KR20170006330A - 요소분해효소 생산능을 가지는 스포로사르시나 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents
요소분해효소 생산능을 가지는 스포로사르시나 속 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20170006330A KR20170006330A KR1020150096594A KR20150096594A KR20170006330A KR 20170006330 A KR20170006330 A KR 20170006330A KR 1020150096594 A KR1020150096594 A KR 1020150096594A KR 20150096594 A KR20150096594 A KR 20150096594A KR 20170006330 A KR20170006330 A KR 20170006330A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- soil
- strain
- urease
- sporosarcina
- calcium
- Prior art date
Links
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 241000246348 Sporosarcina sp. Species 0.000 title abstract description 14
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract description 113
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 56
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 claims description 43
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 28
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 13
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 12
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 claims description 9
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 claims description 6
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 claims 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 11
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 7
- 241000193395 Sporosarcina pasteurii Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 235000019738 Limestone Nutrition 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 239000006028 limestone Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000011133 lead Substances 0.000 description 4
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- RSAZYXZUJROYKR-UHFFFAOYSA-N indophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=CC(=O)C=C1 RSAZYXZUJROYKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000003723 Smelting Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000186547 Sporosarcina Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- KKVFPVZIZAJCBZ-UHFFFAOYSA-N (2-hydroxyphenyl) hypochlorite Chemical compound OC1=CC=CC=C1OCl KKVFPVZIZAJCBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229910021532 Calcite Inorganic materials 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100175482 Glycine max CG-3 gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000099340 Virgibacillus sp. Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910001748 carbonate mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 229910052570 clay Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052745 lead Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960002460 nitroprusside Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- FWFGVMYFCODZRD-UHFFFAOYSA-N oxidanium;hydrogen sulfate Chemical compound O.OS(O)(=O)=O FWFGVMYFCODZRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003900 soil pollution Methods 0.000 description 1
- 239000003583 soil stabilizing agent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09B—DISPOSAL OF SOLID WASTE NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- B09B3/00—Destroying solid waste or transforming solid waste into something useful or harmless
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
- C12Y305/01005—Urease (3.5.1.5)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
Abstract
본 발명은 스포로사르시나 속 신규 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 스포로사르시나 속 KM-01(Sporosorcina sp. KM-01) 균주는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 요소분해효소를 생산할 수 있다.
또한 본 발명에서는 스포로사르시나 속 KM-01 균주를 활성 성분으로 하는 이토양오염 복원용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 스포로사르시나 속 KM-01 균주를 토양에 접종하고 요소를 공급함으로써 산성토양의 중화, 중금속 오염토양의 안정화 및 토양 고결화 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 스포로사르시나 속 KM-01(Sporosorcina sp. KM-01) 균주는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 요소분해효소를 생산할 수 있다.
또한 본 발명에서는 스포로사르시나 속 KM-01 균주를 활성 성분으로 하는 이토양오염 복원용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 스포로사르시나 속 KM-01 균주를 토양에 접종하고 요소를 공급함으로써 산성토양의 중화, 중금속 오염토양의 안정화 및 토양 고결화 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 중금속 오염 토양의 생화학적 정화를 위한 요소분해효소 생산 미생물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 요소와 칼슘이 포함되어 있는 토양에서 요소분해효소를 생산할 수 있는 신규한 스포로사르시나 속 균주 및 이의 토양 복원 용도에 관한 것이다.
국내에 산재해 있는 폐광산지역은 채광, 선광, 제련과정 등의 광산활동 후 적절한 환경오염 처리가 되지 않고 장기간 방치되고 있다. 휴/폐광산 지역에서는 채굴적으로부터 발생된 산성광산배수의 배출, 강수에 의해 광산폐기물 유실 및 광산폐기물로부터의 분진 확산 등으로 인하여 토양 및 하천 수계에 오염이 심각하게 나타나고 있다. 특히 금속 광산 지역에서는 비소, 카드뮴, 구리, 납, 알루미늄 등의 오염도가 높은 것으로 보고되고 있으며, 전체 폐광 지역 중에서 대략 50% 이상에서 주변의 토양오염도가 우려 기준을 초과하고 있다.
이렇게 중금속으로 오염된 토양을 복원하기 위하여, 석회석(CaCO3), 소석회 (Ca(OH)2)등의 알칼리 재료와 Fe, Al, Mn 등의 금속산화물, 점토, 인산염, 퇴비, Red mud(적토), 슬러지(alum sludge) 등을 토양 안정화제로 활용하여 산성 토양을 중화 및 개량하고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 있다. 위 재료들 중에서 특히 탄산염 광물(ex:석회석)은 산화작용에 따른 산성화 반응에 대해 완충 효과가 있어 오염 토양의 pH를 높이고, 금속이온들을 산화물 또는 수산화황산염 형태로 침전시킬 수 있다. 이에 산성을 띠며 중금속으로 오염된 토양에서는 중화제 및 중금속 안정화제로서 탄산칼슘이 널리 사용되고 있다.
