CN116041494A - 一种针对SARS-CoV或SARS-CoV-2的单克隆抗体、其制备方法及应用 - Google Patents

一种针对SARS-CoV或SARS-CoV-2的单克隆抗体、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合SARS‑CoV或SARS‑CoV‑2RBD结构域的单克隆抗体或其抗原结合片段、其相关产品及其制备方法和用途。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能以较高的亲和力与SARS‑CoV或SARS‑CoV‑2RBD抗原结合，且能以较高的中和活性中和SARS‑CoV、SARS‑CoV‑2原型毒株及其一系列变异毒株，从而抑制其感染，因此，在临床治疗、预防和/或检测SARS‑CoV、SARS‑CoV‑2原型毒株及其变异毒株感染方面具有巨大的潜在应用价值。

Description

一种针对SARS-CoV或SARS-CoV-2的单克隆抗体、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及免疫学和分子病毒学技术领域，具体涉及一种针对SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒(包括原型株及其变异株)的单克隆抗体、其制备方法及应用。
背景技术
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，即新型冠状病毒，传播快速、广泛，致死率高，对公众的生命和健康造成重大威胁。与此同时，以SARS-CoV-2的Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron为代表的各种变异株快速传播，尤其自2021年11月Omicron被首次发现以来，其已经发生了近40次S蛋白突变，整个基因组总共有超过60次突变。OmicronBA.1至BA.5的变异，正依次席卷全球。之前已经报道了针对SARS-CoV-2原型株的S蛋白及其RBD的研究，最近的几项研究也已经确定了一些可以逃逸某些单克隆抗体的病毒突变，这些突变发生在中和抗体与病毒结合的关键位置，从而影响中和抗体的效果。
SARS-CoV-2是导致新型冠状病毒(COVID-19)的病原体，是一种具有囊膜结构的单链正链RNA病毒，它与重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)以及中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属冠状病毒科。该病毒表面的刺突蛋白(Spike,S蛋白)在感染宿主的过程中，通过结合宿主细胞受体——血管紧张素转换酶2(ACE2)，从而触发病毒膜与宿主细胞膜融合机制，导致宿主细胞感染病毒。其中S蛋白分为S1和S2两部分，已有研究证实S1的C端(CTD)的受体结合结构域(RBD)与ACE2结合，从而介导病毒膜与宿主细胞膜的膜融合过程。
严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)是严重急性呼吸综合征的病原体，致病性强，对公众健康造成重大威胁。该病毒是单链正链RNA病毒。该病毒表面的刺突蛋白(Spike,S蛋白)在感染宿主的过程中，通过结合宿主细胞受体——血管紧张素转换酶2(ACE2)，从而触发病毒膜与宿主细胞膜融合机制，导致宿主细胞感染病毒。其中S蛋白分为S1和S2两部分，已有研究证实S1的RBD与ACE2结合，从而介导病毒膜与宿主细胞膜的膜融合过程。
迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染的帕利珠单抗(Synagis)，治疗HIV感染的艾巴利珠单抗(Trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的Rabishield。此外，还有多种针对不同病毒的单抗处于临床研究的不同阶段(https://clinicaltrials.gov/)。抗体主要通过两方面起作用。一方面，具有中和活性的抗体可通过结合病毒囊膜蛋白，阻断病毒与细胞受体的结合，从而阻断病毒感染。另一方面，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)可募集巨噬细胞或是补体等免疫细胞和免疫分子，从而清除游离的病毒以及被感染的细胞。
因此，筛选出具有更高亲和力并且能够对所有变异株表现出高中和活性的单克隆抗体是紧迫而重要的，它在提供一种新的有效预防和治疗新型冠状病毒感染的手段的同时，还可以更广泛的保护公众的生命和健康安全。
发明内容
发明目的
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种对SARS-CoV或SARS-CoV-2(包括原型株及其各型变异株)具有高亲和力、并对其表现出高中和活性的单克隆抗体、其相关产品及其制备方法和用途。
解决方案
为了实现上述目的，本发明经过大量的实验研究后发现了一种单克隆抗体，其能够特异性识别并靶向SARS-CoV或SARS-CoV-2原型株及其变异株的S蛋白，特别是S蛋白的受体结合结构域(RBD)，并且能够阻断S蛋白的RBD与细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合，显示出了高效的中和病毒的能力。因此，本发明的单克隆抗体特别适合用于诊断、预防和治疗SARS-CoV或SARS-CoV-2原型株以及变异株感染，或与所述病毒感染相关的疾病(例如新型冠状病毒)。
具体地，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种特异性结合SARS-CoV或SARS-CoV-2S蛋白RBD结构域的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含：
氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
所述轻链可变区包含：
氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
作为优选，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；和，
轻链可变区，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
在一个优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和，
轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
此外，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；优选地，所述恒定区为选自以下的任意一种：IgG、IgA或IgM抗体的恒定区。
在优选的具体实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；并且，优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体的轻链为κ型。
