KR20190067626A - 광견병바이러스 특이 항체 및 이를 이용한 광견병바이러스 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광견병바이러스 특이 항체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 광견병바이러스 특이 항체를 이용한 광견병바이러스 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 광견병바이러스 특이 항체를 이용하여 효소면역분석을 수행할 경우 광견병바이러스에 대한 민감도, 특이도 및 정확도가 우수할 뿐만 아니라 고가의 분석 장비 없이도 광견병을 신속하고, 정확하며, 간편하게 진단할 수 있는바, 광견병 예방, 치료 및 진단 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 광견병바이러스 특이 항체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 광견병바이러스 특이 항체를 이용한 광견병바이러스 검출방법에 관한 것이다.
광견병은 사람과 모든 온혈동물에서 가장 치명적인 질병으로, 임상증상이 나타나면 높은 비율로 폐사한다. 한국을 포함한 모든 나라가 광견병을 인수공통전염병으로 인식하고 있으며, 세계동물보건기구(OIE)에서는 광견병이 발생하면 반드시 보고해야하는 질병으로 지정하였다. 또한 광견병은 국내 보건 분야에서는 3 군 법정감염병으로, 수의 분야에서는 2 종 가축전염병으로 규정하고 관리하고 있다. 각 국가들은 수입 또는 수출되는 동물로부터 광견병 전파를 차단하기 위하여 검역을 강화하고 있다.
광견병의 진단은 광견병바이러스에 감염된 조직을 검사하여 항원인 광견병바이러스를 확인하거나, 광견병바이러스에 감염된 개체의 침에서 항원을 검출하는 방법이 있다. 또한 혈청에 포함된 광견병바이러스에 대한 항체의 농도(serum antibody titer)를 측정하여 광견병 백신 접종여부를 확인할 수 있다. 구체적으로, 상기 혈청에 포함된 광견병바이러스에 대한 항체의 농도를 측정하는 방법에는 바이러스 중화시험(Fluorescent Antibody Virus Neutralization; FAVN, Rapid Focus Fluorescent Inhibition Test; RFFIT)이 있다. 상기 바이러스 중화시험은 항체검사 결과가 정확하다는 장점이 있으나, 실험실 내에서 수행되므로 세포배양과 관련된 장비 및 숙련된 실험자가 필요하고, 실험과정이 복잡하다는 단점이 있다. 외국에서 상용화되어 있는 효소면역반응법을 이용한 광견병바이러스에 대한 항체 검사법은 가격이 비싸고, 국내에서 상용화되어있지 않다.
이에 본 발명자들은 신속하고 정확도, 민감도 및 특이도가 높은 광견병바이러스 검출 방법을 개발하기 위하여 연구를 수행한 결과, 광견병바이러스 특이 항체를 개발하고, 상기 항체를 이용하여 광견병바이러스 검출을 위한 효소면역분석 수행 시 정확도, 민감도 및 특이도가 우수하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단일 사슬 가변 단편(Single-chain variable fragment, scFv)을 포함하는 광견병바이러스 특이 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 광견병바이러스 특이항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 광견병바이러스 특이 항체를 포함하는 광견병바이러스 검출용 효소면역분석 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 생물학적 시료를 코팅용 항체와 반응시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 반응물을 검출용 항체와 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 시료에 포함되어 있는 광견병바이러스와 결합된 검출용 항체의 존재를 효소면역분석에 의하여 검출하는 단계;를 포함하는 광견병바이러스 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단일 사슬 가변 단편(Single-chain variable fragment, scFv)을 포함하는 광견병바이러스 특이 항체를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 광견병바이러스 특이 항체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 광견병바이러스 특이 항체를 포함하는 광견병바이러스 검출용 효소면역분석 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 생물학적 시료를 코팅용 항체와 반응시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 반응물을 검출용 항체와 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 시료에 포함되어 있는 광견병바이러스와 결합된 검출용 항체의 존재를 효소면역분석에 의하여 검출하는 단계;를 포함하는 광견병바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 광견병바이러스 특이 항체를 이용하여 효소면역분석을 수행할 경우 광견병바이러스에 대한 민감도, 특이도 및 정확도가 우수할 뿐만 아니라 고가의 분석 장비 없이도 광견병을 신속하고, 정확하며, 간편하게 진단할 수 있는바, 광견병 예방, 치료 및 진단 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1은 세포 종류에 따른 광견병바이러스 함량 측정 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 광견병바이러스가 접종된 베로 세포의 각 세대별 광견병바이러스 함량 측정 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 광견병바이러스가 접종된 베로 세포의 배양 시간 별 광견병바이러스의 함량 측정 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 광견병바이러스 ERAGS의 G 유전자 염기서열 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 광견병바이러스 ERAGS의 전자현미경 사진 및 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 광견병 특이 항체의 효소면역분석 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 광견병 특이 항체 B2H17의 경쇄 및 중쇄의 상보성결정부위(CDR, complementarity-determining region)를 나타낸 것이다.
도 8은 광견병바이러스 항원의 코팅농도 결정을 위한 효소면역분석 결과를 나타는 도이다.
도 9는 검체 희석 배수 결정을 위한 효소면역분석 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 광견병바이러스 특이 항체와 겨자무과산화효소의 접합체의 희석 배수 결정을 위한 효소면역분석 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 광견병바이러스가 접종된 베로 세포의 각 세대별 광견병바이러스 함량 측정 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 광견병바이러스가 접종된 베로 세포의 배양 시간 별 광견병바이러스의 함량 측정 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 광견병바이러스 ERAGS의 G 유전자 염기서열 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 광견병바이러스 ERAGS의 전자현미경 사진 및 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 광견병 특이 항체의 효소면역분석 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 광견병 특이 항체 B2H17의 경쇄 및 중쇄의 상보성결정부위(CDR, complementarity-determining region)를 나타낸 것이다.
도 8은 광견병바이러스 항원의 코팅농도 결정을 위한 효소면역분석 결과를 나타는 도이다.