종래에는 탄산칼슘을 주성분으로 하는 석회석을 직접 오염토양에 포설하는 방식으로 토양 복원이 이루어져 왔지만, 최근에는 석회석을 직접 포설하는 것이 아니라 요소와 함께 생화학적 제재인 요소분해효소(우레아제)를 주입하여 우레아제의 반응에 의하여 요소로부터 탄산이온을 발생시키고 토양 내 칼슘 이온이 탄산과 반응하여 탄산칼슘이 석출되도록 하는 방안이 연구되고 있다. 우레아제를 사용하는 생화학적 방법은 석회석을 직접 포설하는 방식에 비하여 지속성이 보장되어 효과적이다. 그러나 이러한 생화학적 방식도 요소와 함께 우레아제를 주기적으로 공급해줘야 할 뿐만 아니라, 식물로부터 우레아제를 추출하는 공정이 경제적이지 않다는 문제점이 지적되고 있다.
본 발명의 목적은 요소분해효소를 생성할 수 있는 스포로사르시나 속 KM-01 균주의 신규한 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 스포로사르시나 속 KM-01의 다양한 용도를 제공하는 것이다. 즉, 스포로사르시나 속 KM-01을 함유하는 토양오염복원용 조성물 및 이를 접종하여 중금속 오염토양 및 산성 토양을 생화학적으로 복원하는 방법을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있는 스포로사르시나 속 KM-01 균주(Sporosarcina pasteurii KM-01)를 제공한다. 이 균주는 KCTC(Korea Collection for Type Cultures)에 Accession number KCTC 12800BP로 등록되어 있다. 본 발명에 따른 스포로사르시나 속 균주는 폐광산 지역의 산성을 띠며 중금속으로 오염된 토양으로부터 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 스포로사르시나 속 균주는 요소가 존재하는 환경에서 우레아제를 생성하며, 우레아제는 토양 내 요소를 가수분해하여 탄산염과 암모늄을 발생시킨다. 탄산염은 토양 내 칼슘과 반응하여 탄산칼슘을 석출시키고, 탄산칼슘이 석출되는 과정에서 토양 내 중금속은 탄산칼슘에 흡착되거나 공침되어 이동성이 현저하게 저하되어 오염물의 확산이 방지된다. 또한, 요소의 가수분해에 의해 발생되는 암모늄 이온은 토양의 pH를 상승시켜 산성 토양을 중화시킬 수 있다. 더욱이, 본 발명의 생화학적 작용에 의해서 생성된 탄산칼슘은 토양 내 공극을 메움으로써 토양을 고결화시켜 지반을 안정화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 관점에서, 상기 스포로사르시나 속 균주를 활성 성분으로 함유하는 중금속 오염토양 복원용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 스포로사르시나 속 균주를 요소와 함께 중금속으로 오염된 토양에 접종하면 토양 내 중금속이 안정화되어 이동성을 저하시킬 수 있으며, 토양을 고결화시켜 토양 유실을 방지할 수 있다. 더욱이, 토양이 산성인 경우 토양을 중화시킬 수 있다.
본 발명은 대사작용에 의하여 우레아제를 생성할 수 있는 스포로사르시나 속 KM-01 균주의 발견 및 이의 용도에 관한 것으로, 위 균주로부터 생성된 우레아제는 요소를 가수분해하여 생성되는 탄산과 토양 내 칼슘과 반응함으로써 토양에 탄산칼슘을 석출시킬 수 있다.
탄산칼슘이 석출되는 과정에서 중금속은 탄산칼슘 내에 흡착 및 공침되어 이동도가 저하되므로 중금속이 안정화될 뿐만 아니라, 탄산칼슘은 토양 내 공극을 메워 토양을 고결화 함으로써 토양 유실이 방지되고 지반이 강화된다는 이점이 있다.
또한, 우레아제에 의해 요소가 분해되는 과정에서 발생하는 암모늄 이온은 토양의 pH를 증가시켜 산성 토양을 중화시킬 수 있다.
도 1은 본 연구진이 분리한 3개 균주에 대한 phylogenetic Tree를 작성한 결과이다.
도 2는 토양시료 내 중금속의 농도, 토양시료의 pH 및 EC를 나타낸 표이다.
도 3은 본 연구진이 분리한 3개 균주의 생육도 확인실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 연구진이 분리한 3개의 균주와 Sporosarcina pasteurii 표준 균주에 대한 우레아제 활성을 실험한 결과 그래프이다.
도 5는 본 연구진이 분리한 3개 균주로부터 생성되는 우레아제에 의해 생성된 CaCO3를 전자현미경(SEM)으로 촬영한 사진 및 EDS 원소 분석 결과를 나타낸 표이다.
도 6은 SEM-EDS 분석한 시료 침전물을 대상으로 시간에 따른 무게의 변화를 측정한 그래프이다.
도 2는 토양시료 내 중금속의 농도, 토양시료의 pH 및 EC를 나타낸 표이다.
도 3은 본 연구진이 분리한 3개 균주의 생육도 확인실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 연구진이 분리한 3개의 균주와 Sporosarcina pasteurii 표준 균주에 대한 우레아제 활성을 실험한 결과 그래프이다.
도 5는 본 연구진이 분리한 3개 균주로부터 생성되는 우레아제에 의해 생성된 CaCO3를 전자현미경(SEM)으로 촬영한 사진 및 EDS 원소 분석 결과를 나타낸 표이다.
도 6은 SEM-EDS 분석한 시료 침전물을 대상으로 시간에 따른 무게의 변화를 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 요소분해효소(우레아제) 생성할 수 있는 신규한 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규한 균주는 중금속으로 오염된 지역, 예컨대 폐광산 지역 토양 유래일 수 있고, 형태학적 특징, 대사 활성, 생리적 특징 및 16S rRNA 서열분석을 통한 분자생물학적 동정 결과, 스포로사르시나(Sporosarcina) 속 종균임이 밝혀졌다. 본 발명의 균주는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진다.
