CN117286071A - 一种培养基以及巴氏八叠芽孢球菌的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种培养基以及巴氏八叠芽孢球菌的培养方法，涉及微生物技术领域。本发明提供的培养基利用多种原料协同提升了巴氏八叠芽孢球菌培养过程中脲酶、碳酸酐酶的产量和活性，使菌体提前进入对数生长阶段并适当延长对数期，从而提升了菌体密度。高细胞密度下，有助于提升MICP速率和结晶量。本发明提供的培养基的原料具有原料来源广、要求低(工业级就可满足培养要求)、成本低的特性。此外，本发明提供的培养方法不需要使用多种培养基，从同步提高菌体密度、脲酶活性和碳酸酐酶活性的角度出发，能够显著提升碳酸钙结晶速率。

Description

一种培养基以及巴氏八叠芽孢球菌的培养方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种培养基以及巴氏八叠芽孢球菌的培养方法。
背景技术
巴氏生孢八叠球菌(Sporosarcina pasteurii，S.pasteurii)是已知生物矿化效率最为突出的微生物系统之一，具备优异的颗粒固结特性与重金属固定能力。目前，微生物诱导的碳酸钙沉淀(Microbial induced calcite precipitation，MICP)理论已经在砂土固化、土壤污染治理、矿山修复等领域广泛应用。然而，生长培养基(营养肉汤、酵母提取物和胰蛋白酶大豆肉汤等)成本一直是制约巴氏生孢八叠球菌工业化应用的一个主要限制性因素，其原料成本可达到总生产成本的60％以上，且难以实现全面营养保障。此外，现有技术多数聚焦于脲酶活性的提升，而忽略了碳酸酐酶在巴氏生孢八叠球菌诱导碳酸盐沉淀中所发挥的作用(如动态调节CO2/HCO3 -比例提升碳酸根浓度、间接调节脲酶活性等)，从而导致MICP过程无法突破瓶颈。
专利申请号为CN201710961908.2的专利提供了一种培养具有单位高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法，该方法采用两种培养基在不同的培养阶段进行培养，该专利申请注重使菌株表现单位高脲酶活性，存在规模化生产消耗大量牛肉膏、蛋白胨等价格较高的原料的问题。
专利申请号为CN202210060736.2的专利提供了一种巴氏生孢八叠球菌的培养方法。该专利偏向促进菌株产孢研究，存在原料价格高，培养时间相对较长的问题。
目前有关利用微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，主要是通过功能微生物新陈代谢过程中产生碳酸根、铵根离子，同钙离子结合为碳酸钙沉淀，同时诱使周边微环境呈现碱性。然而，现有技术主要依赖外源添加物从而提升产脲酶菌的尿素分解能力，对外源添加物的种类和制作流程有严格要求，且整体工艺流程较为复杂，不利于产业化应用。例如专利CN111411127 B公开了一种利用微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，该方法需要向含有细菌悬浮液的凝胶液中加入钠蒙脱土从而进行钙碳酸盐沉淀。专利公开号为CN 111088166 A的专利提供了一种藻菌共培养体系促进微生物诱导碳酸钙沉淀的方法，该方法需要将微藻与脲酶细菌在添加一定浓度葡萄糖条件下进行共培养。在该体系中，脲酶细菌降解尿素生成的HCO3 -为微藻利用后生成CO3 2-，进而与溶液Ca2+结合生成碳酸钙。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养基以及巴氏八叠芽孢球菌的培养方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种用于巴氏八叠芽孢球菌培养的培养基，每升培养基中包括2-6g的工业级酵母浸粉，6-14g的工业级骨蛋白胨，2-5g的工业级尿素，3.0-6.0g的氯化钠，0.5-2.0g的磷酸氢二钾，18-25g的三水合磷酸铵，0.1mM-0.3mM的镍源和0.016mM-0.04mM的锌源，培养基的pH为7.2-7.6。