도 9는 검체 희석 배수 결정을 위한 효소면역분석 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 광견병바이러스 특이 항체와 겨자무과산화효소의 접합체의 희석 배수 결정을 위한 효소면역분석 결과를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단일 사슬 가변 단편(Single-chain variable fragment, scFv)을 포함하는 광견병바이러스 특이 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서, “광견병바이러스”는 랍도바이러스군에 속하며, 포유동물에게 감염되어 광견병을 발생시킬 수 있는 바이러스를 제한없이 포함하며, 바람직하게는 광견병바이러스 ERAGS를 포함한다. 상기 광견병바이러스 ERAGS는 광견병바이러스 ERA의 돌연변이체로, 보다 상세하게는 광견병바이러스 ERA의 G 단백질이 194번째 아미노산 아스파라긴에서 세린으로, 333번째 아미노산이 아르기닌에서 글루탐산으로 치환된 것이다. 상기 광견병바이러스 ERAGS의 G 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, “단일 사슬 가변 단편(Single-chain variable fragment, scFv)”은 실제로 항체의 단편은 아니지만, 약 10 내지 25 개의 아미노산으로 이루어진 짧은 링커 펩타이드로 연결된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합단백질을 의미한다.
본 발명의 광견병바이러스 특이 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단일 사슬 가변 단편을 포함하고, 상기 단일 사슬 가변 단편의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 생체내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단일 사슬 가변 단편을 포함하는 광견병바이러스 특이 항체를 4G36으로 명명하였다. 상기 광견병바이러스 특이 항체 4G36은 광견병바이러스 ERAGS를 마우스에 접종한 후 마우스의 비장세포를 분리하고, 상기 비장세포와 골수종 세포를 융합하여 제조된 하이브리도마 세포주로부터 생산된 것이다. 효소면역분석을 통해 음성혈청의 평균 흡광도/양성혈청의 평균 흡광도 값(N/P value)을 확인한 결과, 상기 광견병바이러스 특이 항체 4G36은 N/P value가 높아 효소면역분석의 코팅용 항체로 사용하기에 적합함을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 광견병바이러스 특이 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서, “가변영역”은 항체의 변이 부위로서, 중쇄 및 경쇄 N-말단의 약 100 내지 120 개의 아미노산으로 이루어진 부분을 의미한다. 상기 가변영역은 동일 개체에서도 아미노산에 차이가 크며, 이러한 차이는 서로 다른 항원결합부위를 만듦으로서 병원체에 대한 특이성을 만든다.
본 발명의 광견병바이러스 특이 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하고, 상기 경쇄 및 중쇄 펩타이드의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 광견병바이러스 특이 항체를 B2H17로 명명하였다. 상기 광견병바이러스 B2H17은 광견병바이러스 ERAGS를 마우스에 접종한 후 마우스의 비장세포를 분리하고, 상기 비장세포와 골수종 세포를 융합하여 제조된 하이브리도마 세포주로부터 생산된 것이다. 효소면역분석을 통해 음성혈청의 평균 흡광도/양성혈청의 평균 흡광도 값(N/P value)을 확인한 결과, 상기 광견병바이러스 특이항체 B2H17은 N/P value가 낮아 효소면역분석의 검출용 항체로 사용하기에 적합함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 광견병바이러스 특이 항체 4G36 또는 B2H17을 포함하는 광견병바이러스 검출용 효소면역분석 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, “효소면역분석(enzyme linked immunosorvent assay, ELISA)”은 비색법, 화학발광법 및 형광분석법에 기초하는 것을 포함한다. 효소면역분석은 혈장 및 뇨를 포함하는 생물학적 시료 중 소량의 약물 및 기타 항원 성분 측정시에 성공적으로 적용되어 왔으며, 수행이 간편하다는 장점이 있다.
본 발명의 효소면역분석 키트는 상기 광견병바이러스 특이 항체 뿐만아니라, 광견병바이러스를 선별적으로 인지할 수 있는 한 다클론항체, 키메릭-항체, 인간화-항체, 단일클론항체의 단편과 같은 다른 항체를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 효소면역분석 키트는 효소면역분석에 사용되는 도구 및 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 도구 및 시약으로는 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 함께 포함할 수 있다. 상기 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액 또는 불용성 담체를 일 수 있다. 상기 완충액의 예로는 PBS 등이 있으며, 불용성 담체의 예로는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (a) 생물학적 시료를 코팅용 항체와 반응시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 반응물을 검출용 항체와 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 시료에 포함되어 있는 광견병바이러스와 결합된 검출용 항체의 존재를 효소면역분석에 의하여 검출하는 단계;를 포함하는 광견병바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, “생물학적 시료”는 임의의 동물, 예컨대 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원용, 스포츠용 또는 애완용 동물, 예컨대, 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 포유동물로서 분류되는 임의의 동물로부터 분리된 신체 시료를 의미하며, 바람직하게는 광견병 미끼백신을 섭취한 동물, 광견병 생백신 혹은 불활화백신을 접종 받았거나, 받은 것으로 의심되는 동물 유래의 시료이다.
상기 시료는 생물학적 체액, 예컨대, 혈청, 혈장, 유리체액, 림프액, 활액, 소포액, 정액, 양수액, 젖, 전혈, 뇨, 뇌-척수액, 타액, 객담, 눈물, 땀, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지뿐만 아니라, 균질화된 조직, 종양 조직, 및 세포 추출물과 같은 조직 추출물을 포함한다. 바람직하게, 시료는 동물로부터 분리된 혈청이다. 본 발명에서 상기 혈청은, 동물로부터 얻어진 혈액으로부터 혈괴를 제거하고 얻어진 상층액을 사용하되 용혈된 혈청은 제외하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서는 광견병바이러스 특이 항체 4G36을 코팅용 항체로 사용하였다. 상기 코팅용 항체는 지지체에 코팅(고정화)된 형태인 것이 바람직하며, PBS (pH 9.6)에 0.1 내지 10 μl/ml의 농도로 희석한 후 지지체에 코팅되는 것이 바람직하다. 코팅(고정화)은 통상적으로, 분석 절차에 앞서 수-불용성 매트릭스 또는 표면으로의 흡착에 의해 또는 비-공유 또는 공유 커플링에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 질산 및 환원제로 지지체를 미리 활성화시키거나 활성화시키지 않은 채로, 글루타르알데히드 또는 카르보디이미드 가교를 사용하여 포획 시약들을 불용화시키거나, 또는 분석 절차 후에 예로서, 면역침전법에 의해 포획 시약들을 불용화시킴으로써 달성된다.
