CN113388649A - 发酵方法 - Google Patents

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肖恩·丹尼斯·辛普森
塞巴斯蒂安·米甲·贝尔纳谢克
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Abstract

本发明提供使用两阶段发酵过程由气态底物产生脂质产物的方法和系统。所述方法包括向含有一种或多种微生物的培养物的第一生物反应器提供包含CO或CO2和H2或其混合物的气态底物，并发酵所述底物以产生乙酸。然后将来自所述第一生物反应器的乙酸提供给第二生物反应器，其中所述乙酸被用作通过一种或多种微藻类发酵成脂质的底物。

Description

发酵方法
本申请是2013年11月29日提交的申请号为PCT/US2013/072475、发明名称为“发酵方法”的国际申请的分案申请，所述国际申请于2015年4月30日进入中国国家阶段，其申请号为201380057205.7。
技术领域
本发明涉及一种用于由气态原料产生脂质的方法。所述方法包括一种用于由气态原料产生一种或多种脂质产物的两阶段系统。
发明背景
全球能源危机引起了对于燃料生产替代方法的不断关注。运输用的生物燃料是汽油的有吸引力的替代物并且作为低浓度共混物快速进入燃料市场。源自生物质的生物燃料生产已作为一种增加替代能源生产和减少温室气体排放的主要方法而出现。已证明由生物质生产生物燃料能使能源独立，从而促进农村地区的发展及经济的可持续发展。
第一代液体生物燃料利用碳水化合物原料，如淀粉、蔗糖、玉米、油菜籽、大豆、棕榈及植物油。第一代原料提出了许多重大的挑战。这些碳水化合物原料的成本受其作为人类食品或动物饲料的价值的影响，而用于乙醇生产的淀粉或蔗糖生产作物的耕种并不是在所有地理区域中都是经济可持续的。这些原料作为生物燃料来源的持续使用将不可避免地对耕地和水资源带来极大的压力。因此，感兴趣的是开发将成本较低和/或更丰富的碳资源转变成燃料的技术。
第二代生物燃料是那些由纤维素和藻类产生的。藻类之所以被选择用来生产脂质归于其快速的生长速率和藻类消耗二氧化碳及产生氧气的能力。
已发现活跃的一个领域是脂质的微生物合成，其包括生物燃料生产所需的原材料。大量的研究已证明能够通过在不同的底物如工业用甘油、乙酸、污泥、乳清渗透物、甘蔗糖蜜及稻草水解物上使用产油酵母而积聚脂质。同时，这些第二代生物燃料技术由于高生产成本以及运输和原料储存成本而遇到了一些问题。
早已认识到催化过程可用于将由CO、CO2或氢气(H2)组成的气体转化为多种燃料和化学品。然而，微生物也可用于将这些气体转化为燃料和化学品。虽然这些生物过程通常比热化学过程要慢，但与催化过程相比具有若干优点，包括更高的特异性、更高的产率、更低的能源成本以及更大的抗中毒能力。
通过一氧化碳和/或氢气及二氧化碳的厌氧发酵来产生乙酸(acetic acid)、醋酸(acetate)及其它产物如乙醇已得到了论证。参见，例如Balch等人,(1977)InternationalJournal of Systemic Bacteriology.,27:355-361；Vega等人,(1989)Biotech.Bioeng.,34:785-793；Klasson等人(1990)Appl.Biochem.Biotech.,24/25:1；等等。
已论证，产乙酸细菌，如来自醋酸杆菌属、穆尔氏菌属(Moorella)、梭状芽孢杆菌属、瘤胃球菌属、醋酸杆菌属、真杆菌属、丁酸杆菌属、产醋杆菌属(Oxobacter)、甲烷八叠球菌属、甲烷八叠球菌属及脱硫肠状菌属的那些，利用包含H2、CO2和/或CO的底物并且通过Wood-Ljungdahl途径(其中乙酰辅酶A合酶是关键酶)将这些气态底物转化为乙酸、乙醇及其它发酵产物。举例来说，由气体产生乙酸和乙醇的杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的各种菌株描述于WO00/68407、EP 117309、美国专利号5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO 98/00558和WO 02/08438中。已知细菌醇梭菌菌种(Clostridium autoethanogenumsp)也由气体产生乙酸和乙醇(Aribini等人,Archives of Microbiology 161,第345-351页(1994))。
在约30℃的温度下生长良好的伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)(一种严格厌氧的非孢子形成微生物)显示由H2和CO2产生乙酸。Balch等人首先公开了细菌伍氏醋酸杆菌，其通过氢气的厌氧氧化和二氧化碳的还原来生长。Buschorn等人证明了乙醇通过伍氏醋酸杆菌在葡萄糖上的产生和利用。伍氏醋酸杆菌的发酵在高达20mM的葡萄糖(果糖)浓度下进行。Buschorn等人发现当葡萄糖浓度增加到40mM时，在伍氏醋酸杆菌进入稳定生长期时几乎一半的底物被保留，且乙醇作为另外一种发酵产物出现。Balch等人发现，通过由伍氏醋酸杆菌进行的H2和CO2的发酵所检测的仅有的主要产物是根据以下化学计量的乙酸：4H2+2CO2->CH3COOH+H2O。
乙酸可能是不合需要的发酵产物，因为它是从含水发酵肉汤中回收的具有挑战性的产物，其商业用途有限。
本发明的一个目标是提供一种通过至少某种方式克服以上缺点的方法和发酵系统，或至少向公众提供一种有用的选择。
发明内容
第一方面，提供一种用于由气态底物产生至少一种脂质产物的方法，所述方法包括：
a)在含有至少一种微生物的培养物的第一生物反应器中接纳所述气态底物，并发酵所述气态底物以产生选自至少一种酸或至少一种酸和至少一种醇的产物；以及
b)将所述产物的至少一部分传送到包含至少一种微藻类的培养物的第二生物反应器，并发酵所述酸以产生至少一种脂质产物。
在一个实施方案中，气态底物包含CO或CO2和H2、或其混合物。在某些实施方案中，气态底物源自于工业来源。在某些实施方案中，将来自至少一个工业来源的至少一种气体共混以提供具有所期望的组成的气态底物。
在一个实施方案中，所述一种或多种酸选自由以下组成的组：乙酸、丁酸、琥珀酸、乳酸或丙酸。
在一个实施方案中，所述一种或多种醇选自包括以下的组：乙醇、丁醇、甲醇或丙醇。
在各种实施方案中，将在第一阶段产生的所有酸和/或醇转化为第二阶段中的脂质。在各种实施方案中，回收第一阶段中产生的至少一部分酸和/或醇。
第二方面，提供一种用于由包含CO或CO2和H2或其混合物的气态底物中产生至少一种脂质产物的方法，所述方法包括：
a)在包含至少一种微生物的培养物的初级生物反应器中接纳所述气态底物，并发酵所述气态底物以产生至少一种酸；以及
b)将所述至少一种酸的至少一部分传送到包含至少一种微藻类的培养物的次级生物反应器，并发酵所述至少一种酸以产生至少一种脂质产物。
