CN101501190A - 无催化活性的蛋白以及用于恢复来自植物源材料的酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于在含有一种或多种活性木聚糖酶和木聚糖酶抑制剂的植物源材料中恢复木聚糖酶活性的无活性的木聚糖酶分子。该无活性的木聚糖酶分子与植物源材料中的木聚糖酶抑制剂结合，因而允许准确测量植物源材料中所含酶的木聚糖酶活性。本发明还包括由SEQ IDNO.4至112表示的氨基酸分子，其中每个氨基酸分子的催化活性位点都被修饰从而产生无活性的木聚糖酶分子。制备所述无活性的木聚糖酶分子的方法包括：使用表达盒使所述无活性的木聚糖酶分子表达在微生物或真核生物(例如，包括巴斯德毕赤酵母在内的酵母)宿主细胞中，该表达盒包含可操作地连接到编码该无活性的木聚糖酶分子的核酸分子的启动子；以及在测试中使用所表达的分子来恢复植物源材料中(例如，诸如动物饲料等植物源材料中)的木聚糖酶活性。
Description
发明领域
本发明涉及用于产生无催化活性的蛋白的突变木聚糖酶编码序列。本发明还涉及这些突变木聚糖酶在微生物和酵母中的表达。本发明还涉及无催化活性的蛋白在改善来自诸如经配制的动物饲料等植物源材料中的木聚糖酶活性的可恢复性方面的用途。
发明背景
木聚糖是由β-1，4连接的D-吡喃木糖形成的直链多糖。木聚糖往往含有α-1，2、α-1，3、或α-1，2和α-1，3连接的L-阿拉伯呋喃糖苷的侧链。这些被取代的木聚糖通常称为阿拉伯木聚糖。木聚糖和阿拉伯木聚糖是植物中主要的非淀粉多糖(NSP)之一。这些NSP形成可在烘烤、酿造和动物饲料应用中造成麻烦的粘稠溶液。例如，在烘烤应用中制备生面团时，木聚糖和阿拉伯木聚糖的存在会导致粘连到器具上和造成污染问题的粘面团。在酿造应用中，木聚糖和阿拉伯木聚糖增加了麦芽汁的粘度因此对其可滤性造成负面影响，这是个潜在的费钱费时的问题。在动物饲料应用中，非淀粉多糖(NSP)关系到与消化物的粘度变化有关的鸡用谷类的营养质量的变化性(Bedford，M.R.& H.L.Classen)。在纸浆和纸张应用中，木聚糖以及与其实体上相关联的木质素结合在纤维素上。经常使用强力漂白化学物质以除去木质素并增加纤维素的白度。
木聚糖酶(例如，内-1，4-β-木聚糖酶，EC 3.2.1.8)分解植物中的非淀粉多糖。在自然界中，植物病原体诸如真菌和细菌产生木聚糖酶来消化植物结构物质。木聚糖酶水解木聚糖的内部β-1，4-木糖苷键而生成分子量更小的木糖低聚物(xylo-oligomer)。木聚糖酶主要属于两个糖苷水解酶家族，10和11。第10和11族酶依靠活性位点催化残基来水解木聚糖键。该活性位点包括亲核体催化残基和酸/碱催化残基。例如，第11族木聚糖酶含有对应于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)木聚糖酶的第78位的亲核体催化残基和对应于该酶第172位的酸/碱催化残基。其他催化残基是已知的。另外还显示这些位点的氨基酸取代会产生无活性的酶。(Wararchuk等；Lawson等)
在大量工业应用中向使用的植物源材料中加入了木聚糖酶。例如，木聚糖酶用于加工和制造人类食物中。一直作为人类食物的谷类和面粉可以用木聚糖酶进行酶促处理来减少其中的木聚糖含量。木聚糖含量的降低通过提高诸如铁、钙、锌等必需矿物质的营养利用率从而提高了食物的质量。除了提高食物的营养质量，在食品加工过程中使用的木聚糖酶还能提高食品生产方法的整体效率。
在酿造工业中向麦芽汁中加入木聚糖酶可改善发酵。在纸张漂白过程中也向纸浆中加入木聚糖酶以降解木聚糖并增加纸张亮度。
木聚糖酶还可以有利地用于单胃动物和多胃动物，尤其是犊牛。鱼和甲壳类动物的饲粮中也可以添加木聚糖酶以进一步提高饲料的转化率。还可将添加了木聚糖酶的饲料供给动物，诸如禽类(例如火鸡、鹅、鸭)和猪、马、牛、绵羊、山羊、犬科动物和猫科动物，以及鱼和甲壳类动物。当添加到含谷类(例如大麦、小麦、玉米、黑麦、黑小麦或燕麦)或谷类副产品的动物饲料(如用于单胃动物，包括家禽或猪)时，木聚糖酶促进了植物细胞壁的分解从而提高动物对植物营养的利用。这导致了生长速率和饲料转化的提高。而且，含有木聚糖的饲料的粘度会因木聚糖酶的存在而降低。
对于动物饲料，由添加木聚糖酶而引起的表观代谢能的增加是难以预计的。当前技术无法准确地测定动物饲料中的木聚糖酶活性。木聚糖酶活性的准确恢复对于持续优化动物饲料配方是必需的。
可能造成木聚糖酶活性恢复困难的几个因素包括酶与植物材料成分(例如，纤维素多糖或半纤维素多糖)的物理结合、盐或重金属的抑制、内源性木聚糖酶抑制剂的抑制、或被内源性植物蛋白酶降解。在木聚糖酶含量非常低(例如，ppb或ppm)的某些应用(例如，动物饲料)中这个问题可能会更严重。在动物饲料应用中，准确测定木聚糖酶活性，即“木聚糖酶恢复”，是很难的。为饲料应用设计的大多数的商品化木聚糖酶由于其酶促活性在经配制的饲料中的较差的可恢复性而未被选用。这个问题对于恢复仅为10-20％的某些酶而言尤其尖锐。
因此，必需发展组合物和方法以改善在诸如动物饲料和谷类加工、生物燃料、清洁、织物护理、化学品、植物加工、纸浆和纸张的除木素和增亮及其他等的各种工业应用中木聚糖酶活性的恢复。
发明概述
本发明包括在用于在含一种或多种的活性木聚糖酶的植物源材料中恢复木聚糖酶活性的新方法中使用的无活性的木聚糖酶分子。本发明的无活性的木聚糖酶能在植物源材料中与木聚糖酶抑制剂结合，从而使本发明的方法可以在诸如饲料制品等植物源材料中测量具酶促功能的木聚糖酶的活性。
本发明还包含了用于评估诸如动物饲料、纸浆、麦芽汁等材料中所含的木聚糖酶的质量的方法。另外，本发明包括针对所有这些材料用于确定木聚糖酶活性的比较值的方法。
本发明还包含了用于从诸如饲料制品等含有一种或多种可能的木聚糖酶抑制剂的植物源材料中恢复木聚糖酶活性的方法，该方法包括以下步骤：提供能与木聚糖酶抑制剂分子结合的无活性的木聚糖酶分子、将无活性的木聚糖酶分子与含有活性木聚糖酶和可能的木聚糖酶抑制剂的材料在足以使该无活性的木聚糖酶分子和所述木聚糖酶抑制剂直接或间接结合到一起的条件下混合，和测量木聚糖酶的活性。
本发明还提供了包含SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.113的木聚糖酶，其中当这些酶的催化活性位点被修饰时即产生无活性的木聚糖酶分子。
本发明还提供了制备无催化活性的木聚糖酶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：使表达盒在微生物或真核生物(例如，包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)在内的酵母)宿主细胞中表达，所述表达盒包含可操作地连接到编码突变的木聚糖酶的核酸分子的启动子，所述突变的木聚糖酶展现低于0.1％的在相同条件下检测的野生型蛋白的活性。本发明还提供了利用含有突变的无催化活性的木聚糖酶的缓冲液或溶液提取动物饲料的方法。
本发明还提供了改善从饲料中恢复木聚糖酶活性的方法，包括使用含有无催化活性的木聚糖酶的缓冲液或溶液。
本发明还包括经修饰的木聚糖酶多肽，其中，该修饰位于SEQ IDNO.3所表示的氨基酸序列的第78号氨基酸残基处或其他同源木聚糖酶多肽的等效位置，其中所述经修饰的木聚糖酶多肽是无活性的但保留其与木聚糖酶抑制剂结合的能力。
本发明还包括经修饰的木聚糖酶多肽，其中，该修饰位于SEQ IDNO.3所表示的氨基酸序列的第78位氨基酸残基处或第11类木聚糖酶多肽的等效位置。
本发明提供了经修饰的木聚糖酶多肽，其中，该修饰位于SEQ IDNO.3所表示的氨基酸序列的第78位氨基酸残基处或SEQ ID NO.4至114所表示的木聚糖酶氨基酸序列的等效位置。
本发明还提供了编码所述经修饰的木聚糖酶多肽的分离的核酸分子。
本发明还包括表达盒，其含有编码无活性的木聚糖酶蛋白的核酸分子。
附图说明
图1为pTrcHis_Xy1A1A质粒的载体图谱。
图2为pTrcHis_Xy1A1_E79A质粒的载体图谱。
图3为pCR4Blunt Xy1A1A_E79A质粒的载体图谱。
图4为pIC9 Xy1A1A_E79A质粒的载体图谱。
图5为一个表，其展示SEQ ID NO.3至113木聚糖酶氨基酸序列的比对。
序列表的简要说明
SEQ ID NO.1为Xy1A1A_E79A基因的编码区的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2为Xy1A1A_E79A基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3为Xy1A1A-木聚糖酶基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.4为斑点气单胞菌ME-1(Aeromonas punctata ME-1)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.5为豌豆壳二孢(Ascochyta pisi)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.6为鹰嘴豆壳二孢(Ascochyta rabiei)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.7为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.8为泡盛曲霉ATCC11358(Aspergillus awamoriATCC11358)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.9为黑曲霉BCC14405(Aspergillus of.nigerBCC14405)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.10为白曲霉(Aspergillus