CN104893999B - 一种肠杆菌及其在降解木质素中的应用 - Google Patents

一种肠杆菌及其在降解木质素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肠杆菌及其在降解木质素中的应用，属于微生物技术领域。本发明提供一种肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C，于2014年3月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.8941；所述肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C在环保领域中的应用，特别优选所述肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C应用于生物降解木质素，包含以下步骤：将含有木质素的无机盐培养基pH值调至6.0‑8.0，然后将OD600值0.4~0.5（对数增长期）的肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C按体积比10‑40%的接种量接种，于25‑37℃进行反应；肠杆菌YC105C是首次从圆唇散白蚁内筛选出的可高效降解木质素的肠杆菌（Enterobacter sp.）。肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C对木质素的降解率可达90‑100%，远高于其他木质素降解菌的木质素降解率。

Description

一种肠杆菌及其在降解木质素中的应用
技术领域
本发明涉及一种肠杆菌及其在降解木质素中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
木质素是一种广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧化苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物，是自然界中在数量上仅次于纤维素的第二大天然高分子材料。木质素由于结构和性质的特殊性，使其在工业、农业、医药方面有广泛的应用。在工业上，可用其制备燃料分散剂、粘合剂、皮革鞣剂、混凝土减水剂和乳化稳定剂；在农业上，可用作植物生长剂、高效氮肥、沙土稳定剂、液体地膜和农药缓释剂；在医药方面，可制造香兰紫、抗菌增效剂TMP、抗炎剂、抗癌剂和兴奋剂等。制浆造纸工业每年从植物中分离出大约1.4亿吨纤维素，同时得到5000万吨左右的木质素副产品。但是超过95%的木质素主要作为工业制浆的废弃物，随废水直接排入江河或浓缩后烧掉。造纸黑液的直接排放造成很大的资源浪费，同时也对环境造成了严重的污染。因此木质素降解研究对经济发展和环境治理保护都具有现实意义。
目前，木质素的降解主要采用理化处理和生物降解。理化处理成本较高，且易造成二次污染。筛选并利用微生物不仅可以缓解环境污染，生产生物能源，还可以通过控制性的解聚，变废为宝，生成有利用价值的芳香族化合物，实现资源再利用。目前，一般认为木质素的完全降解是真菌、细菌和相关微生物群落共同作用的结果，其中真菌起着主要的作用。降解木质素最常见的真菌主要是白腐真菌、褐腐真菌、和软腐真菌，而白腐菌是自然界中最主要的木质素降解菌。目前，研究较多的白腐菌有：黄孢原毛平革菌（Phanerochete chrysosporium）、烟管（Berkandera adjusted）、变色栓菌（Thametes ersicoo）等。除真菌外，细菌也是木质素生物降解过程中的一个重要的参与者。能降解木质素的细菌种类很多，放线菌是降解能力较强的一类细菌，包括链霉菌（Streptomyces）、节杆菌（Arthrobacter）、小单胞菌（Micromonospora）和诺卡式菌（Nocardia）等。能够降解木质素的非丝状细菌主要是不动杆菌（Acinetobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、微球菌属（Micrococcus）、假单胞杆菌（Pesudomonas）和黄单胞杆菌（Xanthomonas）。虽然目前已发现可降解木质素的微生物不少，但降解效率都普遍不高。白蚁作为自然界中可高效降解木质纤维素的昆虫，其后肠中寄居这大量共生微生物，Katsumata等（2007）和Ke等（2010）分别以麻头堆砂白蚁（Cryptotermes brevis）和台湾乳白蚁（Coptotermes formosamus shiraki ）为研究对象检测到木质素在白蚁体内的降解和修饰。
本发明从圆唇散白蚁肠道内中筛选出一株可高效降解木质素的肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C，这是首次从圆唇散白蚁筛选出可降解木质素的肠杆菌的报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C。
本发明的另一目的在于提供所述肠杆菌在环保领域中的应用，特别是在生物降解木质素方面的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C，于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 8941。
所述肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C具有以下的形态和生理生化特性：
A、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和扫描电镜观察，为革兰氏阴性杆状细菌；
