JP2019092396A - 自動培養装置、細胞培養方法 - Google Patents
自動培養装置、細胞培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019092396A JP2019092396A JP2017221926A JP2017221926A JP2019092396A JP 2019092396 A JP2019092396 A JP 2019092396A JP 2017221926 A JP2017221926 A JP 2017221926A JP 2017221926 A JP2017221926 A JP 2017221926A JP 2019092396 A JP2019092396 A JP 2019092396A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture
- cells
- container
- solution
- automatic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
- C12M41/16—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature by recirculation of culture medium at controlled temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/28—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of redox potential
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/48—Automatic or computerized control
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Computer Hardware Design (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Thermal Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physiology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】簡易な構成により細胞を容器から剥離するとともに、細胞に対するダメージを抑制することができる、自動培養装置を提供する。【解決手段】本発明に係る自動培養装置は、刺激応答性を有する培養容器によって細胞を培養し、別の容器から供給する溶液によって前記培養容器に対して刺激を与えることにより、細胞を前記培養容器から剥離する。【選択図】図3
Description
本発明は、細胞を培養する自動培養装置に関する。
安定した品質の細胞を大量製造するため、種々の自動培養装置が開発されている。例えば培養環境の制御のように、機械制御によるメリットが大きい要素に関しては開発が進んでおり、細胞品質の安定化が期待できる。しかし、細胞培養においてこれまで人が実施している作業を全て機械で置き換えるのは、必ずしも容易ではない。
無菌空間内にロボットアームのような可動機構を多数備えた自動培養装置によって人の作業を再現する試みがなされている(特許文献1−3)。一方、閉鎖系流路(気密に維持された流路)から構成される閉鎖系自動培養装置は、特許文献1−3のような可動機構を多数備える装置と比較して一般に、構造的に単純かつ小型である。また、酵素などの剥離溶液を用いることなく細胞を容器から剥離することができる培養装置も開発されている(特許文献4)。
特許文献1−3記載のような自動培養装置においては、(a)無菌空間によって装置の大部分を覆う必要があり装置が大型になってしまうこと、(b)機械的機構が複雑であること、(c)必要な部品数が多く安価に製造しにくいこと、(d)メンテナンス性に難があること、などの課題がある。
閉鎖系流路から構成される閉鎖系自動培養装置においては、細胞を容器から剥離するために剥離溶液を用いるので、細胞に対するダメージを抑制するため、例えば遠心分離機などを用いて、細胞を剥離溶液から分離する必要がある。遠心分離機は自動培養装置とは別の装置であり、閉鎖系流路に対して直接接続されていないので、細胞を遠心分離器に対して持ち込む工程が別途必要である。この工程を自動化することは、複雑な機構が必要であるので一般に困難である。
特許文献4のように、剥離溶液を用いずに細胞を容器から剥離する装置においては、細胞を継代可能な状態で剥離するために複雑な機構を要するのが一般的である。したがって簡易な装置構成を実現するのは困難であると考えられる。
本発明は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、簡易な構成により細胞を容器から剥離するとともに、細胞に対するダメージを抑制することができる、自動培養装置を提供することを目的とする。
本発明に係る自動培養装置は、刺激応答性を有する培養容器によって細胞を培養し、別の容器から供給する溶液によって前記培養容器に対して刺激を与えることにより、細胞を前記培養容器から剥離する。
