检较本案抗体也更多,因此,本案抗体IgE1-66在诊断试剂开发方面具有更好的潜力和优势。
表5不同抗人IgE抗体对比测试
综上所述,本案经过制备免疫原、免疫小鼠、抗体筛选、重组表达、性能比对等方法,开发出了一种能够应用于高通量化学发光微阵列蛋白芯片平台的抗体,其克隆号为IgE1-66,该抗体相比于对照抗体具有更为优异的性能表现,能够用于IgE介导的过敏性疾病的诊断试剂盒的开发。
表6序列
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种抗人IgE的重组抗体,其特征在于,所述重组抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.编码权利要求1所述重组抗体的基因,其特征在于,编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.制备权利要求1所述重组抗体的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将SEQ ID No.9所示信号肽核苷酸序列、SEQ ID No.1所示重链可变区的核苷酸序列和SEQ ID No.5所示重链恒定区的核苷酸序列连接至载体pCDNA3.1,获得重组载体1,将SEQ ID No.9所示信号肽核苷酸序列、SEQ ID No.2所示轻链可变区的核苷酸序列和SEQIDNo.6所示轻链恒定区的核苷酸序列连接至载体pCDNA3.1,获得重组载体2;
(2)将步骤(1)所述重组载体1和重组载体2转染至HEK 293细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,将所述HEK 293细胞在35-40℃,4-8%CO2,90-130rpm,培养5-7天。
5.根据权利要求3或4所述的方法,其特征在于,将培养上清用proteinA亲和层析进行纯化。
6.一种制备IgE体外诊断产品的方法,其特征在于,以HEK 293细胞为宿主,重组表达IgE抗体;所述抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.3所示,轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQID No.1所示,编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
8.权利要求1或2所述的重组抗体,或权利要求3~5任一所述的方法在制备抗人IgE的重组抗体或含抗人IgE的重组抗体的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述产品包括抗人IgE体外诊断平台。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述体外诊断平台为高通量微阵列化学发光平台。
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