KR20110091284A - 광견병 바이러스를 중화하는 단클론항체 ４Ｇ３１의 ｓｃＦｖ유전자 및 이를 발현한 재조합단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광견병 바이러스를 중화하는 단클론항체 4G31의 scFv 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 16의 염기 및 아미노산 서열을 갖는 광견병 바이러스(RAV)를 특이적으로 중화하는 4G31 scFv(single chain variable fragment antibody) 유전자 및 이의 발현벡터 등에 관한 것이다.
본 발명은 동물과 사람에 발생하여 많은 인명피해 및 경제적인 피해를 주는 광견병의 원인체인 RAV를 중화할 수 있는 4G31 scFv 단백질과 관련된 발명으로서, 치료용 면역글로불린을 대신하여 RAV를 중화시킴으로써 광견병에 의한 피해를 줄일 수 있는 치료제가 될 수 있으므로 제조한 단백질은 광견병의 진단에 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 광견병의 예방 및 치료의 기본물질로 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 동물과 사람에 발생하여 많은 인명피해 및 경제적인 피해를 주는 광견병의 원인체인 RAV를 중화할 수 있는 4G31 scFv 단백질과 관련된 발명으로서, 치료용 면역글로불린을 대신하여 RAV를 중화시킴으로써 광견병에 의한 피해를 줄일 수 있는 치료제가 될 수 있으므로 제조한 단백질은 광견병의 진단에 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 광견병의 예방 및 치료의 기본물질로 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 광견병 바이러스를 중화하는 단클론항체 4G31의 scFv 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 16의 염기 및 아미노산 서열을 갖는 광견병 바이러스(RAV)를 특이적으로 중화하는 4G31 scFv (single chain variable fragment antibody) 유전자 및 이의 발현벡터 등에 관한 것이다.
scFv를 기술적으로 작성하는 방법에 대한 연구로는 Ward 등(1989)이 마우스 유래 항체의 대장균 발현 단쇄 가변(single variable) 도메인이 원래의 IgG 항체와 동일한 특이도 및 항원결합능을 가지고 있음을 보고한 이래 Holliger와 Hudson(2005, Review)이 scFv를 포함하여 다양한 형태의 항체분자를 활용한 바이오치료제 등 다양한 활용과 산업화 현황 및 전망을 보고한 바 있다. 수의학 관련분야에서도 병원체에 중화능이 있는 scFv를 이용한 예방 또는 치료제에 효과를 입증하는 연구는 Gould 등(2005)의 웨스트나일 바이러스(West Nile virus)에서의 치료효과 연구, 돼지에서 설사 등을 일으키는 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis 바이러스)에 대하여 Veiga 등(2003)과 돼지유행성설사병(porcine epidemic diarrhea 바이러스)에 대하여 Pyo 등(2009)이 중화능이 있는 단클론항체의 scFv를 치료제로 활용하는 연구결과를 보고한 바 있다. 바이러스 분야 뿐 만 아니라, Almquist 등(2006)의 파상풍균의 독소에 대한 중화능 연구 등 세균 등에서도 최근까지 활발히 보고되고 있다.
특히 RAV에 대한 scFv와 관련된 보고로는 Muller 등(1997)이 파아지 디스플레이(Phage-display) 기술을 이용하여 RAV를 중화하는 마우스 scFv의 생산을 보고한 바 있고 Zhao 등(2004, 2008)은 동일한 기술을 이용하여 RAV 중화 에피톱(epitope)에 반응하는 사람 scFv를 생산하여 특성을 보고한 바 있다. Mousli 등(2007, 2008)이 scFv 와 효소의 융합단백질을 이용하여 광견병바이러스 진단에 활용하는 보고 등이 있었다.
사람에게서는 공수병이라고도 불리는 광견병은 아시아지역에서 매년 3만 여명을 사망시키고 있는 중요한 인수공통전염병의 하나이다. 일단 감염되어 신경증상 등이 증상을 나타내면 사망하게 되는 전염병으로 주로 광견병에 걸린 동물에 물려 광견병에 걸리게 되며 사람에서는 물린 후 적절한 조치를 취하면 질병에 걸리지 않을 수 있다. 그 적절한 조치로는 공수병 백신과 면역글로불린을 투여하는 방법이다. 그러나 이 고도로 면역된 말 또는 사람에게서 혈청을 분리하여 생산하기 때문에 물량이 한정될 뿐만 아니라 매우 고가로 특히 후진국 또는 개발도상국 등에서는 경제적인 이유 때문에 적절한 조치를 받지 못하여 사망하는 경우가 많은 실정이다.