본 발명에서는 이 신규한 균주를 스포로사르시나 속 KM-01(Sporosarcina sp. KM-01)이라 명명하고, KCTC(Korea Collection for Type Cultures)에 서열번호 1의 정보를 등록하였다(Sporosarcina pasteurii KM-01, Accession number KCTC 12800BP). 이하에서는 Sporosarcina pasteurii KM-01 균주를 스포로사르시나 속 균주로 칭하기로 한다.
본 발명에 따른 스포로사르시나 속 KM-01 균주는 중금속으로 오염된 폐광산 지역의 토양을 채취하고 우레아 배지에 넣고 배양한 후, 균주로부터 단일 콜로니로 분리하여 순수 배양할 수 있다.
본 발명에 의한 균주는 3가지 용도로 사용된다. 즉, 토양 내 중금속의 이동성 저하를 통한 안정화, 토양의 고결화를 통한 지반 강화 및 토양유실방지, 그리고 산성 토양의 중화의 3가지 목적을 갖는다.
위의 세 가지 목적은 탄산칼슘 석출을 통해 이루어진다. 뒤에서 자세히 설명하겠지만, 본 발명에 의한 스로포사르시나 속 KM-01 균주는 요소가 존재하는 환경에서 우레아제를 생성하여 요소를 탄산이온과 암모늄이온으로 가수분해한다. 탄산이온은 토양 내 칼슘이온과 반응하여 탄산칼슘을 석출시킨다.
첫 번째 목적인 중금속의 안정화와 두 번째 목적인 지반 강화는 탄산칼슘이 석출되는 과정에서 이루어진다. 즉, 탄산칼슘이 석출되면서 미세 입도를 가지는 중금속은 탄산칼슘 내에 공침되거나 흡착되어 안정화된다. 여기서, '안정화'란 우수나 갱내 침출수 등 산성을 띠는 물에 의하여 용해되어 이동될 가능성이 현저히 저하된다는 것을 의미한다. 또한 탄산칼슘은 토양 내 공극을 메워 토양의 강도를 증대시킴으로써 토양이 고결화된다. 이를 통해 지반이 안정화되며 토양 유실을 방지할 수 있다. 토양 유실이 방지된다는 것은 중금속의 이동을 저하시키는 측면에서도 의미가 있다. 그리고 마지막 목적인 산성 토양의 중화는 요소의 가수분해 산물인 암모늄 이온에 의하여 이루어진다. 암모늄 이온은 염기성을 띠어 토양의 pH를 높인다. 암모늄 이온에 의해 토양의 pH가 증가하면 부수적으로 탄산칼슘 석출반응이 촉진되는 효과도 수반한다.
본 발명에 의한 균주에 의하여 안정화되는 중금속은 망간, 비소, 아연, 구리, 납 등을 포함하며, 이 외에도 다양한 중금속이 포함될 수 있다. 앞에서 기술한 바와 같이 중금속의 안정화는 탄산칼슘 석출반응에서 중금속의 공침 및 흡착을 의미하므로 중금속의 종류에 크게 구애받지 않고 다양한 중금속에 대하여 적용될 수 있다.
특히 본 발명에서는 KM-01 균주를 활성 성분으로 함유하는 오염토양 복원용 조성물을 제공한다. 또한, 오염토양 복원용 조성물에는 요소 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 복원하고자 하는 오염토양에 요소가 충분한 조건이라면 위 균주 단독으로 조성물로 사용하고 토양 내 요소를 이용하면 되지만, 토양에 따라 요소가 포함되어 있지 않다면 요소를 추가하는 것이 바람직하다. 또한, 대부분의 토양에는 칼슘원이 포함되어 있는 것이 일반적이지만, 칼슘원이 없는 경우라면 오염토양 복원용 조성물에 칼슘원도 추가할 수 있다.
이하에서는 본 발명에 이르게 된 경위와 실시예에 대하여 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
토양에 존재하는 일부 미생물은 요소와 칼슘이 존재하는 환경에서 우레아제(urease,요소분해효소)를 유도하여 그 주변에 탄산칼슘과 같은 광물질을 생성하게 된다. 즉, 미생물은 대사활동에 의해 우레아제를 생성하고, 우레아제는 아래의 식(1)과 같이 1mole의 요소를 가수분해하여 2mole의 암모늄 이온과 1mole의 탄산이온을 발생시킨다. 그리고 탄산 이온은 아래의 식(2)와 같이 토양 내 존재하는 칼슘원(ex: 염화칼슘)으로부터 공급된 칼슘 이온과 함께 탄산칼슘을 침전시키는 반응(MICP, Microbially Induced Calcite Precipitation)을 일으킨다.
CO(NH2)2 + 2H2O → 2NH4 + + CO3 2-... 식(1)
Ca2 + + CO3 2- → CaCO3(s)... 식(2)
우레아제는 식물과 일부 박테리아에서 발견되고 있으며, 특히 박테리아 우레아제는 자연 생태계에서 농경지의 질소순환 또는 반추동물의 질소 대사와 같은 질소화합물의 환경적 변환에 주요역할을 담당하는 것으로 보고되고 있다. 박테리아 우레아제 유전자는 구조적 배열이 매우 유사한 형태의 7개 이상의 유전자로 구성되어 있으며, 구조단백질 (UreA, UreB 및 UreC)과 보조단백질 (UreD, UreE, UreF 및 UreG)로 나뉜다. 구조단백질은 효소활성에 중심역할을 담당하며 보조단백질은 구조단백질에 Ni2 +를 운반 및 조합을 담당한다. 일반적으로 박테리아 우레아제는 200~250 kD의 분자량을 나타낸다.
