KR100438006B1 - 간단하고 빠른 바이러스에 대한 항체의 간접면역효소측정법 - Google Patents

간단하고 빠른 바이러스에 대한 항체의 간접면역효소측정법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간접면역효소측정법 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 바이러스 항원 및 대조군 항원을 마이크로 플레이트에 코팅하는 단계를 포함하여 이루어지는 항-바이러스 항체의 간접효소면역측정법 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 간단한 정제과정을 거친 항원을 이용하므로써, 간접효소면역측정법에 의한 측정이 간단하고 측정시간이 단축되어, 바이러스의 감염여부를 간단하고 빠르게 진단할 수 있게 된다.

Description

간단하고 빠른 바이러스에 대한 항체의 간접면역효소측정법{A SIMPLE AND RAPID INDIRECT ENZYME LINKED IMMUNOASSAY FOR DETECTING ANTI-VIRUS ANTIBODY}
본 발명은 검체 혈액 중의 바이러스에 대한 항체를 간접효소면역측정법을 이용하여 측정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바이러스 항원 및 대조군 항원을 마이크로 플레이트에 코팅하는 단계를 포함하는 간접효소면역측정법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법을 이용한 진단방법에 관한 것이다.
종래 검체의 혈액 중의 바이러스에 대한 항체를 검사하기 위한 검사법으로서, 혈청에 의한 바이러스중화시험(virus neutralization test) 및 효소면역측정법이 사용되어 왔다. 이러한 방법을 사용한 예로는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus: PEDV)에 대한 항체를 검사하기 위한 것으로 대한민국 특허 제10-0143239호 "돼지 유행성 설사병 예방약 생산을 위한 약독화 바이러스주" 에 기재되어 있다.
상기 대한민국 특허 제10-0143239호 에는, 간접효소면역법을 위한 다음과 같은 항원 정제과정이 개시되어 있다.
즉, 유행성 설사 바이러스 배양액을 3회 동결 융해시킨 다음 2,500rpm에서 10분 동안 원심한 후 상층액을 채취하였다. 이후 채취된 상층액 100㎖당 폴리에틸렌 글리콜(PEG M.W. 6000) 과 NaCl을 각각 7%와 2.3g의 농도로 첨가한 후, 5℃에서 16시간 동안 교반한 다음 10,000×g에서 30분 동안 원심한 후 침전물을 수확하였다. 침전물은 TEN(Tris 10mM,EDTA 1mM, NaCl 100mM, pH 7.4) 완충액에 원 용량의 1/10농도로 산정하여 재용해시킨 후 다시 70,000×g 에 90분 동안 원심하여 침전된 펠릿을 수확하여 원심전 용량의 1/20의 농도로 TEN 완충액에 재용해하여 효소 면역법을 위한 항원으로 사용하였다.
그러나, 상기와 같은 종래 기술에 의하면 다음과 같은 문제점이 있었다.
첫째, 종래의 혈청에 의한 바이러스중화시험을 이용하는 경우, 많은 시간이 소요된다. 돼지 유행성 설사 바이러스의 경우 약 7일이 소요되며, 그에 따라 비용이 많이 소요된다.
둘째, 간접효소면역측정법을 사용하는 경우, 돼지는 세포배양된 바이러스를 여러번 백신접종을 받기 때문에 세포배양시 포함되어 있는 혈청과 세포 성분들에 대한 항체가 생산되어 효소면역측정법을 이용할 때 비특이반응이 많이 일어난다. 따라서, 종래에는 상기한 바와 같이 복잡한 항원정제 과정을 거쳐야 하는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여, 간단한 항원정제 과정을 거쳐서 얻어진 바이러스 항원과 함께 바이러스를 접종하지 않은 세포로부터 유래하는 대조군 항원을 사용하므로써, 비특이적 반응으로부터 유래하는 오류를 보정하여 주는 간접효소면역측정법 및 이를 이용한 진단방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도1은 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원의 희석배수별 흡광도를 나타내는 도면이고,
도2는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 혈청의 희석배수별 흡광도를 나타내는 도면이고,
도3은 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 측정하기 위한 간접면역효소측정법 및 그를 이용한 진단방법을 나타내는 흐름도이고,
도4는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 측정하기 위한 간접면역효소측정법에서 얻은 교정흡광도와 혈청중화항체 역가간의 상관관계를 나타내는 도면이고,
도5는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 측정하기 위한 간접면역효소측정법에서 얻은 교정흡광도 및 교정값의 범위와 혈청중화항체 역가간의 상관관계를 나타내는 도면이다.
