CN101509023A

CN101509023A - 羟喜树碱的微生物转化制备方法

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Publication number: CN101509023A
Application number: CNA2009100107455A
Authority: CN
Inventors: 姜波; 王贺双; 高华; 张涓涓; 毕静; 郝爽
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2009-03-19
Publication date: 2009-08-19

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羟喜树碱的微生物转化制备方法，本发明利用无毒黄曲霉Cr－1菌株(Aspergillus.flavus)和根霉T－34菌株(Rhizopus sp.)对悬浮培养的喜树细胞进行生物转化，获得转化后的喜树细胞培养物经过原料粉碎、回流提取、析晶、硅胶柱层析、结晶等分离和精制，从而得到羟喜树碱纯品。本发明是利用微生物对悬浮培养的喜树细胞进行生物转化获取具有抗肿瘤活性的植物次生代谢产物羟喜树碱，其含量达到了细胞干重的0.4％(g/g)；建立了获得羟喜树碱高产的新途径，符合可持续发展的要求；分离羟喜树碱的方法简便易行，产品的纯度高，有很好的发展前景。

Description

羟喜树碱的微生物转化制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体涉及一种羟喜树碱的微生物转化制备方法。

背景技术

自从1966年美国Wall等人首次从中国特有的珙桐科植物喜树中提取出喜树碱(Campothecin，CPT)以来，该类生物碱的抗肿瘤作用就一直受到广泛关注。1985年Hsiang阐述了这类药物抗肿瘤作用的机制，认为喜树碱及其衍生物是以DNA拓扑异构酶I为作用靶点，并抑制生物体DNA的合成而发挥抗肿瘤作用的。这使得此类药物成为除紫杉醇类以外的植物类抗肿瘤药物研究的第二大热点。其中羟喜树碱(Hydroxycamptoyhecin，HCPT)及以羟喜树碱为中间体合成的拓普替康(Topotecan，TPT)和伊立替康(Camptothecin-II，CPT-II)在临床上显示出广泛的抗肿瘤活性，并且毒副作用相对较小，国内的临床需求量和出口量逐年增加。为了满足需求，这类药物的制备研究也愈来愈多地受到重视，尤其是羟喜树碱(H???CPT)的制备，因为它不仅本身就是临床效果较好的抗肿瘤药物，而且还是制备其它喜树碱类衍生物的重要中间体。羟喜树碱是植物喜树中的一种生物碱，长期以来我国企业一直是从植物中直接提取，但因其含量较低，生产成本较高，难以满足临床需要。随后人们对羟喜树碱的制备进行了大量研究，包括化学全合成、化学半合成、生物转化和在近缘植物中寻找新的药源等，但因种种原因，这些方法仍未用于工业化大生产。

发明内容

本发明人在开展悬浮培养喜树细胞生产羟喜树碱的研究中，发现悬浮培养的喜树细胞经接种某些微生物后，喜树细胞培养物中羟喜树碱的含量得到大幅度的提高。因此，针对提高羟喜树碱得率的微生物培养转化条件，羟喜树碱的提取、分离、纯化等方面进行了系统的研究，并对其进行了体外抗肿瘤试验检测，为建立羟喜树碱的制备新方法及产业化打下了基础。

本发明的目在于提供一种羟喜树碱的制备新方法，利用微生物对悬浮培养的喜树细胞进行生物转化从而提高羟喜树碱得率。

本发明的技术方案是：本发明制备的羟喜树碱结构式如下：

羟喜树碱的微生物转化制备方法，是以喜树的幼茎为外植体，将在固体培养基上诱导、并继代的喜树愈伤组织转入液体培养基中，进行喜树细胞悬浮培养，再接种微生物培养转化；然后经提取、析晶、柱层析、结晶等方法分离纯化经微生物转化后的喜树细胞培养物中羟喜树碱，具体如下：

一、喜树细胞培养系的建立：

A、喜树愈伤组织的诱导和继代培养：

喜树愈伤组织的诱导和继代培养是在光照培养箱中进行的，光照8-10小时/天，培养温度为20～35℃，培养3～10天，喜树愈伤组织每隔3～15天继代一次，继代3～10次。