在一个实施方案中，所述至少一种酸是乙酸且所述至少一种微生物选自由以下组成的组：醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、梭状芽孢杆菌属、热球菌属、真杆菌属、脱硫细菌属、氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)、产醋菌属(Acetogenium)、厌氧醋菌属(Acetoanaerobium)、丁酸杆菌属、消化链球菌属、瘤胃球菌属、产醋杆菌属以及甲烷八叠球菌属。
本领域技术人员将理解，包括pH范围的发酵条件是成功发酵包含CO或CO2和H2或其混合物的气态底物所必需的。发明人认识到可根据本发明使用的任何具体的产乙酸微生物将具有最佳的pH范围，通常在pH 4与pH 8之间。在本发明的一个实施方案中，初级生物反应器中的发酵pH维持在约pH 4.5至约pH 6之间。在一个优选实施方案中，pH维持在pH 5.5。
在一个实施方案中，在第二反应器中产生的脂质被用于产生至少一种三级产物。在一个实施方案中，所述一种或多种三级产物选自包括以下的组：生物柴油、氢化来源的可再生柴油(HDRD)、脂肪酸甲酯(FAME)及脂肪酸乙酯(FAEE)。
第三方面，提供一种用于通过厌氧微生物发酵产生至少一种产物的方法，所述方法包括：
a)将包含CO或CO2和H2或其混合物的底物接纳至含有至少一种微生物的培养物的第一初级生物反应器，所述微生物选自由以下组成的组：醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、梭状芽孢杆菌属、瘤胃球菌属、真杆菌属、丁酸杆菌属、产醋杆菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷八叠球菌属及脱硫肠状菌属，并厌氧发酵所述底物以产生包含乙酸的发酵肉汤；
b)将所述发酵肉汤送入含有至少一种微藻类的培养物的次级生物反应器中；以及
c)对乙酸进行发酵以产生至少一种脂质产物。
在一个实施方案中，至少一部分所述发酵肉汤作为肉汤排放物(broth bleed)从初级生物反应器被传送到次级生物反应器。
在一个实施方案中，在初级生物反应器中产生的产物作为渗透物排放物被除去。
在一个实施方案中，肉汤排放物和渗透物排放物在被送入次级生物反应器之前合并。
在一个实施方案中，合并的发酵肉汤被加工以便在料流被送入次级生物反应器之前除去至少一部分乙酸。
第四方面，提供一种用于控制发酵过程中的pH的方法，所述方法包括：
a)在第一生物反应器中接纳气态底物，所属第一生物反应器含有在液体营养培养基中的至少一种微生物的培养物，并发酵所述气态底物以产生选自至少一种酸或至少一种酸和至少一种醇的产物；
b)将所述产物的至少一部分传送到第二生物反应器，所述第二生物反应器包含在液体营养培养基中的至少一种微藻类的培养物，并发酵所述至少一种酸以产生至少一种脂质产物；以及
c)使至少一部分肉汤再循环回到第一生物反应器，其中再循环肉汤中的酸浓度大幅降低。
应当理解，以下实施方案可应用于如上所述的任何一个方面。
在一个实施方案中，在被送入次级生物反应器之前，合并的发酵料流的pH被调节至pH 6与pH 8之间。
在各种实施方案中，次级生物反应器中的脂质生产可通过限制培养基中的至少一种营养素来增加。在一个实施方案中，次级生物反应器中的脂质生产通过限制氮在培养基中的量而增加。
在本发明的一个实施方案中，次级生物反应器中的发酵肉汤中的乙酸与氮的比率是至少10:1。在一个实施方案中，次级生物反应器的发酵肉汤中的乙酸与氮的比率是49:1。在本发明的一个实施方案中，离开第一生物反应器的酸料流被处理以提供将被传送到第二生物反应器的纯化的或浓缩的酸料流。在本发明的一个实施方案中，监测第二生物反应器中的发酵肉汤的碳:氮比率，并且调节到生物反应器中的碳和氮的输入以确保大于49:1的碳:氮比率。
在本发明的一个实施方案中，初级生物反应器中产生的乙酸具有至少约5g/L或至少约10g/L、或至少约15g/L或至少约20g/L的浓度。
在本发明的一个实施方案中，初级生物反应器中乙酸的产生速率是至少约10g/L/天、或至少15g/L/天、或20g/L/天或至少约40g/L/天、或至少约60g/L/天。
在本发明的一个实施方案中，微藻类选自包括以下的组：小球藻属、衣藻属、杜氏藻属、裸藻属、金藻属、扁藻属、紫球藻属、螺旋藻属、蓝藻属(Synechoccus)、项圈藻属、裂壶藻属(Schizochytrium)、Botyrococcus、墨角藻属、拟小球藻属、伪小球藻属、Brateococcus、无绿藻属(Prototheca)以及栅列藻属(Scenedesmus)。
在本发明的一个实施方案中，在次级生物反应器中的培养物的pH维持在约pH 6至约pH 8之间。在一个优选实施方案中，pH维持在pH 7。
在本发明的一个实施方案中，次级生物反应器中的pH与初级生物反应器中的pH基本上相同。在替代实施方案中，离开初级生物反应器的料流在被送入次级生物反应器之前，其pH被调节至约pH 7。
在本发明的一个实施方案中，第二生物反应器中的脂质浓度是至少约10g/L或至少约20g/L、或至少约40g/L、或至少约60g/L、或至少约80g/L、或至少约100g/L、或至少约150g/L。在本发明的一个实施方案中，第二生物反应器中的脂质产生速率是至少约5g/L/天、或至少约7g/L/天、或至少约10g/L/天、或约15/g/L/天、或至少约20g/L/天、或至少约30g/L/天。
在本发明的一个实施方案中，所述方法是连续的两阶段过程。在一个实施方案中，所述方法是半连续的两阶段过程。
在一个实施方案中，在初级生物反应器中产生的所有乙酸都被转移到次级生物反应器中用于发酵成脂质。
在一个实施方案中，回收初级生物反应器中产生的至少一部分乙酸。
在一个实施方案中，使离开次级生物反应器的至少一部分料流再循环到初级反应器。在一个实施方案中，加工出口料流以在其被传送到初级反应器之前除去基本上所有的生物质。在某些实施方案中，进一步处理出口料流以除去可溶性蛋白质及其它不需要的组分。在其它实施方案中，在出口料流被送入初级反应器之前调节其pH。
在一个实施方案中，传送出口料流经过氧气洗涤器以在其传送到初级反应器之前除去基本上所有的氧气。
在一个实施方案中，在次级生物反应器中产生的脂质用于产生至少一种三级产物。在一个实施方案中，所述至少一种三级产物选自包括以下的组：生物柴油、HDRD、FAME及FAEE。
在一个实施方案中，一系列初级反应器被用于为至少一个次级反应器送料。举例来说，三个初级反应器为一个次级反应器送料，四个初级反应器为两个次级反应器送料，等等。
在一个实施方案中，气态底物是来自工业过程的废料或废气。在一个实施方案中，废气选自包括以下的组：来自氢气厂的尾气、焦炉煤气、相关石油气、天然气、催化重整器气体、石脑油裂化器废气、炼油厂燃料气、甲醇工厂尾气、氨工厂尾气以及石灰窑气。