본 발명의 목적은 감염시 사람의 사망 및 온혈동물의 폐사를 일으키는 주요한 인수공통전염병인 광견병을 중화할 수 있는 scFv를 대량으로 발현하여 치료제로 개발할 수 있는 기초물질을 확보하고자 함이다. 즉 본 발명은 동물과 사람에 발생하여 많은 인명피해 및 경제적인 피해를 주는 광견병의 원인체인 RAV를 중화할 수 있는 4G31 scFv 단백질과 관련된 발명으로서, 치료용 면역글로불린을 대신하여 RAV를 중화시킴으로써 광견병에 의한 피해를 줄일 수 있는 광견병의 진단, 예방 및 치료의 기본물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 과제를 해결하고자 본 발명은 서열번호 16의 염기 및 아미노산 서열을 갖는 광견병 바이러스(RAV)를 특이적으로 중화하는 4G31 scFv(single chain variable fragment antibody) 유전자를 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 4G31 scFv 유전자를 발현시킨 것을 특징으로 하는 도 3의 유전자 지도를 가지는 발현벡터 및 상기의 4G31 scFv 유전자를 대장균에서 발현시킨 것을 특징으로 하는 단백질을 제공한다.
보다 상세하게는 본 발명은 서열번호 16의 염기 및 아미노산 서열을 갖는 광견병 바이러스(RAV)를 특이적으로 중화하는 4G31 scFv(single chain variable fragment antibody) 유전자를 제공한다.
본 발명에서 상기 4G31 scFv는 scFv를 구성하는 중쇄 가변(VH) 부위 및 경쇄 가변(VL) 부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 4G31 단클론항체 임을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 상기의 4G31 scFv 유전자를 발현시킨 것을 특징으로 하는 도 3의 유전자 지도를 가지는 발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 4G31 scFv 유전자를 대장균에서 발현시킨 것을 특징으로 하는 단백질을 제공한다.
광견병은 인수공통전염병의 하나로서 일단 감염되어 신경증상 등이 증상을 나타내면 사망하게 되는 전염병으로 주로 광견병에 걸린 동물에 물려 광견병에 걸리게 되며 사람에서는 물린 후 적절한 조치를 취하면 질병에 걸리지 않을 수 있다. 그 적절한 조치로는 공수병 백신과 면역글로불린을 투여하는 방법이다. 그러나 이 고도로 면역된 말 또는 사람에게서 혈청을 분리하여 생산하기 때문에 물량이 한정될 뿐만 아니라 매우 고가로 특히 후진국 또는 개발도상국 등에서는 경제적인 이유 때문에 적절한 조치를 받지 못하여 사망하는 경우가 많다. 이에 본 발명은 본 발명은 광견병 바이러스를 중화하는 단클론항체 4G31의 scFv 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질을 제공함으로써 치료용 면역글로불린을 대신하여 RAV를 중화시킴으로써 광견병에 의한 피해를 줄일 수 있게 되므로 광견병의 진단에 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 광견병의 예방 및 치료의 기본물질로 기여하는 유리한 효과가 있다.
도 1은 RAV에 중화능이 있는 4G31 항체의 VH 및 VL 유전자의 개별 증폭 및 4G31 scFv 유전자를 클로닝하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 4G31 항체의 VH 및 VL 유전자와 링커 유전자를 각각 PCR 증폭하고 전기영동한 사진이다((A)는 4G31 항체의 VH 및 VL 유전자를 PCR 증폭하고 확인한 사진으로, 레인 1은 PCR 증폭한 4G31 항체의 VH 유전자, 레인 2는 사이즈 마커, 레인 3은 PCR 증폭한 4G31 항체의 VL 유전자이다. (B)는 링커 유전자를 PCR 증폭 GKRH 확인한 사진으로, 레인 1은 사이즈 마커, 레인 2는 PCR 증폭한 링커 유전자이다. (C)는 4G31항체의 scFv 유전자를 PCR 증폭하고 확인한 사진으로, 레인 1은 사이즈 마커, 레인 2는 PCR 증폭한 링커 유전자이다.).
도 3은 클로닝한 4G31 scFv 유전자를 대장균에서 발현하기 위한 "pRSARscFv" 플라스미드의 개열지도이다.