本発明に係る自動培養装置によれば、簡易な構成により細胞を容器から剥離するとともに、細胞に対するダメージを抑制することができる。
<細胞培養の一般的工程について>
細胞継代においては一般に、ECM(Extra Cellular Matrix:細胞外マトリクス)を分解するプロテアーゼなどの酵素(例:トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、もしくはそれらの組み換え体)や、3座以上でアルカリ土類金属イオンに配位することによりECMの複合体を解離させるキレート剤(例:EDTA(エチレンジアミン四酢酸))などによって、細胞を容器から剥離する。細胞を剥離した後の細胞懸濁液には、酵素やキレート剤が残存し、これが細胞に対してダメージを与えるので、例えば遠心分離機により酵素やキレート剤と細胞を分離する必要がなる。一般に遠心分離は、細胞懸濁液を培養容器から遠心分離用の容器に移し替える工程をともなうので、機械によって自動化するためには煩雑な機構を必要とする。
細胞継代においては一般に、ECM(Extra Cellular Matrix:細胞外マトリクス)を分解するプロテアーゼなどの酵素(例:トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、もしくはそれらの組み換え体)や、3座以上でアルカリ土類金属イオンに配位することによりECMの複合体を解離させるキレート剤(例:EDTA(エチレンジアミン四酢酸))などによって、細胞を容器から剥離する。細胞を剥離した後の細胞懸濁液には、酵素やキレート剤が残存し、これが細胞に対してダメージを与えるので、例えば遠心分離機により酵素やキレート剤と細胞を分離する必要がなる。一般に遠心分離は、細胞懸濁液を培養容器から遠心分離用の容器に移し替える工程をともなうので、機械によって自動化するためには煩雑な機構を必要とする。
図1は、酵素を用いる細胞継代の工程を例示する模式図である。この場合は以下の工程が含まれる:(1)培養液の除去、(2)洗浄液の添加、(3)洗浄液の除去、(4)洗浄液の添加、(5)洗浄液の除去、(6)酵素溶液の添加、(7)細胞剥離の確認、(8)酵素停止溶液の添加、(9)細胞への液流の印加、(10)細胞懸濁液の遠心管への移し替え、(11)洗浄液の添加、(12)細胞懸濁液の遠心管への追加移し替え、(13)遠心管のフタ閉め、(14)遠心管の遠心機へのセット、(15)遠心分離、(16)遠心管のフタ開け、(17)上清の除去、(18)緩衝液添加、(19)細胞塊への液流の印加、(20)細胞懸濁液の遠沈管からの回収、(21)細胞計数、(22)細胞懸濁液の必要量の計量、(23)播種。この例においては、工程(10)、(12)、(13)、(14)、(16)、(19)、(20)などが遠心分離を実施するために必要であるが、これらは機械的に煩雑な機構を要する。
閉鎖系自動培養装置は、容器間の流路を気密流路によって構成した培養装置であり、以下の利点がある:(a)セッティング後は培養系が外気と接触しないのでコンタミネーションリスクが小さい、(b)ピペットのような機構を用いずチューブにより簡便に送液することができる、(c)ロボットアームを用いる自動培養装置と異なり無菌空間中に設置する必要がない、など。このタイプの自動培養装置は、溶液を容器間で搬送することにより培養工程を実施するので、構造が簡易である。ただし図1と同様に剥離溶液を分離する必要があるので、工程を完全に自動化するためには、図1と同様に複雑な機構を要する。
図1や閉鎖系自動培養装置において、複雑な機構を要するのは、剥離溶液が細胞に対してダメージを与えるのでこれを除去する必要があるからである。そこで本発明は、剥離溶液を用いることなく細胞を容器から剥離することにより、遠心分離機へ細胞を搬送する複雑な機構を用いない構成を提案する。これにより、閉鎖系自動培養装置の簡易な構造による利点を活かして、単純な機構のみで細胞継代を自動的に実施することを図る。
<実施の形態1>
細胞にダメージを与える成分(すなわち剥離溶液)を用いずに容器から細胞を剥離する手段として、刺激応答性培養容器が挙げられる。刺激応答性培養容器とは、物理・化学的な刺激によって、培養容器表面の物性が変化し、細胞に対する接着性が変化し得る培養容器である。刺激の例としては、温度変化、pH変化、溶液組成変化(イオン濃度変化、糖濃度変化、タンパク質濃度変化、ビオチン濃度変化、等)、酸化剤添加、還元剤添加、などが挙げられるが、これらに限定されない。
細胞にダメージを与える成分(すなわち剥離溶液)を用いずに容器から細胞を剥離する手段として、刺激応答性培養容器が挙げられる。刺激応答性培養容器とは、物理・化学的な刺激によって、培養容器表面の物性が変化し、細胞に対する接着性が変化し得る培養容器である。刺激の例としては、温度変化、pH変化、溶液組成変化(イオン濃度変化、糖濃度変化、タンパク質濃度変化、ビオチン濃度変化、等)、酸化剤添加、還元剤添加、などが挙げられるが、これらに限定されない。
図2は、刺激応答を用いる細胞継代の工程を例示する模式図である。この場合は以下の工程が含まれる:(I)培養液の除去、(II)刺激の印加、(III)刺激の停止、(IV)細胞への液流の印加、(V)細胞懸濁液の培養容器からの回収、(VI)細胞計数、(VII)細胞懸濁液の必要量の計量、(VIII)播種。図1と比較して短い工程により細胞継代を実施することができる。
