CN105647951A - 藻蓝蛋白β亚基C端结构域的克隆与表达 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及藻蓝蛋白β亚基C端结构域基因的克隆表达。通过基因工程手段将藻蓝蛋白β亚基C端结构域基因克隆于pET-32a质粒载体，重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21中。构建的工程菌的表达产物用镍亲和层析柱纯化后，达电泳纯。

Description

藻蓝蛋白β亚基C端结构域的克隆与表达
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及藻蓝蛋白β亚基C端结构域的克隆与表达。
技术背景
藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)是钝顶螺旋藻含有的多种生物活性成分之一。它普遍存在于蓝藻细胞中，是一种特殊的捕光色素蛋白，具有抗疲劳、抗辐射、抗病毒、抑制肿瘤、抗过敏、增强免疫力、清除自由基等多种活性功能。藻蓝蛋白由α亚基和β亚基组成。α亚基由162个氨基酸残基组成。β亚基由172个氨基酸残基组成。研究发现，藻蓝蛋白尤其是藻蓝蛋白β亚基具有抗炎和抗肿瘤活性。同等摩尔浓度下，藻蓝蛋白β亚基较藻蓝蛋白和藻蓝蛋白α亚基具有更好的抗肿瘤活性。藻蓝蛋白β亚基由六段α螺旋组成，本发明将含有藻蓝蛋白β亚基靠近C端的两段α螺旋结构域的基因片段用大肠杆菌克隆和表达，为研究该结构域功能奠定基础。
发明内容
本发明所述的藻蓝蛋白β亚基C端结构域的融合蛋白是通过重组质粒构建后转化到感受态大肠杆菌，通过诱导表达，纯化所得蛋白而得。其制备方法如下：
从本实验室保存的含有藻蓝蛋白全部β亚基和部分α亚基基因的重组质粒，PCR法扩增出β亚基C端结构域的基因片段，用内切酶BamHI、HindIII37℃双酶切β亚基C端结构域的基因片段和pET-32a质粒1.5h，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物再16℃连接16h。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21中。工程菌用LB培养基培养到细菌达到对数生长期，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，20℃诱导表达10h。诱导结束后，高速冷冻离心机于8000rpm，15min离心收集菌体，按照每收集1g菌体加入40ml缓冲液的比例，用缓冲液重悬菌体。60％功率超声破碎，并在破碎前加入终浓度为100μg/mL的PMSF以减少蛋白酶的降解作用。12000rpm，30min收集破碎后的上清液。用镍亲和层析柱分离纯化得到藻蓝蛋白β亚基C端结构域的融合蛋白。
附图说明
图1为PCR扩增出的藻蓝蛋白β亚基C端结构域的基因序列。M：DNAMarker；1：藻蓝蛋白β亚基C端结构域基因。
图2为菌液PCR扩增出的藻蓝蛋白β亚基C端结构域的基因序列。M：DNAMarker；1：藻蓝蛋白β亚基C端结构域基因。
图3为提取的重组质粒双酶切验证。M：DNAMarker；1：双酶切得到的藻蓝蛋白β亚基C端结构域基因。
图4为融合蛋白镍亲和层析柱纯化结果。M：蛋白marker；1：诱导前菌体；2：诱导后菌体；3：菌体超声破碎离心后上清；4：菌体超声破碎离心后沉淀；5：透析后融合蛋白镍亲和层析柱纯化效果；6：透析前融合蛋白镍亲和层析柱纯化效果。
具体实施方式
下面结合一些实例并参照图表数据对本发明做进一步的说明。应理解，这些实施
例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
含藻蓝蛋白β亚基C端结构域基因的重组质粒的构建
选择藻蓝蛋白β亚基C端结构域对应的基因序列克隆，序列长度为153bp。在目的基因的上下游引物中分别加入BamHI、HindIII酶切位点。用本实验室保存的含藻蓝蛋白全部β亚基和部分α亚基基因的重组质粒pMD18-T-PC作为模板，并进行PCR扩增β亚基C端结构域对应基因。PCR反应结束后，产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，如图1，切下含有目的DNA的凝胶，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收目的DNA片段。目的基因片段与pET-32a质粒载体同时双酶切，取双酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，切下含有目的DNA的凝胶，按照凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。将目的基因片段与双酶切后的原核表达载体pET-32a在16℃、16h条件下连接。
实施例2
重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21中
取连接产物10μl加入到50μl已制备好的大肠杆菌BL21感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min；42℃水浴中热激90s后，迅速再次冰浴3min；加入500μlLB液体培养基并充分混匀，37℃、220rpm振摇培养1h；离心弃上清留取约100μl转化菌液，涂布于含氨苄青霉素(Amp+，100μg/mL)的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16h。挑取转化成功的单克隆进行菌液PCR验证(图2)、提取质粒双酶切验证(图3)，并测序。
实施例3
工程菌的诱导表达
将保存的菌种在平板上划线培养，37℃，12h。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(Amp+，100μg/mL)的LB培养基的小试管中，37℃，220rpm，12h摇至菌液饱和。将饱和菌液按照1∶100的比例转接到含LB培养基的大锥形瓶中，37℃，220rpm摇至OD600nm值在0.6～0.8之间。加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，20℃诱导表达10h。8000rpm，15min离心收集菌体。
实施例4
融合蛋白的纯化
收集的菌体用缓冲液重悬，加入终浓度为100μg/mL的PMSF，按超声时间3s间隙时间5s、超声功率60％的程序超声，至重悬菌液由乳白色到清澈为止，期间用冰水混合物冰浴。超声结束后，用高速冷冻离心机于4℃、12000rpm离心30min收集上清。镍离子亲和层析柱纯化蛋白：用结合缓冲液平衡柱子，待缓冲液流尽时，加入已经过0.45μm微孔滤膜过滤后的超声破碎后的上清液，待上清液即将流尽，再用结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白。最后用含有150mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液并浓缩处理，用0.22μm无菌滤器过滤后加入终浓度为10％的无菌甘油，-80℃保存。

Claims (4)

1.一种藻蓝蛋白β亚基C端结构域基因在质粒载体上的克隆，其特征在于：质粒载体为pET-32a，酶切位点为BamHI、HindIII。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21中以表达融合蛋白。
3.一种权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：PCR法扩增出藻蓝蛋白β亚基C端结构域基因，将扩增出的基因片段和质粒载体pET-32a同时用BamHI、HindIII内切酶于37℃双酶切1.5h，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物，16℃连接16h。
4.根据权利要求3所述，一种构建的工程菌表达的融合蛋白，其特征在于：融合蛋白用镍亲和层析柱纯化后，达电泳纯。
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