CN106349385A - 一种从毕赤酵母发酵液中提取γ‑干扰素的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从毕赤酵母发酵液中提取γ‑干扰素的工艺，所述的工艺包括放罐、离心、膜分离、赋形、喷雾干燥步骤。所述赋形步骤：向发酵液中加入赋形剂和保护剂。所述的赋形剂为海藻糖、淀粉、甘露醇、麦芽糊精中的任意一种；赋形剂的浓度为5～20%。所述的保护剂为大豆卵磷脂、赖氨酸、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇20000中的任意一种，保护剂的浓度为1～9%。采用本发明方法从毕赤酵母发酵液中提取γ‑干扰素，γ‑干扰素活性可达3.23×106～4.29×106 IU/ml。

Description

一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺
技术领域
本发明涉及一种干扰素提取工艺，具体地说，涉及一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，属于生物技术领域。
背景技术
肉用畜禽在养殖过程中，病毒性疾病严重威胁着畜禽养殖业的发展。疫苗和抗生素的使用是当前所采取的措施。疫苗只能针对特定病原产生保护，使用时则须考虑病毒变异和多样性。抗生素的使用易造成耐药性，而且容易引起动物体内药物残留，影响人类健康；因此，研制出安全、高效、新型的抗病毒制剂和免疫增强剂成为迫切的需要。
干扰素（interferon, IFN）是一类具有抗病毒、提高免疫、抗肿瘤以及抗寄生虫等多种活性的细胞因子，通过对自身免疫系统的调节来达到抗病毒的目的，无耐药性突变和药物残留，为病毒性疾病的防治提供了新的手段。IFN-γ是诱导并激活巨噬细胞产生杀伤力机制中发现最早、研究最多的细胞因子，它在体外既可以单独应用于疾病的防治，又可以与疫苗联合应用增强和改善其免疫效果。
家禽体内自身存在的干扰素极其微量，不易提取，因此利用基因工程技术生产重组干扰素是解决这一难题的有效途径。
而对于工业化发酵生产干扰素，发酵工艺已经较为成熟；但从发酵液提取γ-干扰素，即发酵液的后提取工艺，目前仍然面临着以下问题：
1、γ-干扰素的活性低；2、γ-干扰素的稳定性差；3、生产时间较长，不利于产业化生产；4、生产成本过高；5、过程复杂。
发明内容
本发明针对以上不足，提供一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，以实现以下发明目的：
1、提高毕赤酵母发酵液中提取的γ-干扰素的活性；
2、提高毕赤酵母发酵液中提取的γ-干扰素的稳定性；
3、缩短从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的时间；
4、降低制备γ-干扰素的成本；
5、简化γ-干扰素的提取工艺。
为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，所述的工艺包括放罐、离心、膜分离、赋形、喷雾干燥步骤。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述赋形步骤：向发酵液中加入赋形剂和保护剂。
所述的赋形剂为海藻糖、淀粉、甘露醇、麦芽糊精中的任意一种。
所述赋形剂的浓度为5～20%。
所述的保护剂为大豆卵磷脂、赖氨酸、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇20000中的任意一种。
所述保护剂的浓度为1～9%。
所述的放罐步骤：调节发酵罐压力为0.03MPa～0.07MPa，调节储料罐压力为零，将发酵液压到储料罐中。
所述的离心步骤：离心机转速为10000～18000rpm，离心机处理量为1.2～1.5 m3/h。
所述的离心机转速进一步优选为12000～15000 rpm。
所述的膜分离步骤：膜分离设备的进口压力为0.5MPa，出口压力0.2MPa；过滤时保持上清液温度为：37℃～40℃，上清液流速为1～1.5m3/h。
所述的喷雾干燥步骤：控制喷雾干燥机的进口温度为110～150℃，出口温度为70～80℃，喷液速度为200～300L /h。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、采用本发明方法从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素，γ-干扰素活性可达3.23×106～4.29×106 IU/ml；