作为诱导、继代培养喜树愈伤组织的固体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加了1.0～1.5mg/l 6-苄基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸，凝固剂为琼脂6g/l，pH为5.5～6.5。

B、喜树细胞培养悬浮系建立：

将A步培养好的喜树愈伤组织转入通气量为0.1～0.51/min的气升式内环流反应器中培养，温度为20～35℃，喜树细胞培养每隔3～15天继代一次。

进行悬浮培养的液体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加1.0～1.5mg/l 6-苄基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸，pH为5.5～6.5。

喜树细胞培养周期为5～25天。

二、微生物对悬浮培养喜树细胞的生物转化：

A.喜树细胞的悬浮培养及微生物的接种：

无毒黄曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)和根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)的接种：于喜树细胞培养期的第5～25天接种1％～2％的无毒黄曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)，相距1～100小时后接种1％～2％的根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)；

B.微生物的培养转化条件：

初始PH值为5.5～6.5，温度为25～35℃，在接种根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)后再培养转化1～240小时。

C、喜树细胞培养物的收获：

喜树细胞培养物收获后，用清水冲洗干净，减压抽滤去除残液后置于恒温干燥箱中，50～80℃烘干至恒重，磨成粗粉，备用。

三、羟喜树碱的分离与纯化：

A.经微生物转化后的喜树细胞培养物中羟喜树碱的提取：

以乙醇为提取液，采用连续回流提取，在80～95℃水浴中，提取喜树细胞培养物粉末内的羟喜树碱，得到含有羟喜树碱的提取液；

B.浓缩、析晶：

提取液经减压浓缩至1/15体积，趁热过滤，静置放冷，析晶后过滤，晶体备用；滤液真空挥干溶剂，以少量热乙醇溶解，静置放冷，析晶；合并晶体以热乙醇重结晶，结晶体用甲醇:三氯甲烷＝1:5(V/V)的溶剂溶解，得到含有羟喜树碱的溶液；

C.硅胶柱对结晶溶液的再分离：

硅胶柱分别以三氯甲烷、甲醇:三氯甲烷＝0.3:100(V/V)、甲醇:三氯甲烷＝1.3:100(V/V)依次梯度洗脱，收集甲醇:三氯甲烷＝1.3:100(V/V)洗脱液，得到含有羟喜树碱的洗脱液；

D.对洗脱液的再结晶：

减压回收溶剂至干，分别以无水乙醇和甲醇:三氯甲烷＝0.1:100(V/V)两种溶液结晶，其中甲醇:三氯甲烷＝0.1:100(V/V)溶液结晶得到含量在98％以上羟喜树碱纯品。

本发明的有益效果是：用喜树的幼茎为外植体，不影响原植株的继续生长，所用的培养基和所接种的微生物菌株廉价易得，操作过程简便明了，分离步骤少，分离方法简单，节省大量时间和溶剂，能够得到含量在98％以上羟喜树碱纯品，其抑制肿瘤细胞效果与天然羟喜树碱相同。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，可以使本专业人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明的保护范围。

一、喜树细胞培养系的建立：

A、喜树愈伤组织的诱导和继代培养：

诱导愈伤组织培养基的配制：用蒸馏水配制MS培养基一升。附加1.1mg/L6-苄基腺嘌呤，2g/l蔗糖，3g/l尿素，0.7mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸，凝固剂为琼脂6g/l，pH为6.0。平均分装于25个100mL三角培养瓶，加塞后，置于高压锅中，121℃、15个大气压下，灭菌20分钟。

选取喜树幼茎为外植体，先用清水清洗干净，浸入70％乙醇漂洗35min，取出后用清水冲洗三次，再在滴加了二滴吐温—80的0.1％次氯酸钠溶液中浸泡5min，无菌水冲洗三至四次(直至无泡沫时为止)。将幼茎在无菌条件下剪成约0.8cm×0.8cm大小的小块，接入配制好的诱导培养基中。

在光照培养箱中培养，光照10小时/天，培养温度为28℃，培养7天，就会看到有愈伤组织产生。每隔15天继代一次(所用继代培养基与诱导培养基相同)。经过6次继代培养，就可以得到疏松易碎，生长状态良好，适于悬浮培养的喜树愈伤组织。