培养基配方中的工业级酵母浸粉，工业级骨蛋白胨和工业级尿素作为巴氏八叠芽孢球菌的培养使用的速效氮源，方便了巴氏八叠芽孢球菌的快速利用。氯化钠和磷酸氢二钾起到调节细胞渗透压的作用。磷酸氢二钾能够为巴氏八叠芽孢球菌的培养提供必要的P源。镍源的作用是刺激脲酶的产生。锌源作为合成碳酸酐酶的原料，添加锌源以提高培养过程中碳酸酐酶的产量和活性。上述多种原料协同提升了巴氏八叠芽孢球菌培养过程中脲酶、碳酸酐酶的产量和活性，使菌体提前进入对数生长阶段并适当延长对数期，从而提升菌体密度。高细胞密度下，更利于提升MICP速率和结晶量，且面对高浓度重金属背景的施用环境时菌体具有更高耐受性。
本发明提供的培养基的原料具有原料来源广、要求低(工业级就可满足培养要求)、成本低的特性，相较BPU(Qiao,S.,2021)、NH4-YE等培养基所使用的牛肉膏、蛋白胨、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等高成本试剂，本发明提供的培养基具有原料价格低廉且能实现预期发酵目标。相较BPU培养基，培养体系的尿素施用量大幅减少，减轻了菌株应用过程中的环境污染。此外，本发明提供的培养基中所使用的镍、锌微量元素，添加量远低于标准《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618-2018)规定的筛选值，因而不会产生重金属二次污染。
此外，本发明提供的培养基能够用于培养获得高密度菌体细胞。高细胞密度下，有利于提升MICP速率和结晶量，且面对高浓度重金属背景的施用环境时菌体具有更高耐受性。
采用本发明提供的培养基，通过同步提升菌体密度、脲酶和碳酸酐酶活性，协同促进MICP过程，有较高的推广和实用价值。
在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括2g、3g、4g、5g或6g的工业级酵母浸粉。在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括6g、7g、8g、9g、10g、11g、12g、13g或14g的工业级骨蛋白胨。在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括2g、3g、4g或5g的工业级尿素。在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括3.0g、4g、5g或6.0g的氯化钠。在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括0.5g、1g、1.5g或2.0g的磷酸氢二钾。在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括18g、19g、20g、21g、22g、23g、24g或25g的三水合磷酸铵。在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM的镍源。在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括0.016mM、0.02mM、0.03mM或0.04mM的锌源。
在一种可选的实施方式中，培养基的pH为7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。
在本发明应用较佳的实施方式中，镍源选自氯化镍、硫酸镍、硝酸镍和碳酸镍中的至少一种。
在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括0.015-0.035g的无水氯化镍。
在本发明应用较佳的实施方式中，锌源包括不限于无机锌和/或有机锌；
在一种可选的实施方式中，无机锌包括不限于氯化锌、硫酸锌、硝酸锌和碳酸锌中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，有机锌包括不限于醋酸锌、乳酸锌、天门冬氨酸锌、癸酸锌和辛酸锌中的至少一种。有机锌具有比无机锌更优的提升碳酸酐酶活性的效果。
在一种可选的实施方式中，每升培养基中包括0.004-0.01g的乳酸锌。
第二方面，本发明提供了一种高MICP效率的巴氏八叠芽孢球菌的培养方法，其包括：
将巴氏八叠芽孢球菌接种于上述的培养基中，在27-37℃下培养。