kawachii)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.11为白曲霉IFO4308(Aspergillus kawachiiIFO4308)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.12为构巢曲霉FGSCA4(Aspergillus nidulans FGSCA4)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.13为黑曲霉木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.14为黑曲霉木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.15为黑曲霉木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.16为黑曲霉IFO4066(Aspergillus niger IFO4066)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.17为米曲霉(Aspergillus oryzae)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.18为米曲霉木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.19为塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.20为出芽短梗霉melanigenum变种(Aureobasidiumpullulans var.melanigenum)木聚糖酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO.21为出芽短梗霉(Auerobasidium pullulans)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.22为Bacillus agaradhaerens AC13木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.23为环状芽孢杆菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.24为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.25为坚强芽孢杆菌K-1(Bacillus firmus K-1)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.26为耐盐芽孢杆菌C-125(Bacillus haloduransC-125)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.27为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.28为短小芽孢杆菌HB030(Bacillus pumilus HB030)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.29为芽孢杆菌属的种(Bacillus sp.)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.30为芽孢杆菌属的种YA-14(Bacillus sp.YA-14)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.31为芽孢杆菌属的种YA-335(Bacillus sp.YA-335)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.32为枯草芽孢杆菌B230(Bacillus subtilis B230)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.33为枯草芽孢杆菌亚种subtilis str.168(Bacillussubtilis subsp.subtilis str.168)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.34为热解纤维素菌属的种Rt69B.1(Caldicellulosiruptor sp.Rt69B.1)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.35为粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.36为Cellulomonaspa chnodae木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.37为Cellvibrio japonicus木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.38为混合纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.39为细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.40为细丽毛壳菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.41为嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.42为嗜热毛壳菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.43为嗜热毛壳菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.44为紫麦角菌(Claviceps purpurea)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.45为噬纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.46为Clostridium saccharobutylicum P262的木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.47为粪堆梭菌F-9(Clostridium stercorarium F-9)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.48为热纤维梭菌F1/YS(Clostridium thermocellumF1/YS)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.49为热纤维梭菌F1/YS木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.50为玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.51为玉米圆斑病菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.52为玉米圆斑病菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.53为禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.54为隐球酵母属的种S-2(Cryptococcus sp.S-2)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.55为嗜热网球菌Rt46B.1(Dictyoglomusthermophilum Rt46B.1)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.56为构巢裸孢壳菌(Emericella nidulans)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.57为产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.58为番茄尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.59为番茄尖镰孢菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.60为嗜热脂肪地芽胞杆菌No.236(Geobacillusstearothermophilus No.236)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.61为玉蜀黍赤霉180378(Gibberella zeae 180378)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.62为大斑病长蠕孢(Helminthosporium turcicum)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.63为灰色腐质霉高温变种60849(Humicola griseavar.thermoidea 60849)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.64为特异腐质霉(Humicola