2、采用本发明方法从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素，γ-干扰素稳定性高，存放12个月后产品活性依然可达4.29×106 IU/ml；
3、采用本发明方法从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素，提取时间短，每吨发酵液的提取时间为3.5～4h；
4、采用本发明方法从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素，制备1吨产品的成本价比市场价格低6～8万元；
5、本发明方法工艺简单。
本发明制备γ-干扰素的方法，具有很高的产业化价值，具有广阔的应用市场。
具体实施方式
本发明采用的毕赤酵母（Pichia sp.）保藏号为CICC 1014。
实施例1 一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺
从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素，包括如下步骤：
步骤1 放罐
毕赤酵母发酵的配方为1%毕赤酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、水补齐余量；上述百分数均为质量百分数；毕赤酵母发酵后得到的发酵液存储于发酵罐内；
调节发酵罐压力至0.03MPa，调节储料罐压力为零，利用压力差将经过发酵的毕赤酵母发酵液压到储料罐中。
步骤2 离心
将储料罐内的发酵液通过离心机离心，离心机转速为12000rpm，离心机处理量为1.2m3/h；
所述离心机为串联的两个连续GQ-105型管式离心机，由辽阳隆达制药机械有限公司生产；
离心后，弃去沉淀，上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序。
步骤3 膜分离
将上清液通过2万分子量陶瓷膜设备，进行过滤，过滤压力：进口压力为0.5MPa，出口压力0.2MPa；过滤时保持上清液温度为：40℃，上清液流速为1m3/h；收集透过液。
所述陶瓷膜设备：由安徽普朗膜技术有限公司生产；
小分子物质透过陶瓷膜，含大分子组分的液体被陶瓷膜截留，除去菌体和杂蛋白，从而达到分离、纯化上清液的目的。
步骤4 赋形
在膜分离后的透过液中加入赋形剂、保护剂后，以1000 rpm/min，搅拌20min，得到干扰素提取液；
所述的赋形剂为浓度5%的海藻糖，所述的保护剂为浓度9%的大豆卵磷脂；上述百分数均为质量百分数。
步骤5 喷雾干燥
将干扰素提取液喷雾干燥，采用喷雾干燥机进行喷雾干燥；
所述的喷雾干燥机：由无锡市能达干燥设备有限公司生产；
喷雾干燥条件如下：控制喷雾干燥机的进口温度为110℃，出口温度为70℃，喷液速度为200L /h；
得到γ-干扰素干粉。
实施例2 一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺
从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素，包括如下步骤：
步骤1 放罐
毕赤酵母发酵的配方为1%毕赤酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、水补齐余量；上述百分数均为质量百分数；毕赤酵母发酵后得到的发酵液存储于发酵罐内；
调节发酵罐压力至0.05MPa，调节储料罐压力为零，利用压力差将经过发酵的毕赤酵母发酵液压到储料罐中。
步骤2 离心
将储料罐内的发酵液通过离心机离心，离心机转速为13000rpm，离心机处理量为1.4m3/h；
所述离心机为串联的两个连续GQ-105型管式离心机，由辽阳隆达制药机械有限公司生产；
离心后，弃去沉淀，上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序。
步骤3 膜分离
将上清液通过2万分子量陶瓷膜设备，进行过滤，过滤压力：进口压力为0.5MPa，出口压力0.2MPa；过滤时保持上清液温度为：38.5℃，上清液流速为1.2m3/h；收集透过液；
所述陶瓷膜设备：由安徽普朗膜技术有限公司生产；
小分子物质透过陶瓷膜，含大分子组分的液体被陶瓷膜截留，除去菌体和杂蛋白，从而达到分离、纯化上清液的目的。
步骤4 赋形
在膜分离后的透过液中加入赋形剂、保护剂后，以2000 rpm/min，搅拌20min，得到干扰素提取液；
所述的赋形剂为浓度5%的海藻糖，所述的保护剂为浓度9%的大豆卵磷脂；上述百分数均为质量百分数。
步骤5 喷雾干燥
将干扰素提取液喷雾干燥，采用喷雾干燥机进行喷雾干燥；
所述的喷雾干燥机：由无锡市能达干燥设备有限公司生产；
喷雾干燥条件如下：控制喷雾干燥机的进口温度为135℃，出口温度为75℃，喷液速度为250L /h；
得到γ-干扰素干粉。
实施例3 一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺
从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素，包括如下步骤：
步骤1 放罐
毕赤酵母发酵的配方为1%毕赤酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、水补齐余量；上述百分数均为质量百分数；毕赤酵母发酵后得到的发酵液存储于发酵罐内；
调节发酵罐压力至0.07MPa，调节储料罐压力为零，利用压力差将经过发酵的毕赤酵母发酵液压到储料罐中。
步骤2 离心
将储料罐内的发酵液通过离心机离心，离心机转速为15000rpm，离心机处理量为1.5m3/h；
所述离心机为串联的两个连续GQ-105型管式离心机，由辽阳隆达制药机械有限公司生产；
离心后，弃去沉淀，上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序。
步骤3 膜分离
将上清液通过2万分子量陶瓷膜设备，进行过滤，过滤压力：进口压力为0.5MPa，出口压力0.2MPa；过滤时保持上清液温度为：37℃，上清液流速为1.5m3/h；收集透过液；
所述陶瓷膜设备：由安徽普朗膜技术有限公司生产；
小分子物质透过陶瓷膜，含大分子组分的液体被陶瓷膜截留，除去菌体和杂蛋白，从而达到分离、纯化上清液的目的。
步骤4 赋形
在膜分离后的透过液中加入赋形剂、保护剂后，以3000 rpm/min，搅拌20min，得到干扰素提取液；
所述的赋形剂为浓度5%的海藻糖，所述的保护剂为浓度9%的大豆卵磷脂；上述百分数均为质量百分数。
步骤5 喷雾干燥
将干扰素提取液喷雾干燥，采用喷雾干燥机进行喷雾干燥；
所述的喷雾干燥机：由无锡市能达干燥设备有限公司生产；
喷雾干燥条件如下：控制喷雾干燥机的进口温度为150℃，出口温度为80℃，喷液速度为300L /h；
得到γ-干扰素干粉。
对实施例1-3制备的γ-干扰素检测结果见表1；
用细胞病变抑制法测定干扰素的活性，采用CEF/VSV系统检测干扰素的生物活性，由标准品计算出样品的效价。参照《中华人民共和国药典》2005年版。
表1 采用实施例1-3的方法制备的γ-干扰素活性
由表1可知，采用实施例1-3的方法制备的γ-干扰素活性为3.23×106～3.66×106IU/ml。
实施例4 采用的赋形剂和保护剂正交实验
采用实施例2的工艺，控制因素：赋形剂及其浓度和保护剂及其浓度，进行正交实验，制备γ-干扰素，正交试验因素具体见表2，正交试验结果与分析具体表3、表4；
表2 正交试验因素水平表
表3正交试验结果与分析
表4 方差分析表
从表3和表4可以看出，影响因素A-D中，对制备的γ-干扰素活性的影响程度由大到小为保护剂的种类＞赋形剂的种类＞赋形剂的浓度＞保护剂的浓度；经试验，赋形剂的种类优选为麦芽糊精，赋形剂浓度优选为15%，保护剂的种类优选为聚乙二醇20000，保护剂浓度优选为1%；
上述百分数均为质量百分数。
实施例5 一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺
从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素，包括如下步骤：
步骤1 放罐
毕赤酵母发酵的配方为1%毕赤酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、水补齐余量；上述百分数均为质量百分数；毕赤酵母发酵后得到的发酵液存储于发酵罐内；
调节发酵罐压力至0.05MPa，调节储料罐压力为零，利用压力差将经过发酵的毕赤酵母发酵液压到储料罐中。
步骤2 离心
将储料罐内的发酵液通过离心机离心，离心机转速为13000rpm，离心机处理量为1.4m3/h；
所述离心机为串联的两个连续GQ-105型管式离心机，由辽阳隆达制药机械有限公司生产；
离心后，弃去沉淀，上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序。