고정화를 위해 사용되는 고체상은, 예를 들어, 표면, 입자, 다공성 매트릭스 등의 형태의 지지체를 비롯한, 필수적으로 수-불용성이고 면역분석 측정법에서 유용한 임의의 불활성 지지체 또는 담체일 수도 있다. 통상적으로 사용되는 지지체의 예는 작은 쉬트, 세파덱스, 폴리비닐 클로라이드, 플라스틱 비드, 및 96-웰 플레이트를 포함하여 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로부터 제조된 분석 플레이트 또는 시험관 뿐만 아니라 여과지, 아가로스, 가교된 덱스트란 및 기타 다당류와 같은 입상 물질을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 단계 (a)를 수행한 후 단계 (a)의 반응물을 블로킹 용액을 생물학적 시료와 반응시키는 단계를 추가적으로 수행하였다. 구체적으로, 생물학적 시료와 코팅용 항체를 반응시킨 후 나머지 부분의 반응을 정지시키기 위하여, 5 % 스킴밀크 또는 5 % 소혈청알부민과 같은 블로킹 용액을 반응시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는 광견병바이러스 특이 항체 B2H17을 검출용 항체로 사용하였다. 상기 검출용 항체는 코팅용 항체에 결합된 항원(광견병바이러스)에 반응하는 것이 바람직하다. 또한 항원에 결합된 검출용 항체를 효소면역분석을 통해 검출함으로서, 항원인 광견병바이러스의 존재여부를 확인한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 효소면역분석을 위한 항원 제조
효소면역분석(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 사용할 항원을 제조하기 위하여 다량의 광견병바이러스가 필요하다. 또한 배양과정 중 실험자가 광견병바이러스에 노출될 위험이 있어 병원성이 낮거나 없는 광견병바이러스가 필요한바, 하기 과정을 통해 광견병바이러스 항원을 제조하였다.
1-1.
광견병바이러스
증식을 위한 세포주 선정
광견병바이러스 증식을 위한 세포주를 선정하기 위하여, 각 세포에 광견병바이러스를 감염시킨 후 바이러스의 함량을 측정하였다. 상기 광견병바이러스는 마우스 뇌에 접종하여도 안전한 광견병바이러스 ERAGS를 사용하였고, 세포주는 베로(African green monkey kidney cell), BHK-21(baby hamster kidney cell) 및 NG108-15를 이용하였다. 상기 광견병바이러스 ERAGS는 광견병바이러스 ERA의 돌연변이체로, 보다 상세하게는 광견병바이러스 ERA의 G 단백질이 194 번째 아미노산 아스파라긴에서 세린으로, 333 번째 아미노산이 아르기닌에서 글루탐산으로 치환된 것이다.
먼저, 베로 세포를 롤러(roller) 배양기에서 배양하고, 세포밀도가 90 %에 달하였을 때 광견병바이러스 ERAGS를 접종하였다. 접종 96 시간 후 바이러스를 수확하였다. 3 번의 동결 및 융해 과정을 통해 세포 내 바이러스를 세포 외로 유리시킨 후 3500 내지 4000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리하여 세포 찌꺼기를 제거한 후 광견병바이러스의 함량을 측정하였다. BHK-21 및 NG108-15 세포도 베로 세포와 같은 방법으로 광견병바이러스의 함량을 측정하였다. 광견병바이러스 함량 측정 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 광견병바이러스 함량은 베로 및 NG108-15 세포가 가장 높았다. 마우스 신경세포 유래의 NG108-15 세포는 증식능이 좋아 광견병바이러스의 함량은 높게 측정되었으나, 배양 시 세포를 유지하는 것이 어렵다는 단점이 있다. 상기 결과를 토대로 베로 세포를 광견병바이러스 증식을 위한 세포주로 선정하였다.
1-2. 증식을 위한
광견병바이러스
선정
증식을 위한 광견병바이러스를 선정하기 위하여, 베로 세포에 광견병바이러스 ERAGS를 적응시켰다. 구체적으로, 광견병바이러스 ERAGS가 접종된 베로 세포를 10 대까지 계대배양 하였으며, 각 세대의 광견병바이러스 함량을 측정하였다. 각 세대의 광견병바이러스 함량은 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 9 세대 이상 계대한 베로 세포가 광견병바이러스의 함량이 108 FAID50/ml로 가장 높았다. 따라서 10 세대의 광견병바이러스 ERAGS를 증식을 위한 광견병바이러스로 선정하였다.
1-3.
광견병바이러스의
최적 수확시간 선정
광견병바이러스 ERAGS의 최적 수확시간을 조사하기 위하여, 10 세대의 광견병바이러스 ERAGS를 베로 세포에 접종하여 배양하였다. 각 시간마다 광견병바이러스 ERAGS의 함량을 측정하였다. 각 시간별 광견병바이러스 함량 측정 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 광견병바이러스 ERAGS의 함량은 접종 24 시간 후 106 FAID50/ml로 측정되었다. 또한 접종 48 시간 후는 107.5 FAID50/ml였으며, 접종 96 시간 후는 108 FAID50/ml로 가장 높았으나, 그 이후에는 광견병바이러스의 함량이 점차 감소하는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 통해 최적 수확시간은 광견병바이러스 ERAGS 접종 96 시간 후인 것을 알 수 있다.
1-4.
광견병바이러스
G 유전자의 염기서열 분석
실시예 1-2에서 선정한 광견병바이러스 ERAGS에서 G 단백질을 발현하는 유전자의 염기서열 분석을 수행하였다. G 유전자의 염기서열 분석 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 광견병바이러스 ERAGS에서 광견병바이러스의 병원성과 관련이 있는 G 단백질의 194 및 333 번째 아미노산을 암호화하는 염기가 병원성을 가진 광견병바이러스 ERA와 차이가 있는 것을 알 수 있다. 상기 염기의 차이로 인하여, 광견병바이러스 ERAGS의 G 단백질의 194번째 아미노산이 아스파라긴에서 세린으로, 333 번째 아미노산이 아르기닌에서 글루탐산으로 치환된다. 따라서 광견병바이러스 ERAGS는 병원성을 나타내는 G 단백질의 변형으로 인하여 병원성 복귀 가능성이 낮다는 것을 알 수 있다.