insolens)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.65为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.66为红褐肉座菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.67为Hypocrea lixii E58木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.68为埃杜拉香菇Stamets CS-2(Lentinula edodesStamets CS-2)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.69为稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.70为Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.71为Neocallimastix patriciarum木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.72为Neocallimastix patriciarum木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.73为Neocallimastix patriciarum MCH3木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.74为粗糙脉孢菌OR74A(Neurospora crassa OR74A)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.75为粗糙脉孢菌OR74A木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.76为Nonomuraea flexuaosa木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.77为Orpinomyces sp.PC-2木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.78为宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti Bainier)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.79为绳状青霉(Penicillium funiculosum)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.80为绳状青霉木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.81为产紫青霉(Penicillium purpurogenum)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.82为辣根猿叶甲(Phaedon cochleariae)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.83为黄孢原毛平革菌ME446(Phanerochaetechrysosporium ME446)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.84为树干毕赤酵母(Pichia stipitis)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.85为Piromyces sp.木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.86为Polyplastron mutivesiculatum木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.87为假单胞菌属的种ND137(Pseudomonas sp.ND137)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.88为白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.89为白色瘤胃球菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.90为黄色瘤胃球菌17(Ruminococcus flavefaciens17)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.91为黄色瘤胃球菌17木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.92为黄色瘤胃球菌17木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.93为黄色瘤胃球菌17木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.94为瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.95为裂褶菌(Schizophyllum commune)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.96为嗜酸色串菌(Scytalidium acidophilum)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.97为嗜热色串菌Af101-3(Scytalidium thermophilumAf101-3)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.98为大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.99为天蓝色链霉菌A3(Streptomyces coelicolor A3)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.100为天蓝色链霉菌A3木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.101为变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.102为变铅青链霉菌木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.103为橄榄绿链霉菌E-86(Streptomycesolivaceoviridis E-86)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.104为链霉菌属的种EC3(Streptomyces sp.EC3)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.105为链霉菌属的种S38(Streptomyces sp.S38)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.106为热蓝紫色链霉菌(Streptomycesthermocyaneoviolaceus)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.107为热紫链霉菌OPC-520(Streptomycesthermoviolaceus OPC-520)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.108为绿孢链霉菌(Streptomyces viridosporus)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.109为嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.110为疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.111为木霉属的种SY(Trichoderma sp.SY)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.112为绿色木霉(Trichoderma viride)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.113为绿色木霉YNUCC0183(Trichoderma virideYNUCC0 183)木聚糖酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO.114为pTrcHis_Xy1A1A质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO.115为pTrcHis_Xy1A1A_E79A质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO.116为pCR4BluntXy1A1A_E79A质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO.117为pPIC9Xy1A1A_E79A质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO.118为Xy1A1A的氨基酸序列。
SEQ ID NO.119为Xy1A1A的核苷酸序列。
