CN101851241B

CN101851241B - 一种抗肿瘤化合物及其制备方法和其用途

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Publication number: CN101851241B
Application number: CN2010102165867A
Authority: CN
Inventors: 郭增军; 徐颖; 吴楠; 韩玲; 许文明
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-07-02
Also published as: CN101851241A

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤化合物及其制备方法和其用途，所述化合物是3-异丙基-四氢吡咯[1，2-a]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮或1-乙酰基-2，3，6-三异丙基-四氢嘧啶-4(1H)-酮。本发明的抗肿瘤化合物是以陕西特有植物太白乌头为原料，采用酸水结合阳离子交换树脂的方法提取总生物碱，总生物碱提取物经碱性硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析，以有机溶剂梯度洗脱，得到了具有以下结构的化合物3-异丙基-四氢吡咯[1，2-a]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮和1-乙酰基-2，3，6-三异丙基-四氢嘧啶-4(1H)-酮；本发明同时也公开了这两个化合物的抗肿瘤作用。

Description

一种抗肿瘤化合物及其制备方法和其用途

技术领域

本发明属于天然药物化学和抗肿瘤化合物领域，涉及从陕西特有植物太白乌头(Acomtum taipeicum Hand.-Mazz.)分离的两种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用。

背景技术

癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有200万人，每年死于癌症的约有140万人，且癌症死亡人数逐年上升，我国为肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症的高发区域。

目前尚无有效的药物可以治愈大多数癌症，化疗药物对癌症虽有一定疗效，但毒副作用大，中成药对癌症的疗效普遍较低，疗效均不理想。目前临床应用的抗癌药物大多为细胞毒性药物，在抑制肿瘤细胞增殖的同时，机体正常细胞的增殖也被抑制，最终很难取得良好疗效，故限制了化疗药物的临床应用。因此，开发高效低毒、靶向性强的抗肿瘤药物成为抗肿瘤药物开发的热点。

太白乌头(Aconitum taipeicum Hand.-Mazz.)，又名金牛七，系毛茛科植物，为陕西特有植物。太白乌头具有祛风活血、解痉止痛、麻醉败毒、免疫调节、抗肿瘤等药理作用，在陕西民间用于末期癌症及其引起的疼痛的治疗。迄今为止，国内外对太白乌头的化学成分知之甚少，更没有关于其抗肿瘤活性的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供两种具有抗肿瘤活性的化合物。

本发明的一个目的在于提供上述化合物的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供上述化合物在抗肿瘤方面的应用。

本发明提供两种化合物，即3-异丙基-四氢吡咯[1，2-a]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(化合物1)和1-乙酰基-2，3，6-三异丙基-四氢嘧啶-4(1H)-酮(化合物2)，化合物的结构式为：：

3-异丙基-四氢吡咯[1，2-a]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮

1-乙酰基-2，3，6-三异丙基-四氢嘧啶-4(1H)-酮

另一方面，本发明还提供了上述化合物的制备方法。

本发明的化合物1和2可按如下方法从太白乌头中分离得到：

(1)太白乌头根粗粉，以盐酸渗漉直至渗漉液生物碱反应呈阴性，渗漉液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂，树脂用去离子水洗至中性，晾干，干树脂用氨水碱化后用乙醇回流提取，乙醇提取液回收溶剂后得总生物碱；

(2)总生物碱经过常压碱性硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，等量收集洗脱液，每份300mL，以TLC检测洗脱液，改良碘化铋钾试剂显色，合并相同流份。合并13-20份(氯仿-甲醇50∶1)并蒸干溶剂得A部分，合并143-200份(氯仿-甲醇1∶1)并蒸干溶剂得B部分。

(3)A部分再经碱性硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯洗脱得化合物1。B部分经碱性硅胶柱层析氯仿-乙醇洗脱、Sephadex LH-20柱层析后得化合物2。

本发明的制备方法中，步骤(1)为8-12倍体积的0.02-0.10mol/L的盐酸溶液，上样速度为3-10mL/min，5-15％的氨水，95％的乙醇回流提取2-3次，每次2-4h；盐酸体积(单位：升)是太白乌头根粗粉质量(单位：千克)的8-12倍。