在一些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链，其包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；和，
轻链，其包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
进一步优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；和，
轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在某些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段在其重链可变区和/或轻链可变区的N端还具有前导序列；优选地，所述前导序列具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述前导序列由如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列编码。
在一些可行的实施方案中，所述单克隆抗体的抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性结合SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白(S蛋白)。经实验证实，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够靶向SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)，能够抑制S蛋白的受体结合域(RBD)介导的受体结合和/或膜融合过程，从而抑制病毒对细胞的感染。
发明人还通过实验证实，所述单克隆抗体或其抗原结合片段对于SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒(包括SARS-CoV-2原型株及其一系列变异株)具有较高的中和能力，能够抑制SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒感染或进入宿主细胞，由此，其能够预防和/或治疗SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒的感染。
第二方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。该多核苷酸不受限于其产生的方法，并且可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
在可行的实施方案中，所述多核苷酸为多核苷酸组。
在一些优选的实施方案中，所述多核苷酸组包括：
(I)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为包含如SEQ ID NO:14、15、16所示核苷酸序列(其可分别编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3)的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(II)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为包含如SEQ ID NO:17、18、19所示核苷酸序列(其可分别编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3)的DNA分子或其相应的mRNA分子。
进一步优选地，所述多核苷酸组包括：
(I)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为包含如SEQ ID NO:20所示核苷酸序列(其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区)的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(II)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为包含如SEQ ID NO:21所示核苷酸序列(其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区)的DNA分子或其相应的mRNA分子；
优选地，上述编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一多核苷酸和/或编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二多核苷酸还包括位于5’端的、编码前导序列的核苷酸序列，优选地，所述编码前导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；
优选地，上述多核苷酸组还包括：
(III)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的第三多核苷酸，优选地，所述第三多核苷酸为包含如SEQ ID NO:22所示核苷酸序列(其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链恒定区)的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(IV)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的第四多核苷酸，优选地，所述第四多核苷酸为包含如SEQ ID NO:23所示核苷酸序列(其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链恒定区)的DNA分子或其相应的mRNA分子。
在最优选的实施方案中，所述多核苷酸组包括：
(I)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示的DNA分子或其相应的mRNA分子，其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链；和，
(II)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示的DNA分子或其相应的mRNA分子，其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。
第三方面，本发明提供了核酸构建体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，以及，任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第四方面，本发明提供了一种载体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，或者如上述第三方面所述的核酸构建体。
本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，例如，可以是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在一些优选的实施方案中，所述载体为表达载体，优选为真核表达载体。
