CN113881738A - 一种生物催化的高纯度nmn生产工艺 - Google Patents

一种生物催化的高纯度nmn生产工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物催化的高纯度NMN生产工艺，S1、构建重组表达载体，S2、利用重组表达载体转化宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞，S3、培养遗传工程化的宿主细胞，持续性表达烟酰胺核苷激酶，S4、添加底物烟酰胺核苷，继续培养细胞，利用摇瓶法培养或发酵罐培养，S5、离心收取上清，进行HPLC反应。本发明的优点：成本低，生产工艺简单等优点。

Description

一种生物催化的高纯度NMN生产工艺
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体是指一种生物催化的高纯度NMN生产工艺。
背景技术
NMN全称β-烟酰胺单核苷酸，是人体内长寿蛋白的辅因子NAD+的前体之一。进入体内可迅速变成NAD+,对人体健康发挥着根本性的影响，主导人体内数百项生命活动，掌控着疾病和衰老的节奏。
NAD+分子量过大，无法直接口服吸收补充，其体内主要依赖于细胞合成，但合成量很低，并且老年人体内自行组成NAD+的水平远远达不到所需水平，大量前沿科学研究表明：NMN可直接促进NAD+在体内的自我生成，是补充NAD+的最理想管道。补充NMN可有效的提升体内的NAD+的含量，并显著减缓生物体的生理衰退，增强能量代谢，延长寿命。近期研究发现，通过调节生物体内NMN的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用。
但是目前大部分的NMN来源于化学合成，生产率较低，产品纯度低，含有约50％的手性分子NMN，有毒、难分离、故收率非常低，而且用到大量的有机溶剂，对环境破坏严重。
近年来，生物催化技术已用于NMN的生产，这是一种绿色生物转换，对环境污染几乎为零，不产生手性分子NMN，产率高，成本低，是NMN生产技术的一次重大革命。但是它们所设计的合成方法相对比较复杂，且转化率和收率普遍不高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是解决上述问题，提供一种提供转化率和收率的生物催化的高纯度NMN生产工艺。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种生物催化的高纯度NMN生产工艺，包括以烟酰胺核苷为底物，用含有烟酰胺核苷激酶全293F细胞，进行一步法高效制备β-烟酰胺单核苷酸，表达式为：
Figure BDA0003254785520000021
所述酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质。
编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种重组表达载体，所述重组表达载体含有用于制备NMN的烟酰胺核苷激酶的基因。
一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含用于制备NMN的烟酰胺核苷激酶的基因的重组表达载体。
所述宿主细胞为293F细胞。
一种制备高纯度NMN的方法，包括以下步骤：
S1、构建重组表达载体，
S2、利用重组表达载体转化宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞，
S3、培养遗传工程化的宿主细胞，持续性表达烟酰胺核苷激酶，
S4、添加底物烟酰胺核苷，继续培养细胞，利用摇瓶法培养或发酵罐培养，
S5、离心收取上清，进行HPLC反应。
所述步骤S3为将构建好的稳转烟酰胺核苷激酶全293F细胞，在摇瓶中使用无血清培养基进行培养，调整密度为5-6million/ml。
所述步骤S4为在培养基中加入50mM烟酰胺核苷，在37℃下，摇动反应4h。
采用以上结构后，本发明具有如下优点：全细胞催化剂具有成本低，生产工艺简单等优点。并且利用了合成生物学的手段，将NRK1基因克隆到一个细胞中，并在该基因工程全细胞的催化下，可实施多批次制备NMN，提高了NMN的产量，降低了生产成本；克服了当前化学合成法合成的弊端和现有生物酶法催化的复杂性，提供一种烟酰胺核苷激酶全294F细胞及其生物催化合成NMN工艺，有效降低了反应的复杂性，并能够安全、高效的进行实际生产使用，且可多次重复进行生产原料的使用，进而有效减少实际成本的投入。
附图说明
图1是本发明表达质粒图谱。
图2是本发明全293F细胞催化合成NMN的结果分析图。
图3是本发明10g/L的NMN标准品的分析图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明。
结合所有附图，一种生物催化的高纯度NMN生产工艺，包括以烟酰胺核苷为底物，用含有烟酰胺核苷激酶全293F细胞，进行一步法高效制备β-烟酰胺单核苷酸，表达式为：
Figure BDA0003254785520000031
所述酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质。
编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种重组表达载体，所述重组表达载体含有用于制备NMN的烟酰胺核苷激酶的基因。
一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含用于制备NMN的烟酰胺核苷激酶的基因的重组表达载体。
所述宿主细胞为293F细胞。
一种制备高纯度NMN的方法，包括以下步骤：
S1、构建重组表达载体，
S2、利用重组表达载体转化宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞，
S3、培养遗传工程化的宿主细胞，持续性表达烟酰胺核苷激酶，
S4、添加底物烟酰胺核苷，继续培养细胞，利用摇瓶法培养或发酵罐培养，
S5、离心收取上清，进行HPLC反应。
所述步骤S3为将构建好的稳转烟酰胺核苷激酶全293F细胞，在摇瓶中使用无血清培养基进行培养，调整密度为5-6million/ml。
所述步骤S4为在培养基中加入50mM烟酰胺核苷，在37℃下，摇动反应4h。
本发明在具体实施时，实施例一酶基因表达体系的构建
利用限制酶切位点EcoRV和BspEI将NRK1基因构建到PBSPS质粒载体上面，形成重组质粒PBSPS-NRK1-His。将构建好的重组质粒用HindIII酶线性化，将线性化的重组质粒使用PEI转染到293F细胞中，转染3天后，把转染的293F细胞均分到96孔板中，使用2ug/ml的puro进行筛选。在96孔板中筛选2周后，将存活的单克隆细胞株上清，使用anti-His的二抗进行ELISA检测，筛选到高表达NKR1的单克隆293F细胞株。进行大量扩繁，最终上摇瓶进行悬浮培养。
实施例二全293F细胞催化合成NMN
