KR100719237B1 - 돼지 써코바이러스의 항체 역가를 측정하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 써코바이러스의 항체 역가를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 효소면역흡착법을 이용하여 간단하면서도 민감도, 정확도도 높은 항체 역가를 측정하는 방법에 관한 것이다.

돼지 써코바이러스, 항체 역가, 효소면역흡착법, ELISA

Description

돼지 써코바이러스의 항체 역가를 측정하는 방법{Titer measurement method of antibody for porcine circovirus 2}

본 발명은 돼지 써코바이러스의 항체 역가를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 효소면역흡착법(Enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 간단하면서도 민감도도 높은 항체 역가 측정방법에 관한 것이다.

돼지 써코바이러스(porcine circovirus; "PCV")는 최근 전세계적으로 발생하고 있는 이유자돈의 전신소모성증후군(postweaning multisystemic wasting syndrome; PMWS)의 1차적인 원인체이며, 전신소모성증후군 외의 다양한 돼지 질병증후군들과도 연관성이 있는 것으로 보고되고 있어 최근 양돈산업에서 중요한 병인체로 주목받고 있다. 돼지 써코바이러스 2가 양돈산업에 문제가 되기 시작한 것은 1990년대 이후부터이다. 돼지 써코바이러스는 혈구응집성(HA)이나 세포변성효과(CPE) 등을 나타내지 않아 바이러스 자체를 검출하기가 어렵고 PCR(중합효소연쇄반응)이나 형광항체법(FA) 또는 간접형광항체법(IFA)으로 바이러스 항원을 검출하 여 감염여부를 진단하고 있다. 이 바이러스는 소형의 DNA 바이러스로서 1.76kb의 핵산으로 이루어진 단일쇄 원형 DNA 게놈(single-stranded circular DNA genome)을 보유하고 있으므로 이러한 유전적 특성을 고려하여 돼지 써코바이러스(porcine circovirus)로 명명되었다. 돼지 써코바이러스는 두 가지로 분류되는데, 한 가지는 감염되어도 질병이나 임상증상은 유발되지 않으나 감염 개체의 장기에서 증식하는 것이 있고, 다른 한 가지는 이유자돈(보통 5-12주)의 성장부진, 위축 등을 소견으로 하는 전신소모성증후군을 나타내는 것이 있다. 현재는 돼지 신장세포주에서 유래된 비병원성의 돼지 써코바이러스를 PK-15 PCV 또는 PCV1으로, 전신소모성증후군 발병돈에서 유래된 병원성의 돼지 써코바이러스는 PMWS PCV 또는 PCV2로 구별하여 명명하고 있다. 단백질을 생성할 수 있는 ORF(open reading frame)중 중요한 구조 단백질을 조성하는 ORF1(Rep protein)과 ORF2(capsid protein)에 대한 두 바이러스의 유전자 염기서열과 아미노산 배열을 비교분석한 결과 ORF1의 경우 각각 83%와 86%로 비교적 높은 일치율을 나타내는 반면에 ORF2의 경우에는 각각 67%와 65%의 낮은 일치율을 나타내고 있어 두 바이러스 간에 상당한 유전적 차이가 있다. 각국의 PCV2 분리주와 국내 분리주의 전체 유전자 염기서열에 대한 상관관계를 분석한 결과 국내 분리주는 카나다 분리주 및 미국 분리주와 99% 수준으로 가장 밀접한 상관관계를 나타내고 있는 것으로 보고되었다.

PCV2 항원 검출방법은 숙주가 현재 PCV2에 감염되어 있는지를 판단하기 위한 것으로서 통상 중합효소 연쇄반응(PCR)이나 형광항체법(Fluorescent Antibody assay) 또는 간접형광항체법(Indirect fluorescent antibody test)으로 바이러스 항원을 검출하여 감염 여부를 진단하고 있다.