第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的表达载体；
所述宿主细胞包括但不限于：原核细胞，例如大肠杆菌细胞；真核细胞，例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。所述宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞系。
优选地，所述宿主细胞为真核细胞，进一步优选为哺乳动物细胞。
第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
在一些优选的实施方案中，所述药物组合物还包括其他药学活性剂，例如，法匹拉韦，瑞德西韦，干扰素等。
在一些可行的实施方式中，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂或可注射制剂。
第七方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体、如上述第五方面所述的宿主细胞和/或如上述第六方面所述的药物组合物。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒为检测或诊断试剂盒，其中所包含的本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记；在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗独特型抗体；优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记；此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
第八方面，本发明提供了一种制备如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合于所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下，使如上述第五方面所述的宿主细胞表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。
第九方面，本发明提供了如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体、如上述第五方面所述的宿主细胞、如上述第六方面所述的药物组合物和/或如上述第七方面所述的试剂盒在以下任一方面的应用：
(1)在制备用于检测SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒、或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平的产品中的应用；
(2)在制备用于中和样品中的SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒毒力的产品中的应用；
(3)在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗受试者的SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒感染或与所述病毒感染相关的疾病；
优选地，所述SARS-CoV-2病毒为SARS-CoV-2原型毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株；
进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株选自：SARS-CoV-2的Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)、Epsilon(B.1.429)、Eta(B.1.525)、Kappa(B.1.617.1)、Lambda(C.37)变异株以及Omicron(B.1.1.529)及其亚变异株BA.1、BA1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5。
第十方面，本发明提供了一种检测SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒、或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平的方法，所述方法包括使用如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体、如上述第五方面所述的宿主细胞、如上述第六方面所述的药物组合物和/或如上述第七方面所述的试剂盒。
在该方法的一些优选实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。
在该方法的另一些优选实施方案中，所述方法还包括：使用携带可检测的标记的第二抗体，来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在可行的实施方案中，所述样品包括但不限于来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的排泄物、口腔或鼻腔分泌物、肺泡灌洗液等。
该方法可用于诊断目的(例如，所述样品是来自患者的样品)，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
因此，在一些具体实施方案中，本发明提供了一种诊断受试者是否感染了SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒的方法，其包括：使用如上述第一方面所述的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，检测SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒、或其S蛋白或S蛋白的RBD在来自所述受试者的样品中的存在；在某些优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记；在另一些优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗独特型抗体。
使用单克隆抗体或其抗原结合片段来检测目标病毒或抗原(例如，SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒、或其S蛋白或S蛋白的RBD)在样品中的存在或其水平的一般方法是本领域技术人员所熟知的。在某些优选的实施方案中，所述检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。
第十一方面，本发明提供了一种用于中和样品中SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒毒力的方法，其包括：将包含SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒的样品与如上述第一方面所述的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。
所述方法可以用于治疗目的，或非治疗目的(例如所述样品是细胞样品，而不是患者或来自患者的样品)。