SEQ ID NO.120为Xy1A1A_E79A的氨基酸序列。
SEQ ID NO.121为引物1的核苷酸序列。
SEQ ID NO.122为引物2的核苷酸序列。
SEQ ID NO.123为引物3的核苷酸序列。
SEQ ID NO.124为引物4的核苷酸序列。
SEQ ID NO.125为引物5的核苷酸序列。
SEQ ID NO.126为引物6的核苷酸序列。
SEQ ID NO.127为引物7的核苷酸序列。
SEQ ID NO.128为引物8的核苷酸序列。
发明详述
本发明涉及一种或多种无催化活性的木聚糖酶作为提取含有木聚糖酶的诸如纸浆、麦芽汁以及人类食物和动物饲料或饲料原料等植物源材料所用缓冲液或溶液的添加剂的用途。
本发明还包括用于改善从含有一种或多种木聚糖酶的植物源材料中恢复木聚糖酶活性的组合物及方法。
本发明还包括编码无催化活性的木聚糖酶的核酸分子(即多核苷酸)。
“活性木聚糖酶”指处于正常野生型构象(例如，催化活性状态，与无活性的状态相反)的木聚糖酶蛋白。该活性状态使蛋白能够正常发挥功能。活性位点是在具生物活性的位点处的可用的野生型构象，例如，诸如酶的催化位点、辅因子结合位点、受体与其配体的结合位点以及蛋白质复合物的结合位点等。
从包括真菌和细菌在内的各种生物都可获得编码野生型木聚糖酶的核酸分子。“序列表的简要说明”描述了第11族木聚糖酶(SEQ IDNO.4至113)的氨基酸序列，其中，根据本发明，对它们的催化残基的修饰可以产生无活性的木聚糖酶蛋白。
本发明的木聚糖酶的无活性的状态可由相应木聚糖酶的亲核体和/或酸/碱催化残基的变性、共价或非共价地与抑制剂结合、突变、二次处理(例如磷酸化或去磷酸化)等造成。本发明的无活性的木聚糖酶分子也可以通过在木聚糖酶多肽序列中加入一个或多个氨基酸、在其多肽序列中缺失一个或多个氨基酸残基、在任一端延长多肽链并将其转化为酶原状形态(zymogen-like form)、木聚糖酶多肽序列的环状变换(circular permutation)以及其他蛋白质工程方法获得。所述多肽序列的简单修饰可以用诸如定点诱变等各种标准技术实现。
通过使用包括基于机理的不可逆抑制剂在内的小分子抑制剂来敲除木聚糖酶活性也在本发明范围内。(Gloster等(2003)Chem Commun(Camb).(8)：944-5.Ziser等(1995)Carbohydr Res.274：137-53.)其他本领域技术人员已知的和未知的使木聚糖酶失活的方法也在本发明范围内。就目前的目的而言，术语“经修饰的”是指已经变为无催化活性的木聚糖酶。变为无活性的木聚糖酶在本文也称作“无活性的木聚糖酶蛋白”或“无活性的木聚糖酶分子”。
本发明的无活性的木聚糖酶蛋白包括木聚糖酶蛋白，其与野生型蛋白相比在约37℃下可具有小于比活性的0.1％的活性，并且其保留了与木聚糖酶抑制剂相互作用能力。在另一实施方案中，本发明的无活性的木聚糖酶蛋白保留低于0.01％的野生型蛋白比活性但仍保留与木聚糖酶抑制剂相互作用的能力。在本发明的另一实施方案中，所述无活性的木聚糖酶保留低于1％的野生型蛋白比活性但仍保留与木聚糖酶抑制剂相互作用的能力。
本发明包括在不存在糖基化时为无活性的经修饰的木聚糖酶。可选择地，本发明包括表达被宿主糖基化的无活性的木聚糖酶蛋白。
本发明的方法包括含有表达盒的微生物宿主细胞，该表达盒包含可操作地连接到编码无催化活性的木聚糖酶分子的核酸分子的启动子。所述微生物宿主细胞可以是原核细胞，诸如细菌细胞(例如，埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)或汉逊酵母属(Hansenula))或真菌细胞(例如，曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。
本发明还包括保留结合木聚糖酶抑制剂的能力的无活性的木聚糖酶分子。
本发明还包括编码突变的无活性的木聚糖酶的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接到至少一个调节序列，诸如启动子、增强子、内含子、终止序列或任何这些序列的组合等，并且任选地该多核苷酸可操作地连接到编码信号序列的第二多核苷酸，其将第一多核苷酸所编码的酶引导到如胞外区域等的特定细胞区域。启动子可为组成型启动子或诱导型(条件型)启动子。如本文所述，对编码木聚糖酶的亲本多核苷酸的诱变被用于制备编码突变的无催化活性的木聚糖酶分子(该木聚糖酶分子与由亲本多核苷酸编码的木聚糖酶相比具有削弱的生化性质)的变异(合成)DNA，且其中该无活性的木聚糖酶保留有结合木聚糖酶抑制剂的能力。在本发明的一个实施方案中，对突变的、无催化活性的木聚糖酶分子进行筛选以得到在亲本木聚糖酶将具有活性的pH值和温度条件下丧失活性的、与木聚糖酶抑制剂的结合未改变的或得到改善的、或改善从含木聚糖酶抑制剂的溶液中恢复木聚糖酶的木聚糖酶分子。在另一实施方案中，将大量变异DNA中的突变进行组合以制备编码突变的无催化活性的木聚糖酶分子的合成多核苷酸，所述突变的无催化活性的木聚糖酶分子与木聚糖酶抑制剂结合更强并且与由亲本多核苷酸编码的木聚糖酶相比比活性低于0.1％。
可以从包括植物、细菌或真菌核酸在内的任何来源中获得野生型木聚糖酶多核苷酸，并且可以使用任何方法来从所选定的野生型多核苷酸制备本发明的合成多核苷酸，例如，组合诱变、递归诱变(recursive mutagenesis)和/或DNA混编(DNA Shuffling)。
因此，在本发明的一个实施方案中，突变木聚糖酶相对于野生型木聚糖酶具有一个或多个氨基酸的取代，这些取代与其活性相对于亲本木聚糖酶在相同温度和pH值条件下测试时降低超过99％相关。在本发明的另一实施方案中，突变木聚糖酶相对于野生型木聚糖酶具有一个或多个氨基酸的取代，这些取代与其活性相对于该野生型木聚糖酶在相同温度和pH值条件下测试时降低超过99.9％相关。在本发明的另一实施方案中，突变木聚糖酶相对于野生型木聚糖酶具有一个或多个氨基酸的取代，这些取代与其活性相对于该野生型木聚糖酶在相同温度和pH值条件下测试时降低超过99.99％相关。
在另一实施方案中，所述突变的无催化活性的木聚糖酶具有低于野生型的0.1％的比活性、或低于野生型的0.01％的比活性、或低于野生型的0.001％的比活性，并且在37℃和pH5.0至5.5下比活性小于1.0U/mg，更优选小于0.1U/mg，最优选小于0.01U/mg。一个木聚糖酶单位(XU)为在标准条件下在37℃和pH5.3时每分钟从WAXY(小麦阿拉伯木聚糖)释放1μmol还原端(木糖等价物)的酶量。
本发明还提供了含有至少一个编码SEQ ID NO.4至113的蛋白氨基酸分子的核苷酸序列的重组宿主细胞，其中该蛋白的一个或多个催化活性位点残基失活。该重组宿主细胞可以为细菌、酵母菌或真菌细胞。具体而言，宿主细胞为埃希氏菌属、假单胞菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、曲霉属或木霉属细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。在本发明的另一实施方案中，本发明的载体包含pTrcHis_Xy1A1A_E79A(SEQ ID NO.114)和/或pPIC9_Xy1A1A_E79A(SEQ ID NO.117)。
本发明还提供经修饰的无催化活性的木聚糖酶制剂或经配制的酶混合物。该酶制剂还包含稳定性化合物，诸如但不限于山梨醇。该突变的无活性的木聚糖酶分子或其制剂可以作为补充剂在加工前、加工中或加工后添加以便从诸如人类食物或饮料或动物饲料等植物源材料中或者从食物、饮料和饲料的组分中恢复木聚糖酶的活性。
在一个实施方案中，向饲料组分的混合物中加入本发明的无活性的木聚糖酶以提高在颗粒机中的热(例如，蒸汽)调节之前和/或之后添加的木聚糖酶的可恢复性。
本发明还提供了制备含有无催化活性的木聚糖酶的饲料制品用组合物的方法，该组合物通过将含有本发明的无活性的木聚糖酶分子的液体溶液与膳食粉(例如大豆粉)混合得到混合物、然后将该混合物干燥得到干制组合物来制备。混合物的干燥可以用本领域的常规技术(包括但不限于冻干和/或加热)来完成。
本发明的无活性的木聚糖酶分子以及上述酶混合物均可加入到含有木聚糖酶的所有饲料原料中以提高木聚糖酶活性的恢复。适合的优选实例为符合饲料原料法规规定的那些，诸如预混饲料(premix)、全价饲料、补充饲料和矿物质饲料。
本发明的无活性的木聚糖酶可以用于任何使用木聚糖酶的应用中，诸如但不限于谷类加工、生物燃料、清洁、织物护理、化学品、植物加工以及纸浆和纸张的除木素和增亮。
与本发明相关的可使用的载体的构建由于现有公开内容(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press，1989；Gelvin等，Plant Molecular Biology Manual，1990)而对于本领域技术人员是已知的。本发明的表达盒可以包含在调节序列的调节下允许放置编码木聚糖酶的多核苷酸的一个或多个限制性位点。所述表达盒还可包含可操作地连接到多核苷酸的终止信号以及正确翻译多核苷酸所需的调节序列。本发明的含有多核苷酸的表达盒可以是嵌合的，意指其至少一个组成部分对于至少一个其他组成部分是异源的。在所述表达盒中多核苷酸的表达可能受组成型启动子、诱导型启动子、可调节的启动子(regulated promoter)、病毒启动子或合成启动子的控制。
本领域技术人员了解并可使用多种技术来在细胞宿主中引入构建体。微生物细胞的转化可以通过使用聚乙二醇、氯化钙、病毒侵染、DEAE葡聚糖、噬菌体侵染、电穿孔和本领域公知的其他方法来完成。真菌特别是毕赤酵母的转化，可以根据“毕赤酵母方案”(Methods Mol.Biol.，Higgins，David R.and Cregg，James M.；Eds.(Humana，Totowa，N.J.)(1998))来完成。在酵母中引入重组载体可以用包括电穿孔、使用原生质球、醋酸锂的方法来完成。任何能在动物细胞中引入DNA的方法都可以使用：例如，电穿孔、磷酸钙、脂质转染法等。
