KR101798131B1 - Ｐｃｖ２에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 ｐｍｗｓ의 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지 써코바이러스 2형(porcine circovirus 2; PCV2)에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 돼지 전신소모성 증후군(Post weaning Multi-systemic Wasting Syndrome; PMWS)의 진단 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 돼지 써코바이러스 2형의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질의 단일클론항체 C4-1 및 C4-8 및 이를 이용한 돼지 전신소모성 증후군의 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단일클론항체는 PCV2에 대한 항체가 백신 항원에 의한 중화항체인지 면역회피로 유도된 항체인지 여부에 대한 판별을 가능하게 한다.

Description

ＰＣＶ２에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 ＰＭＷＳ의 진단 방법{PCV2-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY AND METHOD FOR DIAGNOSING PMWS USING THE SAME}
본 발명은 돼지 써코바이러스 2형(porcine circovirus 2; PCV2)에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 돼지 전신소모성 증후군(Post weaning Multi-systemic Wasting Syndrome; PMWS)의 진단 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 돼지 써코바이러스 2형의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cκ 융합 재조합 단백질의 단일클론항체 C4-1 및 C4-8 및 이를 이용한 돼지 전신소모성 증후군의 진단 방법에 관한 것이다.
돼지 써코바이러스 2형(porcine circovirus 2; PCV2)은 약 1.76kb의 단일가닥의 환상 DNA 게놈을 함유하는 소형의 정이십면체의 비-외피형 바이러스로 써코비리데(Circoviridae)과로 분류되며 2개의 주요 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)이 있다. ORF1은 바이러스 복제 단백(Rep)을 만들며, ORF2는 켑시드단백(capsid protein; CP)를 만들어 낸다(J. Gillespie등 J Vet Intern Med, 2009,23,1151-6, Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated disease). PCV2의 ORF2가 전사되어 만들어진 캡시드 단백(capsid protein: CP)은 3개씩 모여 1개의 면을 이루며 20면이 모인 정 20면체의 icosahedral 구조를 취하여 바이러스 유사입자(virus-like particles: VLP) 구조가 완성된다. 각 CP 서브 유닛을 이루는 아미노산 잔기 169에서 180은 강력한 주요항원 결정부위로 알려져 있다. 이 항원 결정부[CP(169~180)]는 VLP 구조에서는 안쪽에 묻혀있어 밖으로 노출되지 않아 항체의 접근이 어려워 바이러스를 중화항체와는 관계가 낮다.
바큘로바이러스(Baculovirus)에서 발현된 CP로 만든 PCV2 VLP를 면역시킨 경우는 높은 중화항체가 만들어지는 반면 항 CP(169~180) 항체는 잘 만들어지지 않으나, CP 단량체를 면역한 경우 또는 PCV2에 감염되어 PMWS 상태의 돼지들에서는 중화항체는 낮게 형성되는 반면 항 CP(169~180) 항체가 높게 만들어지는 경향을 보이므로 CP(169~180) 항원결정부는 면역학적인 회피(decoy)역할을 하는 것으로 추정되고 있다 (Trible BR등, J Virol. 2012 86(24)13508~14, Recognition of the different structural forms of the capsid protein determines the outcome following infection with porcine circovirus type 2). 그러므로, PCV2 백신을 개발하고자 할 때 PCV2에 대한 중화항체는 높이 형성되고 항 CP(169~180) 항체는 잘 형성되지 않도록 PCV2 백신항원에 CP(169~180)잔기가 외부로 노출되지 않도록 VLP가 잘 형성된 항원을 백신으로 사용할 필요가 있다.
한편, PCV2의 항체 검출법은 IPMA(Immunoperoxidase monolayer assay) 및 PCV2 바이러스 입자 및 재조합 CP를 이용한 ELISA법이 개발되어 이용되고 있다(Pileri E등 Vet J. 2014, 201(3)429-32, Comparison of the immunoperoxidase monolayer assay and three commercial ELISAs for detection of antibodies against porcine circovirus type 2). 그러나, PCV2 VLP 백신 접종된 돼지는 PCV2의 복제가 억제되며 높은 중화항체를 보이는 반면, PCV2에 감염되어 질병으로 진행된 돼지에서는 PCV2를 중화하지 못하는 항체 특히 CP의 C-말단에 대한 항체의 역가가 높이 올라가므로 PCV2에 대한 단순 항체가 만으로는 PCV2의 정확한 진단이 어렵다(Trible BR등, Vaccine 2012(30) 4079~85, Antibody responses following vaccination versus infection in a porcine circovirus-type 2 (PCV2) disease model show distinct differences in virus neutralization and epitope recognition).
따라서, PCV2의 항체 진단에 있어서도 PCV2에 대한 항체의 역가 뿐만 아니라 PCV2에 대한 항체가 중화항체인지 바이러스 중화와 관련이 낮은 CP의 C-말단의 면역 회피와 관련된 부위에 대한 항체인지 구분할 필요가 있다.
본 발명은 돼지 써코바이러스 2형(porcine circovirus 2; PCV2)에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 돼지 전신소모성 증후군(Post weaning Multi-systemic Wasting Syndrome; PMWS)의 진단 방법을 제공하고자 한다.
일 측면에 따르면, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)에 특이적인 단일클론항체가 개시된다.
본 발명에 따른 단일클론항체에 있어서, 상기 단일클론항체는 PCV2의 회피항원결정부위(decoy epitope)에 특이적으로 결합하는scFV-human Cκ 융합 재조합 단백질일 수 있다.
본 발명에 따른 단일클론항체에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질은 C4-1, C4-8, 또는 C4-1 및 C4-8일 수 있다.
본 발명에 따른 단일클론항체에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위는 169번 내지 180번에 위치하는 12개의 아미노산일 수 있다.
본 발명에 따른 단일클론항체에 있어서, 상기 아미노산은 STIDYFQPNNKR일 수 있다.
다른 측면에 따르면, 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단일클론항체, 검출 표지, 상기 검출 표지가 결합되는 단일클론항체 및 상기 검출 표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 돼지 전신소모성 증후군(Post weaning Multi-systemic Wasting Syndrome; PMWS)의 진단 시약이 개시된다.
본 발명에 따른 진단 시약에 있어서, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단일클론항체는 PCV2의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cκ 융합 재조합 단백질일 수 있다.