MICP效率是一个由离子浓度、pH值以及细胞密度决定的函数，菌体作为成矿晶核，发挥结构组装和微域粘结的作用，是决定MICP技术上限的关键指标。脲酶活性受限于菌体密度与碳酸酐酶活性。当单位体积菌体量增加时，脲酶活性也将随之提高(Langdon,C.,Takahashi,T.,Sweeney,C.,at al,2000.Effect of calcium carbonate saturationstate on the calcification rate of an experimental coral reef.GlobalBiogeochemical Cycles 14(2),639-654.)。此外，含锌金属酶碳酸酐酶具备极高的CO2捕集与封存效率，可催化碳酸与碳酸氢根间的相互转化。碳酸酐酶主要通过以下两方面介入MICP过程：(1)气态CO2溶解于水中形成碳酸，此步骤为限速反应，而在碳酸酐酶催化作用下，CO2水和速率得到指数级提升，随后碳酸电离出HCO3 -，并进一步与OH-及金属阳离子形成碳酸盐沉淀；(2)CO2需先于Ni2+进入活性位点，脲酶方可表现出活性。因此，碳酸酐酶可通过与脲酶协同等多种策略介入MICP过程，碳酸酐酶活性的提升可能有助激活脲酶活性。
经过长期的摸索和实验，发明人发现：将巴氏八叠芽孢球菌接种于上述培养基中进行培养可以通过同步提升菌体密度、脲酶和碳酸酐酶活性，协同促进MICP过程。
上述培养方法不需要使用多种培养基，从同步提高菌体密度、脲酶活性和碳酸酐酶活性的角度出发，能够显著提升碳酸钙结晶速率。
在本发明应用较佳的实施方式中，培养包括不限于在斜面培养基、液体培养基、或其他的固体或半固体培养基中进行培养。
本发明通过提供特定的用于巴氏八叠芽孢球菌培养的培养基并调整培养条件，使菌体提前进入对数生长阶段并适当延长对数期，从而提升菌体密度。高细胞密度下，有利于提升MICP速率和结晶量，且面对高浓度重金属背景的施用环境时菌体具有更高耐受性。
在本发明应用较佳的实施方式中，培养是在150-200rpm下进行培养。包括不限于在摇瓶中培养。例如培养是在150rpm、160rpm、180rpm、185rpm、190rpm或200rpm下进行培养。
在本发明应用较佳的实施方式中，在150-200rpm下培养20-26h。例如培养20h、22h、24h、26h。本领域的技术人员可以根据需要适当缩短或延长培养时间。
在本发明应用较佳的实施方式中，150-200rpm下培养结束后还包括二次培养，二次培养是指：接种培养基中的菌液至新的培养基中进行二次培养，27-37℃条件下在150-200rpm培养16-40h。二次培养能够提升菌体密度，且菌株性能更稳定。
在本发明应用较佳的实施方式中，巴氏八叠芽孢球菌为保藏编号为CGMCCNO.24089的菌株或其培养物。本发明所采用的生物矿化菌株为前期筛选所得的巴氏生孢八叠球菌kp-22(保藏编号：CGMCCNO.24089)，不存在生物安全性问题。
该菌株不以尿素为唯一氮源，在工业应用中可采用其它速效氮源，以减轻尿素滥用产生的环境问题。推测其基因组中有α、β、γ碳酸酐酶基因，可通过调整培养基成分和培养条件提高碳酸酐酶活性，进而提升MICP效率。
在其他实施方式中，本领域的技术人员可以根据需要选择其他的同属于巴氏八叠芽孢球菌种的其他菌株进行培养。
在本发明应用较佳的实施方式中，培养物为选自巴氏八叠芽孢球菌的浓缩物、干燥物、液态物和稀释物中的至少一种。培养物包括不限于发酵上清液或发酵沉淀物。
发酵上清液可选的采用如下的制备方法制得：接种巴氏八叠芽孢球菌进行培养，去除菌体，即得。
发酵沉淀物可选的采用如下的制备方法制得：接种巴氏八叠芽孢球菌进行培养，离心或自然沉降，去除上清液获得发酵的沉淀物。
第三方面，本发明提供了一种提升微生物诱导碳酸钙沉积效率的方法，其包括如下步骤：将经过上述的培养方法培养的巴氏八叠芽孢球菌培养物、生物成矿体系试剂混合，生物成矿体系试剂包括尿素和氯化钙。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的培养基利用多种原料协同提升了巴氏八叠芽孢球菌培养过程中脲酶、碳酸酐酶的产量和活性，使菌体提前进入对数生长阶段并适当延长对数期，从而提升了菌体密度。高细胞密度下，有助于提升MICP速率和结晶量，且面对高浓度重金属背景的施用环境时菌体具有更高耐受性。
(2)本发明提供的培养基的原料具有原料来源广、要求低(工业级就可满足培养要求)、成本低的特性，相较BPU(Qiao,S.,2021)、NH4-YE等培养基所使用的牛肉膏、蛋白胨、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等高成本试剂，本发明提供的培养基具有原料价格低廉且能实现预期发酵目标。相较BPU培养基，培养体系的尿素施用量大幅减少，减轻了菌株应用过程中的环境污染。