또한, 현재 PCV2가 감염되어 있거나 과거에 감염된 사실이 있어 항체가 존재하는지를 판단하는 PCV2 양성항체 검출방법으로는 대표적으로 세 가지를 들 수 있다. 첫째, 간접형광항체법은 혈청을 10배 정도 희석하여 형광항체법에 의한 PCV2 항체가 측정 방법과 같이 하되 희석용 플레이트에서의 단계희석과정이 생략되며 형광 여부로 판독한다. 둘째, S/P 비율법은 PCV2 항체 검사용 ELISA 킷트(Jenobiotec co.)로 검사하며 음성/양성 판정기준(cut off value)은 S/P 비율(Sample to positive ratio = 가검 시료 평균 흡광도/양성대조군 평균 흡광도)가 0.35 이상이면 양성으로, 그 미만이면 음성으로 판독한다. 셋째, 비교 ELISA(c-ELISA) 진단법은 항PCV2 단일클론항체를 이용하여 단일클론항체-양고추냉이 퍼옥시다아제 콘쥬게이트를 만들어 ELISA 방법으로 억제율 PI=100-(혈청 흡광도/대조군 흡광도)×100을 산출하여 40% 이상인 경우에는 PCV2 항체 양성으로 판정한다.

위와 같은 방법으로 항체 양성으로 판정된 경우 PCV2에 감염되어 형성된 항체 역가가 얼마나 높은지를 판단하게 되는데, PCV2 항체 역가 측정방법으로는 면역효소단층법과 간접형광항체법이 널리 사용되고 있다. 면역효소 단층법(Immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)은 96웰 플레이트에 돼지 신장세포주인 nPK-15 세포주를 배양하고 PCV2를 접종 배양하고 고정하여 효소면역흡착법의 실험방법으로 처리하여 역가를 측정할 수 있으나, 세포를 배양해야 하고, 5×10⁵TCID₅₀ 바이러스를 접종해야 하는 복잡한 과정을 거쳐야 한다. 또한, 간접형광항 체법은 면역효소단층법과 같이 조직배양을 통해 항원을 준비해야 하고, 조작이 번거로우며 형광항체현미경으로 즉시 판독해야 하는 단점이 있다.

PCV2 바이러스는 세포변성효과와 혈구응집특성이 없기 때문에 중화 항체가와 혈구응집억제반응 등의 항원항체반응으로 항체가를 측정하기가 곤란하고, 항체에 형광물질을 부착하여 항원(바이러스)과 반응시키는 항원항체반응으로 항체 양성과 음성을 판정하는 형광항체법(FA)이 일반적인 측정방법이며 더 나아가 항원(PCV2 바이러스)의 항체에 대한 2차 항체에 형광물질을 부착하여 반응시키는 간접형광항체법(IFA)이 개발되어 좀더 정확한 측정이 가능하나 이 역시 항체 양성, 음성 판정이 일반적이며 항체가 판정에는 위에 열거한 것과 같은 복잡한 과정이 필요하다.

효소면역흡착법에 의한 PCV2 바이러스 항체 측정방법도 개발되고 있으나 아직 정확한 역가측정 방법은 개발이 되지 않았고, 단지 양성, 음성 판정에 주로 사용하고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명은 종래 PCV2 바이러스 항체 역가를 측정하기 위하여 면역효소단층법과 간접형광항체법과 같이 복잡한 과정을 거치지 않고 간단한 절차를 통하여 PCV2 항체 역가를 효과적으로 정밀하게 측정하는 방법을 제공하려는 것이다.

일반적인 효소면역흡착법은 항원항체반응의 특이성을 기초로 하여,그 반응계 의 표지(marker)로서 효소를 사용하고, 이 표지효소의 활성을 측정함으로써 그 반응계의 감도를 현저히 높여서, 항원이나 항체의 유무 및 그 양을 측정할 수 있다. 효소 표지에 의한 이와 같은 면역측정법을 효소면역검정(EIA) 또는 효소표지면역검정이라 총칭한다. 특히 고상(solid)의 면역흡착제를 응용하는 경우에는 효소결합면역흡착제검정(enzyme-linked immunosorbent assay, "ELISA")이라하며, 액상으로 실시하는 측정법은 효소다량면역검정(enzymometric immunological test, EMIT)이라 한다.

표지용 효소로 사용되는 것은 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase), 라이소자임(lysozyme), 베타갈락토시다아제(β-galatosidase) 등이 있다. 보통 많이 사용되는 것은 퍼옥시다아제이며, 이 효소는 과산화수소의 존재 하에서 각종 화합물을 산화시킨다. 이 산화에 따라서 정색 반응을 나타내는 기질(수소 공여체)로서 3,3-다이아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)나 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphthol) 등이 사용된다.

ELISA의 장점으로는 비교적 조작이 간단하고 미량정량도 가능하며 IFA에 비해 민감도와 특이도가 높고 다량의 샘플을 처리할 수 있어, 응용범위가 넓다는 것이다.

이에 기반하여 본 발명자들은 효소면역흡착법(enzyme linked immunosorbent assay; "ELISA")를 이용한 간편하고 정밀한 PCV2 항체 역가 측정방법을 개발하기에 이르렀다.

본 발명의 효소면역흡착법을 이용한 PCV2 항체 역가 측정방법은 일반적인 효소면역흡착법에 준한다. 본 발명의 일 실시예에서는 표지용 효소로서 peroxidase(horseradish peroxidase)를 사용하였고, 기질(substrate)은 TMB(Tetramethyl Benzidine)를 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 사용하였다.

본 발명은 돼지 써코바이러스의 항체 역가 측정 방법에 있어서,

ⅰ) 항원을 플레이트에 가하고 배양하는 단계;

ⅱ) 블로킹 용액을 플레이트에 가하여 배양하는 단계;

ⅲ) 표준 혈청을 가검 혈청과 동일하게 희석하고, 표준 혈청을 다시 단계별로 2의 배수로 계대 희석하여 플레이트에 가하여 반응시키는 단계;

ⅳ) 돼지 써코바이러스 항체-표지용 효소 콘쥬게이트를 가하여 배양하는 단계;

ⅴ) 상기 표지용 효소의 기질을 가하여 반응시키는 단계;

ⅵ) 상기 단계 ⅴ)에 의해 염색된 시료의 흡광도를 특정 파장에서 측정하는 단계;를 포함하는 돼지 써코바이러스의 항체 역가 측정 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 표지용 효소로서 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase), 라이소자임(lysozyme) 및 베타갈락토시다아제(β-galatosidase) 중 1종을 선택하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 시료혈청 및 표준 혈청을 하기의 예비시험 즉 플레이트(96웰) 코팅용 항원(PCV2) 제조방법 및 적절한 혈청 희석배율 산정방법을 실시하 여 적절한 희석배율(약20배 희석)을 산정하여 사용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기와 같이 적절히 희석(5-50배, 더욱 바람직하게는 약 20배 희석)한 돼지 써코바이러스 표준 혈청(항체역가가 1024라면)를 2의 배수로 8단계 계대 희석 즉 2⁰배(역가 1024), 2¹배(역가 512), 2²배(역가 256), 2³배(역가 128), 2⁴배(역가 64), 2⁵배(역가 32), 2⁶배(역가 16), 2⁷배(역가 8)로 희석하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 ⅴ) 단계 이후 얻어진 표준 혈청의 희석 단계별 흡광도 측정값들을 역가에 따른 검량선으로 보고, 가검 혈청의 흡광도를 표준 혈청의 역가별 흡광도와 비교하여 일정한 역가와 동일한 값이거나 높은 값을 가지면 그 표준 혈청의 역가를 가검 혈청의 항체 역가로 결정하는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스의 항체 역가 측정방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ⅰ)단계 이전에 항원을 플레이트에 코팅하는 최대희석농도를 산출하는 방법으로서 일정 농도의 PCV2를 단계별로 희석하여 플레이트에 코팅하고 단계별로 희석한 표준 혈청으로 반응시켜 효소면역흡착법(ELISA)과 같이 흡광도를 측정하여 일정한 항원의 희석농도까지 흡광도 값이 일정하게 판독 가능하게 나오고 흡광도 값이 표준 혈청의 희석배수에 반비례하여 나타나는 범위를 최대희석농도로 산출하는 것을 특징으로 한다. ⅰ)단계 이전에 적절한 혈청 희석배율 산정방법은 표준 혈청을 단계별로 희석하여 항원이 단계별로 희석되어 코팅된 플레이트 각 줄마다 표준 혈청 희석배율별로 분주하여 효소면역흡착법(ELISA)과 같이 처리하 여 흡광도를 측정하여 항원의 일정한 희석농도에 대하여 흡광도 값을 일정하게 나타내고 표준 혈청 희석배율에 따라 흡광도가 반비례하는 표준 혈청의 최대 희석농도까지를 혈청의 적절한 희석배율로 산출하는 것을 특징으로 한다. 그리하여 본 발명은 상기 가검 혈청 및 표준 혈청을 처음에 5-50배로 일단 희석하여 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 표준 혈청 및 가검 혈청의 희석 배수는 흡광도 측정이 용이하고, 반응이 정량적으로 일어나는 범위를 한정한 것이다.

아래에서는 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정된 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 아래 실시예의 기재로부터 용이하게 변형할 수 있는 정도의 발명이 본 발명의 범위에 속함은 자명하다.

이하 실시예 및 비교예, 실험예에서 %는 특별한 표시가 없는 한 중량%(w/w)를 나타내는 의미로 사용하였다.

< 실시예 1: PCV2 바이러스 분리배양>

1. PCV2 시료: 전신소모성 증후군 증상이 있는 양돈농가에서 바이러스 시료를 구하여 PCR로 PCV2 단독감염을 확인한 후 시료로 사용했다.

2. 배양세포: PCV2가 없는 돼지신장세포주 nPK-15를 사용했다.

3. 세포배양 배지: α-MEM(α-minimum essential medium, Gibco BRL)에 배지 1ml당 페니실린(penicillin) 100IU, 스트렙토마이신(streptomycin) 100μg 및 락토 알부민 가수분해물(lactoalbumin hydrolysate) 0.25% 첨가한 다음, 56℃에서 30분간 비동화한 우태아혈청(fetal calf serum, "FCS")을 10% 되게 첨가하여 사용하였다.

4. 배양세포접종액: 폐 및 림프절조직 100㎎에 상기 세포배양배지 10㎖를 첨가하여 유제하고, 유제액을 초음파 파쇄기로 20kHz에서 4초 처리한 다음, 저속원심분리(2,000×g, 10분)하여 얻어진 상층액을 다시 원심분리(8,000×g, 4℃, 20분)하여 상층액을 회수하였다. 이 상층액에 동량의 프레온을 첨가하여 1분 교반한 다음, 원심분리(3,000×g, 15분)하여 얻어진 상층액을 다시 원심분리(10,000×g, 3분)한 후에 0.2㎛ 필터로 여과하여 배양세포 접종액으로 사용하였다.

5. PCV2 바이러스 배양:

세포 단층이 50%정도 형성된(시료당 75㎠ 플라스크×2) nPK-15 세포에 위 4의 배양세포접종액 2㎖씩을 접종하고 37℃에서 90분간 감염시켰다.

PBS(Phosphate-buffered saline, pH7.4)로 세포를 2회 세척한 다음, 10% FCS함유 세포배양배지 20㎖를 첨가하고 37℃에서 4시간 더 배양했다.

PBS로 2회 세포를 세척한 다음, 300mM D-글루코사민(glucosamine)이 함유된 α-MEM 용액을 첨가한 후 37℃에서 30분간 처리했다.

처리 즉시 PBS로 세척한 다음, 10% FCS함유 α-MEM 배지를 첨가하여 1일간 배양한 다음, 5% FCS함유 배지를 첨가한 다음, 다시 1-2일간 더 배양했다.

2개의 플라스크 중 하나는 세포를 수거하여 계대하고, 다른 하나는 3회 동결/용해 후 원심분리하여 수거한 상층액 5㎖를 계대한 접종세포 플라스크에 첨가하여 수퍼인펙션(superinfection)시켰다. 너머지 상층액은 나중에 사용하기위해 -70℃에 보관했다.

위와 같은 방식으로 3대 계대한 다음, PCR 및 IFA로 바이러스 감염상태를 확인하였다.

< 실시예 2: 간접형광항체법에 의한 TCID ₅₀ 측정법>

튜브를 사용하여 세포배양 배지로 위에서 배양한 바이러스를 10배수로 단계 희석하였다. 대개 10^-7까지 희석한다. 각 바이러스 희석배수마다 세포배양 마이크로플레이트(8×12)의 8개의 웰에 100㎕씩 접종하였다. 동일한 희석농도를 최소한 5개의 웰에 100㎕씩 접종하는 것이 바람직하다.