1-5.
광견병바이러스의
정제
효소면역분석의 특이도, 민감도 및 정확도에 영향을 미치는 인자들 중 가장 큰 영향을 차지하는 것이 항원의 정제 정도이다. 항원의 정제 순도가 높을수록 효소면역분석의 특이도, 민감도 및 정확도가 높다.
높은 순도의 항원을 얻기 위하여, 네 단계에 거쳐 농축 및 정제하였다.
(i) 실시예 1-2의 광견병바이러스 ERGAS 배양액에 포함된 50 kDa이하의 물질을 제거하기 위하여, 50 내지 100 kDa의 크기를 여과할 수 있는 필터(vivaspin)를 사용하여 광견병바이러스 ERGAS 배양액 1000 ml를 3,000 rpm에서 30분간 원심 분리하였다. 상기 과정을 통해 광견병바이러스 배양액 1000 ml가 100 ml로 농축되었다.
(ii) 삼각플라스크에 1차 농축된 광견병바이러스 ERGAS 배양액 100 ml를 넣은 후 얼음 위에 올려두었다. 상기 삼각플라스크에 0.5 M 염화나트륨 (8.76g/100 ml)과 10 % PEG-8000 (10 g/100 ml)을 첨가하여 용해시켰다. 용해시킨 후 광견병바이러스 ERGAS가 PEG-8000에 응집될 수 있도록 4 ℃에서 12 시간 동안 정치하였다. 그 이후, 3600 rpm에서 30 분 동안 원심 분리하여 침전된 광견병바이러스 ERAGS를 수집하였다. 이때 상층액은 피펫을 통해 모두 제거하였다. 상층액 제거 후 TE 버퍼(50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)를 이용하여 최초 바이러스 용량의 1/50에 해당하는 용액, 즉 2 ml을 첨가하여 광견병바이러스 ERAGS를 부유시켰다. 부유한 용액을 10000 g에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상층액을 얻었다. 이때 상층액에 포함된 광견병바이러스 ERAGS 농축액은 바이러스 이외의 성분이 많기 때문에 효소면역분석의 항원으로 사용하기에 적합하지 않은바, 하기 단계를 수행하였다.
(iii) TE 버퍼를 이용하여 50 %, 40 %, 30 %, 20 % 및 10%의 수크로오스(sucrose) 용액을 제조하였다. 투명한 초원심 튜브에 50 %, 40 %, 30 %, 20 % 및 10%의 수크로오스(sucrose) 용액을 각각 2 ml씩 넣어 농도 구배가 형성되도록 준비하였고, 상기 초원심 튜브에 광견병바이러스 ERAGS 농축액 1 ml을 첨가하였다. 상기 초원심 튜브를 초원심분리기를 이용하여 100000 g에서 3 시간 동안 원심 분리하여 바이러스를 분리하였다. 원심분리한 후 수크로오스 농도 20 %와 30 % 사이에서 보이는 광견병바이러스 ERAGS를 피펫을 이용하여 회수하였다. 회수한 이후에 같은 방법으로 다시 한 번 투석하였다.
(iv) 투석한 광견병바이러스 ERAGS를 아미콘 초원심필터(Amicon ultra centrifugal filter)를 이용하여 여과하였다. 여과된 광견병바이러스 ERAGS의 농도는 1.09 mg/ml 이었다.
상기 단계 (i) 내지 (iv)에 따라 정제된 광견병바이러스 ERAGS를 전자현미경 및 웨스턴 블롯팅으로 확인하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다. 상기 웨스턴 블롯팅은 종래 알려진 방법으로 수행하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 광견병바이러스 ERAGS는 입자의 크기가 80 내지 120 nm임을 확인하였다.
실시예
2. 효소면역분석을 위한 광견병 진단용 항체 제조
2-1.
광견병바이러스
특이 항체 생산 및 정제
광견병에 특이적인 항체는 효소면역분석의 특이도, 민감도에 큰 영향을 미친다. 따라서 광견병바이러스에 특이적인 항체를 얻기 위하여, 실시예 1-5에서 정제한 광견병바이러스 ERAGS를 6 주령 blab/c 마우스에 3 차에 걸쳐 접종하였다. 광견병바이러스 ERAGS가 접종된 마우스의 비장세포와 골수종(myeloma) 세포주인 sp2/0을 융합시켜 하이브리도마(hybridoma)를 제조하였다. 제조된 하이브리도마를 선별한 결과, B2H17, 3E6, 4G36 및 7G48의 하이브리도마를 얻었다. 상기 하이브리도마를 blab/c 마우스 복강에 각각 접종하고, 복강으로부터 복수를 채취하여 항체를 생산하였다. B2H17, 3E6, 4G36 및 7G48을 각각 접종하여 수득한 복수를 친화력 크로마토그래피법으로 정제하였다. 상기 친화력 크로마토그래피는 G 단백질이 충진되어 있는 컬럼에 B2H17, 3E6, 4G36 및 7G48을 각각 주입하였고, 바인딩 버퍼로 컬럼을 3 회 이상 세척한 후 용출액으로 용출시켰다. 항체의 농도를 확인하기 위하여, 상기 용출액을 PBS로 투석한 후 280 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 광견병바이러스 ERAGS에 대한 광견병 특이 항체 B2H17, 3E6, 4G36 및 7G48의 농도는 각각 1.673, 1.056, 1.136 및 0.16 mg/ml이었다.
2-2.