본 발명의 연구진은 종래기술과 같이 우레아제를 식물로부터 추출하여 공급하는 방식이 아니라, 우레아제를 생성할 수 있는 박테리아를 제공하여 오염 토양에 접종함으로써 지속적이고 안정적인 토양 복원이 이루어질 수 있도록 하였다. 우레아제를 생성할 수 있는 박테리아가 오염 토양에서도 활성이 유지될 수 있어야 하므로, 우레아제 생성능을 가지는 미생물을 오염 토양으로부터 분리하는 것을 목적으로 삼았다.
이에 따라 본 발명의 연구진은 폐광산 지역의 오염 토양 내에 존재하는 우레아제 활성이 강한 균주를 선별하여 이들의 미생물학적 특성과 생화학적 활성을 조사 및 관찰하였다.
1. 실험 과정
(1) 균주의 분리동정 및 생육도 확인
박테리아 균주 분리를 위해 부산에 위치한 폐금속 광산 갱구 주변 토양 30 g을 멸균된 Falcon tube에 채취하였다. 본 연구에서 우레아제 생성 박테리아를 분리 및 동정하기 위해 배지는 Urea배지(2% Yeast extract, 1% NH4Cl, 0.3% NaCl, 2% Urea)를 사용하였고, 고체 배지로는 1.5% Agar를 함유한 Urea 배지를 사용하였다. 채취한 시료들로부터 우레아제를 생성하는 균주를 분리하기 위해 99 mL Urea 액체배지에 채취 토양을 1 g을 넣어 Shaking incubator (160rpm, 28°C)에서 48시간 동안 현탁하였고, 현탁액을 20 mM Phosphate buffer (pH 7.0)로 희석하여 Urea 고체배지에 도말한 후 28°C에서 24시간 정치 배양하였다. 약 20 종의 다양한 집락을 Urea 고체 배지에 접종한 후 균주를 각각 순수분리 하였다. 이 중에서 우레아제의 Activity를 가지는 균주들을 순수 분리하여 얻은 colony를 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 이때 primer는 518F (5‘-CCA GCA GCCGCG GTA ATA CG-3’)와 800R (5‘-TAC CAG GGT ATC TAATCC-3’)을 사용하였고, 분석된 염기서열은 'The National Center for Biotechnology Information (NCBI)'의 'Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)' 알고리즘을 통해 'Gene Bank database'와 비교하여 분리된 미생물을 동정하였다. 분석된 16S rRNA gene 염기서열은 'Bioedit (Ver. 7.0)'을 이용해 정렬하였고, Phylogenetic analysis에 사용한 16S rRNA gene sequence 는 NCBI data base에 근거하였으며, Phylogenetic tree는 MEGA (Ver.6.0) 프로그램을 이용하여 'neighbor-joining method'를 사용하여 1,000번의 bootstrap analysis를 진행하여 미생물의 종 유연성 분석을 하였다. 또한, 분리 균주의 생육도를 확인하기 위하여 Urea 액체배지 100 mL에 전배양한 균을 5μL 접종하여 Shaking incubator (28°C, 160 rpm) 에서 진탕배양하였다. 배양 동안에 0, 4, 8, 12, 24, 30, 36, 48, 60, 72시간 배양액을 1 mL 취하여 분광광도계 (DR/4000U spectrophotometer,HACH)로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(2) 균주 분리토양 특성 및 오염도 분석
균주 분리를 위해 채취한 광산지역 토양 내 중금속 오염농도를 확인하기 위하여 왕수 추출법을 통한 토양 내 중금속 함량을 측정하였다. 중금속 함량을 확인하기 위한 실험에는 건조하여 2 mm 체거름한 토양을 사용하였다. 250 mL 반응용기에 토양 3g, 35% HCl 21 mL, 70% HNO3 7 mL을 가한 후 흡수용기에 0.5 M HNO3 15 mL을 첨가하고 흡수용기와 환류냉각관을 반응용기에 연결시켜 유기물이 천천히 산화되도록 2시간 동안 상태를 유지시킨다. 그리고 온도를 서서히 올려 환류조건에 도달하도록 하여 2시간 동안 상태를 유지시키고, 분해가 끝난 후 반응용기를 냉각시켰다. 흡수용기 내 내용물을 환류냉각관을 통하여 반응용기에 첨가하였는데 흡수용기와 환류냉각관을 0.5 M HNO3로 세척하여 반응용기에 넣었다.
'Whatman' No. 40 여과지로 100 mL 부피 플라스크에 여과하고 불용성 잔류물을 여과지 위에서 최소량의 0.5M HNO3를 이용하여 세척한 후 0.5M HNO3로 100 mL까지 채워 냉장보관 하였다. 이렇게 준비된 분석시료는 증류수를 이용하여 희석한 후 ICP-AES (Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometer, ULTIMA2, Horiba)로 분석하였다. 또한 균주 분리를 위해 사용한 토양의 특성 분석을 실시하였다. 50 mL 원심분리 튜브에 토양 4 g과 3차 증류수 40 mL를 첨가하여 150 rpm에서 6시간 동안 진탕하였다. 반응 후, 3분간 2000 rpm으로 원심분리하였고, 상등액을 0.45 μm membrane filter를 이용하여 여과한 용액을 얻어 pH/COND METER (D-54, Horiba)를 사용하여 pH와 EC (Electric Conductivity)를 측정하였다.