刺激応答性容器に対して与える刺激として温度変化を用いる場合は、温度応答性培養容器上で細胞を培養し、培養温度とは異なる温度の培地や緩衝液を作用させることにより細胞に対する接着性を低下させて細胞を剥離する。動物細胞は多くの場合、4℃〜37℃の範囲内における温度変化は短時間であれば細胞に悪影響を及ぼさない。刺激を停止する際には、培養温度程度の溶液を添加すればよい。
低温の培地を用いて細胞を剥離した場合、常温程度の溶液を供給することにより細胞を剥離するので、細胞懸濁液は細胞が長期間生存可能な成分構成となる。したがって溶液成分をさらに調整する必要はない。もっとも、例えば分析のために必要な場合など、用途に応じてさらに成分調整をすることは妨げない。低温の緩衝液を作用させることにより細胞を剥離する場合は、培地や濃縮培地をさらに添加することにより、細胞が長期間生存可能な成分構成に調整することが望ましい。
温度応答性培養容器の例としては、培養容器表面に温度応答性材料を備えるものが挙げられる。温度応答性材料としては、(a)ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N、N−ジエチルアクリルアミド)のようなポリアクリルアミド誘導体、(b)ポリ(オリゴエチレングリコールメタクリレート)のようなポリメタクリレート誘導体、(c)ポリ(メチルビニルエーテル)のようなポリビニルエーテル誘導体、(d)ポリ(N−ビニルカプロラクトン)のようなポリビニルアミン誘導体、(e)ポリエチレングリコール共重合体やポリプロピレングルコール共重合体のようなポリアルキレングリコール誘導体、(f)ポリ(オキサゾリン)のようなポリオキサゾリン誘導体、(g)ヒドロキシプロピルセルロースのようなポリサッカライド誘導体、(h)ポリペプチド、(i)ポリペプチド誘導体、などが挙げられるが、これらに限定されない。容器の形状は限定されない。
刺激応答性容器に対して与える刺激としてpH変化を用いる場合は、pH応答性培養容器上で細胞を培養し、通常の培養条件とpHが異なる培地や緩衝液を作用させることにより細胞に対する接着性を低下させて細胞を剥離する。細胞種にも依存するが、pHの微小な変化は短時間であれば細胞に悪影響を及ぼさない。刺激を停止する際には、培地や緩衝液の添加によりpHを中和・希釈すればよい。
通常の培養条件と異なるpHを有する溶液を作用させる場合、細胞を剥離した後に培地や濃縮培地を添加することにより、細胞が長期間生存可能な成分構成に調整することが望ましい。pHの変化方向としては、酸側・アルカリ側どちらも用いることができるが、細胞に悪影響の少ない方向とすることが望ましい。
pH応答性培養容器の例としては、培養容器表面にpH応答性材料を備えるものが挙げられる。pH応答性材料としては、(a)ポリリシン、ポリエチレンイミン、キトサンのようなポリアミン類、(b)ポリ(ジエチルアミノエチルメタクリレート)−ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)共重合体やポリプロピレングリコール−エチレンジアミン共重合体のようなアミン含有温度応答性ポリマ、(c)ポリグルタミン酸、カルボキシメチルセルロースのようなポリカルボン酸、(d)ポリ(アクリル酸)−ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)共重合体のようなカルボン酸含有温度応答性ポリマ、(e)ポリペプチド、(f)接着性タンパク質、などが挙げられるが、これらに限定されない。容器の形状は限定されない。
細胞・細胞膜・ECMなどがpHに対する十分な応答性を有し、弱酸等によって細胞剥離が可能な程度まで細胞接着が弱まることがある。そのような細胞を用いる場合、必ずしもpH応答性培養容器を用いる必要はない。
図3は、本実施形態1に係る自動培養装置100の構成図である。自動培養装置100は、培養容器110、溶液容器120、剥離細胞容器130を備える。培養容器110と溶液容器120との間は第1閉鎖系流路141によって接続され、培養容器110と剥離細胞容器130との間は第2閉鎖系流路142によって接続されている。
培養容器110は、上述の刺激応答性容器であり、細胞を培養するために用いる。溶液容器120は、培養容器110に対して刺激を与えることにより細胞に対する接着性を低下させる溶液を収容する。この溶液は細胞に対するダメージが小さい必要があるので、従来細胞を剥離するために用いている酵素やキレート剤の濃度が充分低いことが望ましい。具体的には、溶液におけるこれらの濃度が0.01wt%未満であることが望ましい。遠心分離においてこれらを分離する際にこの程度の濃度を目標とするからである。剥離細胞容器130は、培養容器110から剥離された細胞を収容する。
自動培養装置100を閉鎖系培養装置として構成する場合、第1閉鎖系流路141と第2閉鎖系流路142は気密構造を有し、溶液がこれらのなかを通過する際に、細胞が外気にさらされないように構成されている。これにより、閉鎖系培養装置の利点を活かしつつ本発明の効果を発揮することができる。さらに、各容器のうち少なくともいずれかを気密に構成してもよい。
図4は、自動化機構の具体的構成例である。図3で説明した構成に加え、送液機構150、緩衝液保持容器、廃液保持容器、細胞観察機構を設け、送液機構150が各容器間で溶液を搬送することにより、細胞継代の各工程を自動的に実施することができる。