本发明还可包括在申请的说明书中提及或指出的部分、元件和特征，个别地或全体地以两个或更多个所述部分、元件或特征的任何或所有组合形式，并且当在本文中提到的特定整数在与本发明相关的领域中具有已知等价物时，这种已知的等价物被视为如同单独地提出一样并入本文。
附图说明
本发明现将更详细地并参看附图来描述，其中：
图1是一种用于由CO及任选地H2、或CO2和H2产生脂质的两发酵罐系统，如本发明的第二方面所定义。
图2示出一种由CO及任选地H2、或CO2和H2产生脂质的两发酵罐系统，其中基本上不含乙酸的培养基被从次级生物反应器再循环到初级生物反应器。
图3示出使用根据本发明的一个实施方案的CO的发酵中的乙酸浓度。
具体实施方式
本发明总体上涉及一种通过发酵含有CO或CO2和H2的气态底物来产生醇类的方法。本发明的方法通常还涉及在碳捕获方面的改进，其中CO或CO2和H2被转化为有用的产物，即脂质。
定义
除非另外定义，本说明书通篇所用的以下术语定义如下：
渗透物-肉汤中穿过分离器且不被分离器保留的基本上可溶性成分。渗透物通常将含有可溶性发酵产物、副产物和营养液。
稀释率-肉汤在生物反应器中的替换率。稀释率是以每天被营养培养基替换的肉汤的生物反应器容积数量来测量。
发酵肉汤或肉汤-生物反应器中所见的组分(包括肉汤培养物和营养培养基)的混合物。
营养培养基-添加到含有营养素及其它适于生长微生物培养物的组分的发酵肉汤中的溶液。
气态底物及类似术语应当理解为包括任何底物，其中一氧化碳或二氧化碳可被细菌的一种或多种菌株用于例如生长和/或发酵。这种底物可任选地包含H2，其可以变化的比例存在。
肉汤排放物-从生物反应器中除去的未传送到分离器的发酵肉汤的部分。
肉汤培养物-存在于发酵肉汤中的微生物培养物。
肉汤培养物密度-微生物细胞在发酵肉汤中的密度。
分离器-适于接纳来自生物反应器的发酵肉汤并且将所述肉汤传送通过过滤器以产生保留物和渗透物的单元。过滤器可以是膜，例如错流膜或中空纤维膜。
酸-如本文所用，此术语包括羧酸和相关的羧酸根阴离子，如游离乙酸与存在于如本文所述的发酵肉汤中的乙酸的混合物。分子酸与羧酸根在发酵肉汤中的比率取决于系统的pH。术语“乙酸”包括单独的乙酸盐以及分子的或游离的乙酸与乙酸盐的混合物，如乙酸盐与存在于可如本文所述的发酵肉汤中的游离乙酸的混合物。分子乙酸与乙酸盐在发酵肉汤中的比率取决于系统的pH。
脂质-如本文所用，包括脂肪酸、糖脂(glycolipid)、鞘脂、糖脂类(saccharolipid)、聚酮化合物、固醇脂类及孕烯醇酮脂类(prenol lipid)。
生物反应器或发酵罐-包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置，其包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、移动床生物膜反应器(MBBR)、泡罩塔、气举发酵罐、膜反应器如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)、静态混合器或适于气液接触的其它容器或其它装置。
初级生物反应器-如本文所用，此术语旨在包括可与次级生物反应器串联或并联连接的一个或多个反应器。初级生物反应器使用厌氧发酵由气态底物产生酸。一个或多个初级生物反应器的至少一部分酸产物被用作一个或多个次级生物反应器中的底物。
次级生物反应器-如本文所用，这些术语旨在包括任何数量的可与初级生物反应器串联或并联连接的另外的生物反应器。任何一个或多个这些另外的生物反应器还可连接至另外的分离器。
发酵、发酵过程或发酵反应-及类似术语，如本文所用，旨在包括所述过程的生长期和产物生物合成期。如本文进一步描述，在一些实施方案中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，添加金属或组合物到发酵反应中应当理解为包括添加到这些反应器的任一或两个中。
本领域中已知通过厌氧发酵气态底物产生酸的方法。
虽然以下描述集中在本发明的某些实施方案，但应理解本发明可适用于产生其它醇和/或酸和使用其它底物，如本发明相关领域技术人员在考虑本公开之后所知晓的。同样地，虽然特别提到使用产乙酸微生物进行发酵，但本发明也适用于可在相同或不同过程中使用的其它微生物，所述微生物可用于产生有用的产物，包括但不限于其它酸和醇，如乙醇。
如上所定义，一方面，本发明涉及使用两阶段发酵过程由气态底物产生脂质产物的方法。在第一阶段中，包含CO及任选地H2、或CO2和H2的气态底物被厌氧地发酵以产生至少一种酸。在所述过程的第二阶段中，来自第一阶段的至少一种酸被送入含有至少一种微藻类的培养物的第二生物反应器。所述至少一种酸被有氧地转化以产生一种或多种脂质产物。
本发明的一方面的方法包括在含有液体营养培养基的初级生物反应器中培养厌氧性产乙酸细菌的至少一种菌株，其能由含有CO、CO2或H2或其混合物的气态底物产生乙酸，并且将所述气态底物供应给生物反应器。所述发酵方法产生乙酸。在初级生物反应器中产生的乙酸被送入含有至少一种能由含有乙酸的底物产生脂质的微藻类的培养物的次级生物反应器。
所述能由含有CO、CO2或H2或其混合物的气态底物产生乙酸的厌氧性产乙酸细菌的至少一种菌株是来自由以下组成的组：醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、梭状芽孢杆菌属、热球菌属、真杆菌属、脱硫细菌属、氧化碳嗜热菌属、产醋菌属、厌氧醋菌属、丁酸杆菌属、消化链球菌属、瘤胃球菌属、产醋杆菌属以及甲烷八叠球菌属。
利用气态底物的发酵
本发明特别适用于支持由含有CO及任选的H2的工业烟道气的气态底物产生乙酸和乙醇。一种这样类型的气体料流是来自炼钢厂的尾气，其通常含有20-70％CO。这种气体料流可进一步包含CO2。类似的料流是由加工任何基于碳的原料如石油、煤和生物质产生的。本发明还可适用于产生替代酸的反应。
已知用于由气态底物产生乙酸及其它醇的方法。示例性方法包括例如在WO2007/117157、WO2008/115080、US 6,340,581、US6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722及US5,821,111中所述的那些，它们各自以引用的方式并入本文。
已知许多厌氧菌能够进行CO向乙醇和乙酸的发酵并且适用于本发明的方法中。产乙酸菌能够通过Wood-Ljungdahl途径将气态底物如H2、CO2和CO转化为包括乙酸、乙醇及其它发酵产物的产物。适用于本发明的这种细菌的实例包括梭状芽孢杆菌属的那些，如杨氏梭菌的菌株，包括在WO 00/68407、EP 117309、美国专利号5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO 98/00558及WO 02/08438中所述的那些，和醇梭菌(Aribini等人,Archives ofMicrobiology 161:第345-351页)。其它适合的细菌包括穆尔氏菌属的那些细菌，其包括穆尔氏菌菌种HUC22-1(Sakai等人,Biotechnology Letters 29:第1607-1612页)；以及氧化碳嗜热菌属的那些细菌(Svetlichny,V.A.,Sokolova,T.G.等人(1991),Systematic andApplied Microbiology 14:254-260)。这些公布的每一公开内容都以引用的方式全部并入本文。另外，其它产乙酸厌氧菌可由本领域技术人员选出用于本发明的方法中。还应理解两种或更多种细菌的混合培养物可用于本发明的方法中