본 발명의 바이러스 항원의 간접효소면역측정법(indirect enzyme linked immunosorbent assay)은 바이러스 항원 및 대조군 항원을 마이크로 플레이트에 코팅하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 바이러스 항원은 (a) 바이러스를 숙주세포에 접종시켜 증식시키는 단계; (b) 상기 증식된 세포의 세포막을 파쇄하여 세포내 바이러스를 유리시켜 원심분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 여기에서, 상기 바이러스 항원은 순수하게 정제될 필요는 없으며, 조 분리된 것이어도 상관없다. 예를 들면, 돼지 유행성 설사병 바이러스가 감염된 베로 세포에 트리톤 X-100(Triton X-100)을 최종농도 0.1∼0.2부피%로 처리하여, 세포 내용물을 유리시킨 후, 12,000∼15,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 얻어진 상층액이 포함될 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따른 바이러스 항원은 단순한 원심분리와 같이, 간단한 방법에 의하여 준비될 수 있다.
상기 대조군 항원은 상기 방법 중 (a) 단계에서, 바이러스를 접종시키지 않고, 숙주세포를 증식시키는 단계를 거치는 것을 제외하고는 상기 방법과 동일한 방법에 의하여 얻어지는 것이다. 이 대조군 항원은 상기 바이러스 항원에 포함되어 있을 수도 있는 혈청 성분 또는 세포 성분에 의하여 간접면역측정 결과의 민감도 또는 특이성이 낮아지는 것을 보정하기 위한 것이다.
본 발명의 바이러스 항원의 간접효소면역측정법에 있어서, 상기 간접효소면역측정법은, 당업계에서 일반적으로 알려져 있는 방법이다. 이는 예를 들면, 하기 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 이는 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법의 중요한 흐름을 나타낸 것으로, 세부적인 사항 예를 들면, 플레이트의 세척과정 등이 부가될 수 있음은 당연하다. 따라서, 본 발명의 간접효소면역측정법이 여기에 한정되는 것은 아니다.
바이러스 항원을 마이크로 플레이트에 코팅하는 단계;
상기 플레이트의 코팅되지 않은 부분을 차단용액을 사용하여 차단하는 단계;
상기 차단된 플레이트에 검체 혈청 및 표준음성혈청을 반응시키는 단계;
상기 검체 혈청 중의 항체에 특이적인 발색용 항체 접합체(antibody conjugate)를 반응시키는 단계;
상기 항체 접합체에 해당하는 발색제를 사용하여 발색시켜 흡광도를 측정하는 단계.
본 발명은 상기 종래의 간접면역효소측정법 중, 바이러스 항원을 마이크로 플레이트에 코팅하는 단계에서 대조군 항원을 함께 마이크로 플레이트에 코팅하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 간접효소면역측정법을 이용한 진단방법에 관한 것으로, 상기 방법에 의하여 얻어진 흡광도를 하기 식(1)에 대입하여 교정값을 얻고, 이 교정값의 수치에 따라 검체가 상기 바이러스에 감염되었는지 여부를 결정하는 것을 특징으로 한다.
[식1]
본 발명에 사용되는 상기 바이러스는, 배양 중인 숙주세포에 감염시켜 증식시킬 수 있는 것이면 어느 것이나 가능하며, 여기에 특별한 제한은 없다. 예를 들면, 코로나바이러스가 포함될 수 있으며, 바람직하기로는 돼지 유행성 설사병 바이러스이다.