본 발명에 따른 진단 시약에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질은 C4-1, C4-8, 또는 C4-1 및 C4-8일 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 효소결합면역측정법을 이용한 PCV2 항체의 특성 분석 방법이 개시된다. 상기 방법은:
본 발명의 일 측면에 따른 단일클론항체가 PCV2형 감염개체 또는 백신개체의 혈청내 항체와 경쟁반응을 하는 단계;
상기 단일클론항체의 흡광도를 측정하는 단계; 및
상기 단일클론항체의 흡광도로부터 상기 혈청내 항체가 중화항체 또는 면역회피 유도 항체인지 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 PCV2 항체의 특성 분석 방법에 있어서, 상기 방법은 단일클론항체의 흡광도가 일정하게 유지되는 경우 중화항체로 판별하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 PCV2 항체의 특성 분석 방법에 있어서, 상기 방법은 단일클론항체의 흡광도가 감소하는 경우 면역회피 유도 항체로 판별하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 효소결합면역측정법을 이용한 돼지 써코바이러스 2형(PCV2) 항원 내의 회피항원의 정량 방법이 개시된다.
본 발명에 따른 PCV2 항원 내의 회피항원의 정량 방법에 있어서, 상기 PCV2에 특이적인 단일클론항체로서 PCV2의 회피항원결정부위(decoy epitope)에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 PCV2 항원 내의 회피항원의 정량 방법에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질은 C4-1, C4-8, 또는 C4-1 및 C4-8일 수 있다.
본 발명에 따른 PCV2 항원 내의 회피항원의 정량 방법에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위는 169번 내지 180번에 위치하는 아미노산 STIDYFQPNNKR 일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 단일클론항체는 PCV2에 대한 항체가 백신 항원에 의한 중화항체인지 면역회피로 유도된 항체인지 여부에 대한 판별을 가능하게 할 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따른 PCV2의 감염에 따른 decoy epitope의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 실시예 4에 따른 닭의 면역 라이브러리를 이용한 바이오 패닝(Bio-panning)으로부터 무작위로 선별된 96개 클론의 흡광도를 나타낸다.
도 3은 실시예 5에 따른 선별된 C4-1 및 C4-8 클론의 scFv를 포유 세포에서 인간 면역글로블린 Cк 융합 형태의 단백질로 발현시키기 위한 서브 클로닝 벡터 정보를 나타낸다.
도 4는 실시예 6에 따른 선별된 C4-1 및 C4-8의 scFv-human Cк 융합 재조합 단백질 형태가 169번에서 180번 위치의 아미노산에 특이적으로 결합하는 것을 확인하는 흡광도 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 6에 따른 C4-1 및 C4-8을 scFv-human Cк 융합 재조합 단백질의 CP-BSA 펩타이드에 대한 친화도를 확인하는 흡광도 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예 7에 따른 C4-1 및 C4-8을 scFv-human Cк 융합 재조합 단백질이 CP-BSA 펩타이드에 대해 돼지 혈청과 competition 하는 것을 확인하는 흡광도 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예 7에 따른 C4-1 및 C4-8을 scFv-human Cк 융합 재조합 단백질이 CP-BSA 펩타이드에 대해 PCV2 VLP(Virus like particle, Icosahedral)로 백신을 접종한 20마리의 돼지군과 백신 접종을 하지 않아 PCV2의 감염에 노출된 20마리의 돼지군에 대한 competition ELISA의 흡광도 측정 결과를 나타낸다.
달리 정의된 바 없다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원의 전체 개시를 통해 언급되는 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 공보, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 출판물은, 달리 알려진 바 없다면, 그 전체가 참조로써 삽입된다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 그러한 식별자는 바뀔 수 있으며, 인터넷 상의 특정 정보는 변화될 수 있으나, 동등한 정보가 인터넷을 검색하여 발견될 수 있다. 본원의 참조는 그 이용가능성 및 상기 정보의 공중의 보급성을 증명한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 천연의 혹은 부분 또는 전부 합성된, 예컨대 재조합으로 제조된, 전장 면역글로불린의 특이성 결합력을 보유하는 면역글로불린 분자의 가변 영역의 일부 이상을 포함하는 임의의 단편을 포함하는, 면역글로불린 및 면역글로불린 단편을 나타낸다. 따라서, 항체는 면역글로불린 항원-결합 도메인 (항체 결합 부위)와 상동이거나, 실질적으로 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 상기 항체는 합성 항체, 재조합적으로 제조된 항체, 다중특이적 항체, 사람 항체, 비-사람 항체, 사람화 항체, 키메라항체, 인트라바디 또는 항체 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 항체는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이황화-결합 Fv (dsFv), Fd 단편, Fd' 단편, 단일-사슬 Fv (scFv), 단일-사슬 Fab (scFab), 디아바디, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 또는 상기 중 임의의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "중화 항체"는 병원체에 결합하여, 세포를 감염시키거나/시키고 피험자에 질환을 야기하는 병원체의 능력을 방해하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 중화 항체의 예는 바이러스, 박테리아 및 진균 병원체에 결합하는 중화 항체이다. 전형적으로, 본원에서 제공되는 중화 항체는 병원체의 표면에 결합한다. 바이러스의 분류에 따라, 표면 단백질은 캡시드 단백질 또는 바이러스성 외피 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단일클론항체"는 단일클론항체들의 집단 내 각각의 개별적 항체 분자가 다른 것들과 동일한 것을 의미하는, 동일한 항체의 집단을 나타낸다. 이러한 성질은 복수의 상이한 서열들을 갖는 항체들을 포함하는 항체들의 다중클론 집단의 항체와 대조된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fv 항체"단편은 비공유적 상호작용에 의하여 연결된 1개의 가변 중사슬 도메인(VH) 및 1개의 가변 경사슬 도메인(VL)으로 구성되는 항체의 단편이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "scFc 단편"은 임의의 순서로 폴리펩타이드 링커에 의해 공유 결합된, 가변 경사슬(VL) 및 가변 중사슬(VH)를 포함하는 항체 단편을 나타낸다. 상기 링커는 2개의 가변 도메인이 실질적인 간섭 없이 가교되도록 하는 길이이다. 링커의 예는 일부 Glu 또는 Lys 잔기가 용해도 증가를 위하여 전체에 분산되어 있는 (Gly-Ser)n 잔기들이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "링커" 또는 "스페이서" 펩타이드는 2개의 폴리펩타이드 서열 (또는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산)을 결합하는 아미노산의 짧은 서열을 나타낸다. "폴리펩타이드 링커"는 2개의 폴리펩타이드 서열을 결합하는 아미노산의 짧은 서열을 나타낸다. 폴리펩타이드 링커의 예는 펩타이드 전달 도메인을 항체에 연결하는 링커, 또는 2개의 항체 사슬을 합성 항체 단편, 예를 들면 scFv 단편 내에 결합하는 링커이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리펩타이드"는 공유결합된 2 이상의 아미노산들을 의미한다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "펩타이드"는 2 내지 약 또는 40 개의 아미노산 길이인 폴리펩타이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산"은 아미노기와 카르복실산기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩타이드는 둘 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 제공되는 항체 내에 포함된 아미노산은 20개의 천연-발생 아미노산, 비천연 아미노산 및 아미노산 유사체(예를 들면, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산 잔기"는 그 펩타이드 결합에서 폴리펩타이드의 화학적 소화(가수분해)시형성되는 아미노산을 나타낸다. 