(3)本发明提供的培养基中所使用的镍、锌微量元素，添加量远低于标准《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618-2018)规定的筛选值，因而不会产生重金属二次污染。
(4)本发明还提供了一种高MICP效率的巴氏八叠芽孢球菌的培养方法，将巴氏八叠芽孢球菌接种于上述培养基中进行培养可以通过同步提升菌体密度、脲酶和碳酸酐酶活性，协同促进MICP过程。
(5)本发明提供的培养方法不需要使用多种培养基，从同步提高菌体密度、脲酶活性和碳酸酐酶活性的角度出发，能够显著提升碳酸钙结晶速率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为培养基与培养条件优化前后的kp-22菌株培养后的摇瓶实物对比图；
图2为kp-22在不同培养基的生长情况统计结果图；
图3为kp-22细胞的TEM图像和能谱扫描图；
图4为不同外源锌浓度下的碳酸酐酶和脲酶活性统计结果图；
图5为不同处理下kp-22的碳酸盐沉淀生成效率统计结果图；
图6为使用实施例1和对比例3提供的培养基进行培养后的kp-22细胞生长情况统计结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
如下为菌株、试剂和仪器来源。
菌株：巴氏生孢八叠球菌kp-22(保藏编号：CGMCC NO.24089)。分类命名为：芽孢八叠球菌Sporosarcina sp.，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2021年12月13日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
菌株公开的期刊参照Multiple heavy metals immobilization based onmicrobially induced carbonate precipitation by ureolytic bacteria and theprecipitation patterns exploration。
试剂：培养基原料包含工业级酵母浸粉，工业级骨蛋白胨，工业级尿素，氯化钠，磷酸氢二钾，三水合磷酸铵，无水氯化镍与乳酸锌；生物成矿体系试剂包含尿素与氯化钙。以上试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
仪器：紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司，UV-5500)，电导率仪(上海仪电科学仪器股份有限公司，DDS-307A)，电热恒温鼓风干燥箱(上海叶拓科技有限公司，JC101-A)。
实施例1
本实施例提供了一种巴氏生孢八叠球菌高密度培养基。
制备高密度液体发酵培养基：工业级酵母浸粉4.3g/L，工业级骨蛋白胨12g/L，工业级尿素2g/L(过滤灭菌)，氯化钠4.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，三水合磷酸铵22.55g/L，无水氯化镍0.015g，乳酸锌0.007g，pH＝7.3。不同培养基的运行条件均设置为：35℃下150rpm培养。
实施例2
本实施例提供了一种高MICP效率的巴氏八叠芽孢球菌的培养方法，其包括如下步骤：
(1)取菌株kp-22母液于传统NH4-YE固体培养基(酵母提取物20.0g，(NH4)2SO410.0g，pH＝9.0 0.13M Tris buffer 1L，琼脂20g)上划线，并在30℃下培养22h。
(2)从步骤(1)中划线平板上挑取单菌落接种于实施例1制备的高密度液体发酵培养基中，35℃下150rpm扩大培养20-26h。培养体系：100mL摇瓶中盛装发酵液40mL。
(3)取步骤(2)所培养菌液至高密度液体发酵培养基进行二次培养。35℃下150rpm培养18h。培养体系：250mL摇瓶中盛装发酵液100mL。
实施例3
本实施例提供了一种巴氏生孢八叠球菌高密度培养基。
制备高密度液体发酵培养基：工业级酵母浸粉4.3g/L，工业级骨蛋白胨10g/L，氯化钠4g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，三水合磷酸铵23.5g/L，无水氯化镍0.01g，乳酸锌0.009g，pH＝7.3。不同培养基的运行条件均设置为：35℃下150rpm培养。
