CN115572744A - 一种1，4-二羟基-2-丁酮化合物的生物合成方法 - Google Patents

一种1，4-二羟基-2-丁酮化合物的生物合成方法 Download PDF

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姚培圆
李宇
陈曦
冯进辉
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朱敦明
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Abstract

本发明属于生物催化技术领域，公开1，4‑二羟基‑2‑丁酮化合物的生物合成方法，其是以苯甲醛裂解酶为催化剂，催化3‑羟基丙醛和甲醛羟甲基化反应生成1，4‑二羟基‑2‑丁酮。本发明的反应利用廉价、易得的醛为底物合成1，4‑二羟基‑2‑丁酮，提供了一条绿色、可持续的方法，具有重要的应用价值。

Description

一种1，4-二羟基-2-丁酮化合物的生物合成方法
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，涉及苯甲醛裂解酶作为催化剂催化3-羟基丙醛和甲醛的 羟甲基化反应制备1，4-二羟基-2-丁酮的方法。
背景技术
1，4-二羟基-2-丁酮是一种重要的天然产物和药物分子中间体，利用该化合物可以获得手 性氨基醇和多羟基醇等，它们在功能性食品、医药、药物和合成化学方面都具有巨大的应用 潜力。目前该化合物主要是利用化学法合成，但是化学催化合成不仅产率不高，而且金属催 化剂的价格昂贵，难以工业化生产，此外，化学合成反应条件苛刻(Chung,K.et al. Chemoselective Pd-catalyzed oxidation of polyols:synthetic scope andmechanistic studies.J Am Chem Soc 135,7593-7602；De Crisci,A.G.,Chung,K.,Oliver,A.G.,Solis-Ibarra,D.&Waymouth, R.M.Chemoselective Oxidation of Polyolswith Chiral Palladium Catalysts.Organometallics 32, 2257-2266)。而生物催化不仅价格低廉，可重复使用，还具有环境友好的特性。Christine Guérard-Hélaine等人利用醛缩酶实现了丙酮醇和甲醛的缩合反应，获得目标产物1，4-二羟基 -2-丁酮，但是该方法所需底物丙酮醇的合成比较困难，难以工业化利用(Guérard-Hélaine,C.et al.GenomeMining for Innovative Biocatalysts:New Dihydroxyacetone Aldolases for theChemist’s Toolbox.ChemCatChem 7,1871-1879)。因此开发从简单易得的底物出发合成1，4- 二羟基-2-丁酮的方法十分必要。
发明内容
本发明提供了苯甲醛裂解酶催化合成1，4-二羟基-2-丁酮化合物的方法，即利用苯甲醛 裂解酶(BAL)作为催化剂，以3-羟基丙醛(3-HPA)与甲醛为底物，制备1，4-二羟基-2- 丁酮化合物(式I)。
Figure BDA0003722238560000011
本发明所述的苯甲醛裂解酶，是指在酶分类号EC 4.1.2.38的苯偶姻醛缩酶(benzoin aldolase)，在文献中又称为苯甲醛裂解酶(Demir,A.S.,Ayhan,P.,Igdir,A.C.&Duygu,A.N. Enzyme Catalyzed Hydroxymethylation of Aromatic Aldehydes withFormaldehyde.Synthesis of Hydroxyacetophenones and(S)-Benzoins.Tetrahedron60,6509-6512)，该酶有催化苯甲醛缩合生 成芳香羟基酮的活力。
本发明通过功能检索，以文献中的苯甲醛裂解酶(GenBank:AAA50176.1)为模板，挖 掘了21个苯甲醛裂解酶，其具体信息如表1所示，且所述的苯甲醛裂解酶具有将3-羟基丙醛 (3-HPA)与甲醛转化为1，4-二羟基-2-丁酮的能力。所述苯甲醛裂解酶来源于Actinomadura sp. KC345，Polymorphobacterarshaanensis，Streptomyces sp.BK335，Streptomyces umbrinus， Nocardia miyunensis，Herbiconiux sp.SALV-R1，Streptomyces mirabilis， Sphingomonasendophytica，Gordonia sp.LAM0048，Arthrobacter sp.SLBN-100， Marinitenerisporasediminis，Streptomyces sp.NBRC110028，Streptomyces hokutonensis， Cnuibacterphyscomitrellae，Frankia，Gordoniaterrae，Mycolicibacteriumchitae， Altererythrobacterrhizovicinus，Sphingobiumczechense LL01，Variovoraxboronicumulans， Pseudomonas fluorescens。更优选的，所述苯甲醛裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-19， 或其同一性达到90％以上，95％以上，98％以上，优选99％以上的来源同一物种的同源酶。 以HeBAL为例，H28、E49和Q112为催化活性中心高度保守氨基酸残基，如图1所示。
本发明所述的产苯甲醛裂解酶的基因工程菌所用的载体为pET系列质粒。
本发明所述的产苯甲醛裂解酶的基因工程菌为大肠杆菌BL21系列。
用于制备1，4-二羟基-2-丁酮的苯甲醛裂解酶可以是上述苯甲醛裂解酶突变体基因工程 菌的培养物，也可以是通过将培养基离心之后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品 指的是菌体得到的提取物、破碎液或者是对提取物苯甲醛裂解酶突变体和羰基还原酶进行的。 分离和/或纯化得到的分离产品。在本发明中使用最多的是将发酵液离心之后得到的菌体细 胞。
表1苯甲醛裂解酶信息
Figure BDA0003722238560000021
Figure BDA0003722238560000031
表2酶的同一性比较
Figure BDA0003722238560000041
本发明涉及用全细胞催化3-羟基丙醛和甲醛转化生成对应1，4-二羟基-2-丁酮的方法。
优选地，所述的方法是以表达所述苯甲醛裂解酶的编码基因的工程菌经发酵培养获得的 湿菌体为催化剂；优选地，其是全细胞，其用量为5-100g/L，优选100g/L。
具体实施方式中，以pH为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在20℃-50℃条件下进行反 应。优选地，反应中所用的缓冲溶液是pH 6.0-8.0的水溶液，温度为20-40℃，优选pH值为 7.0，温度为30℃。更优选以pH为7.0的磷酸钾缓冲液作为反应介质，在25℃-40℃条件下进 行反应。
进一步优选地，反应体系中还加入有镁离子和ThDP，优选地，所述镁离子具体是通过添 加MgSO4实现；更优选地，MgSO4的添加量为0.5mM-10.0mM。
在具体实施方式中，所述两种底物浓度分别为0.1mM-10mM，优选为4-6mM。考虑到底物转化率和产物得率，底物浓度最优选择5mM。
更进一步地，还包括纯化1，4-二羟基-2-丁酮化合物的步骤，具体是在反应完成之后用 盐酸使蛋白变性，离心去除蛋白，将上清液旋蒸除去水之后利用硅胶柱层析纯化产物。
一个具体例中所述方法为：将所述苯甲醛裂解酶的基因工程菌经种子培养基培养，按一 定的比例接入到发酵培养基中，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG培养一段时间，离心收 集菌体。向苯甲醛裂解酶湿菌体中加入5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mMThDP(焦磷酸硫胺素)，以100mM磷酸钾为缓冲溶液于30℃反应24h。反应完成之后用盐酸 使蛋白变性，离心去除蛋白，将上清液旋蒸除去水之后利用硅胶柱层析纯化产物。
附图说明
图1为1,4-二羟基-2-丁酮的氢谱。
具体实施方式
以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解发明内容，但是这些实施 例不构成对本发明的限制。
实施例1：基因工程菌的构建和培养