本发明的制备方法中，步骤(2)碱性硅胶的制备方法为：50g硅胶加入125mL0.2mol/LNaOH溶液，搅拌均匀后放置30min，倾去上清夜，110℃活化5小时。氯仿-甲醇的梯度为100∶1-1∶100。

本发明的制备方法中，步骤(3)石油醚-乙酸乙酯的梯度为3∶1-7∶1，氯仿-乙醇的梯度为1∶1-7∶1，Sephadex LH-20柱层析洗脱剂为水。

该提取制备方法使用简单硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱层析从太白乌头中分离得两个酰胺生物碱，所分离化合物纯度在99％以上，提取的效果好、成本低。

本发明所用植物太白乌头采于陕西太白山区，也可以按上述方法从类似植物中分离得到这两个化合物。

本发明的化合物可用于制备抗肿瘤药物。所述的肿瘤是血癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌或者前列腺癌。

以MTT法测定化合物1和化合物2对多种癌细胞株的生长抑制作用。将处于对数生长期的细胞株用新鲜培养液稀释成浓度为2×10³细胞/mL的悬液，接种于96孔培养板内，每孔200μL，实验组加不同浓度的被测药物浓度培养液，阴性对照组加相同体积的未添加待测药物的培养液，在37℃、含5％二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养24h。取出96孔板，每孔加入10％MTT溶液20μL，上述条件培养4h。吸取并弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡，于室温放置10min使充分溶解。以590nm为检测波长，利用酶标仪测各孔吸光度值(A)。不同药物对肿瘤细胞生长的抑制率(IR)可用以下公式计算：

以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制细胞的剂量效应曲线，并计算细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。结果表明化合物1和化合物2对多种癌细胞具有生长抑制作用。上述细胞购买于中国科学院上海细胞生物研究所。

本发明的化合物1和化合物2可与市售或者常用载体结合，用于预防和治疗肿瘤和癌症。所述的药物可以为片剂或针剂。

附图说明

图1化合物1的¹H-NMR图谱；

图2化合物1的¹³C-NMR图谱；

图3化合物1的DEPT图谱；

图4化合物1的HMBC图谱；

图5化合物1的HMQC图谱；

图6化合物1的¹H-¹H COSY图谱；

图7化合物2的¹H-NMR图谱；

图8化合物2的¹³C-NMR图谱；

图9化合物2的DEPT图谱；

图10化合物2的HMBC图谱；

图11化合物2的HMQC图谱；

图12化合物2的¹H-¹H COSY图谱；

图13化合物1和化合物2作用于HL60细胞后的形态照片，其中13-A、13-B、13-C、13-D、13-E、13-F分别为2μg/mL阿霉素、2μg/mL化合物1、5μg/mL化合物1、2μg/mL阿霉素、2μg/mL化合物2、5μg/mL化合物2作用于HL60细胞后的形态照片。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

参见图1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13；

实施例1化合物1和2的制备方法

①太白乌头根粗粉2.25kg，以约22L 0.05mol/L盐酸渗漉直至渗漉液生物碱反应呈阴性，渗漉液通过强酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂(湿重约为1kg)，上样速度为5mL/min，树脂用去离子水洗至中性，晾干，干树脂(488g)用0.5L 10％氨水碱化后用乙醇回流提取，乙醇提取液回收溶剂后得总生物碱14.88g。

②总生物碱(14g)经过常压碱性硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(50∶1-3∶5)梯度洗脱，等量收集洗脱液，每份300mL，共收集300份。以TLC检测洗脱液，改良碘化铋钾试剂显色，合并相同流份并蒸干得25个部分，分别命名为A1-A25。其中A2-A3为第13-20流份，A16-A20为143-200流份。

③A2、A3合并后再经碱性硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯5∶1洗脱得化合物1。A16-A20经碱性硅胶柱层析氯仿-乙醇洗脱3∶1、Sephadex LH-20柱层析水洗脱后得化合物2。