(3) 분리균주의 우레아제 활성 측정
분리한 박테리아 균주들의 우레아제 활성을 측정하기 위해 Urea 액체배지 100 mL에 전배양한 균을 접종하여 28°C에서 160 rpm으로 72시간 동안 진탕 배양하였다. 균체는 10분간 원심분리 (4°C, 7,000ⅹg)하여 얻었으며, Pellet washing을 50 mM sodium phosphate(pH 7.5)로 2회 실시한 후 Lysis buffer (50 mM sodium phosphate-1 mM EDTA, pH 7.5)로 균체를 현탁하였다. 현탁한 균체를 Sonicator (Analog Sonifier Model-450, BRANSON)로 Output control 3, Duty cycle 70으로 설정하여 10분간 균체를 파괴하였다. 파괴한 균체를 20분간 원심분리 (4°C,10,000ⅹg)하여 얻은 상등액을 우레아제 활성 측정용 반응액으로 사용하였다. 우레아제 활성측정을 위한 암모니아 함량의 분석은 'Weatherburn'의 indophenol법을 사용하였는데, 암모니아가 phenol-hypochlorite와 반응하여 생성된 indophenol이 나타나는 발색정도를 630 nm에서 흡광도를 측정하였다. 우레아제 반응은 10 mM Urea solution 3 mL과 반응액 10 μL를 첨가하여 섞어준 후 30°C에서 5분간 반응시켰다. 효소반응액에 2 mL phenol-nitroprusside와 2 mL alkaline hypochlorite를 첨가하여 60°C에 10분간 중탕하여 반응을 중지한 후에 630 nm에서 흡광도를 측정하였다. 우레아제 활성도는 준비된 NH4Cl 희석 용액으로부터 얻어진 표준곡선을 통하여 정량 분석하였다. 우레아제 활성의 1 unit은 urea를 기질로 하여 매 분당 1 μmol의 urea를 가수 분해 하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
(4) CaCO3 생성능 확인
분리 균주들에 의해 생성된 CaCO3 침전물의 확인을 위해 Urea 액체배지 400 mL에 전배양액 1mL을 접종하여 28°C에서 160 rpm 진탕 배양하였다. 시간별로 침전물 생성량을 비교하기 위하여 배양 12시간마다 총 96시간 동안 배양액 25 mL을 회수하여 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다(4°C, 12,000ⅹg). 이때 얻은 균체와 침전물을 50°C Dry oven에서 24시간 건조하여 보관 후, 꺼내어서 무게를 측정하였다. 생성된 CaCO3 침전물의 형태학적인 확인을 위하여 전자현미경 SEM (Scanning ElectronMicroscope, JSM-7000F, Jeol) 및 EDS (Energy DispersiveSpectrometer) 분석을 실시하였다. 각 시료를 완전히 건조 시킨 후 0.5 cm cube pieces로 제작하고 Platinum sputter 코팅을 통해 관찰하였다.
2. 실험 결과
(1) 우레아제 활성 균주의 분리 및 동정
중금속으로 오염된 폐금속광산 주변 토양으로부터 우레아제 생성 균주를 분리하기 위하여 Urea 액체 및 고체 배지에 접종, 배양한 후 5단계의 Selective enrichment를 통해 나타난 집락을 순수 분리하였다. 총 12개의 집락을 순수 분리하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 분리균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 blast를 통하여 상동성을 검색한 결과, Sporosarcina sp. 7종, Virgibacillus sp. 2종, Bacillus spp. 3종으로 확인되었다. 12개 균주 중 성장속도가 빠르고 상대적으로 양호한 CaCO3 생성능을 나타낸 3개 균주를 선택하여 각각 Sporosarcina sp. KM-01, Sporosarcina sp. KM-07, Sporosarcina sp. KM-12 균주로 명명하였고 'KCTC'에 기탁하였다.
선택된 균주들을 10회 계대배양 한 후 다시 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, 각 균주는 Sporosarcina pasteurii 균주와 각각 98.87% (KM-01), 99.67% (KM-07), 99.21% (KM-12) 의 상동성을 나타내었다. 이들 3개 균주에 대한 phylogenetic Tree를 작성한 결과를 도 1에 나타내었으며, 3개 균주 모두 Sporosarcina paseurii와 상동성이 높게 나타났고, Sprosarcina siberiensis 균주와의 유연성도 높은 것으로 나타났다. 기존 연구에서 CaCO3 생성능을 가지는 균주들은 주로 중금속 혹은 유기물 등 오염물질이 없는 일반 토양에서 주로 분리가 되었으나, 본 연구에서 분리된 박테리아 균주들은 강산성 및 고농도의 중금속으로 오염된 토양에서 분리 및 생존을 확인함으로써 장기간 방치된 다양한 유/무기 물질들과 계속되는 풍화 작용에 의해 특이적 생존 및 진화가 이루어졌음을 예상할 수 있으며, 토양 미생물의 다양성을 보여주는 예라고 할 수 있다.