광견병바이러스
특이 항체와
겨자무
과산화효소의 접합체 제조
실시예 2-1에서 정제된 광견병바이러스 특이 항체 B2H17, 3E6, 4G36 및 7G48을 퍼옥시데이즈(peroxidase) 법을 이용하여, 겨자무 과산화효소(horse radish peroxidase, HRP)와 접합시켰다. 구체적으로, HRP를 증류수에 녹인 후 0.1 M 과산화나트륨을 첨가하여 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응한 HRP는 1 mM 아세트산나트륨(pH 4.0)으로 투석하였다. 투석된 HRP와 광견병바이러스 특이 항체 B2H17, 3E6, 4G36 및 7G48을 각가 혼합하여 상온에서 2 시간 동안 교반하여 광견병바이러스 특이 항체-HRP 접합체를 제조하였다. 제조된 광견병바이러스 특이 항체-HRP 접합체를 안정한 상태로 환원시키기 위하여 4 mg/ml의 수산화붕소나트륨을 첨가하여 4 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 환원된 광견병바이러스 특이 항체-HRP 접합체는 PBS로 투석하였다.
2-3. 효소면역분석을 위한 코팅용 항체 및 검출용 항체 선별
실시예 2-1에서 제조된 광견병바이러스 ERAGS에 대한 광견병 특이 항체 중 효소면역분석에 사용할 코팅용 항체 및 검출용 항체를 선별하였다.
먼저, 정제된 광견병 특이 항체 B2H17를 각각 농도 2 μg/ml가 되도록 PBS (pH 9.6)에 희석하였고, 희석된 광견병 특이 항체를 플레이트에 1 차 코팅하여, 22 ℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 플레이트 내의 용액을 버린 후 블로킹 용액(blocking solution)(5 % skim milk in PBS) 200 μl를 플레이트에 첨가하여 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 블로킹 용액을 제거하고, 정제된 광견병바이러스 ERAGS 100 μl를 플레이트에 첨가하여 1차 코팅한 항체와 결합하도록 37 ℃에서 2 시간동안 반응시켰다. 검체 희석액으로는 광견병 음성 혈청 및 양성 혈청을 사용하였다. 상기 검체 희석액을 각각 플레이트에 첨가한 후, 37 ℃에서 1 시간 동안 반응하였다. PBST로 플레이트 표면의 항원과 반응하지 않은 잔여물을 제거하였다. 상기 실시예 2-2에서 제조한 광견병 특이 항체-HRP 접합체를 첨가하고, 37 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 반응 후 세척을 통해 반응하지 않은 광견병 특이 항체-HRP 접합체를 제거하고, TMB 기질(substrate)을 첨가하여 상온에서 15 분 동안 반응시켰다. 그 후 반응정지액을 주입하여 HRP와 TMB의 반응을 중지시킨 후, 발색 정도를 흡광도 측정을 통해 확인하였다. 상기 흡광도 측정은 측정 파장 450 nm, 참조 파장 620 nm이다. 또한 광견병 특이 항체 3E6, 4G36 및 7G48도 상기와 같은 방법으로 흡광도를 측정하였다. 상기 흡광도 측정 결과는 도 6에 나타내었다.
또한 흡광도 측정 결과, 광견병 음성 혈청과 양성 혈청 각각의 평균값을 기준으로, 음성혈청/양성혈청 값(N/P value)이 가장 큰 광견병 특이 항체를 코팅항체로, N/P value가 가장 낮은광견병 특이 항체를 검출용 항체로 선정하였다. 상기 N/P value 계산식은 수학식 1과 같다.
[수학식 1]
N/P value = 음성 혈청 평균 흡광도/양성 혈청 평균 흡광도
도 6에 나타낸 바와 같이, 코팅 항체는 N/P value가 가장 큰 광견병 특이항체 4G36을 선정하였고, 검출용 항체는 N/P value이 가장 낮은 B2H17을 선정하였다.
실시예
3. 효소면역분석을 위한 광견병 진단용 항체의 아미노산 서열 분석
3-1. 광견병 특이 항체
4G36의
아미노산 서열 분석
실시예 2에서 코팅항체로 선정된 광견병 특이 항체 4G36의 단일 사슬 가변 단편(Single-chain variable fragment, scFv)의 아미노산 서열 분석을 수행하였다.
광견병 특이 항체 4G36의 단일 사슬 가변 단편의 아미노산 서열 분석 결과, 광견병 특이 항체 4G36은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시된다는 것을 확인하였다.
3-2. 광견병 특이 항체
B2H17의
동형, 염기서열 및 아미노산 서열분석
실시예 2에서 검출용 항체로 선정된 광견병 특이 항체 B2H17의 동형, 염기서열 및 아미노산 서열을 분석하였다.
먼저, 효소면역분석(ELISA)을 통해 광견병 특이 항체 B2H17의 동형(isotype)을 확인하였다. 구체적으로, 실시예 2-1의 B2H17 하이브리도마 세포의 배양 상층액을 이용하여 효소면역분석을 수행하였고, 상기 효소면역분석은 Thermo Fisher 사의 Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit를 사용하였다. 광견병 특이 항체 B2H17의 동형 분석 결과는 표 1에 나타내었다.
| 동형(Isotype) | 1/50 dil. |
| IgG1 | 1.3310 |
| IgG2a | 0.0340 |
| IgG2b | 0.0320 |
| IgG3 | 0.0250 |
| IgA | 0.0330 |
| IgM | 0.0200 |
| Kappa | 0.1040 |
| Lamda | 0.0210 |
표 1에 나타낸 바와 같이, 광견병 특이 항체 B2H17은 마우스 IgG1/ kappa 형인 것을 알 수 있다.
또한 광견병 특이 항체 B2H17의 염기서열 및 아미노산 서열 분석을 수행하였다. 구체적으로, 실시예 2-1의 B2H17 하이브리도마 세포의 배양 상층액으로부터 DNA를 추출하였다. 상기 DNA 추출은 Bioneer 사의 genomic DNA extraction kit를 이용하였고, 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 또한 추출된 DNA를 이용하여 PCR, TA 클로닝 및 시퀀싱을 수행하여 가변영역(variable region)을 분석하였다. 구체적으로, TaKaRa Ex Taq(RR001A, TaKaRa)를 이용하여 합성된 DNA의 PCR을 수행하였고, PCR 산물로 TA 클로닝을 수행하였다. 상기 TA 클로닝은 pGEM-T Easy 벡터(A1360, Promega)를 사용하였다. 또한 TA 클로닝 산물의 시퀀싱을 수행하여 가변영역의 염기서열 및 아미노산 서열을 분석하였다.