이하, 본 발명을 실시예를 참조하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이실시예는 단지 예시적인 목적일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 실시예는 돼지 유행성 설사병 바이러스를 항원으로 하는 간접효소면역측정법에 관한 것이다. 돼지 유행성 설사 바이러스는 어린 자돈에서 심한 수양성 설사, 탈수 및 폐사를 일으키는 코로나바이러스 그룹I에 속하는 바이러스이다. 이 바이러스는 베로(vero)세포와 돼지 방광 및 신장 세포에서 트립신의 존재하에서 증식한다.
(1) 간접효소면역측정법을 위한 바이러스 항원의 준비
본 실시예에 사용된 돼지 유행성 설사병 바이러스는 대한민국 국립수의과학검역원에서 분양받은 KPED-9 주로서 현재 대한민국 내에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 생독 백신주로서 이용되고 있는 것이다.
돼지 유행성 설사병 바이러스는 α-MEM과 0.03% 효모 추출물(yeast extract), 0.3% 트립토즈 포스페이트 브로쓰(tryptose phosphate broth) 및 2㎍의 트립신이 포함된 배지로 롤러병(490cm2)의 베로 세포에 접종하여 증식시켰다. 이때 바이러스 접종량은 0.1m.o.i이었다. 접종 48시간 후에 바이러스가 감염된 세포를 0.85% 염수(saline)로 3회 세척하고, 세포수확기(cell scraper)로 세포를 모은 다음, 트리톤 X-100을 최종농도 0.1∼0.2부피%가 되게 첨가하였다. 이것을 4℃에서 밤새 교반하고, 37℃에서 다시 1시간 동안 교반하였다. 이렇게 준비된 것을 12,000∼15,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 그 상층액을 바이러스 항원으로 사용하였다.
대조군 항원은 바이러스만 접종하지 않은 것을 제외하고는, 상기 바이러스 항원 준비과정과 동일하게 준비하였다.
상기와 같이 준비된 바이러스 항원과 대조군 항원은 단백질량을 측정하여 간접효소면역측정법의 항원으로 사용하였다.
(2) 최적 항원농도 및 최적 혈청 희석배율의 결정
간접효소면역측정법의 최적 항원 농도와 최적 혈청 희석배율을 결정하기 위하여 체크보드검정(checkboard assay)법을 이용하였다. 즉, 바이러스 항원과 대조군 항원을 1㎍/웰(well)에서 0.001㎍/웰까지 희석하고, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 표준 양성혈청과 음성혈청을 각 항원 희석 농도별로 50배, 100배, 1000배, 5000배로 희석하여 반응시킨 후, 흡광도를 측정하였다. 표준양성혈청은 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신을 돼지에 2회 접종하여 면역시킨 것으로서 혈청중화항체가로서 26의 역가를 가지고 있는 것이었다. 표준음성혈청은 임상적으로도 돼지 유행성 설사병이 없으며 백신접종도 하지 않은 돼지로부터 분리한 혈청을 이용하였으며, 혈청중화항체가로서 21이하의 역가를 가지고 있는 것이었다.
체크보드검정의 결과, 항원의 희석은 0.1㎍/웰로 희석하는 것이 면역측정용 플레이트에 코팅(coating)하는데 최적이며(도1), 혈청의 희석배수는 50배로 희석하는 것이 최적임을 결정하였다(도2).
(3) 간접 면역효소측정법의 시험단계
각 시험검체의 혈청에 대한 항-돼지 유행성 설사병 바이러스 항체의 간접면역효소측정법은 다음과 같은 단계로 진행되었다. 그 결과 바이러스 항원과 대조군 항원에 대하여 동시에 흡광도를 측정하였으며, 이 흡광도로부터 식(1)을 이용하여 교정 흡광도와 교정값을 계산하여 돼지 유행성 설사병 바이러스의 감염여부가 양성인지 음성인지를 진단하였다.