前述の例の工程(I)〜(VIII)は例えば下記のように実現できる。工程(I)は、送液機構150が培養容器110中の培地を廃液保持容器に移送することにより実現できる。工程(II)は、送液機構150が溶液容器120中の刺激溶液を培養容器110に移送することにより実現できる。工程(III)は、送液機構150が緩衝液保持容器から培養容器110に緩衝液を移送することにより実現できる。工程(IV)は、工程(III)の際に液流を発生させることにより実現できる。工程(V)〜(VIII)は、細胞観察機構を用いて細胞数を計数し、送液機構150が培養容器110中の細胞懸濁液のうち一定量を剥離細胞容器130に移送することにより実現できる。
<実施の形態1:まとめ>
本実施形態1に係る自動培養装置100は、刺激応答性容器を用いて細胞を培養し、刺激を与える溶液を搬送することにより細胞を容器から剥離する。これにより、剥離溶液などの細胞に対してダメージを与える溶液を用いる必要がなくなるので、遠心分離機などの外部装置に対して細胞を移送する必要はない。したがって、簡易な装置構成で細胞継代を自動化することができる。
本実施形態1に係る自動培養装置100は、刺激応答性容器を用いて細胞を培養し、刺激を与える溶液を搬送することにより細胞を容器から剥離する。これにより、剥離溶液などの細胞に対してダメージを与える溶液を用いる必要がなくなるので、遠心分離機などの外部装置に対して細胞を移送する必要はない。したがって、簡易な装置構成で細胞継代を自動化することができる。
<実施の形態2>
刺激応答性容器に対して与える刺激として、イオン濃度変化を用いることもできる。この場合は、イオン応答性培養容器上で細胞を培養し、イオン濃度の変化によって細胞を剥離することができる。培養条件におけるイオン濃度を細胞剥離のために変化させたとしても、短時間であれば細胞に悪影響を及ぼさない。刺激を停止する際には、添加液や希釈液を用いてイオン濃度を調整すればよい。
刺激応答性容器に対して与える刺激として、イオン濃度変化を用いることもできる。この場合は、イオン応答性培養容器上で細胞を培養し、イオン濃度の変化によって細胞を剥離することができる。培養条件におけるイオン濃度を細胞剥離のために変化させたとしても、短時間であれば細胞に悪影響を及ぼさない。刺激を停止する際には、添加液や希釈液を用いてイオン濃度を調整すればよい。
カドヘリンに代表される一部のECMはアルカリ土類金属イオン応答性を有し、アルカリ土類金属イオン濃度を低下させることにより細胞剥離が可能な程度まで細胞接着が弱まることがある。そのような細胞を用いる場合、必ずしもイオン応答性培養容器を用いる必要はない。
刺激応答性容器に対して与える刺激として、培養時に細胞と共存しても問題ない成分や培地中に含まれる成分の濃度変化を用いることもできる。このような成分としては、グルコース(ボロン酸やレクチンのようなグルコース応答性材料に対して刺激)、ビオチン(アビジンやストレプトアビジンのようなビオチン応答性材料に対して刺激)、PEG(抗PEG抗体のようなPEG応答性材料に対して刺激)、グルタチオン(ジスルフィド結合のような易還元性の結合に対する還元刺激)、などが挙げられる。
溶液を作用させることにより刺激を与えることに代えて、例えば、(a)培養容器をインキュベータから取り出して外気に暴露することにより温度を変化させる、(b)光を照射する、(c)力学的刺激を印加する、などのように、溶液交換を必要としない刺激を用いることもできる。その場合、必ずしも刺激を与える前に培養液を除去する必要はないので、プロセスの簡便さとしては有利である。他方で刺激印加機構としてその刺激に対応する特殊な機構を要するので、溶液を作用させるのみで細胞を剥離する手法と比較して、装置構成の単純さという観点では有利でない。
なお、溶液を作用させることにより細胞を剥離する場合、作用する溶液の浸透圧は、細胞に悪影響のない浸透圧の範囲を超えないことが望ましい。細胞に悪影響のない浸透圧の範囲は、代表的には260〜320mOSM/kgである。
<本発明の変形例について>
本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換える事が可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について他の構成の追加・削除・置換をすることができる。
本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換える事が可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について他の構成の追加・削除・置換をすることができる。
本発明に係る自動培養装置100を用いて細胞継代を実施する場合には、培養する細胞の性質にも依存するが、剥離された細胞が播種可能な状態である必要がある。したがってシングルもしくは小さなクランプの状態で剥離することが好ましい。一般にコンフルエントになる前に剥離すれば、大きなクランプにならずに剥離することができる。例えば培養容器の細胞と接触する部位が適切なモルフォロジーにパターニングされていれば、細胞の形態がシングルもしくは小さいクランプの状態で、剥離された細胞を容易に得ることができる。凹凸のような物理的なパターニングに加え、細胞非接着性成分の導入や細胞接着性成分の剥離のような化学的なパターニングでもよい。細胞と接触する部位が多孔質状、繊維状、ビーズ状などである場合には、1ヵ所あたりの面積や曲率の制御によって大きなクランプの形成を抑制できる可能性がある。