(2) 균주 분리토양 특성 및 오염도 분석
채취한 폐광산 지역 토양 내 중금속 오염도를 확인하기 위해 채취한 토양 시료를 전처리 후, ICP-AES 분석을 통해 중금속에 대한 정성 및 정량 분석을 수행하였다. 그 결과 수 종의 중금속들이 검출 되었는데, 비교적 높은 농도로 분류되는 10 mg kg-1을 초과하는 종들은 Mn (170.50 mg kg-1), As (114.05 mg kg-1), Zn (92.07 mg kg-1), Cu (62.44 mg kg-1), Pb (40. mg kg-1)등이었다(도 2의 표 참고). 상기한 모든 중금속 종이 모두 40 mgkg-1을 상회하는 농도로 극심한 중금속 오염 토양임을 확인할 수 있었고, 특히 Mn 과 As 등의 경우에는 100 mg kg-1을 초과하여 고농도의 오염도를 나타내는 전형적인 폐금속 광산 토양임을 알 수 있다. 본 분석 결과와 같이 휴폐광산지역 내 토양은 As의 오염이 두드러지는 경우가 많으며, 제련 등의 과정에서 발생하는 광미가 유실되고 갱내수 등의 유출로 Mn, Zn, Pb, Cu, Cd 등의 중금속으로 오염되어 있는 경우가 발생한다.
따라서, 본 연구에서 분리한 우레아제 활성 균주들은 탄산칼슘 침전능 뿐만 아니라 여러 중금속에 대한 내성도 가지고 있을 것으로 예상할 수 있어서 향후 이와 같은 형태의 오염 토양 복원 시 다양한 분야로 확대 적용할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 토양의 특성분석을 위하여 pH와 EC를 측정하였다. 그 결과 토양의 pH가 2.66 으로 강산성 토양임을 확인 할 수 있었고 EC 측정 결과도 우리나라 농경지보다는 더 높은 값을 나타내어 광화된 상태의 토양임을 알 수 있었다(도 2의 표 참고). pH와 EC 측정 결과 균주 분리 실험에 사용한 토양이 비교적 극한환경의 토양임을 확인할 수 있었다.
(3)분리 균주의 생육도 확인
Sporosarcina sp. KM-01, KM-07, KM-12 균주 등 본 연구에서 분리한 3개 균주의 생장속도의 차이 및 특징을 확인하기 위하여 생육도 확인 실험을 진행하였다. 그 결과 접종 후 8시간 배양까지는 균주 별 생장속도의 차이가 나타나지 않았으나, 12시간 배양 후에는 KM-01 균주가 KM-07, KM-12 균주 대비 보다 빠른 생장 속도를 나타내었고 이후에도 꾸준한 생장을 유지하였다. 반면에, KM-07 균주의 경우에는 KM-01 균주 혹은 KM-12 균주보다는 생장속도가 다소 느리지만 꾸준한 Cell turbidity 값의 증가를 나타내었다(도 3의 그래프 참고). 또한, 본 생육도 확인 실험에서 모든 균주에 대해 전 배양을 통해 접종을 하여 Lag phase가 짧게 빠르게 생장하는 것을 볼 수 있었는데, 이를 실제 오염지역에 응용 연구 시에 이와 같은 특징을 적용하면 중금속 안정화 혹은 지반 안정화에 빠른 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.
균주 별 생육은 도 3의 그래프에 나타낸 바와 같이 접종 후 72시간까지 꾸준히 유지되는 경향을 보이며, 이들의 생장곡선이 감소하는 시간에 반복 접종 등을 통해 해당 활성을 장기간 유지 및 효율을 증대할 수 있을 것으로 기대한다.
(4) 분리균주의 우레아제 활성 측정
폐광산지역 토양으로부터 분리한 박테리아 균주들이 실제로 생화학적 효소 Urease 활성을 갖는지를 직접적으로 확인하기 위해 분리한 Sporosarcina sp. KM-01, KM-07, KM-12 균주들과 비교군으로 표준 균주 Sporosarcina pasteurii KCTC3558 균주를 분양 받아 각각 Crude enzyme extract를 추출하여 우레아제 활성을 Weatherburn의 indophenol법을 사용하여 암모니아 함량을 측정 및 비교하였다. 그 결과, 도 4의 그래프에 나타낸 바와 같이 분리한 균주들의 활성을 나타내는 암모니아 농도가 KM-01 (0.70 mM), KM-07 (0.64 mM), KM-12 (0.53 mM) 등으로 측정이 되었고, 양성 대조군으로 비교한 표준 균주 Sporosarcina pasteurii KCTC3558의 경우에는 0.72 mM로 분리한 균주들과 유사한 값의 정도를 나타내었다. 특히, KM-01 균주의 경우에는 비교 균주 Sporosarcina pasteurii KCTC3558 와 거의 동등한 수준의 활성을 나타내어 상기한 생장곡선 실험 결과와 동일한 경향으로 분리한 균주들 중 가장 높은 활성을 나타내었다. 이는 분리한 균주들이 표준 균주와 비교했을 때에도 생장의 경향성 및 우레아제 활성도 등의 결과와 일치하며, 매우 활성도가 높은 균주임을 확인할 수 있었다.