B、喜树细胞培养悬浮系建立：

液体培养基的配制：液体培养基的组成用蒸馏水配制MS培养基1升。附加1.1mg/l 6-苄基腺嘌呤，2g/l蔗糖，3g/l尿素，0.5mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸，pH为6.0。与固体培养基组成基本一致，只去除掉琼脂，将2，4-D浓度改为0.5mg/l。高压灭菌后分装于11气升式内环流反应器中，每个反应装置500ml培养液，。

将6次继代培养的以上疏松易碎、生长旺盛的喜树愈伤组织转入液体培养基中，每个反应装置的接种量(鲜重)50克，为培养液重量的10％。在通气量为0.351/min的气升式内环流反应器中培养，温度为28℃。经7天培养，用新鲜的液体培养基更换瓶中1/3体积的培养液。以后每隔7天，用新鲜培养基更换培养瓶中2/3体积的培养液。更换两次培养液后，愈伤组织已离散到培养液中分散成单细胞或小颗粒，并快速生长。经过28天左右即可建成淡黄色、生长旺盛、单细胞与小细胞团均匀混合的喜树细胞悬浮培养系。

二、微生物对悬浮培养喜树细胞的生物转化：

A、喜树细胞的悬浮培养及微生物的接种：

称取50g继代培养10天的喜树细胞为“种子”，分装于内装500ml培养液的11气升式内环流反应器中，上述(1.B项)条件下喜树细胞悬浮培养20天，接种1％的无毒黄曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)，相距48小时后接种1.2％的根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)。

B.微生物的转化条件：

初始PH值为6.0，温度为28℃，在接种根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)后再转化72小时。

C、喜树细胞培养物的收获：

喜树细胞培养物收获后，用清水冲洗干净，减压抽滤去除残液后置于恒温干燥箱中，60℃烘干至恒重，磨成粗粉，备用。

三、羟喜树碱的分离与纯化：

A.羟喜树碱的提取：

称取80g喜树细胞培养物粗粉，装入滤纸筒中，封好，将其放入500ml索氏提取器中，用200ml 92％乙醇、在90℃水浴下回流提取6小时，收集提取液，备用。

B.浓缩、析晶：

提取液经减压浓缩至1/15体积，趁热过滤，静置过夜，析晶后过滤，取晶体备用；滤液再真空挥干溶剂，以少量热乙醇溶解，静置过夜，析晶；合并晶体以适量热乙醇溶解，静置过夜，重结晶。结晶体用20ml甲醇:三氯甲烷＝1:5(V/V)的溶剂溶解，得到含有羟喜树碱的溶液，

C.硅胶柱对结晶溶液的再分离：

将产于青岛海洋化工厂的硅胶G800g装入φ40×800的玻璃柱中，用三氯甲烷浸透硅胶柱。将所得结晶体溶液加硅胶柱中，分别以三氯甲烷、甲醇:三氯甲烷＝0.3:100(V/V)、甲醇:三氯甲烷＝1.3:100(V/V)依次梯度洗脱，流速5ml/min，收集甲醇:三氯甲烷＝1.3:100(V/V)洗脱液。

D.对洗脱液的再结晶：

洗脱液减压浓缩回收溶剂至干，分别以适量无水乙醇和甲醇:三氯甲烷＝0.1:100(V/V)两种溶液结晶，其中甲醇:三氯甲烷＝0.1:100(V/V)溶液的结晶为羟喜树碱纯品，经干燥称重后避光保存备用。

羟喜树碱收率为细胞干重的0.42％(g/g)。

四、羟喜树碱的含量检测：

用高效液相色谱法检测羟喜树碱的含量。液相色谱分析采用WATERS高效液相色谱仪，色谱柱：YWM-C18(10)200×4.6mm(大连化物所出品)，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(60∶40)为流动相；检测波长为266nm。理论板数按羟喜树碱峰计算应不少于3000。测定时避光操作。取本品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为溶液(1)，精密量取2ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液。另取在105℃干燥至恒重的羟喜树碱对照品约20mg，精密称定，同法操作，作为对照品溶液。分别精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