본원에 기재된 아미노산 잔기는 일반적으로 "L" 이성체 형태이다. "D" 이성체 형태 내 잔기는 원하는 기능적 성질이 폴리펩타이드에 의해 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH2는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 나타낸다. COOH는 폴리펩타이드의 카르복시 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체의 "성질"은 이에 제한되지 아니하나 결합 특이성, 구조적 배치 또는 형태, 단백질 안정성, 단백질가수분해에 대한 저항성, 구조적 안정성, 열적 내성, 및 pH 조건에 대한 내성을 포함한 폴리펩타이드에 의해 나타나는 임의의 성질을 의미한다. 성질의 변화는 폴리펩타이드의 "활성"을 변경할 수 있다. 예를 들어, 항체 폴리펩타이드의 결합 특이성의 변화는 항원에 결합능 및/또는 다양한 결합 활성들, 예를 들면, 친화력 또는 결합력 또는 폴리펩타이드의 생체내 활성을 변경할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체의 "활성" 또는 "기능적 활성"은 폴리펩타이드에 의해 나타나는 임의의 활성을 나타낸다. 상기 활성들은 실험적으로 결정될 수 있다. 상기 활성은 항원-결합, DNA 결합, 리간드 결합 또는 이량체화, 효소활성, 예를 들어, 키나제 활성 또는 단백질가수분해 활성을 통한 생체분자와 상호작용하는 능력을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체에 대한 활성은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 항원-결합의 친화력, 항원-결합의 결합력, 결합속도(on-rate), 해리속도(off-rate), 이펙터 기능, 예를 들면 항원 중화 또는 제거, 바이러스 중화 촉진능, 및 생체내 활성, 예를 들면 병원체의 감염 또는 침습을 예방하거나, 제거를 촉진하거나, 특별한 조직 또는 체액 또는 세포를 투과하는 능력을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 활성은 알려진 측정 방법, 예를 들면, ELISA, 유세포분석기, 표면 플라스몬 공명 또는 결합- 또는 해리-속도를 측정하는 동등한 측정 방법, 면역조직화학법 및 면역형광조직학 및 현미경관찰, 세포-기반 측정법, 유세포 분석 및 결합 분석법(예를 들면, 패닝(panning) 분석)을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "올리고"는 동의어로 사용된다. 올리고뉴클레오타이드는 제한된 길이의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 당업자는 올리고뉴클레오타이드가 일반적으로 약 또는 250 이하, 전형적으로 약 또는 200 이하, 전형적으로 약 또는 100 이하의 뉴클레오타이드 길이인 것으로 인식한다. 전형적으로 본원에서 제공되는 올리고뉴클레오타이드는 합성 올리고뉴클레오타이드이다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 약 또는 250 또는 200 뉴클레오타이드 보다 적은 길이, 예를 들면, 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 보다 짧은 길이의 뉴클레오타이드를 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드이다. 끝의 "머"는 올리고뉴클레오타이드의 길이를 나타내는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, "100-머" 는 100 뉴클레오타이드 길이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 언급하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산 분자"는 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들면 뉴클레오타이드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 "골격" 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합 (펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 (핵산 분자)는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA) 뿐 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머"는 적절한 조건 하(예를 들면, 4개의 상이한 클레오시드 트리포스페이트 및 중합화제, 예를 들면, DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재)에 적절한 완충액 및 적절한 온도에서 주형-유도(template-directed) 핵산 합성의 개시점으로써 작용할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 제공될 수 있음이 이해될 수 있다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록시기를 가진다. 프라이머는 다양한 방법, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역-전사효소(RT)-PCR, RNA PCR, LCR, 다중 PCR, 팬핸들(panhandle) PCR, 캡쳐PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 인 시츄(in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 다른 증폭 프로토콜에서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 예를 들면, PCR에 의해 증폭되는 서열의 5' 말단과 특이적으로 혼성화하는 5' (상류) 프라이머 및 증폭되는 서열의 3' 말단의 상보물과 특이적으로 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 의미한다. "프라이머"는 동일한 핵산 분자의 풀로 언급되기 때문에, 프라이머 쌍은 일반적으로 프라이머들의 2 풀의 쌍이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "패닝(panning)"은 결합 파트너에 대한 특이성을 갖는 분자, 예를 들면, 포획 분자(예를 들면, 항원) 또는 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 영역, 부분 또는 위치를 표시하는 파지의 분리를 위한 친화력-기반 선택 절차를 의미한다
본 명세서에서 사용된 용어 "분리된" 또는 "정제된" 폴리펩타이드 또는 단백질 (예를 들면, 분리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편) 또는 이들의 생물학적으로 활성인 부분 (예를 들면, 분리된 항원-결합 단편)은 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예를 들면, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에의하여 결정되어, 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예를 들면, 효소 및 생물학적 활성을 탐지가능하게 변경하지 않도록 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 경우, 추가 정제가 화합물의 특이적 성질을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 단수 형태인 "하나의" "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 반대로 구술되지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면 "면역글로불린 도메인"을 포함하는 폴리펩타이드에 대한 언급은 하나 또는 복수의 면역글로불린 도메인을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "또는"은 선택사항 만을 나타내는 것으로 명시적으로 지시되거나, 선택사항들이 상호 배타적이지 않은 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. "약"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5개의 아미노산"은 "약 5개의 아미노산" 및 또한 "5개의 아미노산"을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "임의적인" 또는 "임의적으로"는 이어서 기재되는 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기재가 상기 사건 또는 환경이 발생하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들면, 임의적 변이체 부분은 그 부분이 변이이거나 비변이인 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 보호기, 아미노산, 및 다른 화합물에 대한 약어는 달리 기재되어 있지 않으면, 그들의 통상적인 사용법, 인식된 약어 또는 생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회에 따른다(Biochem. (1972) 11(9):1726-1732 참조).