培養容器110の刺激応答性材料は、接着性タンパク質、接着性タンパク質の誘導体、接着性タンパク質の組み換え体であっても構わない。接着性タンパク質が刺激に対して応答して構造変化もしくは重合度低下して接着性が低下する場合、刺激応答性材料として用いることができる。
自動培養装置100は、図3〜図4で説明した構成の他、培地保持容器、装置制御機構、ネットワーク接続機構、試薬保持容器、気体濃度制御機構、温度制御機構、滅菌機構、容器輸送機構、センサ類、サンプリング機構、光照射機構、などの機構を備えていてもよく、追加の各種容器・機構を備えていてもよい。1つの筐体の内部に複数の自動培養機構、自動継代機構を備えていてもよい。
自動培養装置100は、接着細胞の培養に用いることができる。浮遊細胞は、その元来の性質から、細胞懸濁液を希釈するのみで継代とすることができるので、自動培養装置100による効果は小さい。
自動培養装置100が培養する接着細胞のタイプは限定されない。細胞の由来(初代細胞、培養細胞、株化細胞、遺伝子組換えされた細胞、等)や、生物種に関しても制限はない。接着細胞の例としては、幹細胞(間葉系幹細胞、ES細胞、iPS細胞、等)、上皮細胞(血管上皮細胞、胆管上皮細胞、等)、内皮細胞(血管内非細胞、リンパ管内皮細胞、等)、線維芽細胞(NIH3T3、等)、肝細胞、膵島細胞、神経細胞、心筋細胞、筋芽細胞、がん細胞、マクロファージ、HeLa細胞、CHO細胞、などが挙げられる。培養する細胞は1種類である必要はなく、共培養系に適用してもよい。
接着細胞が分化能を有する場合は、自動培養装置100を用いて培養している間に分化させてもよい。分化した細胞と未分化の細胞の刺激に対する応答が異なる場合、条件によっては、刺激応答による細胞剥離の工程中で分化した細胞と未分化の細胞を分離できる。この場合、例えば回収したい細胞のみを次工程に移送することにより、簡便に細胞を精製できる。分化能を有する接着細胞の未分化状態を維持したまま増殖させる場合においても、分化した細胞と未分化の細胞の刺激に対する応答が異なる場合、条件によっては、未分化の細胞のみを次工程に移送することができる。細胞の接着性が培養中に低下する場合も同様である。例えば細胞の分化や馴化によって浮遊性に変わる場合、スフェロイドのような凝集体を形成して接着性が低下する場合、などがこれに当てはまる。
培養した細胞を回収する場合は、必ずしも細胞継代と同様の方法で細胞を剥離する必要はない。回収する前段階の培養に関しては、刺激応答性を有する培養容器を用いる必要もない。細胞の回収の際は、細胞の形態はシングル、小さなクランプ、大きなクランプ、シート状、など特に限定されない。細胞の回収は自動培養装置100の外部で実施してもよい。細胞そのものの回収ではなく、細胞が分泌する成分を継続的に回収するために、自動培養装置100を用いてもよい。
<実施例>
以下では本発明に係る自動培養装置100の効果を検証した結果について、比較例と併せて説明する。
以下では本発明に係る自動培養装置100の効果を検証した結果について、比較例と併せて説明する。
<実施例1>
pH応答性培養容器を用い、pH・溶液組成変化刺激による細胞剥離を検討した。pH応答性培養容器は特願2015−117114に記載の通り作製し、hMSC(タカラバイオ)を播種し、タカラバイオ推奨のプロトコルに従い5日間培養した。得られたhMSCを含む容器から培養液を除去した後にpH6.5のPBS(Phosphate Buffered Saline)を添加し、インキュベートした。その後、37℃の培地を添加することによりpH・溶液組成変化刺激を停止し、液流を発生させてhMSCを容器底面からさらに剥離させた。得られた細胞懸濁液は別の容器に移送し、細胞数および生存率を計数した。容器底面に残存した細胞も計数し、剥離率を算出した。その結果、pH・溶液組成変化刺激による剥離によって得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は90%かつ剥離率は95%と十分に高い値であった。
pH応答性培養容器を用い、pH・溶液組成変化刺激による細胞剥離を検討した。pH応答性培養容器は特願2015−117114に記載の通り作製し、hMSC(タカラバイオ)を播種し、タカラバイオ推奨のプロトコルに従い5日間培養した。得られたhMSCを含む容器から培養液を除去した後にpH6.5のPBS(Phosphate Buffered Saline)を添加し、インキュベートした。その後、37℃の培地を添加することによりpH・溶液組成変化刺激を停止し、液流を発生させてhMSCを容器底面からさらに剥離させた。得られた細胞懸濁液は別の容器に移送し、細胞数および生存率を計数した。容器底面に残存した細胞も計数し、剥離率を算出した。その結果、pH・溶液組成変化刺激による剥離によって得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は90%かつ剥離率は95%と十分に高い値であった。
<実施例2>
実施例1で得られた細胞を評価した。実施例1において得られた細胞懸濁液を新たな容器に播種し、同様にして5日間培養した。その結果、得られた細胞の増殖率および生存率は実施例1と同等であり、pH・溶液組成変化刺激を用いた剥離による細胞の増殖性の低下は認められなかった。