광견병 특이 항체 B2H17의 염기서열 및 아미노산 서열 분석 결과에 따르면, 광견병 특이 항체 B2H17의 경쇄(light chain)의 가변영역은 서열번호 3의 염기서열로 표시되며, 상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열은 서열번호 4로 표시되는 아미노산을 암호화한다는 것을 확인하였다. 또한 광견병 특이 항체 B2H17의 중쇄(heavy chain)의 가변영역은 서열번호 5의 염기서열로 표시되고, 상기 서열번호 5로 표시되는 염기서열은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산을 암호화한다는 것을 확인하였다. 또한 광견병 특이 항체 B2H17 경쇄 및 중쇄의 상보성결정부위(CDR, complementarity-determining region)는 도 7과 같다.
실시예
4. 광견병 진단을 위한 효소면역분석의 최적 조건 확립
4-1.
광견병바이러스
항원
ERAGS의
코팅 농도 결정
광견병바이러스 항원 ERAGS의 최적 코팅 농도를 조사하였다.
코팅 항체 4G36를 PBS (pH 9.6)을 이용하여 2.0 μg/ml가 되도록 희석하였다. 농도가 2.0 μg/ml인 코팅 항체 4G36을 96 웰 플레이트에 1차 코팅하고, 블로킹 용액으로 블로킹하였다. 블로킹 용액을 세척한 후, 정제된 광견병바이러스 ERAGS의 농도가 탄산염 버퍼(carbonate buffer) 내에서 각각 0.96, 0.74 및 0.62 μg/ml이 되도록 96 웰 플레이트에 첨가하였고, 코팅 항체 4G36과 결합하도록 2 시간 동안 반응시켰다. 반응된 96 웰 플레이트에 광견병 음성 및 양성 혈청을 각각 첨가한 후 검출용 항체 B2H17을 첨가하여 반응시켰다. 반응 종료 후 96 웰 플레이트를 PBST 버퍼로 2 회 세척하여 96 웰 플레이트의 흡광도를 측정하였다. 항원 코팅 농도별 흡광도 측정 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 항원인 정제된 광견병바이러스 ERAGS를 농도 0.92 μg/ml가 되도록 첨가하였을 때, 흡광도가 가장 높았다. 이러한 결과는 항원을 농도 0.92 μg/ml가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다는 것을 의미한다.
4-2. 검체 희석 배수 결정
효소면역분석에 사용될 검체인 혈청의 최적 희석 배수를 조사하였다.
구체적으로, 코팅 항체 4G36를 PBS (pH 9.6)로 2.0 μg/ml가 되도록 희석하였다. 농도가 2.0 μg/ml인 코팅 항체 4G36을 96 웰 플레이트에 1차 코팅하고, 블로킹 용액으로 블로킹하였다. 블로킹 용액을 세척한 후, 정제된 광견병바이러스 ERAGS의 농도가 탄산염 버퍼(carbonate buffer) 내에서 0.96 μg/ml가 되도록 96 웰 플레이트에 첨가하였고, 코팅 항체 4G36과 결합하도록 2 시간 동안 반응시켰다. 광견병 음성 및 양성 혈청을 각각 5, 10, 및 20 배 희석하여 검체 희석액을 제조하였다. 상기 반응된 96 웰 플레이트에 검체 희석액을 각각 첨가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 검출용 항체 B2H17을 첨가하여 다시 한 번 반응시켰다. 발색제 및 발색정지 용액은 상기 실시예 4-1과 동일한 것을 이용하였고, 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 반응 종료 후 96 웰 플레이트를 PBST 버퍼로 2 회 세척하여, 96 웰 플레이트의 흡광도를 측정하였다. 검체 희석 배수별 흡광도 측정 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 광견병 음성 혈청은 희석 배수에 상관 없이 0.2 이하의 흡광도가 측정되었다. 반면에, 광견병 양성 혈청은 5 배로 희석한 검체 희석액을 사용하였을 때 가장 높은 흡광도를 보였다. 이러한 결과는 효소면역분석 시 검체인 혈청을 5 배 희석하는 것이 바람직하다는 것을 의미한다.
4-3.
광견병바이러스
특이 항체와
겨자무과산화효소의
접합체의 희석 배수 결정
효소면역분석 시 광견병바이러스 ERAGS 특이 항체-HRP 접합체의 최적 희석 배수를 조사하였다.
코팅 항체 4G36를 PBS (pH 9.6)을 이용하여 2.0 μg/ml가 되도록 희석하였다. 농도가 2.0 μg/ml인 코팅 항체 4G36을 96 웰 플레이트에 1차 코팅하고, 블로킹 용액으로 블로킹하였다. 블로킹 용액을 세척한 후, 정제된 광견병바이러스 ERAGS의 농도가 탄산염 버퍼(carbonate buffer) 내에서 0.96 ug/ml가 되도록 96 웰 플레이트에 첨가하였고, 코팅 항체 4G36과 결합하도록 2 시간 동안 반응시켰다. 광견병 음성 및 양성 혈청을 5 배 희석하여 검체 희석액을 제조하였다. 상기 반응된 96 웰 플레이트에 검체 희석액을 각각 첨가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 검출용 항체 B2H17을 첨가하여 다시 한 번 반응시켰다. 반응 종료 후 96 웰 플레이트 PBST 버퍼로 2 회 세척하였고, 항체-HRP 접합체액의 농도가 4, 2 및 1 μg/ml이 되도록 하였다. 발색제 및 발색정지 용액은 상기 실시예 4-1과 동일한 것을 이용하였고, 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 항체-HRP 접합체 희석 배수별 흡광도 측정 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 광견병 음성 혈청은 항체-HRP 접합체액의 농도에 상관없이 0.2 이하의 흡광도를 나타냈다. 반면에 광견병 양성 혈청은 음성 혈청보다 흡광도가 높았으며, 특히 항체-HRP 접합체의 농도가 2 μg/ml인 경우 N/P value 값이 19.1로 가장 높게 나타냈다. 이러한 결과는 효소면역분석 시 항체-HRP 접합체액의 농도는 2 μg/ml인 것이 바람직하다는 것을 의미한다.