产苯甲醛裂解酶突变体基因工程菌的具体构建和培养方法是：将来源于Actinomadura sp. KC345，Polymorphobacterarshaanensis，Streptomyces sp.BK335，Streptomyces umbrinus， Nocardia miyunensis，Herbiconiux sp.SALV-R1，Streptomyces mirabilis， Sphingomonasendophytica，Gordonia sp.LAM0048，Arthrobacter sp.SLBN-100，Marinitenerisporasediminis，Streptomyces sp.NBRC110028，Streptomyces hokutonensis， Cnuibacterphyscomitrellae，Frankia，Gordoniaterrae，Mycolicibacteriumchitae， Altererythrobacterrhizovicinus,Sphingobiumczechense LL01，Variovoraxboronicumulans， Pseudomonas fluorescens的苯甲醛裂解酶核酸序列SEQ ID NO：1-19进行基因合成，构建到 pET系列载体中，在宿主菌大肠杆菌中进行异源表达。将-80℃保存的菌种解冻，在平板上划 线，放在37℃恒温培养箱中过夜培养。挑选平板上单菌落接种到20mL含相应抗生素的LB 培养基中，培养12h左右作为种子液，按照1％的接种量接种到700mL含相应抗生素的LB 培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养至OD600为0.6-0.8左右，加入终浓度为0.1mmol/L 的IPTG于25℃进行诱导12h，以6000rpm离心收集菌体。
实施例2：苯甲醛裂解酶(AsBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(AsBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为76.3％。产物核磁结果参 见图2。
实施例3：苯甲醛裂解酶(PaBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(PaBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应50h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为73.6％。
实施例4：苯甲醛裂解酶(SsBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(SsBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应50h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为35.2％。
实施例5：苯甲醛裂解酶(SuBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(SuBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为80.5％。
实施例6：苯甲醛裂解酶(NoBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(NoBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应50h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为74.8％。
实施例7：苯甲醛裂解酶(HeBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(HeBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为69.3％。
实施例8：苯甲醛裂解酶(SmBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(SmBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应50h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为61.6％。
实施例9：苯甲醛裂解酶(SeBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(SeBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为63.8％。。
实施例10：苯甲醛裂解酶(GoBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(GoBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为72.8％。
实施例11：苯甲醛裂解酶(ArBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(ArBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为81.5％。
实施例12：苯甲醛裂解酶(MsBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮。
利用苯甲醛裂解酶(MsBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为67.4％。
实施例13：苯甲醛裂解酶(StBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(StBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为76.1％。
实施例14：苯甲醛裂解酶(ShBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(ShBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为78.3％。
实施例15：苯甲醛裂解酶(CpBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(CpBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应50h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为45.7％。
实施例16：苯甲醛裂解酶(FrBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(FrBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应50h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为46.4％。
实施例17：苯甲醛裂解酶(GtBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(GtBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为82.3％。
实施例18：苯甲醛裂解酶(MyBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(MyBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为56.5％。
实施例19：苯甲醛裂解酶(AlBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(AlBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应24h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为45.8％。
实施例20：苯甲醛裂解酶(ScBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(ScBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应50h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为38.2％。
实施例21：苯甲醛裂解酶(VbBAL)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(VbBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应50h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为19.4％。
实施例22：苯甲醛裂解酶(PfBAL_2)催化3-羟基丙醛和甲醛制备1，4-二羟基-2-丁酮
利用苯甲醛裂解酶(PfBAL，100mg/mL)，将5mM 3-HPA，5mM甲醛，2.5mM MgSO4和0.1mM ThDP加入100mM磷酸钾缓冲溶液中，总反应体积为20mL于30℃反应48h。 将反应体系利用苄氧胺盐酸盐衍生，通过液相检测底物转化率和产物得率。检测结果为：苯 甲醛裂解酶催化获得产物1，4-二羟基-2-丁酮，3-HPA底物转化率为23.7％。