第十二方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗受试者的SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒感染或与所述病毒感染相关的疾病(例如，新型冠状病毒)的方法，其包括：给有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。
在可行的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
可通过任何适当的施用途径来将本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物施用给受试者，此类施用途径包括但不限于，口服、口腔、舌下、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、或鼻腔途径。
本发明所提供的药物或药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与其他药学活性剂(例如抗病毒药物，如法匹拉韦、瑞德西韦和干扰素等)联合使用。
所述“预防和/或治疗有效量”可根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
有益效果
如实施例中以COV56抗体作为本发明的代表性实例所证实的，本发明的单克隆抗体能够以较高的亲和力与SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒原型株及其变异株的S蛋白RBD结构域特异性结合，因此，有着极高的潜力开发为SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒抗原检测试剂盒中使用的抗体，并可能能够提供更低的检测下线，提高试剂盒的灵敏度；并且，本发明的单克隆抗体对SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒原型株及其变异株、尤其是对目前主要流行的SARS-CoV-2Omicron各变异株均具有很强的中和活性，因此，作为广谱中和抗体，本发明的单克隆抗体(例如COV56抗体)具有理想的预防和/或治疗SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒及其各型变异株感染的临床应用价值，有被开发为广谱、治疗性抗体的巨大潜力。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为本发明实施例3中重组表达的COV56抗体的分子筛层析结果与SDS-PAGE检测结果，其中，凝胶图上的“-”表示没有添加DTT(非还原性SDS-PAGE)；“+”表示添加了DTT(还原性SDS-PAGE)。
图2为本发明实施例4中检测的COV56抗体结合SARS-CoV、SARS-CoV-2原型株及其各型变异株的RBD蛋白的动力学曲线；各曲线图中，横坐标为时间(秒)，纵坐标为响应值(RU)，上方图注显示了与COV56抗体结合的各类型病毒株的RBD。
图3显示了本发明实施例5中检测的不同浓度的COV56抗体对SARS-CoV、SARS-CoV-2原型株及其各型变异株的假病毒的中和活性，其中，纵坐标Neutralization(％)代表中和百分比，横坐标中的concentration为浓度，上方图注显示了COV56抗体所中和的各类型病毒株的假病毒。
图4显示了本发明实施例6中检测的不同浓度的COV56抗体对SARS-CoV-2原型株活病毒的中和活性，其中，纵坐标Neutralization(％)代表中和百分比，横坐标中的concentration为浓度。
图5显示了本发明实施例7中检测的各实验组小鼠的肺部组织的病毒滴度；其中，纵坐标RNA copies(log10 copies/g)代表肺部病毒的载量，横坐标显示了实验组别：Placebo是安慰剂组，Prophylaxis是预防组，Therapeutics是治疗组。
图6显示了本发明实施例7中检测的各实验组小鼠的肺部组织的切片染色结果。
图7是本发明实施例8中所鉴定的COV56抗体识别SARS-CoV RBD和SARS-CoV-2RBD的表位信息。
具体实施方式
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
此外，在本发明中，除非另有说明，否则其所使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义；并且，本发明中(若有涉及)所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤；同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本发明中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本发明中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本发明，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423 426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879 5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444 6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121 1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体COV56)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本发明中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本发明中所使用的，术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见Journal of virological methods,2009,158(1-2):171-179)。
如本发明中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。
如本发明中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本发明中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本发明中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本发明中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合能力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体COV56)以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，新型冠状病毒S蛋白的RBD)，此数值使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE 8K设备中测定。