종합적으로, 광견병 진단을 위한 효소면역분석의 최적 조건은 항원의 농도가 0.92 μg/ml, 혈청 희석 배수는 5 배, 항체-HRP 접합체액의 농도는 2 μg/ml임을 확인하였으며, 상기 조건 시 효소면역분석의 민감도 및 정확도가 우수하다.
실시예
5. 효소면역분석을 이용한 광견병 진단의 민감도, 특이도 및 정확도 확인
5-1. 개 혈청을 이용한 분석
실시예 4에서 조사한 효소면역분석 최적 조건 하에서 개 혈청으로부터 광견병바이러스를 검출할 수 있는지 확인하였다. 구체적으로, 코팅항체 4G36 2 μg/ml를 96 웰 플레이트에 코팅하고, 정제한 광견병바이러스 항원 0.92 μg/ml를 플레이트에 코팅하였다. 코팅된 96 웰 플레이트에 138개의 개 혈청을 5 배 희석한 후 100 μl 씩 첨가하였다. 다른 실험 조건 및 방법은 상기 실시예 4-1의 방법과 동일하게 실시하였다. 실험에 사용한 개 혈청은 바이러스 중화시험(FAVN)을 통해 양성 및 음성을 이미 판단한 혈청이며, 본 실시예의 효소면역분석의 민감도, 특이도 및 정확도 확인을 위한 비교대상으로 이용되었다. 개 혈청의 효소면역분석 및 바이러스 중화 시험(FAVN)의 비교 결과는 표 2에 나타내었다.
| 바이러스 중화 시험(FAVN) | 합계 | |||
| 양성 | 음성 | |||
| 효소면역분석 | 양성 | 23 | 4 | 27 |
| 음성 | 1 | 110 | 111 | |
| 합계 | 24 | 114 | 138 | |
표 2의 효소면역분석 및 바이러스 중화 시험 비교 결과를 바탕으로, 효소면역분석의 민감도, 특이도 및 정확도를 계산하였다. 민감도, 특이도 및 정확도의 계산식은 하기와 같다.
[수학식 2]
민감도 (%) = 
[수학식 3]
특이도 (%) = 
[수학식 4]
정확도 (%) = 
표 2의 결과를 바탕으로 수학식 2 내지 4에 따라 계산한 결과, 개 혈청에 대한 효소면역분석의 민감도, 특이도 및 정확도는 각각 95.8, 96.5 및 96.3 %임을 확인하였다.
5-2. 너구리 혈청을 이용한 분석
실시예 4에서 조사한 효소면역분석 최적 조건 하에서 너구리 혈청으로부터 광견병바이러스를 검출할 수 있는지 확인하였다. 개 혈청 대신 너구리 혈청을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 5-1과 동일하게 실험을 실시하였다. 실험에 사용한 너구리 혈청은 바이러스 중화시험(FAVN)을 통해 양성 및 음성을 이미 판단한 혈청이며, 본 실시예의 효소면역분석의 민감도, 특이도 및 정확도 확인을 위한 비교대상으로 이용되었다. 너구리 혈청의 효소면역분석 및 바이러스 중화 시험(FAVN)의 비교 결과는 표 3에 나타내었다.
| 바이러스 중화 시험(FAVN) | 합계 | |||
| 양성 | 음성 | |||
| 효소면역분석 | 양성 | 20 | 0 | 20 |
| 음성 | 0 | 12 | 12 | |
| 합계 | 20 | 12 | 32 | |
표 3의 효소면역분석 및 바이러스 중화 시험 비교 결과를 바탕으로, 효소면역분석의 민감도, 특이도 및 정확도를 수학식 2 내지 4에 따라 계산한 결과, 고양이 혈청에 대한 효소면역분석의 민감도, 특이도 및 정확도는 모두 100 %임을 확인하였다.
5-3. 고양이 혈청을 이용한 분석
실시예 4에서 조사한 효소면역분석 최적 조건 하에서 고양이 혈청으로부터 광견병바이러스를 검출할 수 있는지 확인하였다. 개 혈청 대신 고양이 혈청을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 5-1과 동일하게 실험을 실시하였다. 실험에 사용한 고양이 혈청은 바이러스 중화시험(FAVN)을 통해 양성 및 음성을 이미 판단한 혈청이며, 본 실시예의 효소면역분석의 민감도, 특이도 및 정확도 확인을 위한 비교대상으로 이용되었다. 고양이 혈청의 효소면역분석 및 바이러스 중화 시험(FAVN)의 비교 결과는 표 4에 나타내었다.