(5) CaCO3 생성능 확인
폐광산 지역에서 분리한 균주의 CaCO3 침전을 위하여 Urea 배지에 염화칼슘 (Calcium Chloride, CaCl2)를 첨가하여 균을 배양하였다. 균주로부터 생성되는 우레아제에 의해 생성된 CaCO3를 전자현미경 (SEM) 및 EDS 원소 분석 등을 통해 확인하였고(도 5 참고), SEM-EDS 분석한 시료 침전물을 대상으로 해당 무게를 측정하여 3개 균주 모두에서 시간이 지남에 따라 증가하는 경향을 나타내었다(도 6의 그래프 참고). CaCO3 침전 확인을 위해 실시한 SEM-EDS 결과에서 볼 수 있듯이 각 균주 배양 후에 C, O, Ca로만 이루어진 침전물을 확인할 수 있었고 형태학적으로 CaCO3 침전을 관찰할 수 있었다. KM-01 균주는 24시간이 지나면서 침전물 생성량이 급격하게 늘었고, KM-07 균주는 36시간이 되었을 때 침전물의 양이 증가하는 경향을 나타내었다. 반면에, KM-12 균주의 경우에는 KM-01 및 KM-07 균주와 달리 침전물이 급격하게 증가하는 시점이 없이 꾸준하게 침전물 양이 늘어남을 확인하였다. 이를 각 균주의 생장곡선(도 3) 및 Urease 활성 측정 결과 (도 4)과 비교하면, KM-01균주의 활성이 해당 조건에서 가장 활발하게 나타난 것을 확인할 수 있다. 또한, 96시간 이후에 침전물의 양이 감소하는 것은 배지에 첨가된 칼슘원 및 영양의 고갈로 인해 균주들의 우레아제 활성 감소로 인한 것으로 예측된다. 따라서, 고농도의 중금속으로 오염된 폐광산지역 토양에서 분리한 3개의 균주가 칼슘원으로 사용한 CaCl2와 우레아제 작용에 의하여 CaCO3 침전물을 생성할 수 있음을 확인하였다.
본 연구에서 분리한 박테리아 균주들의 활성을 활용하여 향후 중금속으로 오염된 휴/폐광산 지역 등의 토양 복원에 생화학적인 반응을 적용한 복원 연구에 유용하게 활용되기를 기대한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF GEOSCIENCE AND MINERAL RESOURCES
<120> Sporosarcina sp. having a capability of producing urease and the
Use thereof
<130> 2015P313
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1481
<212> RNA
<213> Sporosarcina sp.
<400> 1
caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgaacaga tgaggagctt 60
gctcctctga cgttagcggc ggatgggtga gtaacacgtg ggcaacctgc cctgtagttg 120
gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cgaataatta gtttcttcgc atgaaggaac 180
tctgaaagac ggctatgctg tcactacagg atgggcccgc ggcgcattag ctagttggtg 240
gggtaatggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300
gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg 360
acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gcgaagaagg ttttcggatc gtaaagctct 420
gttgtgaggg aagaacaagt acaggagtaa ctgtctgtac cttgacggta cctcattaga 480
aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540
gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gccttttaag tctgatgtga aagcccacgg 600
cttaaccgtg gaaggtcatt ggaaactgga aggcttgagt acagaagagg aaagcggaat 660
tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctt 720
tctggtctgt aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 780
tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc 840
tggagcaaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag 900
gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag 960
aaccttacca ggtcttgaca tcccgctgac cggtatagag atataccttt cccttcgggg 1020
acagcggtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080
tcccgtaacg agcgcaaccc ttgaccttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt 1140
gactgccggt gataaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200
acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacagaggg ttgccaaccc gcgaggggga 1260
gctaatccca taaaaccatt cccagttcgg attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc 1320
aggaatcgct agtaatcgtg gatcagcatg ccacggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac 1380
accccgcccg tcacaccacg gagagtttgt aacacccgga agtcggtggg ggtaaccctt 1440
tttgggagcc agccccccaa aggtgggaca aaatgattgg g 1481
Claims (10)
- 요소분해효소를 생산할 수 있는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 스포로사르시나 속 KM-01(Sporosorcina pasteurii KM-01) 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 스포로사르시나 속 균주는 폐광산 지역의 중금속 오염 토양으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 균주. - 제1항에 있어서,
상기 스포로사르시나 속 균주는 폐광산 지역의 산성 토양으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 균주. - 제1항의 스포로사르시나 속 균주를 활성 성분으로 함유하는 오염토양 복원용 조성물.