実施例1で得られた細胞を評価した。実施例1において得られた細胞懸濁液を新たな容器に播種し、同様にして5日間培養した。その結果、得られた細胞の増殖率および生存率は実施例1と同等であり、pH・溶液組成変化刺激を用いた剥離による細胞の増殖性の低下は認められなかった。
<実施例3>
pH応答性培養容器を用い、pH・溶液組成変化刺激による細胞剥離を検討した。実施例1と同様にしてCHO(Chinese Hamster Ovary)細胞の培養および継代を実施した。その結果、pH・溶液組成変化刺激による剥離によって得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は90%かつ剥離率は90%と十分に高い値であった。継代後の増殖性は継代前とほぼ同等であった。
pH応答性培養容器を用い、pH・溶液組成変化刺激による細胞剥離を検討した。実施例1と同様にしてCHO(Chinese Hamster Ovary)細胞の培養および継代を実施した。その結果、pH・溶液組成変化刺激による剥離によって得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は90%かつ剥離率は90%と十分に高い値であった。継代後の増殖性は継代前とほぼ同等であった。
<実施例4>
温度応答性培養容器を用い、温度・溶液組成変化刺激による細胞剥離を検討した。温度応答性培養容器としてセルシード社のレプセルを用い、細胞剥離液として10℃のPBSを用い、実施例1と同様にhMSCの培養および継代を実施した。その結果、温度・溶液組成変化刺激による剥離によって得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は85%かつ剥離率は90%と十分に高い値であった。継代後の増殖性は継代前とほぼ同等であった。
温度応答性培養容器を用い、温度・溶液組成変化刺激による細胞剥離を検討した。温度応答性培養容器としてセルシード社のレプセルを用い、細胞剥離液として10℃のPBSを用い、実施例1と同様にhMSCの培養および継代を実施した。その結果、温度・溶液組成変化刺激による剥離によって得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は85%かつ剥離率は90%と十分に高い値であった。継代後の増殖性は継代前とほぼ同等であった。
<比較例1>
比較例1として、通常のポリスチレン培養容器を用いて細胞の剥離を検討した。通常のポリスチレン培養容器にhMSCを播種し、実施例1と同様に培養し、実施例1と同様に剥離を検討した。その結果、温和な液流の条件ではpH・溶液組成変化刺激ではポリスチレン培養容器から細胞が5%以下しか剥離しないことが判明した。
比較例1として、通常のポリスチレン培養容器を用いて細胞の剥離を検討した。通常のポリスチレン培養容器にhMSCを播種し、実施例1と同様に培養し、実施例1と同様に剥離を検討した。その結果、温和な液流の条件ではpH・溶液組成変化刺激ではポリスチレン培養容器から細胞が5%以下しか剥離しないことが判明した。
<比較例2>
比較例2として、強い液流を用いたポリスチレン培養容器からの細胞剥離を検討した。比較例1と同様にhMSCを培養し、得られた細胞に培地を高流速で30秒間吹き付けることで細胞を培養容器底面から剥離した。その結果、得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は75%と低い値であった。
比較例2として、強い液流を用いたポリスチレン培養容器からの細胞剥離を検討した。比較例1と同様にhMSCを培養し、得られた細胞に培地を高流速で30秒間吹き付けることで細胞を培養容器底面から剥離した。その結果、得られた細胞懸濁液中の細胞の生存率は75%と低い値であった。
<比較例3>
比較例3として、従来の細胞剥離方法で遠心分離をしない場合の細胞への影響を検討した。通常のポリスチレン培養容器上でCHOを培養し、トリプシン/EDTA溶液を用いて細胞を剥離して得た細胞懸濁液を、酵素の停止処理や遠心分離による酵素・キレート剤除去を実施せずポリスチレン培養容器に播種し、その後の増殖性を測定した。その結果、遠心分離せずに播種した場合は遠心分離した場合と比較して増殖性が20%以上低下していた。
比較例3として、従来の細胞剥離方法で遠心分離をしない場合の細胞への影響を検討した。通常のポリスチレン培養容器上でCHOを培養し、トリプシン/EDTA溶液を用いて細胞を剥離して得た細胞懸濁液を、酵素の停止処理や遠心分離による酵素・キレート剤除去を実施せずポリスチレン培養容器に播種し、その後の増殖性を測定した。その結果、遠心分離せずに播種した場合は遠心分離した場合と比較して増殖性が20%以上低下していた。
100:自動培養装置
110:培養容器
120:溶液容器
130:剥離細胞容器
141:第1閉鎖系流路
142:第2閉鎖系流路
150:送液機構
110:培養容器
120:溶液容器
130:剥離細胞容器
141:第1閉鎖系流路
142:第2閉鎖系流路
150:送液機構
Claims (12)
- 細胞を培養する自動培養装置であって、
前記細胞を培養する培養容器、
前記培養容器に対して供給する溶液を収容する溶液容器、
を備え、