在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母或三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本发明中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
如本发明中所使用的，术语“新型冠状病毒”和“SARS-CoV-2”是指，国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)正式分类名的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，二者具有相同的含义，可互换使用。
如本发明中所使用的，术语“新型冠状病毒”和“COVID-19”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的，二者具有相同的含义，可互换使用。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明本发明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中，为了获得具有保护效果的中和抗体，在获得了志愿者签署的知情同意书的情况下，发明人先以293F细胞表达的SARS-CoVRBD蛋白(其氨基酸序列参见以下表1的SEQ ID NO:42)作为抗原，通过流式分选术，从接种三针科兴灭活苗的健康志愿者(末次接种时间为2021.10.31)中筛选到能够特异性结合S蛋白或S蛋白RBD结构域的记忆B细胞，然后，对筛选获得的单一B细胞进行RT-PCR，获得编码抗体可变区的序列；进一步，将编码抗体可变区的序列与恒定区基因连接至表达载体中，并在哺乳动物细胞中进行表达和纯化，从而获得抗体COV56。对抗体COV56进行一系列的功能检测，结果显示，抗体COV56能够特异性结合SARS-CoV-2各种突变株S蛋白RBD结构域，阻断S蛋白RBD结构域与人ACE2的结合，从而抑制SARS-CoV-2对人细胞的感染，因而具有抗SARS-CoV-2感染的广谱中和活性。
本发明所涉及的部分序列的信息如下面的表1所示。
表1、本发明所涉及的部分序列的信息
实施例1：特异性识别RBD蛋白的记忆B细胞的分离
在志愿者的知情同意下，从接种三针科兴灭活苗的健康志愿者(末次接种时间为2021.10.31)体内采集10mL的血液，分离PBMCs。将分离的PBMCs以107个细胞/mL的密度与终浓度为400nM的SARS-CoVRBD蛋白(其氨基酸序列参见表1的SEQ ID NO:42，由293F细胞表达)溶液在冰上孵育结合半小时；然后用PBS洗2次，再与下列抗体(均购自BDBiosciences公司)孵育：anti-human CD3/PE-Cy5，anti-human CD16/PE-Cy5，anti-human CD235a/PE-Cy5，anti-human CD19/APC-Cy7，anti-human CD27/Pacific Blue，anti-human CD38/APC，anti-human IgG/FITC，以及anti-His/PE。在冰上孵育半小时后，用PBS洗PBMCs2次。随后，用FACSAria III分选PBMCs，收集PE-Cy5-APC-APC-Cy7+Pacific Blue+FITC+PE+的细胞(即，B细胞)，按1个细胞/孔，直接将其收集到96孔板内。
实施例2：抗体的分离和鉴定以及重组表达载体的构建
使用Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen)对实施例1获得的B细胞进行逆转录(在55℃，进行60分钟)，其中，所使用的逆转录引物如表2所示。
表2、所使用的逆转录引物的序列信息
以逆转录产物作为模板，用HotStar Tap Plus酶(QIAgen)进行第一轮PCR(即，PCRa)，以扩增抗体可变区的序列；其中，所使用的引物如表3所示；所使用的反应条件如下：95℃，5min；35个循环的(95℃ 30s，55℃(重链/κ链)30s，72℃ 90s)；72℃，7min。随后，以该扩增产物作为模板再进行第二轮PCR(即，PCRb)；其中，所使用的引物如表4所示；所使用的反应条件如下：95℃，5min；35个循环的(95℃30s，58℃(重链)/60℃(κ链)/64℃(λ链)30s，72℃ 90s)；72℃，7min。
通过1％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物。回收条带大小在400-500bp的PCR产物，并送测序公司测序。测序结果用NCBI在线软件进行分析。
通过序列测定，获得一株抗体的序列，命名为COV56。COV56抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示(编码基因如SEQ ID NO:20所示)，重链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示(编码基因如SEQ ID NO:21所示)，轻链可变区的CDR1具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列和CDR3具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。COV56抗体与胚系基因的序列一致性如下面的表5-表6所示。
表3、第一轮PCR(PCRa)所使用的引物
表4、第二轮PCR(PCRb)所使用的引物
以上引物中，R＝A/G，D＝A/G/T，S＝C/G，Y＝C/T，W＝A/T，K＝G/T。
表5、COV56抗体重链与胚系基因的比较
将分析得到的编码重链/轻链可变区的核苷酸序列分别与相应的编码重链/κ链的恒定区的核苷酸序列通过搭桥PCR进行连接，然后分别克隆至表达载体pCAGGS(购自Addgene)中，从而得到分别编码抗体重链和轻链的重组表达载体。表达重链和轻链的构建体的构建方法如下：
重链构建体组成(5’-3’)：CMV启动子-EcoR I酶切位点-前导序列基因-VH基因-CH基因-Xho I酶切位点；
轻链(κ)构建体组成(5’-3’)：CMV启动子-Sac I酶切位点-前导序列基因-VL基因-CL(κ)基因-Xho I酶切位点；
其中，前导序列的氨基酸序列如SED ID NO:13所示(编码基因如SEQ ID NO:26所示)，CH的氨基酸序列如SED ID NO:9所示(编码基因如SEQ ID NO:22所示)，CL的氨基酸序列如SED ID NO:10所示(编码基因如SEQ ID NO:23所示)。
实施例3：COV56抗体的表达与纯化
将实施例2中获得的分别编码抗体重链和轻链的重组表达载体(即，重链、轻链表达质粒)共转染HEK293F细胞。重链和轻链表达质粒的摩尔比为1:1.5，每毫升HEK293F细胞转染2μg质粒和4μg PEI(1mg mL-1)。在310K、5％ CO2条件下，用SMM 293-TII培养基(Sinobiological)培养细胞，然后，在转染后24小时，按照35mL/L的比例补充SMS M293-SUPI(Sinobiological)。在第五天，收集上清液，并将所收集的上清液用0.22μm膜过滤，然后通过His-trap HP柱(GE Healthcare)进行纯化，并使用AKTA-purifier(GE)和200 10/300increase columm(GE Healthcare)在PBS缓冲液(pH7.4)中进一步纯化。随后，通过SDS-PAGE(还原性和非还原性)检测所纯化的目的蛋白。