- 제4항에 있어서,
요소를 공급할 수 있는 요소공급원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 오염토양 복원용 조성물. - 제4항에 있어서,
칼슘을 공급할 수 있는 칼슘공급원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 오염토양 복원용 조성물. - 제1항의 스포로사르시나 속 균주를 중금속으로 오염된 토양에 접종하여,
상기 균주에 의해서 발생된 우레아제의 작용에 의하여 토양 내 요소를 가수분해하여 탄산이온을 발생시키고, 상기 탄산이온과 토양 내 칼슘이온이 반응하여 탄산칼슘이 석출되게 함으로써,
상기 토양 내 중금속을 안정화시키는 것을 특징으로 하는 중금속 오염토양 안정화방법. - 제7항에 있어서,
상기 토양 내 공극을 상기 탄산칼슘이 메움으로써 상기 토양이 고결화되는 것을 특징으로 하는 중금속 오염토양 안정화방법. - 제7항에 있어서,
상기 토양 내 요소는 미리 토양에 살포하는 것을 특징으로 하는 중금속 오염토양 안정화방법. - 제1항의 스포로사르시나 속 균주를 산성 토양에 접종하여,
상기 균주에 의해서 발생된 우레아제의 작용에 의하여 토양 내 요소를 가수분해하여 암모늄 이온을 발생시키고, 상기 암모늄 이온에 의하여 상기 토양의 산도를 감소시키는 것을 특징으로 하는 산성토양 중화방법.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150096594A KR20170006330A (ko) | 2015-07-07 | 2015-07-07 | 요소분해효소 생산능을 가지는 스포로사르시나 속 균주 및 이의 용도 |
| AU2016100971A AU2016100971A4 (en) | 2015-07-07 | 2016-06-30 | Method for remediating contaminated soil using microorganism strain having ability to produce urease |
| US15/203,034 US9821354B2 (en) | 2015-07-07 | 2016-07-06 | Method for remediating contaminated soil using microorganism strain having ability to produce urease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150096594A KR20170006330A (ko) | 2015-07-07 | 2015-07-07 | 요소분해효소 생산능을 가지는 스포로사르시나 속 균주 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170006330A true KR20170006330A (ko) | 2017-01-18 |
Family
ID=57992648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150096594A KR20170006330A (ko) | 2015-07-07 | 2015-07-07 | 요소분해효소 생산능을 가지는 스포로사르시나 속 균주 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20170006330A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114107090A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-03-01 | 广东以色列理工学院 | 一种生化复合材料及其制备方法和应用 |
| CN117286071A (zh) * | 2023-10-17 | 2023-12-26 | 四川大学 | 一种培养基以及巴氏八叠芽孢球菌的培养方法 |
-
2015
- 2015-07-07 KR KR1020150096594A patent/KR20170006330A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114107090A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-03-01 | 广东以色列理工学院 | 一种生化复合材料及其制备方法和应用 |
| CN114107090B (zh) * | 2021-10-26 | 2023-11-24 | 广东以色列理工学院 | 一种生化复合材料及其制备方法和应用 |
| CN117286071A (zh) * | 2023-10-17 | 2023-12-26 | 四川大学 | 一种培养基以及巴氏八叠芽孢球菌的培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2016100971A4 (en) | Method for remediating contaminated soil using microorganism strain having ability to produce urease | |
| Li et al. | Heavy metal removal by biomineralization of urease producing bacteria isolated from soil | |
| Kang et al. | Bioremediation of lead by ureolytic bacteria isolated from soil at abandoned metal mines in South Korea | |
| Achal et al. | Remediation of copper-contaminated soil by Kocuria flava CR1, based on microbially induced calcite precipitation | |
| Zhao et al. | Rahnella sp. LRP3 induces phosphate precipitation of Cu (II) and its role in copper-contaminated soil remediation | |
| Govarthanan et al. | Significance of autochthonous Bacillus sp. KK1 on biomineralization of lead in mine tailings | |
| Zhang et al. | Removal of lead from acidic wastewater by bio-mineralized bacteria with pH self-regulation | |
| Govarthanan et al. | Lead biotransformation potential of allochthonous Bacillus sp. SKK11 with sesame oil cake extract in mine soil | |
| Cuaxinque-Flores et al. | Bioimmobilization of toxic metals by precipitation of carbonates using Sporosarcina luteola: An in vitro study and application to sulfide-bearing tailings | |
| García | Characterization of bacterial diversity associated with calcareous deposits and drip-waters, and isolation of calcifying bacteria from two Colombian mines | |
| Do et al. | A psychrotolerant Ni-resistant Bacillus cereus D2 induces carbonate precipitation of nickel at low temperature | |
| Kang et al. | Biosequestration of copper by bacteria isolated from an abandoned mine by using microbially induced calcite precipitation | |
| Queiroz et al. | Rich growth medium promotes an increased on Mn (II) removal and manganese oxide production by Serratia marcescens strains isolates from wastewater | |
| Peng et al. | Manganese enhances the immobilization of trace cadmium from irrigation water in biological soil crust | |
| Wei et al. | Study on the performance of carbonate-mineralized bacteria combined with eggshell for immobilizing Pb and Cd in water and soil | |
| JP2018527181A (ja) | 重金属で汚染された地質材料の常在性微生物によるバイオレメディエーション | |
| Zhang et al. | Reducing cadmium bioavailability and accumulation in vegetable by an alkalizing bacterial strain | |
| Zhao et al. | Effect of the reduction–mineralization synergistic mechanism of Bacillus on the remediation of hexavalent chromium | |
| Karamba et al. | Isolation, screening and characterisation of cyanide-degrading Serratia marcescens strain aq07 | |
| Rajasekar et al. | Biomineralisation performance of bacteria isolated from a landfill in China | |
| Karnachuk et al. | Bacteria of the sulfur cycle in the sediments of gold mine tailings, Kuznetsk Basin, Russia | |
| Kanekar et al. | Alkaline Lonar lake, India–a treasure of alkaliphilic and halophilic bacteria | |
| KR20170006330A (ko) | 요소분해효소 생산능을 가지는 스포로사르시나 속 균주 및 이의 용도 | |
| KR20170006331A (ko) | 요소분해효소 생산능을 가지는 스포로사르시나 속 파스테우리 균주 및 이의 용도 | |
| Rakhmawati et al. | Thermophilic bacteria isolated from Mount Merapi, Java, Indonesia as a potential lead bioremediation agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |