CN105638476A - 一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法 - Google Patents
一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法,包括所用材料为离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块、叶状体组织块分割、诱导叶状体、叶状体株系恢复生长过程、叶状体株系构建、重复诱导筛选高产石杉碱甲叶状体株系、叶状体株系分割继代、高产石杉碱甲叶状体株系的建立与鉴定。运用本发明的方法进行蛇足石杉离体培养，可获得大量高产石杉碱甲的叶状体药用植物资源。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法，即离体诱导和筛选高产石杉碱甲的蛇足石杉叶状体株系的方法,属于植物生物技术领域。
背景技术
蛇足石杉Huperziaserrata(Thunb．exMurray)Trev．，又名千层塔、蛇足石松、蛇足草等，为石杉科石杉属蕨类植物，全草入药。自1972年国内首次报道该植物中的生物碱-石杉碱甲(hupenineA,Hup-A)具有横纹肌松驰作用，以后深入研究发现该生物碱是一种强效、可逆和高选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂。在低剂量Hup-A下对乙酰胆碱酯酶(AchE)有强大的抑制作用，使分布区内神经突触间隙的乙酰胆碱(Ach)含量明显升高，从而增强神经元兴奋传导，强化学习与记忆脑区的兴奋作用，起到提高认知功能、增强记忆保持和促进记忆再现的作用，它是目前国内最为成功的治疗阿尔茨海默病(老年性痴呆症)的药物。随着老年化社会到来，阿尔茨海默病(老年性痴呆症)已成为人类的第四大病魔，蛇足石杉是我国特有植物，由于蛇足石杉等石杉科植物生长于深山密林,生境条件特殊，很难解决石杉科植物大面积的人工栽培。近年来人们大量挖采掠夺野生资源，直接导致国际市场上Hup-A的供应缺口加大，自然千层塔资源匮乏凸显。
自2012年本专利发明人离体培养蛇足石杉叶状体成功以来，深入广泛开展研究，发明了“一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法”和“一种产石杉碱甲的激素自养型蛇足石杉离体叶状体克隆系”，利用上述专利技术又发明了“一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法”，利用本项发明转化生产应用可获得大量的蛇足石杉叶状体高产石杉碱甲药物的植物资源，将产生极其重大的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法。
本发明所述方法步骤如下：
（1）所用材料：材料为离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块,该材料制备方法已申请专利,(专利号ZL201210005499.6，专利名称“一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法”),上述专利的发明人即本专利的发明人；
（2）叶状体组织块分割：在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体备用；
（3）诱导叶状体：将单片叶状体分别置于3%--6%双氧水中，浸泡7～15min，弃双氧水处理液，然后用无菌水重复多次洗去双氧水残液，将叶状体接种到继代培养基上培养；
（4）叶状体株系恢复生长过程：诱导材料接种在继代培养基上第三天至第十五天叶状体几乎全变白色，直到20天后，诱导的叶状体能长出绿色的培养物，以后生长速度加快，50天左右形成叶状体组织块。
（5）叶状体株系构建：当代诱导的叶状体培养50天后,取半致死剂量处理的恢复生长的培养物建立株系，将每块叶状体组织块分割后建成单个株系，并标记株系代号，以后按株系继代扩大培养，每50天为继代周期，连续培养5代，以高效液相色谱法检测每个株系的石杉碱甲含量(ug/g)；
（6）重复诱导筛选高产石杉碱甲叶状体株系：选取石杉碱甲含量较高的叶状体株系，重复步骤（2）、（3），取半致死剂量为3%双氧水浸泡13～15分钟胁迫诱导叶状体,经步骤（4）和（5），定向筛选高产石杉碱甲的叶状体株系；
（7）叶状体株系分割继代：分别从每株系取一小部分叶状体切割成小块作继代，接种到继代培养基上继代培养，以后每45～50天转代一次，分别建成叶状体无性繁殖株系；
（8）高产石杉碱甲叶状体株系的建立与鉴定：每株系继代剩余的另一大部分叶状体培养物继续培养25～35天后收获，用作提取检测石杉碱甲含量，连续培养收获5代，世代间石杉碱甲含量高且重复一致的株系，鉴定为高产石杉碱甲叶状体株系。
所述继代培养基按下列成份组成并进行配制：
诱导后叶状体生长继代培养基：1/4MS+蔗糖2.5%+琼脂粉0.6%；培养基的pH值5.8～6.0,并在0.1MPa高温高压下灭菌25min后使用。
所述培养条件如下：
培养参数：恒温23±2℃,相对湿度60%～70%，光照强度为1500～1800lx,日照时长13～15h/d；