일 구현예에 따르면, 본 발명은 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)에 특이적인 단일클론항체를 제공하고자 한다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2에 특이적인 단일클론항체는 PCV2의 회피항원결정부위(decoy epitope)에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2에 특이적인 단일클론항체는 PCV2의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질의 C4-1, C4-8, 또는 C4-1 및 C4-8일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위는 169번 내지 180번에 위치하는 12개의 아미노산일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위는 STIDYFQPNNKR 펩타이드일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 단일클론항체는 효소결합면역측정법을 이용한 PCV2의 특성을 분석하는데 사용될 수 있다. 상기 효소결합면역측정법을 이용한 PCV2 항체의 특성 분석 방법은:
본 발명에 따른 단일클론항체가 PCV2형 감염개체 또는 백신개체의 혈청내 항체와 경쟁반응을 하는 단계;
상기 단일클론항체의 흡광도를 측정하는 단계; 및
상기 단일클론항체의 흡광도로부터 상기 혈청내 항체가 중화항체 또는 면역회피 유도 항체인지 판별하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 혈청내 항체가 중화항체 또는 면역회피 유도 항체인지 판별하는 단계는 상기 단일클론항체의 흡광도가 일정하게 유지되는 경우 중화항체로 판별하는 단계, 및 상기 단일클론항체의 흡광도가 감소하는 경우 면역회피 유도 항체로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단일클론항체, 검출 표지, 상기 검출 표지가 결합되는 단일클론항체 및 상기 검출 표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 PMWS 진단 시약을 제공하고자 한다.
상기 구현예에 있어서, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단일클론항체는 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)에 특이적인 단일클론항체일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2에 특이적인 단일클론항체는 PCV2의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2에 특이적인 단일클론항체는 PCV2의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질의 C4-1, C4-8, 또는 C4-1 및 C4-8일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위는 169번 내지 180번에 위치하는 12개의 아미노산일 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단일클론항체, 검출 표지, 상기 검출 표지가 결합되는 단일클론항체 및 상기 검출 표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 PMWS 진단 시약을 포함하는 PMWS 진단 키트를 제공하고자 한다.
상기 구현예에 있어서, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단일클론항체는 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)에 특이적인 단일클론항체일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2에 특이적인 단일클론항체는 PCV2의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2에 특이적인 단일클론항체는 PCV2의 회피항원결정부위에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cк 융합 재조합 단백질의 C4-1, C4-8, 또는 C4-1 및 C4-8일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위는 169번 내지 180번에 위치하는 12개의 아미노산일 수 있다.
상기 구현예에 있어서, 상기 PCV2의 회피항원결정부위는 STIDYFQPNNKR 펩타이드일 수 있다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. PCV2 항원의 제작
1-1. 펩타이드 합성
돼지 써코바이러스 2형(PCV2)의 decoy epitope으로 알려진 169번에서 180번 위치의 12개 아미노산의 끝에 Cysteine을 첨가해 펩타이드 형태로 합성 하였다(Peptron, Korea). C 말단의 Cysteine에 BSA 및 KLH를 conjugation 하여 항체 스크리닝 및 닭의 면역에 대한 항원으로 사용하였다. STIDYFQPNNKR 펩타이드는 Circovirus Peptide를 줄여 CP-BSA 또는 CP-KLH로 명명하였다.
1-2. PCV2 재조합 단백질 (Monomer)
PCV2 N 말단의 아미노산을 deletion 시켜 20면체 구조를 만들지 못하고, monomer 형태로 존재하여 CP(169~180) decoy epitope이 노출 되도록 하여 대장균에서 발현한 recombinant protein으로 PCV2의 CP의 아미노산 잔기가 43번에서 233번까지 포함되도록 하였다(도 1). 당해 분야에 공지된 방법[참조(Pileri E등 Vet J. 2014, 201(3)429-32, Comparison of the immunoperoxidase monolayer assay and three commercial ELISAs for detection of antibodies against porcine circovirus type 2)]으로 대장균에 발현하여 정제하여 사용하였다.
1-3. PCV2 VLP (Virus like particle, Icosahedral)
PCV2 virus의 ORF2 유전자를 이용하여 다음 프라이머로 PCR하여 XL-Topo vector에 각각의 ORF2유전자를 TA cloning하였다.
PCV2-ORF2-F 5' AAGGATCC-ATGACGTATCCAAGGAGGCGTT 3' SEQ ID NO. 1
PCV2-a-R 5' GCTCTAGA-TTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCT 3' SEQ ID NO. 2
PCV2-b-R 5' GCTCTAGA-TTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCT 3' SEQ ID NO. 3
PCV2-d-R 5' GCTCTAGA-TTAGGGGTTAAGTGGGGGGTCT 3' SEQ ID NO. 4
ORF2 유전자가 들어있는 vector와 baculovirus 발현용 vector(pFast Bac1)를 PCV2a-1은 NotI 과 SpeI으로, PCV2a-2와 PCV2b 그리고 PCV2d는 NotI, BamHI의 제한효소로 처리후 T4 DNA ligase를 이용하여 1℃에서 2시간 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, E. coli DH5α에 transformation 하여 ampicillin이 첨가된 LB agar에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 배양 후 형질전환 된 colony를 분리하였다. 분리된 plasmid vector는 transfection하기 위하여 NucleoBond® Xtra Midi Plus로 midi-prep하였다. invitrogen (Lot. no : 1211757)에서 분양 받은 Sf9 cell을 Grace's Insect Medium (10% FBS)을 사용하여 배양하였다. sf9을 6well plate 에 Sf-900II Media를 사용하여 9×105/well 배양 후 transfection하여 3일 후 virus를 수확하였다. 각 재조합 baculovirus는 Express Five® SFM (L-glutamine 200mM) Media를 사용하여 배양된 invitrogen (Lot. no: 1179361) High5 cell에 0.5MOI로 감염시킨 후 8일간 배양한 세포배양액으로부터 얻은 PCV2 VLP를 시험에 사용하였다.