实施例1：定点诱变以将木聚糖酶的催化性亲核体从谷氨酸变为丙氨酸，制备无催化活性的蛋白
木聚糖酶Xy1A1A通过来自环境样品的文库的基于活性的筛选而鉴定。将编码野生型Xy1A1A木聚糖酶(SEQ ID NO.3)的基因克隆到细菌表达载体pTrcHis上。该载体命名为pTrcHis_Xy1A1A，由图1和SEQ ID NO.114表示。为了创建该构建体，从全长基因序列中去掉Xy1A1A的可能的信号序列得到截短的木聚糖酶基因。进一步，将截短的木聚糖酶基因插入到pTrcHis后，含有该木聚糖酶基因的开放阅读框就包含了衍生自克隆载体而并非由木聚糖酶基因编码的5个额外的5’端密码子。全长Xy1A1A编码序列的翻译蛋白和文献中的其他糖基水解酶第11族木聚糖酶的序列比对表明Xy1A1A第79位(氨基酸编号基于没有天然信号序列的截短的Xy1A1A，Xy1A1AN端的推断的甲硫氨酸计为第1位氨基酸)氨基酸处的谷氨酸与这些其他蛋白(参见图5A-5V)中保守的催化性亲核体相对应。然后，用Statagene所述方法(Stratagene，La Jolla，CA)设计重叠的合成寡核苷酸(引物1&2)以通过定点诱变来将第79位的谷氨酸变为丙氨酸。
SEQ ID NO.118(Xy1A1A aa)
73 T R N S L I E Y Y V V D S W 86
SEQ ID NO.119(Xy1A1A nuc)：
GG ACG AGA AAT TCA CTC ATA GAA TAT TAC GTC GTT GAT AGC TGG
SEQ ID NO.120(Xy1A1A_E79A aa)：
73 T R N S L I A Y Y V V D S W 86
SEQ ID NO.121(引物1)：
5′-GG ACG AGA AAT TCA CTC ATA GCT TAT TAC GTC GTT GAT AGC TGG-3′
SEQ ID NO.122：(引物2)：
5′-CCA GCT ATC AAC GAC GTA ATA AGC TAT GAG TGA ATT TCT CGT CC-3′
pTrcHis_Xy1A1A载体用作定点诱变操作的模板。Hotstart TurboPfu DNA聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)用于从亲本分子扩增经修饰的质粒，使用如下的热循环仪设定：
表1
定点诱变聚合酶链式反应(PCR)使得基因序列由GAA(谷氨酸)被修饰为GCT(丙氨酸)。这产生了缺乏进行催化所必需的活性位点亲核体的蛋白。也可如文献所述(参见Milan等人所著)将除丙氨酸外的其他氨基酸引入这个位置以产生相同效果(即，催化活性的丧失)。所得载体命名为pTrcHis_Xy1A1A_E79A，如图2和SEQ ID NO.115所示。
实施例2：在细菌表达宿主中制备无催化活性的木聚糖酶蛋白
使用标准技术[Sambrook等]将pTrcHis_Xy1A1A_E79A载体转化入BL21 Star(pLysS)细胞中并涂布至含100μg/mL氨苄青霉素(LBamp100)的Luria培养液琼脂平板上。挑选单个菌落并接种到3.5mL含有50μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素(TBamp50-chlor25)的Terrific培养液中，37℃下持续振荡过夜生长。培养过夜后，取出部分培养物并将其制成甘油冷冻储备液保存于-80℃下。
从该甘油储备液中，用无菌环接种20mL TBamp50-chlor25到250mL培养瓶中。培养物在37℃下以200-250rpm振摇生长过夜。次日，将5mL过夜培养物稀释到1.5L TBamp50-chlor25中。在37℃下振摇培养该培养物直到OD600达0.6-1.0。然后，加入7.5mL的200mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，该培养物在16℃下以200-250rpm振摇培养过夜。接着离心(10,000xg，4℃，10min)收获细胞。在-80℃将细胞沉淀冷冻再解冻至室温。将细胞沉淀重新悬浮在50mM pH7.0的磷酸钾缓冲液中。超声破碎细胞并离心(20,000rpm，4℃，30min)除去细胞碎片。收集上清液并在50mM pH7.0的磷酸钾缓冲液中用截留分子量3.5kDa的膜透析。将经透析的上清液冻干并保存于4℃下。冻干产物在使用前重新悬浮在水中。
实施例3：用于在酵母宿主巴斯德毕赤酵母中生产Xy1A1A_E79A的表达构建体的制备
pCR4Blunt_Xy1A1A_E79A的构建
使用合成寡核苷酸(引物3和4)以及Pfu DNA聚合酶(Stratagene，LaJol1a，CA)从pTrcHis2-BD6002E79中PCR扩增BD6002E79A基因，所用热循环仪参数设定如下：
引物3
5′-TTTCCCTCTCGAGAAAAGAGCTTCGACAGACTACTGGCAAAATTGG(SEQ IDNO.123)
引物4
5′-TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTATTACCAGACCGTTACGTTAGAGTAC(SEQ IDNO.124)
引物3设计为在对应于含木聚糖酶的pTrcHis开放阅读框上的第5位氨基酸的密码子处退火。另外，引物3在成熟木聚糖酶编码序列之前加入了XhoI限制性位点和Kex2蛋白酶剪切信号(Leu-Glu-Lys-Arg)。引物4在木聚糖酶基因之后包含了双终止密码子。将BD6002E79A PCR产物亚克隆进入中间体pCR4-Blunt TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在PCR扩增或克隆期间未向BD6002E79A基因引入突变。该质粒命名为“pCR4Blunt_Xy1A1A E79A”，由图3和SEQ ID NO.116表示。
pPIC9_Xy1A1A_E79A的构建
包含PCR产物的中间体载体pCR4Blunt_Xy1A1A E79A用XhoI和EcoRI(New England Biolabs)完全消化，然后用Qiagen(Qiagen，Valencia，CA)所述的方法纯化对应于Xy1A1A_E79A基因的约0.5kb的片段。在平行反应中，酵母分泌表达载体pPIC9(Invitrogen，Carlsbad，CA)被XhoI和EcoRI完全消化。消化混合物在0.8％TAE凝胶上进行电泳并用Qiagen所述的方法(Qiagen，Valencia，CA)纯化8.0kb载体。经凝胶纯化的插入物和载体组分用T4-连接酶(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)连接。将该连接反应转化入化学感受态的大肠杆菌TOP10细胞并涂布到含LBAmp100的琼脂平板上。这一克隆策略产生了融合蛋白，其中啤酒酵母α-交配因子前肽原(pre-pro-peptide)分泌信号与Xy1A1A_E79A基因N端框内融合。该融合肽在产生后从细胞分泌出来。在分泌过程中，该融合蛋白的α-因子肽部分被Kex2蛋白酶切割而Xy1A1A_E79A蛋白释放到细胞外环境中。本领域技术人员也可使用其他信号肽。该构建体的Xy1A1A_E79A基因受可由甲醇诱导的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶-1(AOX1)启动子的控制。本领域技术人员也可使用其他启动子。使用Qiagen所述的方法(Qiagen，Valencia，CA)从选择性培养基上生长的菌落中纯化DNA。使用由制造商(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的质粒特异性的5AOX和3AOX测序引物确认所述基因序列。序列确认后，将图4和SEQIDNO.117所表示的pPIC9_Xy1A1A_E79A质粒如前所述重新转化到化学感受态的大肠杆菌TOP10细胞中并使用已知方法制备甘油储备液。
实施例4：生产Xy1A1A_E79A的巴斯德毕赤酵母菌株的建立
用于转化巴斯德毕赤酵母的pPIC9_Xy11A1A_E79A DNA的制备
用含有pPIC9_Xy1A1A_1E79A的大肠杆菌TOP10细胞的甘油储备液接种50mL添加了100μg/mL氨苄青霉素的TB培养液的培养物，37℃下生长过夜。使用Qiagen(Qiaprep Midiprep protocol，Qiagen，Valencia，CA)所述方法从培养物中纯化DNA。分离的质粒DNA用Bg1II核酸内切酶(New England Biolabs，Beverly，MA)消化过夜。消化混合物在0.8％ Tris Acetate EDTA(TAE)琼脂糖凝胶上进行电泳，使用Qiagen(QiaQuick gel purification protocol，Valencia，CA)所述方法从凝胶中纯化对应于Xy1A1A_E79A整合盒(integrationcassette)的6.2kb片段。部分经纯化的片段在0.8％TAE凝胶上电泳以确认消化完全及其相对浓度。另外，将部分经纯化的片段转化到化学感受态的大肠杆菌TOP10细胞中以确认没有残留的含氨苄青霉素标记的环化质粒对样品造成污染。将整个转化混合物涂布到LBAmp100平板上并在37℃下培养过夜。平板上未长出菌落。
用于转化的巴斯德毕赤酵母GS115细胞的制备