B、主要的生理生化特征兼性厌氧，具有运动性，接触酶、氧化酶阳性，水解明胶和淀粉，吲哚试验阴性。
所述肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C的16S rRNA序列如SEQ ID No. 1所示。
所述肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C在环保领域中的应用，特别优选所述肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C应用于生物降解木质素，包含以下步骤：
将含有木质素的无机盐培养基pH值调至6.0-8.0，然后将OD600值0.4~0.5（对数增长期）的肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C按体积比10-40%的接种量接种，于25-37℃ 进行反应，所述反应为振荡反应，振荡速度为100-220rpm。
其中， 无机盐培养基中木质素的浓度为20-100mg/L；
所述的反应时间为72-108h。
本发明的有益效果：
肠杆菌YC105C是首次从圆唇散白蚁内筛选出的可高效降解木质素的肠杆菌（Enterobacter sp.）。肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C对木质素的降解率可达90-100%，远高于其他木质素降解菌的木质素降解率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本发明所述的具有降解木质素能力的肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C从江苏省镇江市南山风景区采集的圆唇散白蚁肠道内分离、纯化而得。
其分离方法如下：
所用的驯化培养基为无机盐培养基（g/L）：6.2g Na2HPO4，3.0g KH2PO4，0.5gNaCl，1.0g NH4Cl。
抽取20头圆唇散白蚁肠道，用匀浆器充分研磨，然后以体积百分比10%接种量将匀浆液接入5ml含20mg/L木质素pH 7.0的无机盐培养液中，30℃驯化3天后，待无机盐培养基中出现浑浊后，以体积百分比10%接种量接入含木质素40mg/L的无机盐培养基接着驯化3天，依次类推逐步提高木质素的浓度进行驯化，木质素的浓度分别为60mg/L、80mg/L、100mg/L。驯化结束后将驯化液涂布于pH7.0 LB琼脂平板（10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母粉，10.0 g NaCl ，15.0 g琼脂粉, g/L）上30℃培养48h，挑选单菌落于LB琼脂平板上进行富集培养，然后测定降解率，选择降解率最高的菌种进行纯化。
降解率的测定：将单菌种接种于5mL LB液体培养基中培养18h，然后将菌液（OD600为0.45）以体积比10%的接种量接入含有20mg/L木质素pH7.0的无机盐培养基中，在30℃，150rpm摇床中反应96h，定时取样通过紫外分光光度计测定菌种对木质素的降解率。
降解率=（初始浓度-终浓度）/初始浓度。
紫外分光光度法用以测定木质素的浓度，以超纯水为对照，紫外分光光度计检测波长为280nm。
将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：
（1）菌体的形态特性：
A、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，为革兰氏阴性杆状细菌，周生鞭毛；
B、主要的生理生化特征兼性厌氧，具有运动性，接触酶、氧化酶阳性，水解明胶和淀粉，吲哚试验阴性。
（2）采用DNA提取方法提取细菌总DNA。采用细菌的16S rRNA通用引物F27（5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3，），下游引物R534（5，-ATTACCGCGGCTGCTGGC- 3，）扩增其16SrRNA基因。PCR扩增体系总体积为50 µL，无菌超纯水 37.5µL，10×PCR Buffer 5µL，MgCl23µL，dNTP Mixture 1µL，上游引物 1µL，下游引物 1µL，Takara Taq 0.5µL，DNA模板 1µL。PCR反应反应29个循环，94.0℃变性。PCR产物直接测序，结果如SEQ ID No.1所示：CTGGGGCAGCTACCATGCAGTCGAGCGGTAACACAGGGAGCTTGCTCCCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGAGGTTAATAACCTCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGACGC
上述PCR产物直接测序的16S rRNA基因序列已提交至NCBI数据库，登录号为KJ470676。将测出的16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对后用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，可知该菌株与肠杆菌Enterobacter sp. 在同一分支，系统位置最接近。根据16S rRNA同源性分析可以判断该菌种为肠杆菌属（Enterobacter sp.）的一个变种。
综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列测定结果，本发明所筛选的细菌应归属肠杆菌属（Enterobacter sp.），且为该属的一个变种，命名为肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C，于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8941。