실시예 2. PCV2 면역 항체 라이브러리의 제작
2-1. 면역화
상기 실시예 1에서 합성된 펩타이드 KLH conjugate(CP-KLH) 50㎍을 항원으로서 750㎕의 인산완충식염수(PBS)와 혼합하여, 37℃ 에서 30분간 배양하였다. 그 다음, 2% 스쿠알렌 중에 독소가 제거된 내독소인 MPL(monophosphorylate lipid A species) 및 마이코박테리아(mycobacteria)의 세포벽 성분인 TDW 및 CWS를 함유하는 유중수 유화액인 보조제(RIBI+MPL+TDM+CWS adjuvant, Sigma, St. Louis, Mo, USA)에 유화시키고, 3마리의 닭 피하에 주사하였다. 동일 방법으로 3주 및 그 다음 2주 후에 추가 접종하여 총 3회의 면역을 수행하였다. 면역화된 닭의 항체 역가(titer)는 이차 항체로 HRP(Horderadish peroxidase) conjugated 항-닭 IgG(Y) 다클론 항체(Rabbot anti-chicken IgG(Y)-HRP, Millipore corporation, Billeria, MA, USA)를 사용하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 결정되었다.
2-2. 닭 단일쇄 Fv 라이브러리 제작
상기 2-1.에서 면역화된 닭의 지라, 비장, 활액낭 및 골수로부터 TRI 시약(Invitrogem, Carlsbad, CA USA)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 올리고-dT 프라이머 및 SuperscriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 사용하여 First strand cDNA를 합성하였다.
닭의 면역 기관으로부터 얻어진 cDNA에 대해 Expand High Fidelity PCR 시스템(Roche Molecular Systems, IN, USA)을 이용해 면역 글로불린의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에 특이적인 하기 표 2의 프라이머를 사용하여 단일쇄 Fv(scFv) 라이브러리를 제작하였다.
VλPrimers
CSCVK (sense) GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG CCG TCC TCG GTG TC SEQ ID NO.5
CKJo-B (reverse) GGA AGA TCT AGA GGA CTG ACC TAG GAC GGT CAG G SEQ ID NO.6
VH Primers
CSCVHo-FL (sense) GGT CAG TCC TCT AGA TCT TCC GGC GGT GGT GGC AGC TCC GGT GGT GGC GGT TCC GCC GTG ACG TTG GAC GAG SEQ ID NO.7
CSCG-B (reverse) CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GGA GAC GAT GAC TTC GGT CC SEQ ID NO.8
Overlap Extension Primers
CSC-F
(sense)		 GAG GAG GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG SEQ ID NO.9
CSC-B (reverse) GAG GAG GAG GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GG SEQ ID NO.10
각 반응에서, 1㎕의 cDNA를 60 pmol의 각 프라이머, 10㎕의 10X 반응 완충액, 8㎕의 2.5mM dNTP(Promega, Madison, WI, USA), 0.5㎕의 Tap DNA 중합 효소 및 물과 혼합하여 최종 부피를 100㎕로 하였다. PCR 반응은 하기 조건 하에서 수행되었다: 30사이클 15초 94℃, 30초 56℃, 및 90초 72℃에 이어서 최종 연장 10분 72℃. 약 350bp의 길이를 갖는 단편을 1.5% 아가로스 젤에 로딩하여 전기 영동한 후, QIAGEN II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 OD 260nm에서 판독하여 정량하였다. (1 OD 단위 = 50㎍/ml).
두 번째 PCR에서 첫 번째 VL 및 VH 생성물은 중복 연장 PCR(Overlap extension PCR)에 의해 무작위적으로 연결되었다. 각각의 PCR 반응은 100ng의 정제된 VL 및 VH 생성물, 60pmol의 각각의 프라이머, 10㎕의 10X 반응 완충액, 8㎕의 2.5mM dNTP 및 0.5㎕의 Taq DNA 중합효소 및 물과 혼합하여 최종 부피 100㎕의 혼합물로 수행되었다. PCR은 하기 조건에서 수행되었다: 25사이클 15초 94℃, 30초 56℃, 및 2분 72℃, 이어서 최종 연장 10분 72℃, 약 700bp의 길이를 갖는 단일쇄 Fv 절편을 1.5% 아가로스 젤에 로딩하여 전기 영동한 후, QIAGEN II Gel Extraction Kit (QIAGEN)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 OD 260nm에서 판독하여 정량 하였다. (1 OD 단위 = 50㎍/ml).
2-3. 라이브러리 라이게이션 및 형질 전환
PCR 산물인 scFv 절편 및 pComb3X-SS 벡터(The Scripps Research Institute, CA, USA)를 클로닝을 위해 SfiI 제한 효소로 절단하였다. 10㎍의 정제된 오버랩 PCR 산물을 360 유닛의 SifI(㎍ DNA 당 16 유닛, Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA), 20㎕의 10X 반응 완충액 및 물과 혼합하여 최종 부피를 200㎕로 조정하였다. 20㎍의 pComb3X-SS 벡터를 120 유닛의 SfiI(㎍ DNA 당 6 유닛), 20㎕의 10X 반응 완충액 및 물과 혼합하여 최종 부피를 200㎕로 조정하였다. 상기 혼합물을 8시간 동안 50℃에서 절단하였다. 약 700bp 길이의 scFv 절편 및 3400bp 길이를 갖는 벡터를 1% 아가로즈 젤에 로딩하여 전기 영동한 후, QIAGEN II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 정제하였다.
1400ng의 SfiI-절단된 pComb3X 벡터 및 700ng의 scFv 절편을 40㎕의 5X 라이게이즈 완충액, 10㎕의 T4 DNA 라이게이즈(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 물과 혼합하여 최종 부피를 200㎕로 맞추어 16℃ 에서 16시간 동안 배양하여 라이게이션을 수행하였다. 이후 에탄올로 침전하여 DNA 펠렛만을 15㎕의 물에 용해시켰다.