도 4는 대장균에서 발현된 4G31 scFv 단백질을 전기영동하고 Western blot 분석한 결과이다((A)는 대장균에서 발현된 4G31 scFv 단백질을 전기영동한 사진으로, 레인 M은 단백질 사이즈 마커(size marker), 레인 1은 동일조건으로 배양한 일반 대장균, 레인 2은 4G31 항체의 scFv를 발현하는 대장균이다. (B)는 대장균에서 발현된 4G31 scFv 단백질을 항 히스티딘 항체를 이용하여Western blot 분석한 사진으로, 레인 M은 단백질 사이즈 마커(size marker), 레인 1은 동일조건으로 배양한 일반 대장균, 레인 2는 4G31 항체의 scFv를 발현하는 대장균이다.)
도 5는 4G31 복수액이 221의 RAV 중화능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 4G31 항체의 VH 및 VL 유전자와 링커 유전자를 각각 PCR 증폭하고 전기영동한 사진이다((A)는 4G31 항체의 VH 및 VL 유전자를 PCR 증폭하고 확인한 사진으로, 레인 1은 PCR 증폭한 4G31 항체의 VH 유전자, 레인 2는 사이즈 마커, 레인 3은 PCR 증폭한 4G31 항체의 VL 유전자이다. (B)는 링커 유전자를 PCR 증폭 GKRH 확인한 사진으로, 레인 1은 사이즈 마커, 레인 2는 PCR 증폭한 링커 유전자이다. (C)는 4G31항체의 scFv 유전자를 PCR 증폭하고 확인한 사진으로, 레인 1은 사이즈 마커, 레인 2는 PCR 증폭한 링커 유전자이다.).
도 3은 클로닝한 4G31 scFv 유전자를 대장균에서 발현하기 위한 "pRSARscFv" 플라스미드의 개열지도이다.
도 4는 대장균에서 발현된 4G31 scFv 단백질을 전기영동하고 Western blot 분석한 결과이다((A)는 대장균에서 발현된 4G31 scFv 단백질을 전기영동한 사진으로, 레인 M은 단백질 사이즈 마커(size marker), 레인 1은 동일조건으로 배양한 일반 대장균, 레인 2은 4G31 항체의 scFv를 발현하는 대장균이다. (B)는 대장균에서 발현된 4G31 scFv 단백질을 항 히스티딘 항체를 이용하여Western blot 분석한 사진으로, 레인 M은 단백질 사이즈 마커(size marker), 레인 1은 동일조건으로 배양한 일반 대장균, 레인 2는 4G31 항체의 scFv를 발현하는 대장균이다.)
도 5는 4G31 복수액이 221의 RAV 중화능을 나타낸 그래프이다.
본 발명인 광견병 바이러스(RAV)를 특이적으로 중화하는 4G31 scFv(single chain variable fragment antibody) 유전자에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 우선, 마우스 유래인 하이브리도마로부터 단클론항체의 scFv를 클로닝하는 기술을 확립하고 이를 이용하여 돼지유행성설사병 바이러스(RAV)에 중화능이 높은 4G31 항체의 scFv 유전자를 클로닝하고 염기서열 분석하여 4G31항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산의 구성을 파악하고자 한다. 또한 분석된 4G31 항체의 scFv 유전자를 발현한 재조합단백질 역시 RAV에 대한 중화능을 가지고 있음을 증명함으로써 본 발명의 4G31 scFv 유전자 및 이를 발현한 단백질이 광견병 (PED)에 대한 직접적 치료제로써의 가능성을 확인하고자 한다.
즉, RAV에 대한 중화능이 확인된 본 발명의 단백질을 경제적으로 대량생산하여 광견병에 대한 치료제를 생산함으로써 고가의 항-광견병 면역글로불린을 대체할 수 있는 항체 혼합액(cocktail)의 주요성분으로 고가의 기존제품을 대체할 수 있다. 면역 글로불린이 가격이 획기적으로 낮아질 경우 가축 등 동물에 대한 광견병 치료 등 방역 수단으로서의 치료제를 개발하는 기술 및 원료을 확보하고자 한다. 본 발명에서 사용한 기술인 단클론항체의 scFv를 클로닝 및 발현하는 기술은 수의분야의 다른 질병에서도 적용이 가능한 활용도 높은 기술로 판단된다.
광견병 바이러스를 특이적으로 중화하는 단클론항체 4G31항체의 중쇄 가변부위(VH) 및 경쇄 가변부위(VL)를 코딩하는 염기서열 및 아미노산 서열과 이를 단쇄로 연결한 scFv(single chain variable fragment) 유전자, 그리고 이와 동일한 염기서열을 가진 scFv 유전자를 삽입하여 제작한 발현벡터 및 광견병에 대한 치료제로 사용할 수 있는 이를 발현한 단백질로 구성된다.
이하 각종 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 4G31 하이브리도마(hybridoma) 세포로부터 total RNA의 분리
RAV를 항원으로 면역한 Balb/c 마우스의 비장세포와 골수암세포(myeloma)를 융합하여 작성한 단클론항체 중 4G31 항체는 200 TCID50 / ㎖ 역가의 RAV CVS주에 대하여 4G31 하이브리도마 배양 상층액에서 7 〉102 과 4G31 복수액에서 5 〉106 의 RAV에 대한 중화능을 확인하였다. 중화능을 나타낸 4G31 항체의 VH 및 VL 유전자를 클로닝하기 위해 도 1과 같이 RT-PCR 방법을 이용하였으며(도 1 참조), 이를 위해 4G31 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 total RNA를 분리하여 실시예 2와 같이 cDNA를 제작하였다. Total RNA의 추출은 RNeasy mini kit (Qiagen)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였고 추출한 total RNA는 -70℃에 보관, 사용하였다.
<실시예 2> total RNA로부터 4G31 VH 및 VL 유전자의 증폭, 클로닝
Klebber 등(1997)이 보고한 논문 및 Burmester와 Pluckthun (2001, Kontermann과 Dubel [eds], Antibody Engineering[Springer])의 2장을 참조하여 마우스의 VH 및 VL 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 설계하였다. VH 센스 프라이머는 VH 유전자의 일차적 증폭을 위해 "VH1BACK"(5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3' : 서열번호 1) 프라이머를 설계하였으며 링커 연결 후 발현벡터로의 삽입을 위한 제한효소 싸이트인 SfiI을 5' 말단에 연장시키고 개시코돈을 삽입시킨 "VH1sfiI" (5'-GCAACTGCGGCCCAGCCGGCC-ATG- GCCCAGGTSMAR CTGCAGSAGTCWGG-3' : 서열번호 2) 프라이머를 설계하였다. VH 안티센스 프라이머는 cDNA 합성 및 VH 유전자 일차적 증폭을 위해 "VH2FOR" (5'-TGAGGAGACGGTGACCG TGGTCCCTTGGCCCC-3' : 서열번호 3) 프라이머를 설계하고 각 프라이머들은 올리고핵산을 주문합성(Bioneer, Korea)하여 사용하였다.
VL 센스 프라이머는 VL 유전자의 일차적 증폭을 위해 "VL1BACK" (5'-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3' : 서열번호 4) 프라이머를 설계하였으며 VL 안티센스 프라이머는 cDNA 합성 및 VH 유전자 일차적 증폭을 위해 VL 유전자 3말단의 다양성에 때문에 4종의 프라이머 즉, "VL2FOR1" (5'-CCGTTTGATTTCCAGCTTGGT GCC-3' : 서열번호 5), "VL2FOR2" (5'-CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3' : 서열번호 6), "VL2FOR3" (5'-CCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC-3' : 서열번호 7) 및 "VL2FOR4" (5'-CCGTTTC AGCTCCAGCTTGGTCCC-3' : 서열번호 8)를 설계하였고 링커 연결 후 발현벡터로의 삽입을 위한 제한효소 싸이트인 NotI을 각각의 VL 안티센스 프라이머의 5' 말단에 연장시키고 전이(translation) 종결(stop) 코돈을 삽입시킨 4종의 "VL2NOT1" (5'-GAG-TCA-TTCT-GCGGCCGC- CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3' : 서열번호 9), "VL2NOT2" (5'-GAG-TCA-TTCT-GCGGCCGC-CCGTTTTATTTCCAGCTTGGT CCC -3' : 서열번호 10), "VL2NOT3" (5'-GAG-TCA-TTCT-GCGGCCGC -CCGTTTTATTTCCA ACTTTGTCCC-3' : 서열번호 11) 및 "VL2NOT4" (5'-GAG-TCA-TTCT-GCGGCCGC- CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC -3' : 서열번호 12) 프라이머를 설계하였고 올리고핵산을 주문합성(Bioneer, Korea)하여 사용하였다.
VH 유전자를 클로닝하기 위해 우선 상기 실시예 1에서 추출한 total RNA 2 과 2 pmole의 VH 안티센스 프라이머 "VH2FOR"를 사용하였고, VL 유전자를 클로닝하기위해서는 실시예 1에서 추출한 total RNA 2 과 VL 안티센스 프라이머 "VL2FOR1", "VL2FOR2", "VL2FOR3" 및 "VL2FOR4" 4종을 각각 0.5 pmole 씩 최종농도가 2 pmole 첨가하여 SuperScriptTM II 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 42℃에서 50분간 반응하여 VH 및 VL 유전자의 first-strand cDNA를 각각 작성하였다.
VH 유전자 증폭을 위해서는 작성된 VH 유전자의 cDNA 5㎕, 10 pmole /㎕ 의 VH1BACK 및 VH2FOR 프라이머 각 1㎕를 사용하였고, VL 유전자 증폭을 위해서는 작성된 VH 유전자의 cDNA 5㎕, 10 pmole/㎕의 VL1BACK 1㎕ 및 각 10 pmole/㎕의 "VH2FOR1", "VH2FOR2", "VH2FOR3" 및 "VH2FOR4" 프라이머를 동량으로 혼합한 1㎕ 를 사용하여 Expand Long Template PCR system (Roche, Germany)으로 제조사의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은 94℃ 2분 반응 후 94℃ 10초, 55℃ 30초, 68℃ 4분 조건에서 10 cycle 실시 후 94℃ 15초, 55℃ 30초, 68℃ 4분을 시작으로 매 cycle마다 20초를 증가시키는 조건에서 20 cycle을 실시한 후 68℃에서 8분 연장(elongation) 반응을 실시하였다.
PCR 실시 후 증폭된 VH 유전자는 도 2의 (A) 레인 1에서와 같이 약 365 bp에 해당하는 band를 확인할 수 있었으며 VL 유전자는 도 3의 (A) 레인 3에서와 같이 약 336 bp에 해당하는 band를 확인할 수 있었다. 이들 VH 및 VL 유전자 각각을 pGemTeasy (Promega)에 TA 클로닝하여 "pG4G31VH" 및 "pG4G31VL" 플라스미드를 작성하고 염기서열 분석하여 확인하였다.
<실시예 3> 4G31 VH 및 VL 유전자로부터 scFv 작성 및 염기서열 분석 확인
실시예 2에서 증폭된 VH 및 VL유전자를 단쇄형으로 연결하기 위하여 도 1과 같이 링커의 5' 말단의 염기서열이 VH 유전자의 3' 말단과 링커의 3' 말단이 VL 유전자의 5' 말단 염기서열이 중첩되도록 각각 연장시킨 (Gly4Ser)3 형태의 링커(5'-GACCACGGTCACCGTCTCCTCA-GGTGGAGGCGGTTCA-GGCGGAGGTGGCTCT-GGCGGTGGCGGATCG -GACATTGAGCTCACCCAGTCTC-3' : 서열번호 13)를 설계하였고 이 단일쇄(single stranded)의 올리고뉴클레오타이드 링커 유전자를 이중쇄(double stranded)로 만들기 위한 센스 "LINKVH" (5'-GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA-3' : 서열번호 14) 및 안티센스 "LINKVL" (5'TGGAGACTGGGTGAGCTCAATGTC-3' : 서열번호 15) 프라이머를 설계하고 올리고핵산을 주문합성(Bioneer, Korea)하여 사용하였다. 합성한 단일쇄의 링커 유전자를 "LINKVH" 및 "LINKVL" 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다.
확인된 이중쇄의 링커 유전자와 실시예 2에서 증폭된 VH 및 VL 유전자를 도 1과 같이 Linker PCR하여 "VH-linker-VL" 순으로 scFv 유전자를 증폭하고 이를 주형(template)으로 실시예 2에서 작성한 SfiI을 5' 말단에 연장시키고 개시코돈을 삽입시킨 센스 프라이머 "VH1sfiI" 및 NotI을 5' 말단에 연장시키고 종결(stop) 코돈을 삽입시킨 4종의 안티센스 프라이머 4종 "VH2NOT1", "VH2NOT2", "VH2NOT3" 및 "VH2NOT4"를 사용하여 5' 말단에 SfiI과 3' 말단에 NotI 싸이트가 연장된 4G31 scFV 유전자를 증폭하였고 그 결과는 도 2의 (C) 레인 2와 같이 약 784 bp의 밴드를 확인할 수 있었다. 증폭된 유전자는 pGemTeasy (Promega) 플라스미드에 TA 클로닝하여 "pG4G31scFvF" 플라스미드를 작성하고 염기서열을 분석하여 확인하였으며 4G31 scFv의 염기서열은 이하 표 1 및 표 2(서열번호 16)에 나타내었다. VH 및 VL유전자의 프레임워크 부위(framwork regions; "FRs")와 상보적 결정부위(complementarity determining regions; 이하 "CDRs"라 한다), 그리고 두 유전자를 연결하는 링커 등의 구성은 이하 표 1 및 표 2의 염기서열(서열번호 16)에 표시한 바와 같고 이를 클로닝한 "pG4G31scFvF" 플라스미드를 작성하였다.