所有微生物操作均使用无菌技术在层流净化罩中进行。通过将细胞划线到YPD琼脂糖平板上制备巴斯德毕赤酵母GS115细胞(Invitrogen，Car1sbad，CA)。30℃下过夜生长后，从YPD琼脂糖平板上将单个酵母菌落转移到7mL YPD培养液中并在30℃下生长过夜。将部分该“种培养物”用于接种含250mL YPD培养液的2L无菌培养瓶。该培养物在30℃下强力振摇过夜生长直到光密度OD600＝1.5。通过在4000×g和4℃下离心5min来收获细胞并重悬浮到80mL无菌蒸馏去离子水中。在悬浮液中先后加入10mL pH7.5的10×TE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA)和10mL1M的醋酸锂(LiAc)。细胞悬浮液在30℃在轻轻涡旋下培养。经45分钟培养后，加入2.5mL1M的DTT并继续在30℃下培养细胞悬浮液15分钟。然后将细胞用水冲洗数次并最终重新悬浮到5mL1M冰冷的山梨醇中。
pPIC9_Xy1A1A_E79A DNA转化入巴斯德毕赤酵母GS115中
将来自经Bg1II消化的pPIC9_Xy1A1A_E79A质粒的Xy1A1A_E79A表达盒的纯化DNA(100ng)与80μL经LiAc/山梨醇处理的巴斯德毕赤酵母GS115细胞在0.2cm电穿孔管中混合并在冰上温育5分钟。将电穿孔管放入BioRad Gene Pulser II型仪器中并在1.5kV，25mF，200W的设定下进行脉冲。向电穿孔混合物中加入冰冷的山梨醇(0.5mL)然后将其涂布到缺乏组氨酸的葡萄糖基本培养基(MD)(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM KPO4 pH 6，4×10-5生物素，1％葡萄糖)琼脂平板上。巴斯德毕赤酵母菌株GS115为组氨酸营养缺陷型因而在组氨酸不存在时无法生长，但在Xy1A1A_E79A表达盒上含有his4基因的稳定转化体恢复成了组氨酸原养型且能在无组氨酸培养基上生长。在30℃下生长3天产生了大量的组氨酸原养型转化体。将在没有转化DNA的情况下进行电穿孔的经LiAc/山梨醇清洗的GS115细胞涂布到MD和MD/组氨酸琼脂板上作为对照。在电穿孔过程中无转化DNA存在的GS115细胞无法产生能在缺乏组氨酸的MD平板上生长的菌落。
实施例5：产生Xy1A1A_E79A的巴斯德毕赤酵母转化体的鉴定
Xy1A1A_E79A蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达
从MD平板上的原始转化体中，挑出24个单一分离的菌落并复制涂布到MD琼脂主板上。接着将这些菌落也复制涂布到含0.1％含氮小麦阿拉伯木聚糖(Azo-WAXY)的缺乏组氨酸的具1.0％甲醇的基本培养基(MM)(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM KPO4p H 6，4×10-5生物素，1％甲醇)琼脂平板上。该MM Azo-WAXY平板在30℃下培养2天。未在任何转化体中观测到木聚糖酶活性。同时，用分配移液器(repeat pipettor)将3mL BMGY(缓冲甘油复合培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM KPO4p H6，4×10-5生物素，1％甘油)液体培养基加到无菌24孔培养板的各个孔中。在每个孔中都接种了分离自MD琼脂主板的代表性E79A。将该培养板用透气带封好并在30℃，175rpm下培养。经过两天的培养后，从摇床中取下培养板并在4000rpm下离心10min以使细胞沉淀。离心后立刻用真空阱装置将BMGY培养基从细胞中抽走。在每个孔中加入3mL BMMY(缓冲甘油复合培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM KPO4pH 6，4×10-5生物素，1％甲醇)液体培养基并轻柔混合使细胞重新悬浮。将培养板用新的透气带封好并在30℃，175rpm下培养。次日早晨，从30℃摇床中取下培养板并用分配移液器在每个孔中加入300μL10％甲醇以使甲醇最终浓度为1％(体积/体积)。将培养板用新的透气带封好并放回摇床在30℃，175rpm下培养。重复此过程3天。最后一天，从30℃摇床中取下培养板并在4000rpm下离心10至15min。无菌收集澄清的上清液。
用于长期保存巴斯德毕赤酵母转化体的穿刺培养物和甘油储备液的制备
通过用来自MD主板的分离菌53-12和53-20接种5mL液体MD培养基并在旋转培养轮上在30℃下生长过夜来制备甘油冷冻储备液。在每个培养物中混入无菌甘油(1mL)以得到15％(体积/体积)的甘油/培养物混合物。将每个培养物等分到4个无菌冷冻管中并在-80℃下保存。
Xy1A1A_E79A巴斯德毕赤酵母表达宿主的表征
MutS表型的筛选
为了鉴定MutS表型，在缺乏组氨酸的含1.0％甲醇的基本培养基(MM)琼脂平板上划线培养2个Xy1A1A_E79A阳性分离菌，旁边为MutS阳性对照(含pPIC9-secHSA的GS115；Invitrogen，Carlsbad，CA)和Mut+对照(含pPIC3-β-Gal的GS115；Invitrogen，Carlsbad，CA)。将平板在30℃下培养4天并记录MM上的生长情况。分离菌53-12与MutS对照相比在MM培养基上生长更慢。
就整合盒的存在进行的PCR筛选
使用YeaStar Genomic DNA Purification试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)从7mL的YPD液体培养物的2mL中将来自2个Xy1A1A_E79A阳性分离菌及GS115的基因组DNA分离出来。该DNA在PCR反应中用作模板来筛选MutS基因型。将合成的寡核苷酸引物5和6设计为从5’侧的AOX1启动子侧翼的基因组序列到HIS4基因的3’端进行扩增。将合成的寡核苷酸引物7和8设计为从AOX1转录终止子的5’端到在3’侧的AOX1基因座侧翼的基因组序列进行扩增。这两个PCR产物在中部重叠了约400bp并都跨过整个AOX1插入位点
引物5：5′-GCTTCTTGCTGTAGAATTTGGGC SEQ ID NO.125
引物6：5′-CCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCG SEQ ID NO.126
引物7：5′-GGAATTCGCCTTAGACATGACTGTTCCTC SEQ ID NO.127
引物8：5′-GTTGGCCAGTAAATATAGAGATCAAGC SEQ ID NO.128
使用HotStarTaqTM聚合酶混合物(Qiagen，Valencia，CA)扩增基因组DNA。该试验所用的热循环仪参数如下：
表2
分离菌53-12在引物3和4作用下使预期3.0kb的片段和在引物5和6作用下使预期4.5kb的片段分别得到扩增。另外，GS115在引物3和4作用下没有生成任何产物而在引物5和6作用下产生预期的1.5kb片段。该实验表明在巴斯德毕赤酵母Xy1A1A_E79A表达分离菌53-12中，天然AOX1基因序列被缺失并且由Xy1A1A_E79A表达盒通过双同源重组替换。Xy1A1A_E79A表达盒对天然AOX1基因的分子替换改变了毕赤酵母代谢甲醇的能力从而产生MutS表型。在诸如his4或3A0X-TT基因座等的其他同源区的重组没有改变天然AOX1基因，因而毕赤酵母在含甲醇的培养基(Mut+)中显示的正常生长速率。选择分离菌53-12用于进一步的DNA表征。
Xy1A1A_E79A表达盒的杂交筛选
为了支持表明Xy1A1A_E79A表达盒对毕赤酵母基因组中的AOX1基因的替代以及不存在氨苄青霉素抗性基因的PCR实验结果，进行了一系列杂交实验。用BamHI、Bg1∏、EcoRI、HindIII、XhoI和NotI消化2微克分离菌5312基因组DNA。消化物在0.8％TAE琼脂糖凝胶上跑胶然后用标准Southern印迹法将其转移到硝酸纤维素膜上。制备对Xy1A1A_E79A基因(xyn)以及对含氨苄青霉素抗性基因和pUC复制起点的载体主干(主干)具有特异性的DNA杂交探针。xyn和主干探针通过聚合酶链式反应使用基因特异性引物进行制备。产物经凝胶纯化并使用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)用5′-[a-32P]-dCTP进行放射性标记。在65℃下PerfectHybTM Plus杂交缓冲液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中用主干探针杂交后，印迹没有显示任何杂交带，除了阳性对照产生了一条约2.3kb的带。该实验表明氨苄青霉素基因、pUC复制起点和任何外来载体序列都没有整合到转基因分离菌5312中。用xyn探针使用前述方法探测到一个类似的印迹。该印迹在Bg1∏限制性酶作用下产生了一条6.2kb的带，这证实转基因巴斯德毕赤酵母Xy1A1A_E79A表达分离菌5312含有完整单一拷贝的Xy1A1A_E79A整合盒。其他所有限制性消化物产生期望大小的xyn探针的杂交。总之，通过PCR、Southern印迹法和在含甲醇的培养基中的生长特性对巴斯德毕赤酵母Xy1A1A_E79A表达分离菌5312的所有表征都表明该分离菌具有His+、MutS基因型，含有插入到AOX1基因的单一拷贝的Xy1A1A_E79A表达盒，并且不含氨苄青霉素抗性基因。
Xy1A1A_E79A巴斯德毕赤酵母主细胞库的制备
从分离菌53-12的MD甘油冷冻储备液制备主细胞库；下文命名为巴斯德毕赤酵母分离菌53-12。将该克隆划线到MD平板上并在30℃下培养直至出现菌落。从MD板上挑出单个菌落并接种到7mL YPD中并且在30℃下培养12至16小时。将过夜后的起始培养物的全部内含物接种到含250mL YPD培养基的2.8L培养瓶中。培养物在30℃下于150rpm的摇床中生长6至8小时。当OD600达到2.0至3.0时加入无菌甘油(110mL)并且在81个无菌螺旋封口冷冻管(Nalgene，Rochester，NY)中分别装入1.0mL细胞等份。将这些冷冻管在室温下放置5分钟然后储存于-80℃冰箱中作长期保存。
巴斯德毕赤酵母Xy1A1A_E79A主细胞库的纯度