适用于本发明中的一种优选微生物是醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)，其可从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)商购获得并且具有DSMZ保藏号DSMZ 10061的鉴定特征。
本发明进一步适用于支持由包含CO2和H2的气态底物产生乙酸。伍氏醋酸杆菌已被证明通过发酵包含CO2和H2的气态底物产生乙酸。Buschhorn等人证明伍氏醋酸杆菌在具有磷酸限制的葡萄糖发酵中产生乙醇的能力。适用于本发明的一种示例性微生物是伍氏醋酸杆菌，其具有在鉴定保藏号DSM 1030下在德国生物材料资源中心(German ResourceCentre for Biological Material，DSMZ)处所保藏的菌株的鉴定特征。
其它适合的细菌包括穆尔氏菌属的那些细菌，其包括穆尔氏菌菌种HUC22-1(Sakai等人,Biotechnology Letters 29:第1607-1612页)；以及氧化碳嗜热菌属的那些细菌(Svetlichny,V.A.,Sokolova,T.G.等人(1991),Systematic and AppliedMicrobiology 14:254-260)。另外的实例包括热醋穆尔氏菌(Morella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)、产生瘤胃球菌(Ruminococcusproductus)、伍氏醋酸杆菌、粘真杆菌(Eubacterium limosum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、醋酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)(Simpa等人CriticalReviews in Biotechnology,2006第26卷.第41-65页)。另外，应理解其它产乙酸厌氧菌可如本领域技术人员所认为的那样适用于本发明。还应理解本发明可适用于两种或更多种细菌的混合培养物。
培养本发明方法中使用的细菌可使用任何数量的本领域中已知的用于使用厌氧菌培养和发酵底物的方法进行。示例性技术提供于以下“实施例”部分中。在某些实施方案中，本发明的细菌的培养物维持在含水培养基中。优选地，含水培养基是最小厌氧性微生物生长培养基。适合的培养基是本领域中已知的并且描述在例如以下文献中：美国专利号5,173,429和5,593,886及WO 02/08438、以及Klasson等人[(1992).Bioconversion ofSynthesis Gas into Liquid or Gaseous Fuels.Enz.Microb.Technol.14:602-608.]、Najafpour和Younesi[(2006).Ethanol and acetate synthesis from waste gas usingbatch culture of Clostridium ljungdahlii.Enzyme and Microbial Technology,第38卷,第1-2期,第223-228页]及Lewis等人[(2002).Making the connection-conversion ofbiomass-generated producer gas to ethanol.Abst.Bioenergy,第2091-2094页]。在本发明的具体实施方案中，最小厌氧性微生物生长培养基如以下实施例部分中所述。作为进一步的实例，可利用通常在以下公开中所述使用气态底物用于发酵的那些方法：WO98/00558，M.Demler和D.Weuster-Botz(2010).Reaction Engineering Analysis ofHydrogenotrophic Production of Acetic Acid by Acetobacteriumwoodii.Biotechnology and Bioengineering 2010；D.R.Martin、A.Misra和H.L.Drake(1985).Dissimilation of Carbon Monoxide to Acetic Acid by Glucose-LimitedCultures of Clostridium thermoaceticum.Applied and EnvironmentalMicrobiology,第49卷,第6期,第1412-1417页。通常，发酵在任何适合的生物反应器中进行，如连续搅拌釜式反应器(CTSR)、泡罩塔反应器(BCR)或滴流床反应器(TBR)。此外，在本发明的一些实施方案中，生物反应器可包含在其中培养微生物的第一生长反应器；以及第二发酵反应器，发酵肉汤被从生长反应器送入所述发酵反应器且其中产生大部分发酵产物(乙醇和乙酸)。
原料
优选地，用于发酵的碳源可以是包含一氧化碳任选地与氢气组合的气态底物。类似地，气态底物可以是含有CO及任选的H2的废气，其作为工业过程的副产物而获得或来自一些其它来源。
如上所述，用于发酵反应的碳源是含有CO的气态底物。气态底物可进一步包含CO2和H2。气态底物可以是含有CO或CO2的废气，其作为工业过程的副产物而获得或来自一些其它来源如来自汽车尾气。在某些实施方案中，工业过程选自由以下组成的组：铁金属产物制造，如钢铁厂、非铁产物制造、石油炼制过程、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中，含有CO的气体可在其排放到大气前使用任何便利的方法从工业过程中捕获。取决于含有CO的气态底物的组成，还可能需要在将所述底物引入发酵前对其进行处理以除去任何不希望有的杂质如尘粒。例如，可使用已知的方法对气态底物进行过滤或洗涤。
另外，经常需要提高底物料流的CO或CO2浓度(或气态底物中的分压)并由此提高当CO或CO2是底物时发酵反应的效率。提高气态底物中的CO或CO2分压增加通向发酵培养基中的质量转移。用于为发酵反应送料的气体料流的组成可显著影响此反应的效率和/或成本。例如，O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后对发酵过程阶段中不需要的或多余的气体的处理会增加所述阶段的负担(例如，进入生物反应器之前压缩气体料流时，多余的能量可用于压缩发酵中不需要的气体)。因此，可能需要处理底物料流，特别是来源于工业来源的底物料流，以便除去不需要的组分和提高所需组分的浓度。
富氢气体料流通过包括蒸汽重整碳氢化合物且特别是蒸汽重整天然气的多种方法产生。煤或碳氢化合物的部分氧化也是富氢气体的一个来源。富氢气体的其它来源包括水的电解、来自用于产生氯的电解池以及来自各种练油厂和化学品料流的副产物。
气态底物可进一步或替代地包含CO2。具有高CO2含量的气体料流源自于多种工业过程并且包括来自碳氢化合物如天然气或油的燃烧的排气。这些过程包括水泥和石灰生产，以及钢铁生产。
料流的共混
如先前所示，可能需要将工业废料流与一个或多个另外的料流共混以改善发酵反应的效率、酸和/或醇生产和/或总碳捕获。
因此，当工业料流具有高CO或CO2含量但包含最少或不含H2时，可能需要将包含H2的一个或多个料流与包含CO或CO2的废料流共混，然后将共混底物料流提供给发酵罐。发酵的总效率、醇生产率和/或总碳捕获将取决于共混料流中CO和H2或CO2和H2的化学计量。然而，在具体的实施方案中，共混料流可基本上包含以下摩尔比的CO和H2：至少1:2、至少1:4或至少1:6或至少1:8或至少1:10。在具体的实施方案中，共混料流可包含以下摩尔比的CO2和H2：至少1:4或至少1:6或至少1:8或至少1:10。
料流的共混还可具有其它优点，特别是在包含CO、CO2或H2的废料流实际上是间歇的情况下。例如，包含CO及任选地H2的间歇废料流可与包含CO和/或H2的基本上连续的料流共混并提供给发酵罐。在本发明的具体实施方案中，基本上连续料流的组成和流速可根据间歇料流而变化以便维持具有基本上连续组成和流速的底物料流向发酵罐的供应。
共混两个或更多个料流以实现所需组成的操作可涉及改变所有料流的流速，或者一个或多个料流可维持恒定，而其它料流是变化的以便将底物料流“调整(trim)”或优化为所需组成。对于连续加工的料流而言，几乎不需要或不需要进一步处理(如缓冲)并且可向发酵罐直接提供料流。然而，可能有必要的是，当间歇地利用一个或多个料流时，和/或当连续地利用料流但其以可变的速率使用和/或产生时，为所述料流提供缓冲存储器。
本领域技术人员应理解，在共混之前监测料流的组成和流速是必要的。对共混料流组成的控制可通过改变成分料流的比例以实现目标或所需组成来实现。例如，基本负载气体料流可主要是CO，并且包含高浓度H2的次级气体料流可共混以实现指定的H2:CO比率。共混料流的组成和流速可通过本领域中已知的任何手段来监测。共混料流的流速可独立于共混操作而受控制；然而，个别成分料流移动的速率必须控制在限定范围内。例如，从缓冲存储器间歇地产生、连续地移动的料流必须以使得缓冲存储器容量既不耗尽又不装满的速率移动。
共混时，个别成分气体将进入混合室，其通常是小型容器或一段管道。在这种情况下，容器或管道可设置有静态混合装置，如挡板，其被布置以促进个别组分的湍流和快速均化。
必要时还可提供共混料流的缓冲存储器，以维持基本上连续的底物料流向生物反应器中的供应。
适于监测成分料流的组成和流速并控制料流以适当比例共混以实现所要或所需共混物的处理器可任选地并入系统中。例如，特定组分可以根据需要或可利用的方式提供以便优化乙酸产生的效率和/或总碳捕获。
在本发明的某些实施方案中，所述系统适于连续地监测至少两个料流的流速和组成并且将其合并以产生具有最佳组成的单一共混底物料流，以及将最佳化的底物料流传送到发酵罐的装置。
通过非限制性实例，本发明的具体实施方案涉及利用来自炼钢过程的一氧化碳气体。通常，这种料流几乎不含或不含H2，因此可能需要将包含CO的料流与包含H2的料流合并以实现更合乎需要的CO:H2比率。H2在钢铁厂的炼焦炉中经常大量地产生。因此，来自包含H2的炼焦炉的废料流可与包含CO的钢铁厂废料流共混以实现合乎需要的组成。
源自于工业来源的底物料流在组成方面通常是可变的。此外，源自于包含高CO浓度(例如像至少40％CO、至少50％CO或至少65％CO)的工业来源的底物料流经常具有低H2组分(如小于20％或小于10％或基本上0％)。因而，特别合乎需要的是，微生物能够通过厌氧发酵包含一定范围的CO和H2浓度、特别是高CO浓度和低H2浓度的底物来产生产物。本发明的细菌在发酵包含CO(且不含H2)的底物时具有惊人的高生长速率和乙酸产生速率。
应当理解，如本文所述的本发明的方法可用于通过捕获由于这种方法所产生的含CO的气体和使用所述气体作为本文所述的发酵过程的底物而减少来自工业过程的总大气碳排放。
或者，在本发明的其它实施方案中，含CO的气态底物可来源于生物质的气化。气化的过程涉及在空气或氧气的受限供应下部分燃烧生物质。生成的气体通常主要包含CO和H2，其中有最小体积的CO2、甲烷、乙烯和乙烷。例如，在食品如来自甘蔗的糖、或来自玉米或谷物的淀粉、或通过林业产业而生成的非食品生物质废料的提取和加工期间获得的生物质副产物可被气化以产生适用于本发明的含CO的气体。
通常优选的是，含CO的气态底物含有大比例的CO。在具体的实施方案中，气态底物包含至少约25体积％、至少约30体积％、至少约40体积％、至少约50体积％、至少约65体积％、或至少约70体积％至约95体积％CO。气态底物不必含有任何氢气。气态底物还任选地含有CO2，如约1体积％至约30体积％、如约5体积％至约10体积％CO2。
反应化学计量
已证明厌氧菌经由乙酰辅酶A生化途径由CO、CO2和H2产生乙醇和乙酸。
通过产乙酸微生物由包含CO的底物形成乙酸的化学计量如下：
4CO+2H2O→CH3COOH+2CO2
并且在H2的存在下：
4CO+4H2→2CH3COOH
还证明厌氧菌由CO2和H2产生乙酸。通过包括伍氏醋酸杆菌的产乙酸细菌由包含CO2和H2的底物形成乙酸的化学计量：
4H2+2CO2→CH3COOH+2H2O
应当理解，对于细菌的生长和CO、或CO2和H2向乙酸发酵的发生，除含CO、CO2和/或H2的底物气体之外，还需要将适合的液体营养培养基送入生物反应器。营养培养基将含有足以容许所用微生物的生长的维生素和矿物。适用于使用CO作为唯一碳源发酵乙醇的厌氧培养基在本领域中是已知的。例如，适合的培养基描述于美国专利号5,173,429和5,593,886和WO 02/08438以及在上文中提及的其它公布中。在本发明的一个实施方案中，培养基如下文的实施例部分中所述。
发酵理想地应在CO、或CO2和H2向乙酸发酵能发生的适当条件下进行。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅动速率(如果使用连续搅拌釜式反应器的话)、接种物水平、确保液相中的CO或CO2不会成为限制的最大气体底物浓度、以及避免产物抑制的最大产物浓度。
在一个实施方案中，发酵在约34℃至约37℃的温度下进行。在一个具体实施方案中，发酵在约34℃的温度下进行。发明人指出此温度范围可有助于支持或提高发酵的效率，包括，例如，维持或提高细菌的生长速率、延长细菌的生长期、维持或增加代谢物(包括乙酸)的产生、维持或增加CO或CO2摄取或消耗。