将将构建好的稳转烟酰胺核苷激酶(NRK1)全293F细胞，在摇瓶中使用无血清培养基进行培养，调整密度为5-6million/ml。在培养基中加入50mM烟酰胺核苷(NR)，37℃，摇动反应4h。离心收取上清，进行HPLC反应。通过与标准品对照，可以得到13.21g/L的NMN生产量，转化效率在87.4％。重新收集细胞并用无血清培养基进行培养后，重复进行催化合成NMN，通过与标准品对照，可以得到12.54g/L的NMN生产量，转化效率在82.7％。说明该细胞可以重复使用。
通过以上实验结果能够进一步说明本发明能够安全、高效的进行实际生产使用，且有效减少实际成本的投入。
本发明所述的全293F稳转细胞包含的烟酰胺核苷激酶(NRK1)的氨基酸序列(SEQID NO：1)如下：
MKTFIIGISGVTNSGKTTLAKNLQKHLPNCSVISQDDFFKPESEIETDKNGFLQYDVLEALNMEKMMSAISCWMESARHSVVSTDQESAEEIPILIIEGFLLFNYKPLDTIWNRSYFLTIPYEECKRRRSTRVYQPPDSPGYFDGHVWPMYLKYRQEMQDITWEVVYLDGTKSEEDLFLQVYEDLIQELAKQKCLQVTA。
本发明所述的全293F稳转细胞包含的烟酰胺核苷激酶(NRK1)的核苷酸序列(SEQID NO：2)如下：ATGAAAACATTTATCATTGGAATCAGTGGTGTGACAAACAGTGGCAAAACAACACTGGCTAAGAATTTGCAGAAACACCTCCCAAATTGCAGTGTCATATCTCAGGATGATTTCTTCAAGCCAGAGTCTGAGATAGAGACAGATAAAAATGGATTTTTGCAGTACGATGTGCTTGAAGCACTTAACATGGAAAAAATGATGTCAGCCATTTCCTGCTGGATGGAAAGCGCAAGACACTCTGTGGTATCAACAGACCAGGAAAGTGCTGAGGAAATTCCCATTTTAATCATCGAAGGTTTTCTTCTTTTTAATTATAAGCCCCTTGACACTATATGGAATAGAAGCTATTTCCTGACTATTCCATATGAAGAATGTAAAAGGAGGAGGAGTACAAGGGTCTATCAGCCTCCAGACTCTCCGGGATACTTTGATGGCCATGTGTGGCCCATGTATCTAAAGTACAGACAAGAAATGCAGGACATCACATGGGAAGTTGTGTACCTGGATGGAACAAAATCTGAAGAGGACCTCTTTTTGCAAGTATATGAAGATCTAATACAAGAACTAGCAAAGCAAAAGTGTTTGCAAGTGACAGCATAA。
本发明的工作原理：全细胞催化剂具有成本低，生产工艺简单等优点。并且利用了合成生物学的手段，将NRK1基因克隆到一个细胞中，并在该基因工程全细胞的催化下，可实施多批次制备NMN，提高了NMN的产量，降低了生产成本。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉生命奥义生物科技有限公司
<120> 一种生物催化的高纯度NMN生产工艺
<130> 2021-9-8
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 1
Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys
1 5 10 15
Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Ser Val
20 25 30
Ile Ser Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Glu Ser Glu Ile Glu Thr Asp
35 40 45
Lys Asn Gly Phe Leu Gln Tyr Asp Val Leu Glu Ala Leu Asn Met Glu
50 55 60
Lys Met Met Ser Ala Ile Ser Cys Trp Met Glu Ser Ala Arg His Ser
65 70 75 80
Val Val Ser Thr Asp Gln Glu Ser Ala Glu Glu Ile Pro Ile Leu Ile
85 90 95
Ile Glu Gly Phe Leu Leu Phe Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Thr Ile Trp
100 105 110
Asn Arg Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Pro Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Arg
115 120 125
Arg Ser Thr Arg Val Tyr Gln Pro Pro Asp Ser Pro Gly Tyr Phe Asp
130 135 140
Gly His Val Trp Pro Met Tyr Leu Lys Tyr Arg Gln Glu Met Gln Asp
145 150 155 160
Ile Thr Trp Glu Val Val Tyr Leu Asp Gly Thr Lys Ser Glu Glu Asp
165 170 175
Leu Phe Leu Gln Val Tyr Glu Asp Leu Ile Gln Glu Leu Ala Lys Gln
180 185 190
Lys Cys Leu Gln Val Thr Ala
195
<210> 2
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 2
atgaaaacat ttatcattgg aatcagtggt gtgacaaaca gtggcaaaac aacactggct 60
aagaatttgc agaaacacct cccaaattgc agtgtcatat ctcaggatga tttcttcaag 120
ccagagtctg agatagagac agataaaaat ggatttttgc agtacgatgt gcttgaagca 180
cttaacatgg aaaaaatgat gtcagccatt tcctgctgga tggaaagcgc aagacactct 240
gtggtatcaa cagaccagga aagtgctgag gaaattccca ttttaatcat cgaaggtttt 300
cttcttttta attataagcc ccttgacact atatggaata gaagctattt cctgactatt 360
ccatatgaag aatgtaaaag gaggaggagt acaagggtct atcagcctcc agactctccg 420
ggatactttg atggccatgt gtggcccatg tatctaaagt acagacaaga aatgcaggac 480
atcacatggg aagttgtgta cctggatgga acaaaatctg aagaggacct ctttttgcaa 540
gtatatgaag atctaataca agaactagca aagcaaaagt gtttgcaagt gacagcataa 600