COV56抗体的分子筛层析结果与SDS-PAGE检测结果如图1所示；图1结果显示，经上述步骤后，获得了经纯化的COV56抗体。
实施例4：COV56抗体与S蛋白RBD结构域的亲和力测定
本实施例中，通过利用Biacore 8K(Biacore Inc.)的表面等离子共振分析，对实施例3获得的纯化后的单克隆抗体COV56进行了亲和力测定。具体程序如下：
首先，固定Protein A芯片至Biacore 8K中，设定实验程序：COV56作为固定项，固定时间60s；各种倍比稀释后的RBD作为流动项，结合时间60s，解离时间60s。然后，以抗体捕获的方式，先让芯片结合纯化的COV56抗体。之后，将用pH 7.4溶液连续倍比稀释的RBD蛋白依次通过各通道(从低浓度开始逐一上样)。记录COV56抗体结合RBD蛋白的动力学曲线(如图2所示)，并利用BIAevaluation software 8K(Biacore，Inc.)软件计算动力学常数(结果如表7所示)，选择“Single-cycle kinetic using Capture”方法进行分析，以“1:1binding”模式进行拟合。
表7、COV56与不同病毒株RBD的亲和力
图2和表7的数据为三次检测取平均值的数据，其结果显示，COV56抗体能够以很高的亲和力结合SARS-CoV-2原型株和各种变异株的S蛋白的RBD结构域和SARS-CoVRBD结构域。各病毒株的RBD序列信息参见表1。
实施例5：COV56抗体对于SARS-CoV-2原型株和各种变异株的假病毒的中和能力评估
将复制缺陷型水疱性口炎病毒载体骨架(VSV-ΔG-GFP)质粒(Nie J,Li Q,Wu J,etal.Establishment and validation ofa pseudovirus neutralization assay forSARS-CoV-2.Emerg Microbes Infect.2020；9(1):680–686.)和相应的具有18个C末端氨基酸残基缺失的新型冠状病毒原型株和各变异株的S蛋白表达质粒(即，将新型冠状病毒原型株和各变异株的S蛋白序列缺失C端18个氨基酸后获得的截短的S蛋白的编码序列(可根据NCBI上所公开的相应序列截短获得)构建在pCAGGS上所获得的表达质粒)共转染到HEK293T细胞中，以产生新型冠状病毒原型株和各变异株的假病毒。
抗体COV56的初始浓度为6400μg/mL，设置三份重复，倍比稀释成15个梯度，并将等体积的抗体稀释液与各毒株的假病毒在310K混合30分钟。然后，将混合物加入到Vero细胞中，在310K的5％ CO2中培养15小时。只含有假病毒的6个重复孔被设置为对照。数据通过CQ1共聚焦显微镜(Yokogawa)测量，IC50使用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。
分析结果见图3和表8。
表8、COV56抗体对各种毒株假病毒的中和滴度(半抑制浓度，IC50)
由图3和表8可见，COV56抗体能够以较高的中和活性抑制SARS-CoV-2原型株及其各种变异株以及SARS-CoV的假病毒。
实施例6：COV56抗体对于SARS-CoV-2prototype活毒的中和能力的评估
将实施例3获得的纯化的COV56抗体从800μg/mL开始倍比稀释至第10个梯度，每个浓度8个副孔，然后，分别与半数组织培养感染剂量(TCID50)的hCoV-19/China/CAS-B001/2020(National Microbiology Data Center NMDCN0000102-3,GISAID databases EPI_ISL_514256-7)在37℃混合孵育1小时。孵育后，将病毒加入到预先接种了Vero细胞的96孔板中，并于37℃、5％ CO2培养箱中培养3天，观察致细胞病变效应(CPE)，并计算COV56抗体对于活病毒的中和滴度。
结果如图4所示；图4显示了不同浓度的COV56抗体针对SARS-CoV-2prototype活病毒的中和活性，该结果表明，COV56抗体对SARS-CoV-2prototype活病毒具有较高的中和滴度，其半抑制浓度IC50为32.63μg/mL左右。
实施例7：COV56抗体对SARS-CoV-2prototype活病毒感染小鼠的保护能力的评估
本实施例中，评估了COV56抗体对SARS-CoV-2prototype活病毒感染小鼠的保护能力，实验分组及具体操作如下。
作为预防组(即，图5中的Prophylaxis组)，5只6-8周龄的利用腺病毒载体在肺脏转导表达人源ACE2的小鼠在腹腔注射50mg/kg实施例3获得的纯化的COV56抗体24小时后，通过滴鼻方式感染2×106TCID50/mL SARS-CoV-2Prototype病毒。
作为治疗组(即，图5中的Therapeutics组)，5只6-8周龄的利用腺病毒载体在肺脏转导表达人源ACE2的小鼠在通过滴鼻方式感染2×106TCID50/mL SARS-CoV-2Prototype病毒12小时后，腹腔注射50mg/kg实施例3获得的纯化的COV56抗体。
安慰剂对照组(即，图5中的Placebo组)为感染同样剂量病毒后，肌肉注射与上述治疗组所用COV56抗体等体积的PBS的小鼠。
所有小鼠在感染病毒3天后处死，提取一侧肺组织的病毒RNA，然后通过采用病毒特异性引物(来自MABSKY公司的病毒检测试剂盒)的PCR检测肺部组织的病毒滴度，其结果如图5所示；将另一侧肺组织用4％福尔马林溶液浸泡后固定，以进行组织切片染色，其染色结果如图6所示。
图5显示，与对照组小鼠相比，预防组和治疗组小鼠的肺部病毒滴度明显下降；图6显示，与对照组小鼠相比，预防组和治疗组小鼠肺部的炎性浸润明显减少。
这些结果说明：本发明的COV56抗体可有效预防小鼠免受SARS-CoV-2prototype活毒的感染，并有效治疗已感染SARS-CoV-2prototype活毒的小鼠。
实施例8：COV56抗体识别抗原表位的鉴定
本实施例中，通过解析COV56抗体与SARS-CoV RBD、SARS-CoV-2RBD的复合物晶体结构，获得了COV56识别的RBD表位，结果如图7所示。
图7显示了COV56识别SARS-CoV RBD、SARS-CoV-2RBD的表位。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (19)

1.特异性结合SARS-CoV或SARS-CoV-2S蛋白RBD结构域的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含：
氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
所述轻链可变区包含：
氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；和，
轻链可变区，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和，
轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4.如权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；