实施例2：
将肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C单菌落接种于5mL LB液体培养基中培养18h，然后将菌液（OD600为0.45）以体积百分比为10%的接种量接入木质素浓度为40mg/L、pH为6.0的无机盐培养基中，在25℃，100rpm的摇床中反应72h，通过紫外分光光度法测定降解率。降解率的测定同实施例1，检测结果为降解率为82%。
实施例3：
将肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C单菌落接种于5mL LB液体培养基中培养18h，然后将菌液（OD600为0.45）以体积百分比为20%的接种量接入木质素浓度为60mg/L、pH为7.0的无机盐培养基中，在30℃，150rpm的摇床反应96h，通过紫外分光光度法测定降解率。降解率的测定同实施例1，检测结果为降解率为86%。
实施例4：
将肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C单菌落接种于5mL LB液体培养基中培养18h，然后将菌液（OD600为0.45）以体积百分比为30%的接种量接入木质素浓度为80mg/L、pH为8.0的无机盐培养基中，在37℃，150rpm的摇床中反应108h，通过紫外分光光度法测定降解率。降解率的测定同实施例1，检测结果为降解率为90%。
实施例5：
将肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C单菌落接种于5mL LB液体培养基中培养18h，然后将菌液（OD600为0.45）以体积百分比为40%的接种量接入木质素浓度为100mg/L、pH为7.0的无机盐培养基中，在37℃，220rpm的摇床中反应108h，通过紫外分光光度法测定降解率。降解率的测定同实施例1，检测结果为降解率为94%。
和上述实施例为本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未违背本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种肠杆菌及其在降解木质素中的应用
<130> 一种肠杆菌及其在降解木质素中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 482
<212> DNA
<213> 圆唇散白蚁
<400> 1
ctggggcagc taccatgcag tcgagcggta acacagggag cttgctcccg ggtgacgagc 60
ggcggacggg tgagtaatgt ctgggaaact gcctgatgga gggggataac tactggaaac 120
ggtagctaat accgcataac gtcgcaagac caaagagggg gaccttcggg cctcttgcca 180
tcagatgtgc ccagatggga ttagctagta ggtggggtaa cggctcacct aggcgacgat 240
ccctagctgg tctgagagga tgaccagcca cactggaact gagacacggt ccagactcct 300
acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gccatgccgc 360
gtgtatgaag aaggccttcg ggttgtaaag tactttcagc ggggaggaag gtgttgaggt 420
taataacctc agcaattgac gttacccgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagac 480
gc 482

Claims (4)

1.肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C在生物降解木质素中应用，其特征在于，包含以下步骤：将木质素的无机盐培养基pH调至6.0-8.0，然后将OD600值为0.4~0.5的肠杆菌YC105C按体积百分比10-40%的接种量添加，在25-37℃条件下进行反应；
所述的肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C，于2014年3月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.8941；
所述的无机盐培养基的组分为：6.2 g/L Na2HPO4，3.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L NaCl，1.0g/L NH4Cl。
2.根据权利要求1所述的肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C在降解木质素方面的应用，其特征在于所述含有木质素的无机盐培养基中木质素的浓度为20-100mg/L。
3.根据权利要求1所述的肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C在降解木质素方面的应用，其特征在于所述的反应为振荡反应，振荡速度为100-220rpm。
4.根据权利要求1所述的肠杆菌（Enterobacter sp.）YC105C在降解木质素方面的应用，其特征在于所述反应的时间为72-108h。
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