最佳反应条件将部分地取决于本发明所用的具体微生物。然而，一般说来，发酵优选地在高于环境压力的压力下进行。在提高的压力下操作使得CO和/或CO2从气相向液相转移的速率显著提高，其中液相的CO和/或CO2可作为碳源被微生物被吸收用于乙酸生产。这也意味着保留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)当生物反应器维持在升高的压力而非大气压力下时可能减少。
此外，因为给出的CO、或CO2和H2向乙酸的转化速率部分地是底物保留时间的函数，并且实现所期望的保留时间反过来指示生物反应器的所需容量，所以使用增压系统可极大地减少所需生物反应器的容量，并因此减少发酵设备的基本费用。
利用酸作为底物用于脂质生产的微藻类
本发明特别适用于支持由含有乙酸的底物产生脂质。一种这样类型的底物是来源于通过厌氧微生物发酵对包含CO或CO2和H2或其混合物的气态底物进行转化的乙酸。
已知许多微藻类能够进行糖向脂质的发酵，并且适用于本发明的方法中。这种微藻类的实例是裂壶藻属或栅列藻属的那些。
已显示微藻类通过异养发酵包含乙酸的底物产生脂质(Huang,G,Chen,F.,Wei,D.,Zhang,X.,Chen,G.“Biodiesel production by microalgal biotechnology”AppliedEnergy,第87(1)卷,2010,38-46；Ren,H.,Liu,B.,Ma,C.,Zhao,L.,Ren,N.“A new lipid-rich microalga Scenedesmus sp.strain R-16isolated using Nile red staining:effects carbon and nitrogen sources and initial pH on the biomass and lipidproduction.Biotechnology for Biofuels,2013,6(143))。
通过微藻类进行的脂质生产可通过氮限制得以改进。在具体的实施方案中，49:1的碳氮比对脂质生产具有显著的影响。
弯曲隐球菌(C.curvatus)在乙酸和乙醇上的生长能力使得本文所述的CO和H2、或CO2和H2发酵过程的产物料流成为用于微藻类转化过程的理想原料。来自CO2/H2发酵的产物料流特别理想，因为它富含乙酸。在本发明的具体实施方案中，来自发酵的产物料流的pH可调节至约pH 7。
适用于本发明方法中的微藻类包括以下的那些：小球藻属、衣藻属、杜氏藻属、裸藻属、金藻属、扁藻属、紫球藻属、螺旋藻属、蓝藻属、项圈藻属、裂壶藻属、Botyrococcus、墨角藻属、拟小球藻属、伪小球藻属、Brateococcus、无绿藻属以及栅列藻属。另外，应理解其它微藻类可如本领域技术人员所认为的那样适用于本发明。还应理解本发明可适用于两种或更多种微藻类物质的混合培养物。
本发明方法中使用的微藻类的培养可使用本领域中已知的许多方法进行。
通常，转化过程在任何适合的生物反应器中进行，如连续搅拌釜式反应器(CTSR)、泡罩塔反应器(BCR)或滴流床反应器(TBR)。在某些实施方案中，微藻类生物反应器将需要氧气或空气进口用于微藻类的生长。
在各种实施方案中，次级生物反应器内含有的微藻类能够将乙酸转化为脂质，其中脂质积聚在生物质的膜级分内。脂质积聚后，次级生物反应器的生物质可被传送到提取系统。在某些实施方案中，提取系统被用于从微藻类生物质的膜级分提取积聚的脂质。脂质提取可使用本领域中已知的许多方法进行。
通过本发明方法产生的脂质可通过本领域中熟知的手段被进一步加工以提供选自包括以下的组的化学品、燃料或燃料组分：柴油、碳氢化合物、HDRD、FAME及FAEE。各种衍生物如清洁和个人护理产品使用如表面活性剂、脂肪醇及脂肪酸的组分，其中所有的脂质都可作为替代物来提供。此外，各种油类化学品可由脂质产生。
培养基再循环
本发明各个方面的发酵过程的效率可通过使离开次级生物反应器的料流再循环到至少一个初级反应器中的进一步过程而得到进一步改善。离开次级生物反应器的料流可含有未使用的金属、盐及其它营养素组分。通过使出口料流再循环到初级反应器，可降低提供连续营养培养基到初级反应器中的成本。此再循环步骤的进一步益处是减少连续发酵过程的水需求。离开生物反应器的料流可在被传送回到初级反应器之前被处理。
此外，再循环步骤是有益的，因为它有助于降低初级生物反应器中的pH控制成本。乙酸产物的积聚导致初级生物反应器肉汤中的pH降低，这对悬浮在培养基中的培养物是有害的。在乙酸积聚的这种情况下，碱如NH3或NaOH必须添加至培养基中以提高pH。通过将肉汤传送到次级生物反应器，然后使其再循环回到初级生物反应器，次级生物反应器的微藻类被用来消耗乙酸且因此提高回到初级生物反应器中的培养基的pH。这减少了对添加昂贵的碱至初级反应器的培养基中的需要，因为乙酸经由次级生物反应器从系统中除去。
在优选实施方案中，生物质被分离和处理以回收一种或多种脂质产物。基本上不含生物质的料流然后可被传送到初级反应器。或者，无生物质的料流可被进一步处理以在被传送到初级反应器之前除去可溶性蛋白质或其它不需要的组分。另外的金属和盐可添加至回到初级反应器的料流中以提供具有所期望的组成的营养素料流。根据初级反应器中发生的发酵过程监测和调节料流的pH。
如在各种实施方案中，微藻类需要氧气用于次级生物反应器中的生长，再循环回到初级生物反应器的任何培养基将需要基本上除去所有氧气，因为存在于初级生物反应器中的任何氧气将对厌氧培养物有害。因此，离开次级生物反应器的肉汤料流可穿过氧气洗涤器以在被传送到初级反应器之前除去基本上所有的氧气。
本发明的方法和系统在本文中参照附图来描述。
图1显示一种用于由包含CO和H2、或CO2和H2的气态料流产生脂质的两阶段系统。所述系统提供初级生物反应器101，所述初级生物反应器101具有培养基进口102、进气口103、分离器装置104、渗透物料流出口107和排放物料流出口108。初级生物反应器连接至次级生物反应器201，所述次级生物反应器201具有分离器205、渗透物料流出口207和排放物料流出口208。
使用中，初级生物反应器101含有发酵肉汤，所述发酵肉汤包含在液体营养培养基中的一种或多种产乙酸细菌的培养物。培养基以连续或半连续方式经由培养基进口102被添加至生物反应器101中。气态底物经由进气口103供应给生物反应器101。分离器装置适于经由第一出口导管104接受来自生物反应器101的至少一部分肉汤并且将其传送通过分离器105，所述分离器105配置为将微生物细胞(保留物)与其余的发酵肉汤(渗透物)大致上分离。至少一部分保留物经由第一回流导管106回到第一生物反应器，这确保了肉汤培养物密度维持在一个最佳水平。分离器105适于经由渗透物输送导管107使至少一部分渗透物从生物反应器101中传出。渗透物输送导管将无细胞的渗透物送入次级生物反应器201。在本发明的某些实施方案中，至少一部分无细胞的渗透物因产物提取而被除去或是在渗透物料流被送入次级生物反应器201之前再循环。提供肉汤排放物出口108以将肉汤从初级生物反应器101直接送入次级生物反应器202。在某些实施方案中，肉汤排放物和渗透物排放物在被送入次级生物反应器之前合并。可能需要在传送到次级生物反应器之前纯化料流以确保至少10:1或至少25:1或至少49:1的碳:氮比率。