상기 라이게이션된 라이브러리 샘플은 E.coli 균주인 ER2738(New England Biolabs Inc, Hitchin, Hertfordshine, SG4 OTY, England, UK)에 유전자 진동기(Gene pulser: Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용해 전기 천공법에 의해 형질전환 시켰다. 세포를 37℃, 5ml Super Broth(SB) 배지에서 혼합하고, 1시간 동안 250rpm으로 교반하여 배양하였다. 그 다음, 10ml SB 배지 및 3㎕의 100mg/ml 카베니실린이 배양액에 첨가하였다. 50㎍/ml의 카베니실린을 함유하는 Luria Broth(LB) agar 플레이트에 상기 배양물 0.1㎕, 1㎕ 및 10㎕를 도말하여 라이브러리 크기를 결정하였다. 배양물을 1시간 동안 추가 교반 후 상기 배양물에 4.5㎕의 100mg/ml 카베니실린을 첨가하여 1시간 더 교반하였다. 상기 배양물에 2ml의 VCM13 헬퍼 파아지(>1011cfu/ml), 183ml의 미리 가온된 SB 및 92.5㎕의 100mg/ml 카베니실린을 첨가하여 250rpm, 37℃에서 2 시간 동안 교반 하였다. 상기 배양물에 280㎕(50mg/ml)의 카나마이신을 첨가하고, 250rpm, 37℃ 에서 밤새 교반 하였다. 다음날, 배앵물을 고속 원심분리기(Beckman, JA-10 rotor)를 이용해 3,000g, 4℃에서 원심 분리하였다. 그 다음, 박테리아 펠렛은 phagemid DNA제조를 위해 저장하고, 상층액은 멸균된 원심분리 병으로 옮겼다. 이후 8g 폴리에틸렌 글리콜-8000(PEG-8000, Sigma) 및 6g의 염화나트륨(NaCl, Merck)을 첨가하고, 얼음에서 30분간 보관한 후, 상층액을 15,000g, 4℃ 에서 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버리고, 파지 펠렛은 1% BSA를 함유하는 트리스-완충 식염수(TBS)에 재 현탁시켰다.
실시예 3. 고정화된 항원 상에서의 라이브러리 패닝 (바이오 패닝, Bio-panning)
자성 비드(Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen)을 이용하여 바이오 패닝을 수행하였다. 1X107 비드에 3㎍의 CP-BSA(Peptide) 및 PCV2 재조합 단백질(monomer)을 실온에서 20시간 동안 회전 교반시키면서 항원을 코팅하였다. 코팅된 비드를 PBS로 4회 세척한 후 3%BSA를 함유하는 인산완충식염수(PBS)로 상온에서 한 시간 동안 블로킹한 후 상기 실시예 2-3.에서 수득한 Phage-dislayed scFv와 함께 실온에서 두 시간 동안 배양하였다. 비드에 코팅된 항원에 결합되지 않은 phage를 제거하기 위해 0.05% Tween20/PBS로 세척한 후, 결합된 파지를 50㎕의 0.1M 글리신/염화 수소(0.1M Glycine-HCl, pH 2.2)를 이용하여 용출시키고, 3㎕의 2M 트리스-염화 수소(Tris-HCl, pH 9.1)로 중화 시켰다. 이러한 파지 함유 상등액을 사용하여 E.coli ER2738을 감염시키고, 파지의 밤샘 증폭을 위해 VCSM13 헬퍼 파지를 이용하여 rescue 하였다. 또한 상기 파지로부터 감염된 배양물을 50㎍/ml의 카베니실린을 함유하는 LB agar 플레이트 상에 도말하여 투입(input) 및 생산(output) 파지 역가를 결정하였다. 다음날, 실시예 1-4.에서와 같이 PEG-8000 및 NaCl를 첨가하여 파지만을 침전시키고, 상기 침전된 파지를 다음 차수 바이오 패닝에 사용하였다.
상기 과정을 반복하여 1차에서는 CP-BSA 펩타이드를 2차에서는 PCV2 재조합 단백질을 항원으로 3차에서 7차까지 펩타이드와 재조합 단백질을 번갈아 패닝을 수행하였다. 또한 세척 단계를 1차에서는 1회 이후 세척 회수를 점차적으로 증가시켜 7차에서는 10회로 수행하면서 높은 친화도를 갖는 파지의 선별 및 enrichment 시켜 나갔다.
실시예 4. 파아지 ELISA에 의한 클론의 선별
바이오 패닝으로부터 선별된 클론을 분석하기 위하여 무작위로 선택된 phage-displayed scFv 개별 클론 중 PCV2 CP-BSA 펩타이드 및 PCV2 재조합 단백질(monomer)에 동시에 결합력을 갖는 지를 확인하고자 ELISA를 수행하였다.
CP-BSA(Peptide)와 PCV2 재조합 단백질(monomer)을 0.1M NaHCO3 완충액에 희석하여 96well 마이크로타이터 플레이트에 100ng/well로 4℃에서 16시간 동안 코팅한 후 다음날 3%BSA/PBS로 37°C에서 1시간 동안 블로킹하였다. 이후, 파지 상등액을 6%BSA/PBS와 동일하게 혼합하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 0.05% Tween20/PBS로 세척한 후, 플레이트에 HRP conjugated 항-M13 항체(a-M13-HRP, Pierce Chemical Co, Rockford, IL, USA)를 1/5000으로 희석하여 50㎕씩 첨가 후 1시간 동안 37°C에서 배양하였다. 배양이 끝나고 세척을 수행한 후에 색상 반응을 위해, 0.05M 구연산 완충 용액 내, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS, Amresco, Solon, OH, USA) 1㎍/ml 및 0.1% H2O2를 각각의 well에 첨가하고 발색하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2a는 6차 및 도 2b는 7차 바이오 패닝의 생산 파지(output)에서 각각 48개씩의 클론을 분석한 결과를 나타낸다. CP-BSA 펩타이드와 PCV2 재조합 단백질에 동시에 결합하는 클론 중 흡광도가 높은 10개의 클론의 유전자 서열을 분석하여, 총 3종의 서로 다른 서열을 가진 scFv 클론을 수득하였고, 이후의 C4-1 및 C4-8 클론을 사용하였다.
실시예 5. 재조합 항 PCV2 scFv-human Cк 융합 단백질 제작
5-1. 포유류 발현 벡터로 항 PCV2 scFv 서브 클로닝 (scFv-Cк)
클로닝이 용이하도록 제한효소 부위를 변형시킨 포유세포 발현 벡터인 pCEP4(Invitorgen)에 인간 면역글로블린 Cк 를 코딩하는 유전자를 HindIII 및 XhoI(New England Biolabs, UK) 제한효소에 의해 삽입하였다. 항-PCV2 scFv를 코딩하는 유전자를 pComb3X 벡터로부터 두 SfiI 제한 효소 부위에 의해 인간 Cк 영역의 5' 말단으로 서브 클로닝하였다 (도 3).