实施例4
本实施例提供了一种巴氏生孢八叠球菌高密度培养基。
制备高密度液体发酵培养基：工业级酵母浸粉4g/L，工业级骨蛋白胨15g/L，工业级尿素1.5g/L(过滤灭菌)，氯化钠4.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，三水合磷酸铵22.55g/L，无水氯化镍0.015g，乳酸锌0.01g，pH＝7.3。不同培养基的运行条件均设置为：35℃下150rpm培养。
对比例1
配置BPU培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，尿素20g/L(过滤灭菌)，pH＝7.3。
对比例2
配置NH4-YE液体培养基：酵母提取物20.0g/L，(NH4)2SO4 10.0g/L，pH＝9.0 0.13MTris buffer 1L。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于不含乳酸锌。
实验例1
将kp-22菌株分别在实施例1和对比例1-3提供的培养基中进行培养，培养条件同实施例2。区别仅在于，培养基不同。
生长情况如图1和图2所示。结果显示，菌株kp-22在不同培养基中，于6h步入对数期。BPU和NH4-YE培养基约在12h时步入稳定期，而高密度发酵培养基的稳定期则在20h前后，OD600可达4.683。以上结果表明，高密度发酵培养基适当地延长了kp-22的生长对数期，有助于菌株的扩大培养。
使用含乳酸锌和不含乳酸锌的培养基进行培养后的kp-22细胞生长情况参照图6所示，结构显示含乳酸锌的高密度发酵培养基更有助于菌株的扩大培养，菌株的OD600下的浓度更大。
根据TEM结果(图3)，可以观察到椭圆形的细菌细胞以及孢子的形成。细菌孢子是具有极强复原力的细菌遗传物质，能在恶劣条件下生存，孢子形式利于kp-22相关制剂的长程运输。将细菌样品切片后进行能谱扫描，发现锌元素均匀地分布于细胞内部，且细胞富集锌元素后与周围环境呈现明显浓度差。
实验例2
本实施例针对实施例1提供的巴氏生孢八叠球菌高密度培养基进行碳酸酐酶与脲酶活性的测试。培养条件和方法同实施例2.
在这项测试中，分别设置了Control(不添加乳酸锌)、Zn-10(添加10μmol/L乳酸锌)、Zn-10(添加10μmol/L乳酸锌)、Zn-20(添加20μmol/L乳酸锌)、Zn-30(添加30μmol/L乳酸锌)五个处理组。
脲酶活性采用Whiffin等人所报道的电导率法进行测定(Whiffin VS,PaassenLAV,Harkes MP.2007.Microbial carbonate precipitation as a soil improvementtechnique.Geomicrobiol J.24(5):417-423.)，该方法在没有钙离子干扰情况下适用。将1mL菌液添加至盛有9mL 1.11mol尿素溶液离心管中，用电导率仪测定初始电导率，20℃反应2min后，再测量混合液电导率从而获得电导率变化率。一个单位的尿素酶活性被定义为每分钟水解1mmol尿素(mmol urea.min-1)的酶量。在一定测量范围内，1ms.cm-1.min-1的电导率变化率等价于11.1mmol.min-1尿素水解速率。
通过对硝基苯酚产量的测定定量测得碳酸酐酶活性。
脲酶和碳酸酐酶的活性统计结果参照图4所示，其中碳酸酐酶的活性随着乳酸锌添加量的增加，逐渐自2.152提升至2.778U/mL/COD600，这与锌是碳酸酐酶的组分相关。
而脲酶活性在乳酸锌浓度为20和30mmol/L时，达到较高水平，分别为3.560和3.655U/mL/COD600。在50mmol/L降低至3.402U/mL/COD600，主要是因为菌体OD600值有明显下降。
实验例3
本实施例针对实施例1提供的巴氏生孢八叠球菌高密度培养基进行生物成矿效率的测试。培养条件和方法同实施例2。