상기 표 1 및 표 2는 4G31 scFv 단백질 발현을 위하여 5' 말단에 SfiI 싸이트 및 전이(translation) 개시코돈(ATG)과 3' 말단에 NotI 싸이트 및 정지(stop) 코돈(TGA)을 삽입하여 클로닝된 4G31 항체의 scFV 유전자의 구성부위를 표시한 염기 및 아미노산 서열이다. "FR" 은 "framework region" 을 나타내며 "CDR" 은 complementarity determining region" 을 나타낸다.
[실시예 4] 4G31 scFv 발현 대장균 벡터 작성 및 발현
상기 실시예 3에서 "pG4G31scFvF"에 클로닝 및 염기서열 분석 확인된 4G31 scFv 유전자를 대장균 발현 벡터인 "pRSET"(Invtrogen)에 삽입시키기 위하여 도 2와 같이 개시코돈의 5' 말단쪽에 BamHI 싸이트를 연장시킨 4G31FB (5'-CGCGGATCC-ATG GCCCAGGTCCAACTGCAG-3' : 서열번호 17) 프라이머 및 XhoI 싸이트를 5' 말단에 연장시키고 stop 코돈을 삽입시킨 4G31RX('5-CCGCTCGAG-TCA-TTCTGCGGCCGCCCGTTT -3' : 서열번호 18) 프라이머를 사용하여 "pG4G31scFvF"를 템플레이트로 이용하여 PCR 증폭하고 BamHI 및 XhoI으로 처리한 760bp의 유전자 분절을 "pRSET-A" (Invtrogen) 플라스미드를 BamHI 및 XhoI으로 처리한 3.8kb의 유전자 분절과 라이게이션(ligation)하여 "pRSET4G31scFv" 플라스미드를 작성하였으며 플라스미드의 유전자 지도는 도 3에 나타내었다.
4G31scFv 유전자의 대장균에서의 발현은 "pRSET4G31scFv" 플라스미드를 E.coli BL21(DE3)pLysS 균주에 형질전환(tranformation)하여 제조사의 pRSET A, B, and C 킷트(Invitrogen) 매뉴얼에 따라 발현하였다.
[실시예 5] 대장균 발현 4G31 scFv 단백질의 정제
실시예 4에서 대장균에서 발현된 4G31 scFv의 단백질의 정제는 변성(denature) 조건에서 ProBond Purification system (Invitrogen)을 사용하여 4G31의 scFv와 융합 형태로 발현된 단백질의 연속된 6개의 히스티딘(Histidine; 이하 "6x His"라 한다)과 니켈-나이트릴로트리아세틱 에시드(nickel-nitrilotriacetic acid; 이하 "Ni-NTA" 라 한다)간의 결합력을 이용하여 정제하였으며 제조사의 방법에 따라 실시하였다. 50 ㎍/㎖ 농도의 암피실린(ampicillin) 및 35 ㎍/㎖ 클로람페니콜(chloramphenicol)이 첨가된 LB배지에서 24시간 배양된 pRSARscFv 플라스미드로 형질전환된 BL21(DE3)pLysS 2 ㎖를 100 ㎖의 신선한 LB배지에 37에서 광학밀도(optical density; "OD") 600에서 0.4~0.5까지 흡광도를 나타낼 때까지 진탕배양하고 1 mM 되게 이소프로필-베타-디-티오갈락토시드(isopropyl-β-D-thiogalactoside; 이하 "IPTG"라 한다) 첨가하여 유도(induction)시킨 후 4시간 추가 진탕배양한 후 50㎖을 변성(denaturing) 조건으로 정제하였다.