돼지 신장세포주 nPK-15를 배양하여 약 2×10⁵ 세포/100㎕로 부유된 세포를 각 웰에 100㎕씩 가했다. 3-7일 배양하여 세포단층(monolayers)이 형성되었을 때 PBS로 세척하고 냉장 메탄올을 첨가하여 10분 동안 세포를 고정했다. 플레이트를 알루미늄 호일로 밀봉하여 사용시까지 -20℃에 보관하였다.

고정세포에 PBS로 10배 희석한 PCV2 양성 혈청을 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 건조되지 않게 커버를 씌워 한 시간 반응시켰다. PBS를 웰당 300㎕씩 첨가하여 3-5회 세척한 다음 용액을 완전히 제거하였다. PBS로 200배 희석한 돼지 IgG(whole molecule)에 대한 FITC-결합된 래빗 IgG 분획 용액을 웰당 50㎕씩 분주하여 37℃에서 30분 내지 1시간 반응시켰다. PBS를 웰당 300㎕씩 첨가하여 3-5회 세척한 다음, 용액을 완전히 제거했다. 역상 형광현미경 하에서 핵 내에 형광을 나타내는 특이 형광세포의 존재를 판독하였다. 카버 방법(Karber method)으로 TCID₅₀/100㎕를 계산했다(log TCID₅₀ = xa-D(Sp-0.5)).

< 비교예 : 간접형광항체법( Indirect fluorescent antibody test ; " IFA ")에 의한 PCV2 항체가 측정>

1. 검사방법;

IFA 검사용 플레이트 제작은 PCV2 를 감염시킨 nPK-15 세포를 서브컬쳐(subculture)하여 37℃에서 18시간 배양한 후, 300mM D-글루코사민(glucosamine)으로 처리하고, 2일간 더 배양한 다음, 트립신(trypsine)-버신(versine)으로 처리하여 감염세포를 회수하였다. 회수한 세포를 2×10⁵/㎖ 농도로 조정한 다음, 96-웰(12×8) 조직배양 플레이트에 웰당 100㎕씩 분주하여 37℃에서 2일간 더 배양하였다. 플레이트의 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척한 다음 공기 건조하고, 냉장 메탄올(100%)을 첨가하여 -20℃에서 10분간 세포를 고정하였다. 플레이트를 알루미늄 호일로 밀봉하여 사용시까지 -20℃에 보관하였다. 희석용 플레이트 각 웰에 PBS 100㎕를 분주하고, 비동화한 가검 혈청을 플레이트의 첫 웰에 100㎕ 분주한 다음에 혼합하고 100㎕씩 계대 혼합하여 2의 배수로 12웰까지 단계 희석하였다.-> 희석배율이 제일 높은 12번째 웰부터 100㎕씩 항원처리된 형광항체용 플레이트의 각 웰로 옮겼다.-> 밀봉한 다음, 37℃에서 한 시간 동안 배양하였다.-> PBS를 웰당 300㎕ 씩 첨가하여 3-5회 세척한 다음 용액을 완전히 제거하였다.-> PBS로 200배 희석한 돼지 IgG(whole molecule)에 대한 FITC-결합된 래빗 IgG 분획용액을 웰당 50㎕씩 분주하였다.-> 37℃에서 30분 내지 1시간 반응시켰다.-> PBS를 웰당 300㎕씩 첨가하여 3-5회 세척한 다음, 용액을 완전히 제거한 후 역상 형광현미경으로 판독하였다.

2. 판정기준;

가검 혈청을 첨가한 웰에서 황록색의 형광이 관찰되면 양성(positive)으로 판정하였다. 최종양성으로 판정된 웰까지의 계대 희석배수(2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096)를 그 혈청의 역가로 하였다. 역가가 8 미만인 혈청은 음성(negative)으로 본다. 양성(positive) 및 음성(negative) 대조군을 같이 실험하여 결과를 비교하였다.

3. 문제점;

조직배양을 통해 플레이트에 항원을 준비해야 하고 조작이 번거로우며 형광현미경으로 즉시 판독해야 하는 단점이 있다.

이 방법은 시험절차가 ELISA보다 복잡하고 형광물질이 빛에 의해 분해되는 성질이 있어 신속한 실험이 요구되며, 빛에 될 수 있으면 많이 노출되지 않는 것이 정확도를 높여준다. 형광물질이 비특이적으로 항원에 반응할 수 있다는 단점과 고가의 형광현미경이 필요하다는 단점이 있다.

< 실시예 3: ELISA 법을 응용한 돼지 써코바이러스 항체 역가 측정방법>

1. 플레이트(96웰) 코팅용 항원(PCV2) 제조방법 및 적절한 혈청 희석배율 산정방법

96웰 플레이트 코팅용 항원(PCV2)은 상기 바이러스 분리배양 방법과 같이 세포배양하여 IFA법으로 농도를 측정하여 5X10⁴ TCID₅₀을 사용하였다.

표준 혈청(Standard serum)은 수의과학검역원에 요청하여 배정받아 사용하였다. IFA에 의하여 측정한 PCV2 항체 역가는 1024였다.

항원을 96웰 플레이트에 코팅하는 농도(최대희석농도) 산출방법: 상기 농도의 PCV2를 100배, 200배, 500배, 1000배로 희석하여 플레이트에 코팅하고 단계별로 일정한 농도로 희석한 표준 혈청으로 반응시켜 아래에 기술한 ELISA 방법과 같이 측정하여 흡광도 값이 일정하게 나오고 판독 가능하게 나오는 PCV2의 최대희석배수를 사용하였다. 상기 PCV2 농도를 500배 희석한 것까지가 흡광도 값이 일관성 있게 높게 나타났으므로 항원을 플레이트에 코팅하는 최대희석농도는 500배로 하였다.

적절한 혈청 희석배율 산정방법: 항원 플레이트 코팅농도 산출시 사용하는 표준 혈청은 10배, 20배, 50배, 100배로 희석하여 아래에 기술한 효소면역흡착법(ELISA)의 혈청 역가측정법과 동일한 방법으로 항원이 코팅된 플레이트에 분주하여 처리하였다. 표준 혈청의 20배 희석농도까지가 항원의 일정한 희석단계(500배)까지 흡광도 값을 일정하게 나타냈고 표준 혈청 희석배율에 따라 흡광도도 반비례하였으므로 표준 혈청과 가검 혈청의 20배 희석농도까지를 PCV2 항체역가 측정시 사용하였다.

항원의 플레이트 코팅농도 및 적절한 혈청 희석배율 산출시 사용하는 항원 희석농도별 항체 희석농도를 다음의 표 1에 나타내었다.

↓항체희석＼항원희석→	100배	200배	500배	1,000배
10배	*	*	*
20배	*	*	*
50배
100배

*적절한 항원, 항체 희석비율을 나타냄

2. 시약

1) 코팅 완충액의 조성은 Na₂CO₃ 1.59g, NaHCO₃ 2.93g을 정제수에 녹여 최종 부피 1ℓ가 되도록 하였다. pH는 9.6이었다. 코팅 완충액은 4℃에 보관한다.

2) 블로킹 용액은 3% 젤라틴 용액을 사용하였다.

3) 세척액은 다음의 표 2와 같이 저염 용액(Low salt solution)과 고염 용액(High salt solution) 두 가지로 제조하였다. 사용할 때는 10배 희석하여 사용한다.

시약	저염 용액	고염 용액
Tris-base	24.2g	24.2g	증류수에 녹여 최종 부피 1ℓ가 되도록 함
NaCl	222.2g	292.2g
Thimerosal	1g	1g
pH	7.3	7.7	HCl로 pH 맞춤
Tween-20	5㎖	10㎖

4) 콘쥬게이트

항 돼지 항체의 콘쥬게이트로 HRPO 콘쥬게이트를 사용하였다.

5) TMB 기질

DMSO 1ℓ에 TMB 0.8g의 비율로 혼합하였다.

6) TMB 기질 희석액

실험 직전에 제조하는 것으로, 구연산 10㎖당 상기 5)의 TMB 기질 100㎕와 과산화수소 2㎕를 혼합하였다.

7) 구연산 : 0.1M 구연산 인산 완충액을 제조하고 NaOH를 이용하여 pH 4.0이 되도록 맞추었다.

8) 반응정지 용액(Stop solution)

다음의 표 3과 같이 제조하였다.

NaEDTA	400mg	세 가지를 증류수에 녹여 1ℓ가 되게 한 후 아래 플루오르화수소산과 혼합함
1N NaOH	6㎖
구연산	10.5g
50% 플루오르화수소산 (ghydrofluoric acid)	2.5㎖

9)PBS(Phosphate buffered saline)

NaCl 8g, KH₂PO₄ 0.2g, Na₂HPO₄ 1.19g, KCl 0.2g을 증류수 1000㎖에 용해한 다음 pH 7.4로 맞추었다.

3. 실험방법

1) 항원(PCV2)을 위에서 계산한 배율로 코팅 완충액으로 희석하였다.

2) 희석된 항원을 코팅 플레이트에 100㎕씩 분주(또는 플레이트의 각 웰에 바이러스 역가가 100 TCID₅₀/50㎕ 정도인 PCV2를 50㎕씩 분주) 후 37℃에서 3시간 배양하였다.

3) 저염 용액(Low salt solution)으로 300㎕씩 분주 후 2회 세척하였다. 타월로 여분의 용액을 제거하였다.

4) 블로킹 용액(blocking solution)을 200㎕ 분주 후 37℃에서 30분 배양하였다.

5) 저염 용액으로 2회 세척하였다.

6) 비동화한 가검 혈청을 20배 희석하여 코팅 플레이트에 100㎕씩 분주하고, 표준 혈청(1024배를 사용)은 20배 희석한 후 2의 배수로 8단계로 계대 희석하여(가검 혈청의 역가가 표준 혈청보다 높을 때는 희석하여 희석배율을 적용한다) 동일한 코팅 플레이트에 희석배수별로 100㎕씩 분주하고, 37℃ 35분간 배양하였다.

7) 고염 용액(High salt solution)으로 4회 세척하였다.

8) 항 PCV2 양고추냉이 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase) 콘쥬게이트를 저염 용액에 10,000배 희석하여 100㎕씩 분주하여 37℃에서 30분 배양하였다.

9) 고염 용액으로 4회 세척하였다.

10) TMB 기질 희석액을 100㎕씩 분주하고 실온에서 약 15분 배양하였다.

11) 반응 정지 용액을 100㎕씩 분주하여 반응을 정지시킨 다음 효소면역흡착법 판독기(ELISA reader)로 흡광도를 측정하여 결과를 파장 610nm에서 판독하였다.

4. 항체 역가 계산방법

1) 표준 혈청의 항체 역가와 흡광도:

가검 혈청과 동일하게 희석(보통 20배)하고 다시 2의 배수로 계대 희석하였으므로 최초 역가가 1024배 이면 희석단계별로 항체 역가가 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8이며 그에 따른 각 단계별 흡광도가 나온다.

2) 가검 혈청의 항체 역가 산정:

위의 표준 혈청의 흡광도들을 역가에 따른 검량선으로 생각하여 가검 혈청의 흡광도를 표준 혈청의 역가별 흡광도와 비교하여 일정한 역가와 동일한 값이거나 높은 값을 가지면 그 표준 혈청의 역가를 가검 혈청의 항체 역가로 본다. 가검 혈청의 항체 역가가 8 이하로 나오면 음성으로 본다.

5. 가검 혈청의 PCV2 항체 역가 측정실험 결과

상기 방법으로 가검 혈청의 PCV2 항체 역가를 측정한 결과는 다음과 같다. 표 4는 각 희석 시료의 흡광도 값이고, 표 5는 이를 항체 역가로 계산한 값을 나타낸다.

흡광도(O.D)					대조군(표준 혈청)
시료 1	시료 2	시료 3	시료 4	시료 5	흡광도	역가
0.755	0.549	0.444	0.600	0.118	0.602	1024
0.586	0.253	0.547	0.291	0.128	0.499	512
0.640	0.364	0.586	0.560	0.229	0.390	256
0.468	0.525	0.393	0.478	0.313	0.298	128
0.410	0.488	0.470	0.423	0.442	0.214	64
0.383	0.464	0.526	0.433	0.526	0.145	32
0.329	0.427	0.501	0.316	0.518	0.100	16
0.267	0.706	0.470	0.602	0.708	0.080	8

상기 표 4의 흡광도를 항체 역가로 환산하였다. 이를 아래의 표 5에 나타내었다.

항체 역가					대조군(표준 혈청)
시료 1	시료 2	시료 3	시료 4	시료 5	흡광도	역가
1024 이상	512	256	512	16	0.602	1024
512	64	512	64	16	0.499	512
1024 이상	128	512	512	64	0.390	256
256	512	256	256	128	0.298	128
256	256	256	256	256	0.214	64
128	256	512	256	512	0.145	32
128	256	512	128	512	0.100	16
64	1024 이상	256	1024	1024 이상	0.080	8

아래 표 6은 종래의 간접형광항체법을 이용하여 PCV2 항체 역가를 측정한 결과이다.

항체 역가
시료 1	시료 2	시료 3	시료 4	시료 5
1024 이상	512	256	512	16
1024 이상	64	512	64	32
1024 이상	128	512	512	64
256	512	256	256	128
256	256	256	256	256
128	256	512	256	512
128	256	512	128	512
64	1024 이상	256	1024 이상	1024 이상

간접 형광항체법(IFA) 양성혈청 85점 중 81점이 양성이었고, IFA 음성혈청 133점 중 130점이 음성으로 나타나 IFA에 대한 본 발명 항체 역가 측정방법의 민감도, 특이도 및 정확도(민감도=양성판정 수/전체 양성혈청 수, 특이도=음성판정 수/전체 음성혈청 수, 정확도=양성판정 수와 음성판정 수의 합계/전체 양성혈청 수와 음성혈청 수의 합계)는 95.3%, 97.7% 및 96.8%로 확인되었다. 상기 가검 혈청에 대한 IFA 항체역가와 비교에서도 편차(정확도 95.0%)가 크게 없었다.

따라서 본 발명 ELISA를 이용한 PCV2 항체 역가 측정방법은 기존의 간접형광항체법과 비교할 때 민감도, 특이도 및 정확도가 95~98%로서 종래의 항체 역가 측정방법을 대체할 수 있는 유용한 진단법인 것으로 확인되었다.

본 발명의 ELISA를 이용한 PCV2 항체 역가 측정 방법은 복잡한 과정을 거치지 않고도 항체 역가를 간단하고 정확하게 측정할 수 있도록 한다.

Claims (4)

1. 돼지 써코바이러스의 항체 역가 측정 방법에 있어서,

   항원을 플레이트에 코팅하는 최대희석농도를 산출하기 위하여 일정 농도의 돼지 써코바이러스 2를 단계별로 희석하여 플레이트에 코팅하고 적절한 농도로 희석한 표준 혈청으로 반응시켜 효소면역흡착법과 같이 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 일정하게 나오고 판독 가능하게 나오는 돼지 써코바이러스 2의 최대희석농도까지를 혈청의 적절한 희석배율로 산출하고, 적절한 혈청 희석배율 산정방법으로서 표준 혈청을 단계별로 희석하여 항원이 단계별로 희석되어 코팅된 플레이트 각 줄마다 표준 혈청 희석배율별로 분주하여 효소면역흡착법과 같이 처리하여 흡광도를 측정하여 항원의 일정한 희석농도에 대하여 흡광도 값을 일정하게 나타내고 표준 혈청 희석배율에 따라 흡광도가 반비례하는 표준 혈청 희석농도까지를 혈청의 적절한 희석배율로 산출하는 준비 단계;

   ⅰ) 항원을 플레이트에 가하고 배양하는 단계;

   ⅱ) 블로킹 용액을 플레이트에 가하여 배양하는 단계;

   ⅲ) 표준 혈청을 가검 혈청과 동일하게 희석하고, 표준 혈청을 다시 단계별로 2의 배수로 계대 희석하여 플레이트에 가하여 반응시키는 단계;

   ⅳ) 돼지 써코바이러스 2 항체-표지용 효소 콘쥬게이트를 가하여 배양하는 단계;

   ⅴ) 상기 표지용 효소의 기질을 가하여 반응시키는 단계;

   ⅵ) 상기 단계 ⅴ)에 의해 염색된 시료의 흡광도를 특정 파장에서 측정하는 단계;를 포함하며,

   상기 ⅴ) 단계 이후 얻어진 표준 혈청의 희석 단계별 흡광도 측정값들을 역가에 따른 검량선으로 보고, 가검 혈청의 흡광도를 표준 혈청의 역가별 흡광도와 비교하여 일정한 역가와 동일한 값이거나 높은 값을 가지면 그 표준 혈청의 역가를 가검 혈청의 항체 역가로 결정하는 것을 특징으로 하는 돼지 써코바이러스의 항체 역가 측정 방법.
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