叶状体诱导半致死剂量为3%双氧水处理13～15分钟，筛选获得高产株系的叶状体生物量每代鲜重比接种量增加30～35倍、叶状体每克干重含石杉碱甲60～88微克。
对单片叶状体诱导试剂为3%--6%双氧水，浸泡7～15min，然后用无菌水洗净残液；接种恢复生长，建立株系、繁殖5代，并检测叶状体株系的生长量和累积石杉碱甲含量，选着优良的叶状体株系继续重复诱导，定向筛选石杉碱甲高生产率的叶状体株系。
本发明的技术效果是：蛇足石杉离体培养叶状体再生仅发明人有成功报道和授权专利（ZL2012100005499.6）。鉴于蛇足石杉离体培养是开发生产原植物源药用石杉碱甲（Hup-A）资源的重要技术，本发明又建立了蛇足石杉离体叶状体每克干重产石杉碱甲60～88微克的高产株系，它超过了蛇足石杉母植株每克干重产石杉碱甲58.54微克的含量，突破了同类研究中的关键技术。利用这项技术扩大规模离体培养叶状体提取生产的药物石杉碱甲（Hup-A）将产生极为重大的经济价值。本发明的诱导方法、培养条件、基质配方为蛇足石杉离体叶状体增殖高产株系提供了技术体系。因此，运用本发明的方法进行蛇足石杉离体培养，可获得大量高产石杉碱甲的叶状体药用植物资源。
附图说明
图1蛇足石杉叶状体诱导高产株系的培养：
图1A为双氧水胁迫诱导后培养10天的生长情况;
图1B为双氧水胁迫诱导后培养30天的恢复生长情况;
图1C为筛选的单株培养系的生长情况;
图1D为叶状体来源的野生原植株移植于花钵中供取材的样本;
图2高产株叶状体提取物与原植株提取物、标准品石杉碱甲的高效液相图谱：
图2A中箭头所示标准品石杉碱甲峰;
图2B中箭头所示高产株系叶状体提取物中石杉碱甲峰；
图2C中箭头所示野生蛇足石杉原植株枝叶提取物中石杉碱甲峰。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
<一>取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块；
<二>在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体备用；
<三>将单片叶状体分别置于3%浓度的双氧水中，浸泡时间7分钟，弃双氧水处理液，然后用无菌水重复多次洗去双氧水残液，将叶状体接种到继代培养基上培养；
<四>诱导处理的叶状体材料接种在继代培养基上第三天至第十五天叶状体几乎全变白色，直到20天后，诱导的叶状体能长出绿色的培养物，以后生长速度加快，50天左右形成叶状体组织块；
<五>当代诱导的叶状体培养50--60d后,取半致死剂量处理的恢复生长培养物建立株系，将每块叶状体组织分割后建成单个株系，并标记株系代号，以后按株系继代扩大培养，每50天为继代周期，连续培养5代，高效液相法检测每个株系的石杉碱甲含量(ug/g)；
<六>重复诱导筛选高产石杉碱甲叶状体株系，选取石杉碱甲含量较高的叶状体株系，重复<二>、<三>取半致死剂量为3%双氧水浸泡15分钟诱导叶状体、重复<四>、<五>步骤，定向筛选高产石杉碱甲叶状体株系；
<七>分别从每株系取一小部分叶状体切割成小块作继代，接种到继代培养基上继代培养，以后每50左右天转代一次，分别建成叶状体无性繁殖株系；
<八>各株系继代剩余的另一大部分叶状体培养物继续培养25～35天后收获，用作提取检测石杉碱甲含量，连续培养收获5代，世代间石杉碱甲含量高且重现性好的株系，鉴定为高产石杉碱甲叶状体株系。
<九>培养条件
1．继代培养基配方
诱导后叶状体生长的继代培养基：1/4MS+蔗糖2.5%左右+琼脂粉0.6%左右；培养基的pH值5.8～6.0,并在0.1MPa高温高压下灭菌25min后使用。
2．培养环境
提供培养的环境：恒温23±2℃,相对湿度60%～70%，光照强度为1500～1800lx,日照时长13～15h/d；
实施例2：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于3%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为10分钟，其它与实施例1相同。
实施例3：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于3%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为13分钟，其它与实施例1相同。
实施例4：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于3%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为16分钟，其它与实施例1相同。
实施例5：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于4.5%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为7分钟，其它与实施例1相同。
实施例6：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于4.5%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为10分钟，其它与实施例1相同。