변성(denature) 조건에서의 정제는 50 ㎖을 원침한 세균체를 8 ㎖의 6M의 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride; 이하 "GuHCl"이라 한다)조건의 용해액(lysis buffer; 100 mM NaH2PO4; 10 mM Tris; 6 M GuHCl; pH 8)에 용해하고 실온에서 5분 처리 후 초음파 파쇄(sonication)하여 원심한 뒤 상층액을 세척과정을 거친 Ni-NTA 수지(resin)에 실온에서 30분 동안 반응시켜 결합시켰다. 반응 후 4 ㎖의 pH 6의 denaturing 세척액(100 mM NaH2PO4; 10 mM tris·Cl; 8 M Urea, pH 6.0)으로 2회 및 pH 5.3의 denaturing 세척액으로 2회 세척 후 5 ㎖의 pH 4.0의 세척분리액(elution buffer, 100 mM NaH2PO4; 10 mM Tris·Cl; 8 M Urea)으로 세척 분리하여 사용하였다.
[실시예 6] 대장균 발현 4G31 scFv 정제 단백질의 RAV 중화능 분석
상기 실시예 5에서 정제된 대장균 발현 4G31 scFv 및 4G31 하이브리도마를 마우스 복강내에 접종하여 생산, 수확한 복수액(ascite)과 함께 RAV에 대한 중화능을 측정하였다. 먼저, 우태아 혈청이 첨가되지 않은 일반배양배지 즉, 비필수아미노산(Gibco) 및 항균-항진균제(Gibco)가 첨가된 a-MEM(Gibco) 조직배양 배지를 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하고, 0.25 ㎎/㎖(pH 6.0)의 정제된 denature 형태의 재조합 scFv 단백질, 그리고 대조군으로 4G31 단클론항체 복수액 각각을 각 2개의 첫 번째 웰에 50 ㎕씩 첨가하고 두 배 단계로 희석하였고, RAV는 국내분리주로 조직배양에 순화(adaptation)된 200 TCID50/㎖의 ERA주를 마이크로 플레이트의 각 웰에 50 ㎕첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 이때 바이러스 희석액이 각 웰에 100 TCID50/㎖가 되도록 정확히 첨가되었는가를 확인하기 위하여 200 TCID50/㎖ 바이러스를 10배, 100배, 및 1,000배로 희석하여 최종적으로 100, 10, 1 및 0.1 TCID50/㎖이 되도록 첨가한 역상 역가측정(back titration)을 함께 실시하였다. 1시간 반응 후 10%의 우태아혈청이 포함된 배지에 Vero 세포를 2 × 105/ 되게 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 72시간 배양하여 결과를 도립현미경하에서 CPE여부를 판독하여 중화능의 정도를 확인하였다. 그 결과 도 5와 같이 4G31 복수액은 221의 RAV 중화능을 나타내었고 대장균에서 발현하여 정제한 0.25 ㎎/㎖의 재조합 4G31 scFv 단백질은 24 즉 16배의 중화능을 확인할 수 있었다.
사람에게서는 공수병이라고도 불리는 광견병은 아시아지역에서 매년 3만 여명을 사망시키고 있는 중요한 인수공통전염병의 하나이다. 일단 감염되어 신경증상 등이 증상을 나타내면 사망하게 되는 전염병으로 주로 광견병에 걸린 동물에 물려 광견병에 걸리게 되며 사람에서는 물린 후 적절한 조치를 취하면 질병에 걸리지 않을 수 있다. 그 적절한 조치로는 공수병 백신과 면역글로불린을 투여하는 방법이다. 그러나 이러한 것들은 고도로 면역된 말 또는 사람에게서 혈청을 분리하여 생산하기 때문에 물량이 한정될 뿐만 아니라 매우 고가로 특히 후진국 또는 개발도상국 등에서는 경제적인 이유 때문에 적절한 조치를 받지 못하여 사망하는 경우가 많다. 이에 본 발명은 본 발명은 광견병 바이러스를 중화하는 단클론항체 4G31의 scFv 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질을 제공함으로써 광견병의 진단에 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 광견병의 예방 및 치료의 기본물질로 기여할 수 있을 것이므로 산업상이용가능성이 높다고 할 것이다.