1) 바이러스 항원과 대조군 항원을 흡착용 코팅완충용액(증류수 200㎖에 Na2CO30.376g, NaHCO30.542g, NaCl 1.462g을 녹인 용액: pH9.6: 2주간 냉장보관하여 사용하고 2주 경과시 다시 만들어서 쓴다)을 사용하여 1.0㎍/㎖로 희석하여 면역분석용 플레이트에 0.1㎍/웰씩 첨가하여 4℃에서 밤새 보전하여 항원을 흡착시켰다.
2) 흡착이 종료된 후, 플레이트를 PBST(0.15M PBS, 0.05% tween-20)로 5회 세척한 후 차단완충용액(PBS 중의 5% 토끼 혈청(rabbit serum))을 200㎕/웰씩 넣어 37℃에서 1시간 동안 차단시켰다.
3) 차단이 종료된 후, 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 PBST로 1:50으로 희석한 검체의 혈청을 바이러스 항원과 대조군 항원이 흡착된 웰에 각각 100㎕씩 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
4) 혈청 반응이 종료된 후, 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 항-돼지 접합체인 항-돼지 IgG HRP(KPL사)를 PBST로 최적의 농도로 희석한 후(1:1000) 100㎕/웰씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
5) 반응 후, PBST로 5회 세척하고 ABTS(KPL사)를 100㎕/웰씩 넣어 실온에서 30분 동안 발색시킨 후 1% SDS 용액을 50㎕/웰씩 첨가하여 발색반응을 정지시켰다.
6) 발색이 정지된 플레이트내 반응을 ELISA 리더(reader)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다(도3).
7) 각 혈청의 흡광도는 다음의 식(1)에 의하여 교정흡광도와 교정값으로 환산되었다.
교정 흡광도 = 검체의 바이러스 항원에 대한 흡광도 - 검체의 대조군 항원에 대한 흡광도
[식1]
8) 그 결과 검체의 교정값이 2.000이상일때는 양성으로, 2.000이하일때는 음성으로 판정하였다.
(4) 혈청 중화 시험
검체의 혈청중화항체가 측정은 다음과 같이 실시하였다. 즉, 검체의 혈청을 56℃에서 30분 동안 비동화하고 2진 희석한 후 200 TCID50/0.1㎖의 돼지 유행성 설사병 바이러스와 동량 혼합한 후, 1시간 동안 반응시켰다. 그리고, 단층이 형성된 베로(vero)(ATCC CCL081) 세포를 PBS로 세척한 후, 혈청과 바이러스가 혼합된 것을 0.1㎖씩 각 웰에 넣어 37℃에서 1시간 동안 흡착시킨 후 2회 PBS로 세척하고, 트립신 함유 배지를 각 웰에 첨가하여 37℃에서 5일간 배양하였다. 그 결과 세포변성효과가 나타나지 않는 최고 희석배수의 역수를 혈청중화항체가로 표시하였다.
(5) 간접효소면역측정법의 특이성과 민감성
간접효소면역측정법의 유효성을 혈청중화항체가와 비교하여 계산하였으며, 상관도(r2) 값은 마이크로칼 오리진 6.0(Microcal Origin 6.0 program,Microcal Software사)으로 측정하였다.
그 결과, 이미 알고 있는 혈청중화항체가(10농장, 119 검체의 혈청)와 교정 흡광도 및 교정값을 비교하였을 때, 교정 흡광도와의 상관도(r2) 값은 0.8367이었으며(도4), 교정값과의 상관도(r2) 값은 0.8568이었다(도5). 또한, 25이상과 22이하의 중화항체가를 보이는 혈청은 100% 양성 및 음성으로 판정되었으나, 23, 24의 중화항체가는 각각 44%, 69%의 일치율을 보였다(표1). 또한, 혈청중화항체가가 24이상일 경우를 혈청중화항체가 양성으로 판정할 때 간접효소면역측정법은 89.1%의 민감성과 94.5%의 특이성을 보여(표2), 간접효소면역측정법이 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체 검출에 유효함을 확인할 수 있었다.