Claims (9)

1.一种生物催化的高纯度NMN生产工艺，其特征在于：包括以烟酰胺核苷为底物，用含有烟酰胺核苷激酶全293F细胞，进行一步法高效制备β-烟酰胺单核苷酸，表达式为：
Figure FDA0003254785510000011
2.根据权利要求1所述的一种生物催化的高纯度NMN生产工艺，其特征在于：所述酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的一种生物催化的高纯度NMN生产工艺，其特征在于：编码SEQID No.1所示的蛋白质的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体含有用于制备NMN的烟酰胺核苷激酶的基因。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含用于制备NMN的烟酰胺核苷激酶的基因的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为293F细胞。
7.一种制备高纯度NMN的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、构建重组表达载体，
S2、利用重组表达载体转化宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞，
S3、培养遗传工程化的宿主细胞，持续性表达烟酰胺核苷激酶，
S4、添加底物烟酰胺核苷，继续培养细胞，利用摇瓶法培养或发酵罐培养，
S5、离心收取上清，进行HPLC反应。
8.根据权利要求7所述的一种制备高纯度NMN的方法，其特征在于：所述步骤S3为将构建好的稳转烟酰胺核苷激酶全293F细胞，在摇瓶中使用无血清培养基进行培养，调整密度为5-6million/ml。
9.根据权利要求7所述的一种制备高纯度NMN的方法，其特征在于：所述步骤S4为在培养基中加入50mM烟酰胺核苷，在37℃下，摇动反应4h。
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