5-2. 형질 주입 및 단백질 정제
pCEP4-항 PCV2 scFv-human Cк를 단백질 형태로 발현 및 정제하고자 포유 세포 형질 주입 및 과발현 시스템을 사용하였다. 배양 부피의 ml당 2㎍의 포유류 발현 벡터와 4㎍의 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, Warrington, PA, USA)을 세포 배양부피의 1/10에 해당하는 150mM 염화나트륨(NaCl, Merck)에 혼합하고, 상온에서 15분간 방치하였다. 단백질 과발현 시스템에 사용되는 포유세포 HEK293F(2X106세포/ml, Invitrogen)에 상기 혼합물을 첨가하여, 6일 동안 100U/ml 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 FreestyleTM 293 발현 배양액(Invitrogen)에서, 37℃, 7% CO2 및 135rpm의 교반 조건하에 배양하였다. 세포 배양액을 원심분리 후 상층액으로부터 발현된 항 PCV2 scFv-Cк 형태의 융합 단백질만을 정제하고자 Kappaselect(GE Healthcare Bio science, Sweden)를 이용한 친화도 젤 크로마토그래피 방법을 사용하였다.
실시예 6. scFv-Cк 융합 단백질의 결합능 측정
6-1. 항 PCV2-scFv-Cк 융합 단백질의 PCV2 결합 부위 확인
상기 실시예 5에서 생산된 scFv-Cк 융합 단백질 형태의 항체가 CP-BSA 펩타이드 및 epitope으로 예상되는 169에서 180번 아미노산이 노출되어있는 형태에서만 결합능을 갖는지 확인하고자 ELISA(enzyme-linked immunosobent assay)를 수행하였다. 코팅하는 항원의 종류로는 CP-BSA 펩타이드 및 PCV2 재조합 단백질(monomer), PCV2 VLP(Virus like particle, icosahedral)를 0.1M NaHCO3에 희석하여 96well 마이크로타이터 플레이트에 100ng/well로 4℃ 에서 16 시간 동안 코팅하였다. 항 PCV2 scFv-Cк 융합 단백질은 1㎍/ml 농도로 3%BSA/PBS에 희석하여 각 well당 50㎕씩 첨가해 두 시간 동안 반응 시켰다. 배양이 끝나고 0.05% Tween20/PBS로 세척한 후 HRP conjugated 항-인간 Cк 항체(Goat anti-human Cк-HRP, Abcam, Cambridge, UK)를 1/5000로 희석하여 50㎕/well로 첨가하여 1시간 배양 후 세척하고, Tetramethylbenzidine(TMB, Gendepot, Barker, TX, USA)를 첨가하여 발색한 후 650nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 실험은 duplicate로 진행되었으며, 평균값으로 그래프를 그리고, 표준 편차로 오차 범위를 표시하였다.
도 4로부터 알 수 있듯이, CP-BSA 펩타이드 및 PCV2 재조합 단백질(monomer) 형태에서만 항-PCV2-scFv-Cк 융합 단백질이 결합하며, epitope이 숨어있는 PCV2 VLP(Virus like particle, icosahedral)에는 결합하지 못하는 것을 통해 PCV2에서의 결합 부위가 PCV2 decoy epitope인 169번에서 180번 위치의 아미노산임이 확인되었다.
6-2. scFv-Cк 융합 단백질의 결합능 측정
상기 실시예 5에서 생산된 scFv-Cк 융합 단백질 형태의 항체를 CP-BSA 펩타이드에 대한 결합능을 측정하고자 ELISA를 수행하였다. CP-BSA 펩타이드를 0.1M NaHCO3 에 희석하여 25ng/well로 4℃ 에서 16 시간 동안 코팅한 96well 플레이트에 scFv-Cк 융합 단백질이 CP-BSA 펩타이드의 epitope 수의 100배 mole수가 50㎕ 부피에 들어가는 농도인 7500nM에서 1/10씩 serial dilution 하여 0.00075nM 까지 8point 농도로 첨가하여 두 시간 동안 반응 시켰다. 첨가되는 scFv-Cк 융합 단백질의 종류로는 CP-BSA 펩타이드에 대한 결합력을 갖는 클론인 C4-1과 C4-8 그리고 음성 대조군으로서 CP-BSA 펩타이드에 결합하지 않는 Control-scFv-Cк를 사용하였다. 그 다음 실시예 6-1.에서와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하고, 그 결과는 도 5에 나타내었다. 실험은 duplicate로 진행되었으며, 평균값으로 그래프를 그리고, 표준 편차로 오차 범위를 표시하였다.
도 4로부터 알 수 있듯이, 클론 C4-1 및 C4-8는 CP-BSA 펩타이드에 대한 우수한 결합능을 갖는 것임이 확인되었다.
실시예 7. 항 PCV2-scFv-Cк 융합 단백질과 돼지 혈청 간의 Competition ELISA
7-1. 항 PCV2-scFv-Cк 융합 단백질의 농도에 따른 돼지 혈청 간의 competition ELISA
상기 실시예 4에서 생산된 항 PCV2-scFv-Cк 융합 단백질 형태의 항체를 이용하여 감염에 의해 노출되는 부위인 169에서 180번 아미노산에 대해 생성된 혈청 내 존재하는 돼지 항체와 첨가되는 항 PCV2-scFv-Cк의 competition 효과가 양에 따라 농도 gradient가 걸리는지를 확인하고자 하였다. 예비실험을 통해 코팅하는 항원의 양을 100ng에서 1/2씩 dilution 하여 가장 signal이 급격히 변화되는 point를 잡았고, 그 조건인 25ng/well로 0.1M NaHCO3에 희석하여 96well 마이크로타이터 플레이트에 4℃ 에서 16 시간 동안 코팅하였다. 다음날 Germ free porcine (무균돼지, Seoul national university, Korea), Vaccinated porcine (백신군 돼지), Infected porcine(야외 감염 돼지) 각각의 serum은 1/50로 3%BSA/PBS에 희석하고, 항 PCV2-scFv-Cк 및 음성 대조군 Control scFv-Cк를 15000nM에서 1/10씩 serial dilution 하여 0.0015nM 까지 8 point 농도로 준비하여 serum과 항 PCV2-scFv-Cк를 25㎕ 씩 동일 부피로 섞었다. 최종 농도로 혈청은 1/100 항 PCV2-scFv-Cкк는 7500nM에서 0.00075nM 까지 8point로 첨가하여 두 시간 동안 반응 시켰다. Plate를 0.05% Tween20/PBS로 세척 후 이차 항체로서 HRP conjugated 항-돼지 면역글로블린 항체(goat anti-swine IgG-HRP, Santacruz, CA, USA)를 1/4000로 희석하여 50㎕/well로 사용하고, 한 시간 배양 후 Tetramethylbenzidine(TMB, Gendepot, Barker, TX, USA)를 첨가 및 발색하여 650nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. A는 첨가된 돼지 혈청이 없으며, B는 무균 돼지 혈청, C는 백신을 접종한 돼지 혈청, D는 감염된 돼지의 혈청이 사용되었다. 실험은 duplicate로 진행되었으며, 평균값으로 그래프를 그리고, 표준 편차로 오차 범위를 표시하였다.