羟喜树碱的含量为98.6％(g/g)。

五、羟喜树碱的体外抗肿瘤活性检测：

采用噻唑蓝(MTT)比色法试验。收集生长良好的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的PRMI1640培养基配制成1×10⁴/ml细胞悬液，于96孔培养板内接种，每孔100μl(含1000个肿瘤细胞)，置于37℃，5％CO₂温箱内培养24小时后加入受试的化合物，试验以转化羟喜树碱为试验组，天然羟喜树碱和羟喜树碱注射液为对照品(均按纯化合物计算给药量)，受试样品均设4个浓度，每个浓度3个平行孔，置37℃，5％CO₂温箱内培养2天。弃去培养液，每孔加入MTT溶液(0.4mg/mL，PRMI1640配制)100μl，37℃孵育4小时，弃去上清液，每孔加入二甲基业矾(DMSO)25μl，溶解甲攒颗粒，轻度振荡后，用550型酶标仪在检测波长540nm，参考波长405nm下测定光吸收值，计算出化合物对细胞的抑制率。以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图，可得到剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度(IC₅₀)。

试验结果显示各组对所有的癌细胞都有较强的细胞毒性。转化羟喜树碱与天然羟喜树碱的细胞毒性作用相当，对六种癌细胞的IC₅₀值达到了nmol·L^-1(10^-9mol·L^-1)级，二者均优于羟喜树碱注射液，可能是因为羟喜树碱注射液中的羟喜树碱开环后形成钠盐所致。结果见表1：

表1

IC₅₀：半数抑制浓度；KB：人口腔癌细胞；A549：人肺腺癌细胞；HCT-8：、人结肠癌细胞；KB/VCR：人耐药口腔癌细胞；Bel7402：人肝癌细胞；A2780：人卵巢癌细胞。

Claims

1.羟喜树碱的微生物转化制备方法，其特征在于，以喜树的幼茎为外植体，将在固体培养基上诱导、并继代的喜树愈伤组织转入液体培养基中，进行喜树细胞悬浮培养，再接种微生物培养转化；然后经提取、析晶、柱层析、结晶等方法分离纯化经微生物转化后的喜树细胞培养物中羟喜树碱，步骤如下：

一、喜树细胞培养系的建立：

A、喜树愈伤组织的诱导和继代培养：

作为诱导、继代培养喜树愈伤组织的固体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加了1.0～1.5mg/l6-苄基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸，凝固剂为琼脂6g/l，pH为5.5～6.5；

B、喜树细胞培养悬浮系建立：

将A步培养好的喜树愈伤组织转入通气量为0.1～0.5l/min的气升式内环流反应器中培养，温度为20～35℃，喜树细胞培养每隔3～15天继代一次；

进行悬浮培养的液体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加1.0～1.5mg/l 6-苄基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸，pH为5.5～6.5；

喜树细胞培养周期为5～25天；

二、微生物对悬浮培养喜树细胞的生物转化：

A.喜树细胞的悬浮培养及微生物的接种：

B.微生物的培养转化条件：

初始PH值为5.5～6.5，温度为25～35℃，在接种根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)后再培养转化1～240小时；

C、喜树细胞培养物的收获：

喜树细胞培养物收获后，用清水冲洗干净，减压抽滤去除残液后置于恒温干燥箱中，50～80℃烘干至恒重，磨成粗粉，备用；

三、羟喜树碱的分离与纯化：

A.经微生物转化后的喜树细胞培养物中羟喜树碱的提取：

B.浓缩、析晶：

提取液经减压浓缩至1/15体积，趁热过滤，静置放冷，析晶后过滤，晶体备用；滤液真空挥干溶剂，以少量热乙醇溶解，静置放冷，析晶；合并晶体以热乙醇重结晶，结晶体用甲醇∶三氯甲烷＝1∶5(V/V)的溶剂溶解，得到含有羟喜树碱的溶液；

C.硅胶柱对结晶溶液的再分离：

硅胶柱分别以三氯甲烷、甲醇∶三氯甲烷＝0.3∶100(V/V)、甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100(V/V)依次梯度洗脱，收集甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100(V/V)洗脱液，得到含有羟喜树碱的洗脱液；

D.对洗脱液的再结晶：

减压回收溶剂至干，分别以无水乙醇和甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100(V/V)两种溶液结晶，其中甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100(V/V)溶液结晶得到羟喜树碱纯品。