在该项测试中，分别设置了Control(不添加乳酸锌)、Zn(添加20μmol/L乳酸锌)、ACZ(添加10μmol/L碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺)、AHA(添加5mmol/L脲酶抑制剂乙酰羟肟酸)、Zn+ACZ(添加20μmol/L乳酸锌和10μmol/L乙酰唑胺)、Zn+AHA(添加20μmol/L乳酸锌和5mmol/L乙酰羟肟酸)六个处理组。具体地，kp-22菌株于不同处理中150rpm连续曝气培养72h。菌液高速离心(10000rpm，10min)去上清收获菌体细胞，菌体细胞用磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)重悬后离心洗涤3次，随后调节PBS重悬菌液的OD600为0.8。将1mL细菌重悬液加入到含有1mL CaCl2(0.350mol/L)和2mL尿素(3mol/L)的混合反应体系溶液。在30℃抚育72h后，于25℃，10000rpm条件下，离心5min，收集沉淀。沉淀在50℃条件下烘干24h后称重，用沉淀物的重量来评估沉淀能力。
沉淀孵育3h时，不同处理的沉淀重量相近，处于0.0151-0.0173g范围内(图5)。至6h，Zn处理组的沉淀量最大，为0.0341g，较位于第二的Control组高10.11％。添加碳酸酐酶抑制剂ACZ或脲酶抑制剂乙酰羟肟酸AHA后，沉淀量仅分别为0.0270和0.0265g。在Zn同时存在时，ACZ与AHA对沉淀速率的抑制减小，Zn+ACZ和Zn+AHA处理的沉淀量分别为0.0289和0.0292g。理论最大碳酸盐沉淀量为0.035g，不同处理组至第9h时均已接近最大沉淀量(97.81％-99.05％)。
以上结果表明，Zn元素有利于提升沉淀速率，可能通过提升细胞密度、碳酸酐酶活性和脲酶活性的方式实现。因此，本发明观察到碳酸酐酶对提升MICP效率的重要性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于巴氏八叠芽孢球菌培养的培养基，其特征在于，每升所述培养基中包括2-6g的工业级酵母浸粉，6-14g的工业级骨蛋白胨，2-5g的工业级尿素，3.0-6.0g的氯化钠，0.5-2.0g的磷酸氢二钾，18-25g的三水合磷酸铵，0.1mM-0.3mM的镍源和0.016mM-0.04mM的锌源，所述培养基的pH为7.2-7.6。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述镍源选自氯化镍、硫酸镍、硝酸镍和碳酸镍中的至少一种；
优选地，每升所述培养基中包括0.015-0.035g的无水氯化镍。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述锌源选自无机锌和/或有机锌；
优选地，所述无机锌选自氯化锌、硫酸锌、硝酸锌和碳酸锌中的至少一种；
优选地，所述有机锌选自醋酸锌、乳酸锌和天门冬氨酸锌中的至少一种；
优选地，每升所述培养基中包括0.004-0.01g的乳酸锌。
4.一种高MICP效率的巴氏八叠芽孢球菌的培养方法，其特征在于，其包括：
将巴氏八叠芽孢球菌接种于权利要求1-3任一项所述的培养基中，在27-37℃下培养。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述培养是在150-200rpm下进行培养。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，在150-200rpm下培养20-26h。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，150-200rpm下培养结束后还包括二次培养，所述二次培养是指：接种所述培养基中的菌液至新的所述培养基中进行二次培养，27-37℃条件下在150-200rpm培养16-40h。
8.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述巴氏八叠芽孢球菌为保藏编号为CGMCC NO.24089的菌株或其培养物。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述培养物为选自所述巴氏八叠芽孢球菌的浓缩物、干燥物、液态物和稀释物中的至少一种。
10.一种提升微生物诱导碳酸钙沉积效率的方法，其特征在于，其包括如下步骤：将经过权利要求4-7任一项所述的培养方法培养的巴氏八叠芽孢球菌培养物、生物成矿体系试剂混合，所述生物成矿体系试剂包括尿素和氯化钙。
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