前記培養容器は、前記溶液が与える刺激によって前記細胞に対する接着性が変化する刺激応答性を有する
ことを特徴とする自動培養装置。 - 前記溶液において、細胞外マトリックスの重合度を低下させる酵素の濃度は0.01wt%未満であり、
前記溶液において、アルカリ土類金属イオンに対して配位できるキレート剤の濃度は0.01wt%未満である
ことを特徴とする請求項1記載の自動培養装置。 - 前記細胞外マトリックスの重合度を低下させる酵素は、プロテアーゼであり、
前記アルカリ土類金属イオンに対して配位できるキレート剤は、3座以上でアルカリ土類金属イオンに配位できるキレート剤である
ことを特徴とする請求項2記載の自動培養装置。 - 前記プロテアーゼは、トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、もしくはそれらの組み換え体であり、
前記3座以上でアルカリ土類金属イオンに対して配位できるキレート剤は、EDTAである
ことを特徴とする請求項3記載の自動培養装置。 - 前記培養容器は、温度変化によって前記細胞に対する接着性が変化する刺激応答性を有しており、
前記培養容器は、刺激応答性材料として、ポリアクリルアミド誘導体、ポリメタクリレート誘導体、ポリビニルエーテル誘導体、ポリビニルアミン誘導体、ポリアルキレングリコール誘導体、ポリオキサゾリン誘導体、ポリサッカライド誘導体、ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、のうち少なくともいずれかを用いて形成されている
ことを特徴とする請求項1記載の自動培養装置。 - 前記培養容器は、pH変化によって前記細胞に対する接着性が変化する刺激応答性を有しており、
前記培養容器は、刺激応答性材料として、ポリアミン、アミン含有温度応答性ポリマ、ポリカルボン酸、カルボン酸含有温度応答性ポリマ、ポリペプチド、接着性タンパク質、のうち少なくともいずれかを用いて形成されている
ことを特徴とする請求項1記載の自動培養装置。 - 前記培養容器は、前記溶液の組成変化、酸化反応、還元反応、のうち少なくともいずれかによって与えられる刺激により、前記細胞に対する接着性が変化する刺激応答性を有する
ことを特徴とする請求項1記載の自動培養装置。 - 前記自動培養装置はさらに、前記溶液を前記溶液容器から前記培養容器に対して搬送する送液機構を備える
ことを特徴とする請求項1記載の自動培養装置。 - 前記自動培養装置はさらに、
前記培養容器から剥離された前記細胞を収容する剥離細胞容器、
前記溶液容器と前記培養容器との間を接続する第1流路、
前記培養容器と前記剥離細胞容器との間を接続する第2流路、
を備え、
前記第1流路と前記第2流路はともに、気密構造を有する
ことを特徴とする請求項1記載の自動培養装置。 - 前記培養容器、前記溶液容器、または前記剥離細胞容器のうち少なくともいずれかは、気密構造を有する
ことを特徴とする請求項9記載の自動培養装置。 - 請求項1から10のいずれか1項記載の自動培養装置を用いて細胞を培養する細胞培養方法。
- 前記細胞培養方法は、前記自動培養装置が備える送液機構を用いて前記溶液を前記溶液容器から前記培養容器に搬送することにより、前記培養容器に対する前記細胞の接着性を低下させて、前記培養容器から前記細胞を剥離する工程を有する
ことを特徴とする請求項11記載の細胞培養方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017221926A JP2019092396A (ja) | 2017-11-17 | 2017-11-17 | 自動培養装置、細胞培養方法 |
PCT/JP2018/038761 WO2019097946A1 (ja) | 2017-11-17 | 2018-10-18 | 自動培養装置、細胞培養方法 |
US16/754,430 US20200318059A1 (en) | 2017-11-17 | 2018-10-18 | Automatic culture system, and cell culture method |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017221926A JP2019092396A (ja) | 2017-11-17 | 2017-11-17 | 自動培養装置、細胞培養方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019092396A true JP2019092396A (ja) | 2019-06-20 |
Family
ID=66539495
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017221926A Pending JP2019092396A (ja) | 2017-11-17 | 2017-11-17 | 自動培養装置、細胞培養方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20200318059A1 (ja) |
JP (1) | JP2019092396A (ja) |