또한 본 발명의 유전자 및 단백질은 RAV에 대한 중화능이 확인된 본 발명의 단백질을 경제적으로 대량생산하여 광견병에 대한 치료제를 생산함으로써 고가의 항-광견병 면역글로불린을 대체할 수 있는 항체 혼합액(cocktail)의 주요성분으로 고가의 기존제품을 대체할 수 있어 산업상 매우 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Korea (National Veterinary Research and Quarantine Service)
<120> scFv gene and its recombinant protein of 4G31, monoclonal
antibody, neutralizing Rabies virus
<160> 16
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH1BACK PCR primer
<400> 1
aggtsmarct gcagsagtcw gg 22
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH1sfiI PCR primer
<400> 2
gcaactgcgg cccagccggc catggcccag gtsmarctgc agsagtcwgg 50
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH2FOR PCR primer
<400> 3
tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc cc 32
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL1BACK PCR primer
<400> 4
gacattgagc tcacccagtc tcca 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL2FOR1 PCR primer
<400> 5
ccgtttgatt tccagcttgg tgcc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL2FOR2 PCR primer
<400> 6
ccgttttatt tccagcttgg tccc 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL2FOR2 PCR primer
<400> 7
ccgttttatt tccaactttg tccc 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL2FOR4 PCR primer
<400> 8
ccgtttcagc tccagcttgg tccc 24
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL2NOT1 PCR primer
<400> 9
gagtcattct gcggccgccc gtttgatttc cagcttggtg cc 42
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL2NOT2 PCR primer
<400> 10
gagtcattct gcggccgccc gttttatttc cagcttggtc cc 42
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL2NOT3 PCR primer
<400> 11
gagtcattct gcggccgccc gttttatttc caactttgtc cc 42
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL2NOT4 PCR primer
<400> 12
gagtcattct gcggccgccc gtttcagctc cagcttggtc cc 42
<210> 13
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 13
gaccacggtc accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg 60
cggatcggac attgagctca cccagtctc 89
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense LINKVH primer
<400> 14
gggaccacgg tcaccgtctc ctca 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense LINKVL primer
<400> 15
tggagactgg gtgagctcaa tgtc 24
<210> 16
<211> 783
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4G31 scFv gene sequence
<400> 16
gcccagccgg ccatggccca ggtgcagctg cagcagtcag gacctgaact ggtgaagcct 60
ggggcttcag tgaggatatc ctgcaaggct tctggttatt ctttcagtga ctacctcatg 120
ttctgggtga agcagagcca tggaaagagc cttgagtgga ttggaaatat tagtccttac 180
tatggtacta ttagttacaa tctgaagttt aagggcaagg ccacattgac tgtagacaaa 240
tcttccagca cagcctacat gcagctcaac agtctgacat ctgaggactc tgcagtctat 300
tactgtgcaa gagaaaggag gtacgacggg gattactatg ctatggacta ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctcgggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 420
ggcggatcgg acattgagct cacccagtct ccagcttctt tggctgtgtc tctagggcag 480
agggccacca tctcctgcag agccagcgaa agtgttgata attatggcat tagttttatg 540
aactggttcc aacagaaacc aggacagcca cccaaactcc tcatctatgc tgcatccaac 600
caaggatccg gggtccctgc caggtttagt ggcagtgggt ctgggacaga cttcagactc 660
aacatccatc ctatggagga ggatgatact gcaatgtatt tctgtcagca aagtaaggag 720
tttccgtaca cgttcggagg ggggaccaag ctggaaataa aacgggcggc cgcagaatga 780
ctc 783
Claims (4)
- 서열번호 16의 염기 및 아미노산 서열을 갖는 광견병 바이러스(RAV)를 특이적으로 중화하는 4G31 scFv(single chain variable fragment antibody) 유전자.
- 제1항에 있어서, 상기 4G31 scFv는 scFv를 구성하는 중쇄 가변(VH) 부위 및 경쇄 가변(VL) 부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 4G31 단클론항체 임을 특징으로 하는 광견병 바이러스(RAV)를 특이적으로 중화하는 4G31 scFv(single chain variable fragment antibody) 유전자.
- 특허청구범위 제1항의 4G31 scFv 유전자를 발현시킨 것을 특징으로 하는 도 3의 유전자 지도를 가지는 발현벡터.
- 특허청구범위 제1항의 4G31 scFv 유전자를 대장균에서 발현시켜 얻어진 단백질.
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| KR20190067626A (ko) * | 2017-12-07 | 2019-06-17 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 광견병바이러스 특이 항체 및 이를 이용한 광견병바이러스 검출방법 |
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2010
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