次级生物反应器202含有在液体营养培养基中的一种或多种微藻类的培养物。次级生物反应器以连续或半连续的方式经由肉汤排放物出口108和渗透物输送管道107接受来自初级生物反应器的肉汤和渗透物。分离器装置适于经由第一出口导管204接受来自生物反应器201的至少一部分肉汤并且将其传送通过分离器205，所述分离器205配置为将微生物细胞(保留物)与其余的发酵肉汤(渗透物)大致上分离。至少一部分保留物经由第一回流导管206回到第一生物反应器，这确保肉汤培养物密度维持在一个最佳水平。分离器205适于经由渗透物去除导管207使至少一部分渗透物从生物反应器201中传出。提供肉汤排放物出口208以将肉汤从次级生物反应器201中直接除去。肉汤排放物料流被处理以将生物质除去以便使用已知的方法进行脂质提取。将基本上不含生物质的排放物料流与渗透物料流合并以产生合并的料流。在本发明的某些方面，合并的料流可回到初级反应器以补充被连续地添加的液体营养培养基。在某些实施方案中，可能需要进一步加工再循环料流以除去二次发酵的不合需要的副产物。在某些实施方案中，可调节再循环料流的pH，并且进一步添加维生素和金属以补充料流。
图2示出用于由包含CO和H2、或CO2和H2的气态料流产生脂质的简化系统，其中基本上不含乙酸的培养基被从次级生物反应器再循环到初级生物反应器。所述系统包括具有培养基进口302、进气口303、含乙酸的排放物料流304的初级厌氧性生物反应器301，次级需氧生物反应器305、氧源306、含有脂质和生物质的产物料流307、以及乙酸耗尽的再循环培养基料流。
使用中，初级生物反应器301含有发酵肉汤，所述发酵肉汤包含在液体营养培养基中的一种或多种产乙酸细菌的培养物。培养基以半连续方式经由培养基进口302被添加至生物反应器301中。包含CO及任选地H2、或CO2和H2或其混合物的气态底物经由进气口303被供应给初级生物反应器301，其中气体通过细菌转化为乙酸。初级生物反应器301维持在6.5-7范围内的pH下，pH部分地通过根据需要添加碱来控制。乙酸产物在含水的肉汤料流304中离开初级生物反应器，所述含水的肉汤料流304被送入次级需氧生物反应器305。在次级生物反应器305中，在含水肉汤中的乙酸通过微藻类被转化为脂质和非脂质生物质。氧气通过氧气或空气进气口306被供应给需氧发酵。通过过滤从次级生物反应器305中除去含脂质的微藻类细胞，产生含脂质和生物质的产物料流307和渗透物料流308。因为需氧发酵消耗乙酸，所以肉汤的pH随着乙酸的消耗而提高，并且渗透物料流308的pH因此比含乙酸的肉汤料流304的pH名义上更高。维持次级生物反应器305的稀释率以使得渗透物料流308的pH保持在7.0-7.5的范围内。乙酸耗尽的渗透物料流308回到初级生物反应器301。除使构成初级生物反应器301的培养基的水、盐、金属及其它营养素的相当大一部分再循环之外，再循环水料流308还用于使系统内使用的碱再循环，从而相对于其中pH仅通过直接添加碱到生物反应器培养基中来控制的系统显著地降低发酵pH控制的成本。
实施例
材料和方法
培养基：
Figure BDA0003115160100000221
Figure BDA0003115160100000231
Figure BDA0003115160100000241
所用的两种类型的醇梭菌是保藏在德国生物材料资源中心(DSMZ)处并且分配入藏登记号DSM 19630和DSM 23693的那些。DSM 23693是经由迭代选择过程由醇梭菌菌株DSM19630(DSMZ,Germany)发展而来。
细菌：伍氏醋酸杆菌是从德国生物材料资源中心(DSMZ)处获得。给予细菌的入藏登记号是DSM 1030。
Na2S的制备-向500ml烧瓶中装入Na2S(93.7g，0.39mol)和200ml H2O。搅拌溶液直到盐已经溶解并且在恒定的N2流量下添加硫(25g，0.1mol)。在室温下搅拌2小时之后，“Na2Sx”溶液(相对于[Na]大约4M且相对于硫大约5M)现在是澄清的红棕色液体，将其转移到N2净化血清瓶中，用铝箔覆盖。
Cr(II)溶液的制备-1L三颈烧瓶装备有气密进口和出口以便允许在惰性气体下操作并且随后将所需产物转移到适合的储存烧瓶中。向烧瓶中装入CrCl3.6H2O(40g，0.15mol)、锌粒[20目](18.3g，0.28mol)、汞(13.55g，1mL，0.0676mol)以及500ml蒸馏水。用N2吹扫一小时之后，将混合物温热至约80℃开始反应。在恒定的N2流量下搅拌两小时之后，将混合物冷却至室温且再连续搅拌48小时直到反应混合物已变成深蓝色溶液为止。将溶液转移到N2净化血清瓶中并且保存在冰箱中备用。
采样和分析工序：
培养基样品是在30天期间内在一定时间间隔下采集。
所有样品都被用于确定在600nm下的吸光率(分光光度计)以及底物和产物的水平(GC或HPLC)。HPLC常规地用于定量乙酸水平。
HPLC：HPLC System Agilent 1100系列。流动相：0.0025N硫酸。流量和压力：0.800mL/min。柱：Alltech IOA；目录号#9648，150×6.5mm，粒度5μm。柱的温度：60℃。检测器：Refractive Index。检测器的温度：45℃。
用于样品制备的方法：将400μL的样品和50μL的0.15M ZnSO4和50μL的0.15M Ba(OH)2装入Eppendorf试管中。将试管在12,000rpm、4℃下离心10min。将200μL上清液转移到HPLC小瓶中，并且将5μL注射到HPLC仪器中。
顶空分析：测量是在具有两个安装通道的Varian CP-4900微型GC上进行。通道1是在70℃、200kPa氩气和4.2秒的反冲时间下运行的10m Mol-筛柱，而通道2是在90℃、150kPa氦气和没有反冲下运行的10m PPQ柱。两个通道的注射器温度是70℃。运行时间被设定为120秒，但所关注的所有峰通常将在100秒之前洗脱。发酵罐的顶部空间通过Gas-GC(Varian4900Micro-GC)每小时自动地分析。
细胞密度：通过计数发酵肉汤的限定等分试样中的细菌细胞来测定细胞密度。或者，样品的吸光率是在600nm下测量(分光光度计)并且干燥质量根据公开的工序经由计算来测定。
实施例1：CO在生物反应器中的发酵以产生乙酸：