实施例7：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于4.5%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为13分钟，其它与实施例1相同。
实施例8：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于4.5%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为16分钟，其它与实施例1相同。
实施例9：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于6%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为7分钟，其它与实施例1相同。
实施例10：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于6%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为10分钟，其它与实施例1相同。
实施例11：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于6%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为13分钟，其它与实施例1相同。
实施例12：
取本研究室离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块，在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体，将单片叶状体分别置于6%不同浓度的双氧水中，浸泡时间为16分钟，其它与实施例1相同。
部分实验结果如表1：
在表1筛选结果的基础上,取株20分割单片叶状体，再次以3%H2O2，浸泡诱导单片叶状体15分钟左右、洗净H2O2残液，接种培养、淘汰、选出累积石杉碱甲含量高的几个叶状体株系，并分别继代培养多代,高效液相法连续检测5代的含量重现性一致，选作高产株系，结果见表2。
Claims (3)
1.一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法,其特征在于:
（1）所用材料：材料为离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块,该材料制备方法已申请专利,专利号ZL201210005499.6，专利名称“一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法”;
（2）叶状体组织块分割：在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体备用；
（3）诱导叶状体：将单片叶状体分别置于3%--6%双氧水中，浸泡7～15min，弃双氧水处理液，然后用无菌水重复多次洗去双氧水残液，将叶状体接种到继代培养基上培养；
（4）叶状体株系恢复生长过程：诱导材料接种在继代培养基上第三天至第十五天叶状体几乎全变白色，直到20天后，诱导的叶状体能长出绿色的培养物，以后生长速度加快，50天左右形成叶状体组织块;
（5）叶状体株系构建：当代诱导的叶状体培养50天后,取半致死剂量处理的恢复生长的培养物建立株系，将每块叶状体组织块分割后建成单个株系，并标记株系代号，以后按株系继代扩大培养，每50天为继代周期，连续培养5代，以高效液相色谱法检测每个株系的石杉碱甲含量,单位为ug/g；
（6）重复诱导筛选高产石杉碱甲叶状体株系：选取石杉碱甲含量较高的叶状体株系，重复步骤（2）、（3），取半致死剂量为3%双氧水浸泡13～15分钟胁迫诱导叶状体,经步骤（4）和（5），定向筛选高产石杉碱甲的叶状体株系；
（7）叶状体株系分割继代：分别从每株系取一小部分叶状体切割成小块作继代，接种到继代培养基上继代培养，以后每45～50天转代一次，分别建成叶状体无性繁殖株系；
（8）高产石杉碱甲叶状体株系的建立与鉴定：每株系继代剩余的另一大部分叶状体培养物继续培养25～35天后收获，用作提取检测石杉碱甲含量，连续培养收获5代，世代间石杉碱甲含量高且重复一致的株系，鉴定为高产石杉碱甲叶状体株系。
2.根据权利要求1所述的一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法,其特征在于:所述继代培养基按下列成份组成并进行配制:1/4MS+蔗糖2.5%+琼脂粉0.6%；培养基的pH值5.8～6.0,并在0.1MPa高温高压下灭菌25min后使用。
3.一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法,其特征在于:所述培养参数：恒温23±2℃,相对湿度60%～70%，光照强度为1500～1800lx,日照时长13～15h/d。
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