바이러스중화항체가(2n) 교정흡광도의 범위 교정값의 범위 양성검체수/시험검체수
≤1 0.004∼0.124 0.10∼1.47 0/58 (0%)
2 0.052∼0.200 0.60∼1.85 0/6 (0%)
3 0.224∼0.400 1.87∼2.70 4/9 (44%)
4 0.184∼0.432 1.80∼3.95 11/16 (69%)
5 0.280∼0.604 3.33∼7.19 17/17 (100%)
6 0.432∼1.100 5.14∼13.09 13/13 (100%)
중화항체시험 간접 면역효소측정법
양성 음성 계
양성 41 5 46
음성 4 69 73
계 45 74 119
간접면역효소측정법의 민감성: 89.1%(41×100/46)
간접면역효소측정법의 특이성: 94.5%(69×100/73)
본 발명에 의하면, 대조군 항원을 사용하므로써 바이러스 항원을 높은 순도로 정제하기 위하여 복잡한 과정을 거칠 필요없이, 간단한 정제과정을 거친 항원을 이용하므로써, 간접효소면역측정법에 의한 측정이 간단하고 측정시간이 단축되게 된다.
또한, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체가를 간단하고 빠르게 측정할 수 있게 하므로써, 상기 바이러스의 감염여부를 간단하고 빠르게 진단할 수 있게 된다.

Claims (11)

  1. 바이러스 항원 및 대조군 항원을 마이크로 플레이트에 코팅하는 단계를 포함하여 이루어지는 항-바이러스 항체의 간접효소면역측정법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 항원은 (a) 바이러스를 숙주세포에 접종시켜 증식시키는 단계; (b) 상기 증식된 세포의 세포막을 파쇄하여 세포내 바이러스를 유리시킨 후, 원심분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 것이고,
    상기 대조군 항원은 상기 방법 중 (a) 단계에서, 바이러스를 접종시키지 않고 숙주세포를 증식시키는 단계를 거치는 것을 제외하고는 상기 방법과 동일한 방법에 의하여 얻어지는 것임을 특징으로 하는 항-바이러스 항체의 간접효소면역측정법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 증식된 세포막을 트리톤 X-100을 최종농도 0.1∼0.2부피%가 되게 첨가하고, 이것을 4℃에서 밤새 교반하고, 37℃에서 다시 1∼2시간 동안 교반한 후, 이렇게 준비된 것을 12,000∼15,000rpm에서 약 10분 동안 원심분리하는 것을 특징으로 하는 간접효소면역측정법.
  4. 제1항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-바이러스 항체의 간접효소면역측정법:
    바이러스 항원 및 대조군 항원을 마이크로 플레이트에 코팅하는 단계;
    상기 플레이트의 코팅되지 않은 부분을 차단용액을 사용하여 차단하는 단계;
    상기 차단된 플레이트에 검체 혈청 및 표준음성혈청을 반응시키는 단계;
    상기 검체 혈청 중의 항체에 특이적인 발색용 항체 접합체를 반응시키는 단계; 및
    상기 항체 접합체에 해당하는 발색제를 사용하여 발색시켜 흡광도를 측정하는 단계.
  5. 제4항의 방법에 의하여 얻어진 흡광도를 하기 식(1)에 대입하여 교정값을 얻고, 이 교정값의 수치에 따라 검체가 상기 바이러스에 감염되었는지 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 바이러스 진단방법.
    [식1]
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 바이러스는 코로나바이러스임을 특징으로 하는 간접효소면역측정법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 돼지 유행성 설사병 바이러스임을 특징으로 하는 간접효소면역측정법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 숙주세포는 베로세포인 것을 특징으로 하는 간접효소면역측정법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 바이러스는 코로나바이러스임을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 바이러스 진단방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 돼지 유행성 설사병 바이러스임을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 바이러스 진단방법.
  11. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 베로세포인 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 바이러스 진단방법.
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논문(석사학위논문, 1994) *

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