도 6로부터 알 수 있듯이, 무균 혹은 백신을 접종한 돼지 혈청은 CP epitope에 대한 항체가 생성되지 않기 때문에 scFv-Cк 융합 단백질이 과량으로 첨가되어도 competition이 일어나지 않고, 낮은 signal로 유지된다는 것이 확인되었다. 반면, 감염된 돼지의 경우 CP epitope에 대한 항체가 생성되기에 같은 epitope을 갖는 scFv-Cк 융합 단백질과 competition이 일어나며, 첨가되는 scFv-Cк의 농도가 증가할수록 돼지 혈청내 존재하는 항체에 대한 signal이 competition에 의해 감소하는 결과를 나타내었다.
7-2. 항 PCV2-scFv-Cк 융합 단백질과 돼지 혈청 간의 competition ELISA
상기 실시예 7-1.에서와 동일한 방법으로 수행되었으며, 코팅하는 항원의 양은 25ng/well로 고정시키고, 일차 항체의 최종 농도는 돼지 혈청이 1/100, 항 PCV2-scFv-Cк 융합 단백질이 750nM이 되도록 하였다. 한 마리의 무균 돼지가 대조군으로 사용되었으며, 20마리의 백신 접종 돼지군의 혈청과 백신을 처리하지 않아 야외감염의 가능성이 있는 20마리의 돼지군 혈청을 사용하여 총 41마리의 돼지에 대한 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7 A는 CP-BSA 펩타이드를 항원으로서 도7 B는 항원을 코팅하지 않은 블로킹 컨트롤에 백신 접종 돼지군의 혈청으로 실험을 수행한 결과이다. 도7 C는 CP-BSA 펩타이드를 항원으로서 도7 D는 항원을 코팅하지 않은 블로킹 컨트롤에 백신을 접종하지 않은 돼지군의 혈청으로 실험을 수행한 결과이다. 실험은 triplicate로 진행되었으며, 평균 값으로 그래프를 그리고, 표준편차를 오차 범위로 표시하였다.
도 7로부터 알 수 있듯이, 백신을 접종한 돼지군 혈청의 경우 첨가하는 항체에 의해 signal의 변화가 거의 없지만, 백신 접종을 하지 않은 돼지군의 경우 야외 감염으로 인한 아미노산 169번에서 180번에 대한 항체가 형성되어 첨가하는 항 PCV2 scFv-Cк 융합 단백질과 competition 하여 signal이 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.
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Claims (13)

  1. 효소결합면역측정법을 이용한 돼지 써코바이러스 2형(PCV2) 항원 내의 회피항원 정량 방법으로,
    PCV2의 회피항원결정부위(decoy epitope)에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cκ 융합 재조합 단백질인 C4-1, C4-8, 또는 C4-1 및 C4-8 단일클론항체가 사용되고,
    상기 PCV2의 회피항원결정부위는 169번 내지 180번에 위치하고, 아미노산 서열이 STIDYFQPNNKR 인 것인, 회피항원 정량 방법.
  2. 제 1 항에 기재된 회피항원 정량 방법을 이용한 PCV2 백신 품질검사 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 진단용 항원, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단일클론항체, 검출 표지, 상기 검출 표지가 결합되는 단일클론항체 및 상기 검출 표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 돼지 전신소모성 증후군(Post weaning Multi-systemic Wasting Syndrome; PMWS)의 진단 시약으로,
    상기 진단용 항원 포획을 위한 단일클론항체는 PCV2의 회피항원결정부위(decoy epitope)에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cκ 융합 재조합 단백질인 C4-1, C4-8, 또는 C4-1 및 C4-8 단일클론항체가 사용되고
    상기 PCV2의 회피항원결정부위는 169번 내지 180번에 위치하고, 아미노산 서열이 STIDYFQPNNKR 인 것인, PMWS 진단 시약.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 효소결합면역측정법을 이용한 돼지 써코바이러스 2형(PCV2) 항체의 특성 분석 방법으로,
    PCV2의 회피항원결정부위(decoy epitope)에 특이적으로 결합하는 scFV-human Cκ 융합 재조합 단백질인 C4-1, C4-8, 또는 C4-1 및 C4-8 단일클론항체가 PCV2형 감염개체 또는 백신개체의 혈청내 항체와 회피항원결정부위에 대하여 경쟁반응을 하는 단계;
    상기 회피항원결정부위에 결합된 단일클론항체 또는 돼지혈청항체를 정량하는 단계;
    상기 회피항원결정부위에 결합된 단일클론항체 또는 돼지혈청항체의 양으로부터 상기 혈청내 항체가 중화항체 또는 면역회피 유도 항체인지 판별하는 단계를 포함하고;
    상기 PCV2의 회피항원결정부위는 169번 내지 180번에 위치하고, 아미노산 서열이 STIDYFQPNNKR 인 것인, PCV2 항체의 특성 분석 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 회피항원결정부위에 결합된 단일클론항체 또는 돼지혈청항체의 양이 일정하게 유지되는 경우 중화항체로 판별하는 단계를 더욱 포함하는 것인, PCV2 항체의 특성 분석 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 회피항원결정부위에 결합된 단일클론항체의 양이 감소하는 경우 또는 회피항원결정부위에 결합된 돼지혈청항체의 양이 증가하는 경우 면역회피 유도 항체로 판별하는 단계를 더욱 포함하는 것인, PCV2 항체의 특성 분석 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
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