通过理化常数测定、HR-ES-MS、1D-NMR以及2D-NMR数据分析确定其化学结构。

化合物1：

白色针状结晶(丙酮)，分子式为C₁₀H₁₆N₂O₂，分子量：196。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：5.88(1H，s，NH)，0.91、1.07(各3H，d，CH(CH₃)₂)，2.63(1H，m，H-1”)，4.08(1H，t，H-9)，3.87(1H，t，H-3)，3.60(2H，m，H-6)，2.95(2H，m，H-7)，2.20(2H，m，H-8)。

¹³C-NMR(CDCl₃)δppm：164.89(C-2)，60.36(C-3)，169.96(C-4)，45.15(C-6)，22.35(C-7)，28.52(C-8)，58.82(C-9)，28.36(C-1’)，19.25(C-2’)，16.04(C-1”)。

该化合物为新化合物，命名为3-异丙基-四氢吡咯[1，2-a]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(3-isopropyl-tetrahydropyrrolo[1，2-a]pyrimidine-2，4(1H，3H)-dione)。其1D及2D-NMR图谱见图1-6。

化合物2：

白色无定形粉末(丙酮)，分子式为C₁₅H₂₈N₂O₂，分子量：268。

¹H-NMR(CDCl₃)δppm：3.28(1H，d，H-2)，1.55、1.70(1H，m，H-5)，3.43(1H，m，H-6)，1.89(3H，s，COCH ₃)，2.17(1H，m，2-CH(CH₃)₂)，1.89(1H，m，3-CH(CH₃)₂)，1.24(1H，m，6-CH(CH₃)₂)，1.00-1.20(18H，m，-CH(CH ₃)₂)。

¹³C-NMR(CDCl₃)δppm：60.94(C-2)，176.92(C-4)，42.01(C-5)，53.78(C-6)，179.14、22.91(COCH ₃)，30.36(2-CH(CH₃)₂)，37.25(3-CH(CH₃)₂)，24.51(6-CH(CH₃)₂)，16.40、18.29(2-CH(CH ₃)₂)，22.10、20.83(3-CH(CH ₃)₂)，10.91、14.63(2-CH(CH ₃)₂)。

该化合物为新化合物，命名为1-乙酰基-2，3，6-三异丙基-四氢嘧啶-4(1H)-酮(1-acetyl-2，3，6-triisopropyl-tetrahydropyrimidin-4(1H)-one)。其1D及2D-NMR图谱见图7-12。

实施例2化合物1和2的体外抗血癌活性

以MTT法测定化合物1和2对人早幼粒白血病细胞株HL-60和人红白血病细胞株K562的生长抑制作用。将处于对数生长期的细胞株用新鲜培养液稀释成浓度为2×10³细胞/mL的悬液，接种于96孔培养板内，每孔200μL，实验组加不同浓度的被测药物浓度培养液，阴性对照组加相同体积的未添加待测药物的培养液，在37℃、含5％二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养24h。取出96孔板，每孔加入10％MTT溶液20μL，上述条件培养4h。吸取并弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡，于室温放置10min使充分溶解。以590nm为检测波长，利用酶标仪测各孔吸光度值(A)。不同药物对肿瘤细胞生长的抑制率(IR)可用以下公式计算：

以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制细胞的剂量效应曲线，并计算细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。结果见表1。不同浓度药物作用于HL-60细胞后细胞形态变化见图13。上述细胞购买于中国科学院上海细胞生物研究所。

表1 化合物1和2对K562及HL-60的半数抑制浓度IC₅₀(μg/mL)

	K562	HL-60
			化合物1	5.2±0.12	1.1±0.03
化合物2	7.3±0.12	1.6±0.07
			adriamycin	2.0±0.05	2.0±0.06

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。

Claims

1.一种抗肿瘤化合物，其特征在于：

所述化合物是3-异丙基-四氢吡咯[1，2-a]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。

2.一种抗肿瘤化合物，其特征在于：

所述化合物是1-乙酰基-2，3，6-三异丙基-四氢嘧啶-4(1H)-酮。

3.如权利要求1或2所述化合物应用于制备治疗血癌的药物。