优选地，所述恒定区为选自以下的任意一种：IgG、IgA或IgM抗体的恒定区；
进一步优选地，所述恒定区包含如SEQ ID NO:9所示的重链恒定区和如SEQ ID NO:10所示的轻链恒定区。
5.如权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链，其包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；和，
轻链，其包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；和，
轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
7.如权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
8.多核苷酸，其编码如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
9.如权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸为多核苷酸组，所述多核苷酸组包括：
(I)包含如SEQ ID NO:14、15、16所示核苷酸序列的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(II)包含如SEQ ID NO:17、18、19所示核苷酸序列的DNA分子或其相应的mRNA分子。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸组包括：
(I)包含如SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，(II)包含如SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的DNA分子或其相应的mRNA分子；
优选地，所述多核苷酸组还包括：
(III)包含如SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，(IV)包含如SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的DNA分子或其相应的mRNA分子。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸组包括：
(I)核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(II)核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示的DNA分子或其相应的mRNA分子。
12.核酸构建体，其包含如权利要求8-11任一项所述的多核苷酸，以及，任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
13.一种载体，其包含如权利要求8-11任一项所述的多核苷酸，或者如权利要求12所述的核酸构建体；
优选地，所述载体为表达载体，更优选为真核表达载体。
14.一种宿主细胞，其包含如权利要求8-11任一项所述的多核苷酸、如权利要求12所述的核酸构建体或如权利要求13所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞为真核细胞；
进一步优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
15.一种药物组合物，其包括如权利要求1至7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如权利要求8-11任一项所述的多核苷酸、如权利要求12所述的核酸构建体、如权利要求13所述的表达载体或如权利要求14所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括其他药学活性剂；
优选地，所述其他药学活性剂选自：法匹拉韦，瑞德西韦，干扰素；
优选地，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
进一步优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；
进一步优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂或可注射制剂。
17.一种试剂盒，其包括如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如权利要求8-11任一项所述的多核苷酸、如权利要求12所述的核酸构建体、如权利要求13所述的表达载体、如权利要求14所述的宿主细胞和/或如权利要求15或16所述的药物组合物。
18.一种制备如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合于所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下，使权利要求14所述的宿主细胞表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。
19.如权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如权利要求8-11任一项所述的多核苷酸、如权利要求12所述的核酸构建体、如权利要求13所述的表达载体、如权利要求14所述的宿主细胞、如权利要求15或16所述的药物组合物和/或如权利要求17所述的试剂盒在以下任一方面的应用：
(1)在制备用于检测SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒、或其S蛋白或S蛋白的RBD在样品中的存在或其水平的产品中的应用；
(2)在制备用于中和样品中的SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒毒力的产品中的应用；
(3)在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗受试者的SARS-CoV或SARS-CoV-2病毒感染或与所述病毒感染相关的疾病；
优选地，所述SARS-CoV-2病毒为SARS-CoV-2原型毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株；
进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株选自：SARS-CoV-2的Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)、Epsilon(B.1.429)、Eta(B.1.525)、Kappa(B.1.617.1)、Lambda(C.37)变异株以及Omicron(B.1.1.529)及其亚变异株BA.1、BA1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5。
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