将主细胞库中的一管样品重新悬浮到丰富培养基中然后涂布到YPD琼脂平板上并过夜培养以在平板上产生大量独立菌落(约100个)。经肉眼检查后发现这些菌落具有与亲本菌株巴斯德毕赤酵母GS115菌落相同的同源菌落形态。将大量菌落从YPD板转移到MD和MM琼脂平板上。所有菌落都能在缺乏组氨酸的MD和MM琼脂上生长，表明它们像分离菌53-12而不像亲本菌株GS115，它们均具有His+表型。而且，所有菌落在含有甲醇作为碳源的MM琼脂上生长缓慢，表明它们像分离菌53-12而不像菌株GS115，它们具有AOX1突变体所预期的Muts表型。这些分析结果表明本文所述的MCB是纯的且未受其他微生物污染。
巴斯德毕赤酵母Xy1A1A_E79A克隆的遗传稳定性
通过在MD琼脂上进行20次连续涂布实验测试了分离菌53-12中Xy1A1A_E79A表达盒的遗传稳定性。将一个MCB冷冻管中的细胞转移到MD琼脂平板上并在30℃下生长36至48小时(平板1)。从平板1中，挑出单一菌落并重新涂布到第二个MD板上。连续执行该挑取单一菌落并重新涂布的循环20次。从接种有来自板1和20的单一菌落的YPD液体培养物中纯化了基因组DNA。将该DNA用于如前所述的Southern杂交。从平板1和20制备的基因组DNA的杂交片段大小相同，表明Xy1A1A_E79A盒的插入是稳定的。从这重新划线培养的20个平板中，用来自平板1和20的菌落建立液体培养物用于蛋白表达分析。将来自每个板上的一个单一菌落接种到100mL BMGy培养基中。细胞在30℃下生长过夜，然后离心并重新悬浮到10mL BMMY中。培养物在30℃下培养96小时并每天加入甲醇直至最终浓度为0.5％(体积/体积)。在发酵末期，用抗木聚糖酶ELISA分析澄清的上清液培养液。来自两个板的克隆产生了相似量的Xy1A1A_E79A。来自平板1和20的细胞的DNA完整性和蛋白表达的分子特征表明了巴斯德毕赤酵母GS115基因组中整合的Xy1A1A_E79A表达盒及其中Xy1A1A_E79A基因表达的稳定性。
用ELISA对Xy1A1A_E79A表达转化体的鉴定
在ELISA稀释剂(1.17g/L Na2HPO4，0.244g/L NaH2PO4·H2O，8.18g/L NaCl，10g/L BSA，0.5mL/L Tween20，0.2g/L NaN3，pH 7.4)中稀释来自甲醇诱导的巴斯德毕赤酵母Xy1A1A_E79A转化体的澄清的上清液并通过使用2种多克隆抗体的定量夹心法对其进行分析。使用固定化的木聚糖酶(Xy1A1B)对兔和山羊抗木聚糖酶XyhA1B抗体进行免疫亲和纯化(IAP)。首先，将100μL山羊抗木聚糖酶IAP抗体(以1μg/mL溶于硼酸盐缓冲盐水(BBS；6.19g/L硼酸，9.50g/LNa2B4O7·10H2O，4.39g/L NaCl，pH8.5))添加到Nunc Maxisorp C96板中并在4℃温育过夜。用ELISA冲洗缓冲液(1.21g/L Tris(Trizma)，0.5mL/L Tween20，0.2g/L NaN3，pH 8.0)冲洗该板3次然后在室温下用300μL ELISA稀释剂封闭45分钟。然后，用ELISA冲洗缓冲液冲洗该板3次。接着，加入100μL经稀释的培养物上清液并在室温下温育1.5小时。用ELISA冲洗缓冲液冲洗该板5次然后在每个孔中加入100μL兔抗木聚糖酶IAP抗体(以1μg/mL溶于ELISA稀释剂)并在37℃下温育1小时。用ELISA冲洗缓冲液冲洗该板5次然后在每个孔中加入100μL碱性磷酸酶缀合的驴抗兔(以1μg/mL溶于ELISA稀释剂)并在37℃下温育1小时。用ELISA冲洗缓冲液冲洗该板5次然后在每个孔中加入100μL碱性磷酸酶底物溶液(对硝基苯磷酸)并在室温下温育30分钟。用492nm的参比滤光片测量了405nm处的吸光度。在24个分离菌中，12个对木聚糖酶类似蛋白的存在呈阳性。
通过木聚糖酶活性恢复对Xy1A1A_E79A表达转化体的鉴定
将来自甲醇诱导的巴斯德毕赤酵母Xy1A1A_E79A转化体的澄清的上清液以1：5稀释在50mM pH5.4的McIlvaine缓冲液中。将500mg小麦面粉分配到24孔板的每个孔中。将经稀释的Xy1A1A_E79A上清液转移至含小麦面粉样品的孔中。然后，在所有孔中加入经稀释的木聚糖酶Xy1A1A并在每个孔中加入搅拌子然后在室温下混合内容物20分钟。离心(1,000×g，室温，10min)除去固体物质。取出上清液并用azo-WAXY作为底物进行测试。对于该测试，在90mL沸水中加入azo-WAXY底物(1.0g)并搅拌10分钟。将溶液冷却并用水调整至100mL。将该底物分配到24孔板(500μL/孔)中并在每个孔中加入一个搅拌子。将含底物的平板以及含澄清的巴斯德毕赤酵母上清液、小麦提取物和木聚糖酶的板在37℃下平衡至少5分钟。然后，将500μl样品加入至底物中以起始反应。将该板在37℃温育10分钟并不时混合。然后，在每个孔中加入2.5mL95％乙醇并轻摇该板以进行混合。在室温下经10min后，在室温、1,000×g下将该板离心10min。从每个孔中吸取4×200μL上清液并放入96孔板的4个孔中。在读板器中测量595nm处的吸光度。含有Xy1A1A_E79A的孔鉴定为蓝色的孔。这表明Xy1A1A_E79A蛋白阻断了木聚糖酶抑制剂的作用并使得所加的木聚糖酶Xy1A1A能够降解阿拉伯木聚糖底物。在测试的24个分离菌中，9个显示木聚糖酶活性的恢复。9个对木聚糖酶活性恢复呈阳性的分离菌中，全部都在ELISA中对木聚糖酶类似蛋白的存在呈阳性。
实施例6：降低的木聚糖酶活性的测定
测量了大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A_E79A的木聚糖酶活性并将其与大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A的木聚糖酶活性相比较。将冻干的Xy1A1A_E79A蛋白样品重新悬浮在100mMpH5.3的醋酸钠缓冲液中至固体浓度为1mg/mL。在未进一步稀释下对Xy1A1A_E79A蛋白进行测试。将冻干的Xy1A1A蛋白样品重新悬浮在100mM pH5.3的醋酸钠缓冲液中并稀释到约1:10000。
用二辛可宁酸(BCATM)方法(Pierce，Rockford，IL)以微量滴定板格式测定大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A_E79A以及大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A的蛋白浓度并用来计算每个测试的蛋白量。
用小麦阿拉伯木聚糖作为底物并测量由还原端与3，5-二硝基水杨酸(DNS)的反应释放的还原端来测定酶促活性。将底物制备为小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme P-WAXYM)在100mM pH5.3的醋酸钠缓冲液中的1.4％(重量/重量)溶液。DNS试剂含0.5％(重量/重量)、15％酒石酸钠钾和1.6％(重量/重量)的氢氧化钠。进行测试时，将500μL底物与200μL各种样品混合。在所需温度下温育所需时间后(对Xy1A1A和Xy1A1A_E79A蛋白为15分钟)，加入700μL DNS试剂。将内含物混合并置于100℃下10分钟。使内含物冷却然后转移到比色皿中并在540nm处测量相对于已知浓度木糖的吸光度。酶的稀释、温育时间和温育温度的选择可由本领域技术人员掌握。
大肠杆菌产生的Xy1A1A的活性为635U/mg固体而巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A的活性为4439U/mg固体。大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A_E79A蛋白活性低于代表0.001U/mg固体或观测到的大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A蛋白活性的0.0002％和0.00002％的测试检出限。
表3
| 蛋白 | 测试稀释倍数 | [总蛋白]测试 | 吸光度@540nm | 计算活性(umol/min/mg) |
| 大肠杆菌Xy1A1A | 2640 | 39μg | 0.741 | 635 |
| 巴斯德毕赤酵母Xy1A1A | 10681 | 1.73μg | 1.160 | 4439 |
| 大肠杆菌Xy1A1A_E79A | 1121 | 24.07μg | 0.166 | 低于检出限 |
| 巴斯德毕赤酵母Xy1A1A_E79A | 1019 | 0.520μg | 0.175 | 低于检出限 |
实施例7：小麦中木聚糖酶抑制剂的鉴定
WXI抑制的动力学
用于纯化木聚糖酶抑制剂的小麦提取物的制备
在KTec厨房磨中研磨Soissons小麦面粉以通过1mm筛网(美国标准测试筛网#18)。将约50g面粉重新悬浮于500mL含0.02％(重量/体积)叠氮化钠的100mM pH5.3的醋酸钠缓冲液(1xSAB)中并在室温下搅拌1小时。将浆液在GS3转子中在室温下于5,000rpm离心10min。收集上清液并在使用前储存于4℃。
木聚糖酶亲和柱的制备
将冻干木聚糖酶，约10mg巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A，重新悬浮于1.25mL蒸馏水中并用0.1M pH8.3的NaHCO3加至5mL。将该溶液在4L0.1M的Na HCO3中在4℃下透析5.5小时然后加入到蒸馏水冲洗过的亲和胶-10(affige1-10)中。将偶联了木聚糖酶的亲和胶-10(affige1-10)倒入2mL柱中。
木聚糖酶抑制剂的纯化