WO (1) | WO2019097946A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7428866B2 (ja) * | 2019-06-20 | 2024-02-07 | シンフォニアテクノロジー株式会社 | 細胞回収方法及び細胞培養装置 |
CN111304079A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-06-19 | 广州浚远康生物科技有限公司 | 一种细胞间内对培养细胞热刺激的方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018139497A (ja) * | 2015-06-10 | 2018-09-13 | 株式会社日立製作所 | 細胞培養容器及び細胞培養方法 |
-
2017
- 2017-11-17 JP JP2017221926A patent/JP2019092396A/ja active Pending
-
2018
- 2018-10-18 WO PCT/JP2018/038761 patent/WO2019097946A1/ja active Application Filing
- 2018-10-18 US US16/754,430 patent/US20200318059A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20200318059A1 (en) | 2020-10-08 |
WO2019097946A1 (ja) | 2019-05-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sebastian et al. | Tissue engineering with electric fields: Immobilization of mammalian cells in multilayer aggregates using dielectrophoresis | |
WO2019097946A1 (ja) | 自動培養装置、細胞培養方法 | |
JP6451023B2 (ja) | 細胞培養基材 | |
JPH05192138A (ja) | 皮膚細胞培養法及び培養皮膚 | |
WO2014142161A1 (ja) | 細胞培養容器、細胞培養装置、及び細胞培養方法 | |
JP6268770B2 (ja) | 細胞剥離方法 | |
WO1993003139A1 (en) | Cell culture support, production thereof, and production of cell cluster using same | |
DE60334025D1 (de) | Verfahren zur herstellung von zellkulturen aus biologischen präparaten für chemotherapeutische und andere assays | |
JP2009538617A (ja) | ヒト胚芽幹細胞の培養方法 | |
JP2008220354A (ja) | 細胞表層蛋白修復方法 | |
JP6189747B2 (ja) | ヒアルロン酸産生能を有する細胞シート及びその製造方法 | |
CN106754724A (zh) | 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法 | |
Hendrick et al. | Adhesion, growth and detachment of cells on modified polystyrene surface | |
Matsushita et al. | Expansion and differentiation of human iPS cells in a three-dimensional culture using hollow fibers and separation of the specific population by magnetic-activated cell sorting | |
JP6277684B2 (ja) | 細胞積層体の製造方法 | |
CN105624115B (zh) | 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基及其诱导方法 | |
JPH05244938A (ja) | 細胞及びその培養法 | |
JP6054223B2 (ja) | 幹細胞培養装置、幹細胞培養方法 | |
JP7271870B2 (ja) | 多能性幹細胞の培養基材及び多能性幹細胞の製造方法 | |
JP4724836B2 (ja) | 細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液 | |
JP2006296257A (ja) | 細胞培養基材及び細胞培養方法 | |
JP2017046592A (ja) | 細胞培養容器および細胞継代培養システム並びに細胞継代培養方法 | |
CN109554336B (zh) | 一种无饲养层的大鼠精原干细胞的分离培养方法 | |
JP2824081B2 (ja) | 細胞培養方法 | |
CN113201483B (zh) | 异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法 |