| 바이러스 중화 시험(FAVN) | 합계 | |||
| 양성 | 음성 | |||
| 효소면역분석 | 양성 | 10 | 0 | 10 |
| 음성 | 1 | 14 | 15 | |
| 합계 | 11 | 14 | 25 | |
표 4의 효소면역분석 및 바이러스 중화 시험 비교 결과를 바탕으로, 효소면역분석의 민감도, 특이도 및 정확도를 수학식 2 내지 4에 따라 계산한 결과, 고양이 혈청에 대한 효소면역분석의 민감도, 특이도 및 정확도는 각각 90.9, 100 및 96 %임을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 광견병바이러스 ERAGS에 특이적인 항체를 개발하고, 상기 광견병바이러스 ERAGS에 특이적인 항체를 이용한 효소면역분석의 최적 조건을 확인하였다. 이를 이용하여 광견병 신속하고 정확하게 진단할 수 있고, 고가의 분석 장비 없이도 광견병 진단이 가능함을 의미하는 바, 본 발명의 광견병 진단을 위한 효소면역분석은 광견병 예방, 치료, 및 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Rabies virus-specific antibody and detecting method of rabies
virus using thereof
<130> 1-90P
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1575
<212> DNA
<213> rabies virus
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1575)
<223> rabies virus ERAGS G gene
<400> 1
atggttcctc aggctctcct gtttgtaccc cttctggttt ttccattgtg ttttgggaaa 60
ttccctattt acacgatacc agacaagctt ggtccctgga gcccgattga catacatcac 120
ctcagctgcc caaacaattt ggtagtggag gacgaaggat gcaccaacct gtcagggttc 180
tcctacatgg aactaaaagt tggatacatc ttagccataa aaatgaacgg gttcacttgc 240
acaggcgttg tgacggaggc tgaaacctac actaacttcg ttggttatgt cacaaccacg 300
ttcaaaagaa agcatttccg cccaacacca gatgcatgta gagccgcgta caactggaag 360
atggccggtg accccagata tgaagagtct ctacaaaatc cgtaccctga ctaccgctgg 420
cttcgaactg taaaaaccac caaggagtct ctcgttatca tatctccaag tgtggcagat 480
ttggacccat atgacagatc ccttcactcg agggtcttcc ctagcgggaa gtgctcggga 540
gtagcggtgt cttctaccta ctgctccact aaccacgatt acaccatttg gatgcccgag 600
aatccgagac tagggatgtc ttgtgacatt tttacctcca gtagagggaa gagagcatcc 660
aaagggagtg agacttgcgg ctttgtagat gaaagaggcc tatataagtc tttaaaagga 720
gcatgcaaac tcaagttatg tggagttcta ggacttagac ttatggatgg aacatgggtc 780
gcgatgcaaa catcaaatga aaccaaatgg tgccctcccg atcagttggt gaacctgcac 840
gactttcact cagacgaaat tgagcacctt gttgtagagg agttggtcag gaagagagag 900
gagtgtctgg atgcactaga gtccatcatg acaaccaagt cagtgagttt cagacgtctc 960
agtcatttaa gaaaacttgt ccctgggttt ggaaaagcat ataccatatt caacaagacc 1020
ttgatggaag ccgatgctca ctacaagtca gtcgaaactt ggaatgagat catcccttca 1080
aaagggtgtt taagagttgg ggggaggtgt catcctcatg tgaacggggt gtttttcaat 1140
ggtataatat taggacctga cggcaatgtc ttaatcccag agatgcaatc atccctcctc 1200
cagcaacata tggagttgtt ggaatcctcg gttatccccc ttgtgcaccc cctggcagac 1260
ccgtctacca ttttcaagga cggtgacgag gccgaggatt ttgttgaagt tcaccttccc 1320
gatgtgcaca atcaggtctc aggagttgac ttgggtctcc cgaactgggg gaagtatgta 1380
ttactgagtg caggggccct gactgccttg atgttgataa ttttcctgat gacatgttgt 1440
agaagagtca atcgatcaga acctacgcaa cacaatctca gagggacagg gagggaggtg 1500
tcagtcactc cccaaagcgg gaagatcata tcttcatggg aatcacacaa gagtggaggt 1560
gagaccagac tgtga 1575
<210> 2
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rabies virus-specific antibody 4G36 scFv
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser
20 25 30
Asp Tyr Leu Met Phe Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Thr Ile Ser Tyr Asn Leu
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Arg Tyr Asp Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Asp Ile Glu Leu Thr Gln
115 120 125
Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser
130 135 140
Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
145 150 155 160
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Thr Asp Phe Arg Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp
195 200 205
Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
210 215 220
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu
225 230 235
<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rabies virus-specific antibody B2H17
<400> 3
gacattgtga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60
atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agttatttaa actggttcca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccaa tcactag 357
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rabies virus-specific antibody B2H17
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 342
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rabies virus-specific antibody B2H17
<400> 5
gaggtcaagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggagcttc aatgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga accttgagtg gattggactt attaatcctt acaatggtga tactagctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccaa cacagcctac 240
atggagctcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgc aactaccccc 300
tttgaccact ggggccaagg caccactctc acagtctctt ca 342
<210> 6
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rabies virus-specific antibody B2H17
<400> 6
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Thr Pro Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
Claims (9)
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단일 사슬 가변 단편(Single-chain variable fragment, scFv)을 포함하는 광견병바이러스 특이 항체.
- 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 광견병바이러스 특이 항체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 광견병바이러스 특이 항체는 광견병바이러스 ERAGS을 항원으로 하는 것을 특징으로 하는 광견병바이러스 특이 항체.
- 제3항에 있어서,
상기 광견병바이러스 ERAGS는 G 유전자가 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 광견병바이러스 특이 항체.
- 제1항 또는 제2항에 따른 광견병바이러스 특이 항체를 포함하는 광견병바이러스 검출용 효소면역분석 키트.
- (a) 생물학적 시료를 코팅용 항체와 반응시키는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 반응물을 검출용 항체와 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 시료에 포함되어 있는 광견병바이러스와 결합된 검출용 항체의 존재를 효소면역분석에 의하여 검출하는 단계;를 포함하는 광견병바이러스 검출 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 코팅용 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단일 사슬 가변 단편(Single-chain variable fragment, scFv)을 포함하는 광견병 특이 항체 4G36인 것을 특징으로 하는 광견병바이러스 검출 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 검출용 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 광견병 특이 항체 B2H17인 것을 특징으로 하는 광견병바이러스 검출 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈장, 전혈, 혈청, 뇨 및 타액으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 광견병바이러스 검출 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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ID=67064907
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| KR1020170167753A KR101990795B1 (ko) | 2017-12-07 | 2017-12-07 | 광견병바이러스 특이 항체 및 이를 이용한 광견병바이러스 검출방법 |
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Citations (2)
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| KR20110091284A (ko) * | 2010-02-05 | 2011-08-11 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 광견병 바이러스를 중화하는 단클론항체 ４Ｇ３１의 ｓｃＦｖ유전자 및 이를 발현한 재조합단백질 |
| KR20150016590A (ko) * | 2012-05-24 | 2015-02-12 | 마운트게이트 그룹 리미티드 | 광견병 감염의 방지 및 치료에 관한 조성물 및 방법 |
-
2017
- 2017-12-07 KR KR1020170167753A patent/KR101990795B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20110091284A (ko) * | 2010-02-05 | 2011-08-11 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 광견병 바이러스를 중화하는 단클론항체 ４Ｇ３１의 ｓｃＦｖ유전자 및 이를 발현한 재조합단백질 |
| KR20150016590A (ko) * | 2012-05-24 | 2015-02-12 | 마운트게이트 그룹 리미티드 | 광견병 감염의 방지 및 치료에 관한 조성물 및 방법 |
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