步骤3 膜分离
将上清液通过2万分子量陶瓷膜设备，进行过滤，过滤压力：进口压力为0.5MPa，出口压力0.2MPa；过滤时保持上清液温度为：38.5℃，上清液流速为1.2m3/h；收集透过液；
所述陶瓷膜设备：由安徽普朗膜技术有限公司生产；
小分子物质透过陶瓷膜，含大分子组分的液体被陶瓷膜截留，除去菌体和杂蛋白，从而达到分离、纯化上清液的目的。
步骤4 赋形
在膜分离后的透过液中加入赋形剂、保护剂后，以2000 rpm/min，搅拌20min，得到干扰素提取液；
所述的赋形剂为15%麦芽糊精，所述的保护剂为1%的聚乙二醇20000；上述百分数均为质量百分数。
步骤5 喷雾干燥
将干扰素提取液喷雾干燥，采用喷雾干燥机进行喷雾干燥；
所述的喷雾干燥机：由无锡市能达干燥设备有限公司生产；
喷雾干燥条件如下：进口温度为135℃，出口温度为75℃，喷液速度为250L /h；
得到γ-干扰素干粉。
经检测，本实施例制备γ-干扰素，喷雾干燥后与喷雾干燥前的活性比为100%，可有效保证γ-干扰素的活性，制备的γ-干扰素活性为4.29×106 IU/ml，。
对制备的γ-干扰素进行稳定性实验，具体方法如下：
取制备的γ-干扰素干粉，在室温下，放存12个月，分别在3、6、9、12个月时进行活性检测，具体结果见表5；
表5 时间对所制备γ-干扰素成品稳定性的影响
从表5可见，本发明方法制备的γ-干扰素不但具备高生物活性，而且具备高稳定性，存放12个月后γ-干扰素活性为4.29×106 IU/ml。
本发明制备γ-干扰素的方法，无需昂贵的价格，提取时间短,每吨发酵液的提取时间为3.5～4h；生产成本低，制备1吨产品的成本价比市场价格低6-8万元；得到的γ-干扰素活性高，活性可达3.23×106～4.29×106 IU/ml；得到的γ-干扰素稳定性高，存放12个月后产品活性依然可达4.29×106 IU/ml，不宜吸潮变质，具有很高的产业化价值，具有广阔的应用市场。
本发明所述的γ-干扰素为鸡γ-干扰素。
以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述的工艺包括放罐、离心、膜分离、赋形、喷雾干燥步骤。
2.根据权利要求1所述的一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述赋形步骤：向发酵液中加入赋形剂和保护剂。
3.根据权利要求2所述的一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述的赋形剂为海藻糖、淀粉、甘露醇、麦芽糊精中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述赋形剂的浓度为5～20%。
5.根据权利要求2所述的一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述的保护剂为大豆卵磷脂、赖氨酸、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇20000中的任意一种。
6.根据权利要求2所述的一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述保护剂的浓度为1～9%。
7.根据权利要求1所述的一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述的放罐步骤：调节发酵罐压力为0.03MPa～0.07MPa，调节储料罐压力为零，将发酵液压到储料罐中。
8.根据权利要求1所述的一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述的离心步骤：离心机转速为10000～18000rpm，离心机处理量为1.2～1.5 m3/h。
9.根据权利要求1所述的一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述的膜分离步骤：膜分离设备的进口压力为0.5MPa，出口压力0.2MPa；过滤时保持上清液温度为：37℃～40℃，上清液流速为1～1.5m3/h。
10.根据权利要求1所述的一种从毕赤酵母发酵液中提取γ-干扰素的工艺，其特征在于：所述的喷雾干燥步骤：控制喷雾干燥机的进口温度为110～150℃，出口温度为70～80℃，喷液速度为200～300L /h。
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