Claims (10)

1.一种生物催化制备1，4-二羟基-2-丁酮化合物的方法，其特征在于，利用的生物催化剂为苯甲醛裂解酶，反应底物为3-羟基丙醛和甲醛，所述的苯甲醛裂解酶，是指在酶分类号EC 4.1.2.38的苯偶姻醛缩酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苯甲醛裂解酶来源于Actinomadura sp. KC345，Polymorphobacterarshaanensis，Streptomyces sp. BK335，Streptomyces umbrinus，Nocardia miyunensis，Herbiconiux sp. SALV-R1，Streptomyces mirabilis， Sphingomonasendophytica，Gordonia sp. LAM0048，Arthrobacter sp. SLBN-100， Marinitenerisporasediminis， Streptomyces sp. NBRC 110028，Streptomyces hokutonensis，Cnuibacterphyscomitrellae， Frankia，Gordonia terrae， Mycolicibacteriumchitae，Altererythrobacterrhizovicinus， Sphingobiumczechense LL01，Variovoraxboronicumulans，Pseudomonas fluorescens；更优选的，所述苯甲醛裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-19，或其同一性达到90%以上，95%以上，98%以上，优选99%以上的来源同一物种的同源酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苯甲醛裂解酶选自产苯甲醛裂解酶的重组基因工程菌的培养物，或将所述培养基离心之后得到的菌体细胞或其加工制品，优选地所述加工制品指的是菌体得到的提取物、破碎液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法是以表达所述苯甲醛裂解酶的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂；优选地，其是全细胞，其用量为5-100g/L，优选100 g/L。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，以pH为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在20℃-50℃条件下进行反应。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以pH为7.0的磷酸钾缓冲液作为反应介质，在25℃-40℃条件下进行反应。
7.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，反应体系中还加入有镁离子和ThDP，优选地，所述镁离子具体是通过添加MgSO4实现；更优选地，MgSO4的添加量为0.5 mM-10.0 mM。
8.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述两种底物浓度分别为0.1 mM-10 mM，优选为4-6mM。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括纯化1，4-二羟基-2-丁酮化合物的步骤，具体是在反应完成之后用盐酸使蛋白变性，离心去除蛋白，将上清液旋蒸除去水之后利用硅胶柱层析纯化产物。
10.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的产苯甲醛裂解酶的基因工程菌所用的载体为pET系列质粒；所述的产苯甲醛裂解酶的基因工程菌为大肠杆菌BL21系列。
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