醇梭菌的甘油原料在血清瓶中复苏。将保存在80℃的甘油原料缓慢解冻并使用注射器将其转移到血清瓶中。此过程在厌氧箱内部进行。随后，将接种的血清瓶从厌氧箱中移开并且使用含CO的气体混合物(40％CO、3％H2、21％CO2、36％N2)加压到45psi的总压力。然后将瓶子水平地置于在37℃的温度下的培养箱内的振动器上。培养两天之后且检验到培养物生长之后，将瓶子用于接种另一组八个含气体的血清瓶，所述血清瓶具有5mL的此培养物。如上所述，再将这些血清瓶培养一天，然后用于接种5L在10L CSTR中制备的液体培养基。初始的含CO的气体流量被设定在100～mL/min且搅拌速度被设定在低的200rpm。当微生物开始消耗气体时，将搅动和气体流量增加到400rpm和550mL/min。以分批模式生长两天之后，发酵罐转为以0.25 1/天的稀释率连续进行。稀释率提高了0.25 1/天，达到每24小时11/天的值。
代谢物和微生物生长可见于图3中。反应器中载运的乙酸浓度为约10g/L至高于20g/L。稀释率为1.0。乙酸的生产率为10g/L/天至高于20g/L/天。乙酸与乙醇的比率在约5:1至约18:1之间变化。
实施例2：CO2和H2在生物反应器中的发酵以产生乙酸：
pH 6.5的培养基使用由Balch等人(参见，例如Balch等人,(1977)InternationalJournal of Systemic Bacteriology.,27:355-361)所定义的方案来制备。三升反应器中填充有1500ml培养基。通过用N2连续地喷射将氧气从培养基中除去。在接种之前30分钟将气体从N2转换为60％H2、20％CO2及20％N2的混合物。接种物(150ml)来自于用相同气体混合物喂饲的连续伍氏醋酸杆菌培养物。生物反应器维持在30℃下并且在接种之时在200rpm下搅拌。在之后的分批生长期期间，将搅动逐渐地提高到600rpm。根据因增加的生物质而在顶部空间中滴落的H2/CO2，气体流量逐渐地增加了50ml/min。为了补偿所产生的乙酸，使用5MNaOH将pH自动地控制至7。在整个发酵过程中，将0.5M Na2S溶液以0.2ml/小时的速率泵送入发酵罐中。1天之后培养基成为连续的。为了达到高生物质以及高气体消耗，必须将发酵罐中的乙酸浓度保持在低于20g/L的水平。这是通过在相对较高的稀释率(D～1.7/天)下运行发酵罐同时保留具有孔径大小为0.1μm的聚砜膜过滤系统的发酵罐(GE healthcarehallow纤维膜)中的微生物来实现。用于连续培养的培养基是排除了复合痕量金属溶液的溶液A，其通过使用自动注射泵以1.5ml/小时的速率被单独送入。在至少1天之前为培养基脱气且在整个发酵过程中进行连续脱气。
结果
三十天后，产生浓度为12.5g/L的乙酸。乙酸的平均生产率为每天21.8g/L。
乙酸在连续培养中的最大浓度是17.76g/L(296mM)。
实施例3微藻类乙酸利用
最近已论证微藻类可利用乙酸作为碳源来产生脂质。Ren等人已证明在包含乙酸作为碳源的液体培养基中培养的栅列藻种产生43.4％的总脂质含量和1.86g L-1的最大生物质浓度(Ren,H.,Liu,B.,Ma,C.,Zhao,L.,Ren,N.“A new lipid-rich microalgaScenedesmus sp.strain R-16isolated using Nile red staining:effects carbon andnitrogen sources and initial pH on the biomass and lipidproduction.Biotechnology for Biofuels,2013,6(143))。
在本系统中，源自于气态底物的厌氧发酵的乙酸被送入包含微藻类如栅列藻种的CSTR。微藻类是在25℃和pH 7下在培养基中培养。搅动被设定在150rpm。氮源如硝酸钠也应存在于培养基中，浓度在0.1-1.0g/L范围内，这取决于乙酸浓度。一旦培养基中的所有乙酸都被转化为生物质，便使用已知的提取法将脂质从生物质中提取出。
本说明书中对任何现有技术的参考不被并不应被认为承认或以任何形式地建议现有技术在任何国家形成所致力领域的公知常识的部分。
除非上下文另外要求,否则在整个说明书和权利要求书中,单词“包括”、“包括”等均被视为是与封闭含义相反的开放含义，也就是“包括但不限于”的意思。

Claims (10)

1.一种用于由气态底物产生至少一种脂质产物的方法，所述方法包括：
i.在第一生物反应器中接纳包含CO和/或H2的气态底物，所述第一生物反应器包含在液体营养培养基中的至少一种微生物的培养物，其中所述微生物选自由以下组成的组：醋酸杆菌属和梭菌属，并在厌氧条件下发酵所述气态底物以产生选自酸或酸和醇的产物；
ii.将酸产物的至少一部分传送到第二生物反应器，所述第二生物反应器包含在液体营养培养基中的至少一种微藻类的培养物，其中所述微藻选自由以下组成的组：衣藻属、杜氏藻属、裸藻属、金藻属、扁藻属、紫球藻属、螺旋藻属、蓝藻属、项圈藻属、裂壶藻属、Botyrococcus、墨角藻属、伪小球藻属、Brateococcus和栅列藻属，并在有氧条件下发酵所述酸以产生至少一种脂质产物；
iii.从所述第二生物反应器获得发酵肉汤；
iv.使来自所述第二生物反应器的所述发酵肉汤穿过氧气洗涤器以除去氧气并产生处理的发酵肉汤；以及
v.使所述处理的发酵肉汤的至少一部分再循环回到所述第一生物反应器；
其中所述酸选自由以下组成的组：乙酸、丁酸、琥珀酸、乳酸或丙酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述酸是乙酸，并且乙酸在所述第一生物反应器中的产生速率是至少10g/L/天。
3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(ii)中产生的所述至少一种脂质产物被用于产生选自由以下组成的组的至少一种三级产物：氢化来源的可再生柴油(HDRD)、脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪酸乙酯(FAEE)及生物柴油。
4.如权利要求1所述的方法，其中脂质生产在所述第二生物反应器中通过基本上限制在所述液体营养培养基中的至少一种营养素而增加。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述限制性营养素是氮。
6.如权利要求1所述的方法，其中再循环肉汤中的酸浓度大幅降低。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述第一生物反应器中的pH维持在pH 4.5至6。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种醇选自由以下组成的组：乙醇、丁醇、甲醇或丙醇。
9.如权利要求1所述的方法，进一步包括首先处理来自步骤(iii)的肉汤以除去基本上所有的生物质，之后使所述肉汤再循环到所述第一生物反应器。
10.如权利要求1所述的方法，进一步包括首先使来自步骤(iii)的肉汤穿过氧气洗涤单元，之后使所述肉汤再循环到所述第一生物反应器。
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