木聚糖酶亲和柱用1mL0.1M pH2.5的甘氨酸-HCl预洗脱然后在pH7.3的PBS中进行平衡。将50mL Soissons小麦提取物借重力加入柱中。然后用PBS冲洗柱直到如用280nm处的吸光度所监测不再有蛋白被洗脱。结合到木聚糖酶亲和柱的蛋白用1mL0.1M pH2.5的甘氨酸-HCl随后用6mL PBS洗脱。收集2mL的级分。(重复10次)记录每个级分在280nm处的吸光度。基于A280合并含蛋白的级分(约22mL)并在1xSAB中用截留分子量3kDa的膜(Pierce Snake Skin)彻底透析。经透析的样品标记为小麦木聚糖酶抑制剂(WXI)。
小麦木聚糖酶抑制剂溶液的制备
将小麦木聚糖酶抑制剂在1 x SAB中稀释为3个浓度递减的溶液：16.2μg/mL、3.2μg/mL和0.7μg/mL。将这3个浓度分别标记为1xSABWXIA、1xSABWXIB和1xSABWIC。用二辛可宁酸方法以微量滴定板格式测定蛋白浓度并用于计算每个测试的蛋白量。
木聚糖酶测试样品的制备
用3种木聚糖酶测定小麦木聚糖酶抑制剂的抑制动力学。这些木聚糖酶是大肠杆菌产生的Xy1A1A、巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A和大肠杆菌产生的Xy1A1B。将每种酶都稀释到1 x SAB、1 x SABWXIA、1 x SABWXIB和1 x SABWXIC中。酶的稀释的选择可由本领域技术人员掌握。
木聚糖酶活性抑制的测定
用小麦阿拉伯木聚糖作为底物并测量由还原端与任一种DNS的反应释放的还原端来测定酶促活性。制备了8种浓度的小麦阿拉伯木聚糖溶液：2.86％、1.45％、0.71％、0.48％、0.24％、0.16％、0.12％和0.09％(最终重量/体积，1xSAB中)。DNS试剂含0.5％(重量/重量)、15％酒石酸钠钾和1.6％(重量/重量)的氢氧化钠。进行测试时，将500μL底物与200μL各种样品混合。在所需温度下温育所需时间后，加入700μL DNS试剂。将内含物混合并置于100℃下10分钟。使内含物冷却然后转移到比色皿中并在540nm处测量相对于已知浓度木糖的吸光度。
表4
在小麦木聚糖酶抑制剂存在下，大肠杆菌产生的Xy1A1A的残留活性
缓冲液：→1 x SAB 1 x SABWXIA 1 x SABWXIB 1 x SABWXIC
表5
在小麦木聚糖酶抑制剂存在下，大肠杆菌产生的Xy1A1B的残留活性
缓冲液：→1 x SAB 1 x SABWX1A 1 x SABWXIB 1 x SABWX1C
实施例6：使用固定化的木聚糖酶Xy1A1A从饲料样品中除去木聚糖酶抑制剂
缓冲液：→1 x SAB 1 x SABWXIA 1 x SABWXIB 1 x SABWXIC
用于纯化木聚糖酶抑制剂的小麦提取物的制备
在KTec厨房磨中研磨Soissons小麦面粉以通过1mm筛网(美国标准测试筛网#18)。将约50g面粉重新悬浮于500mL含0.02％(重量/体积)叠氮化钠的100mM pH5.3的醋酸钠缓冲液中并在室温下搅拌1小时。将浆液在GS3转子中在室温下于5,000rpm离心10min。收集上清液(WE)并在使用前储存于4℃。
木聚糖酶亲和柱的制备
将冻干木聚糖酶，约10mg巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A(rXy1A1A，批号Xv1-Xy1A1A-PB206)，重新悬浮于1.25mL蒸馏水中并用0.1M pH8.3的NaHCO3加至5mL。将该溶液在4L0.1M的NaHCO3中在4℃下透析5.5小时然后加入到蒸馏水冲洗过的亲和胶-10(affige1-10)中。将偶联了木聚糖酶的亲和胶-10(affige1-10)倒入2mL柱中。
木聚糖酶抑制剂的纯化
木聚糖酶亲和柱首先用1mL pH11.5的50％乙二醇预洗脱然后用pH7.3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。然后将柱用0.1M pH2.5的甘氨酸-HCl预洗脱接着在6mL PBS中进行平衡。
将30mL Soissons小麦提取物借重力加入柱中。然后用PBS冲洗柱直到如用280nm处的吸光度所监测不再有蛋白被洗脱。收集35mL该流出物(flow through)并标记为小麦流出物(WFT)。结合到木聚糖酶亲和柱的蛋白用1mL pH11.5的50％乙二醇随后用PBS洗脱。记录每个级分在280nm处的吸光度。总共收集35mL并标记为WXI11.5。将WXI11.5和WFT样品在1xSAB中用截留分子量3kDa的膜彻底透析。
透析后，用BCATM方法以微量滴定板格式测定WE、WFT和WXI11.5的蛋白浓度并用于计算每个测试的蛋白量。
木聚糖酶活性的测定
用小麦阿拉伯木聚糖作为底物并测量由还原端与任一种3，5-二硝基水杨酸(DNS)的反应释放的还原端来测定酶促活性。底物作为小麦阿拉伯木聚糖在1 x SAB中的1.4％(重量/重量)溶液制备。DNS试剂含0.5％(重量/重量)、15％酒石酸钠钾和1.6％(重量/重量)的氢氧化钠。进行测试时，将500μL底物与200μL各种样品混合。在所需温度下温育所需时间后，加入700μL DNS试剂。将内含物混合并置于100℃下10分钟。使内含物冷却然后转移到比色皿中并在540nm处测量相对于已知浓度木糖的吸光度。酶的稀释、温育时间和温育温度的选择可由本领域技术人员掌握。
表7
| 样品名称 | ％残留活性 |
| 巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A | 100.0 |
| 巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A+小麦提取物 | 28.4 |
| 巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A+小麦流出物 | 73.2 |
| 巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A+AmSo4ppt.d WXI pH 11.5 | 17.2 |
将木聚糖酶样品，巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A以约1:10000稀释到pH5.30的100mM醋酸钠缓冲液中，WE在pH5.30的100mM醋酸钠缓冲液中浓度为190μg/mL，WFT在pH5.30的100mM醋酸钠缓冲液中浓度为134μg/mL，而WXI11.5在pH5.30的100mM醋酸钠缓冲液中浓度为0.58μg/mL。
在样品中加入小麦提取物后巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A的活性降低。小麦提取物使活性降低了71.6％(从4355U/mg到1238U/mg)。但是，当测试WFT时，73.2％的木聚糖酶活性得到了恢复。这表明木聚糖酶亲和柱有效除去了WE中存在的93.6％的木聚糖酶抑制性活性。当在巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A中加入纯化的小麦木聚糖酶抑制剂(WXI11.5)时，相对于WE中存在的80.3％的抑制活性，活性降低了82.8％(从4355U/mg到747U/mg)。这表明WE中存在的绝大多数木聚糖酶抑制剂都能被该亲和树脂捕获。
实施例9：添加Xy1A1A_E79A蛋白可用于在小麦木聚糖酶抑制剂存在时恢复木聚糖酶活性的证实
用于纯化木聚糖酶抑制剂的小麦提取物的制备
在KTec厨房磨中研磨Soissons小麦面粉以通过1mm筛网(美国标准测试筛网#18)。将约50g面粉重新悬浮于500mL100mM pH5.3的醋酸钠缓冲液(简称1xSABWOA)中并在室温下搅拌1小时。将浆液在GS3转子中在室温下于5,000rpm离心10min。收集上清液并在使用前储存于4℃。
木聚糖酶亲和柱的制备
将冻干木聚糖酶，约10mg巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A，重新悬浮于1.25mL蒸馏水并用0.1M pH8.3的NaHCO3加至5mL。将该溶液在4L0.1M的NaHCO3中在4℃下透析5.5小时然后加入到蒸馏水冲洗过的亲和胶-10(affige1-10)中。将偶联了木聚糖酶的亲和胶-10(affige1-10)倒入2mL柱中。
木聚糖酶抑制剂的纯化
木聚糖酶亲和柱用1mL0.1M pH2.5的甘氨酸-HCl预洗脱然后在pH7.3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行平衡。将50mL Soissons小麦提取物借重力加入柱中。然后用PBS冲洗柱直到如用280nm处的吸光度所监测不再有蛋白洗脱。结合到木聚糖酶亲和柱的蛋白用1mL0.1M pH2.5的甘氨酸-HCl随后用6mL PBS洗脱。收集2mL的级分。(重复10次)记录每个级分在280nm处的吸光度。基于A280合并含蛋白的级分(约22mL)并在1 x SABWOA中用截留分子量3kDa的膜彻底透析。经透析的样品标记为小麦木聚糖酶抑制剂(WXI)。
木聚糖酶测试样品的制备
使用了如下的木聚糖酶样品：巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A和Avizyme 1310。将这些木聚糖酶样品稀释在100mM pH5.30的醋酸钠缓冲液中，pH11.5的AmSO4ppt.d WXI在100mM pH5.30的醋酸钠缓冲液中浓度为0.58μg/mL，而巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A_E79A在100mM pH5.30的醋酸钠缓冲液中浓度为100μg/mL。
木聚糖酶活性的测定
用小麦阿拉伯木聚糖作为底物并测量由还原端与任一种3，5-二硝基水杨酸(DNS)的反应释放的还原端来测定酶促活性。底物作为小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme P-WAXYM)在100mM pH5.30的醋酸钠缓冲液中的1.4％(重量/重量)溶液制备。DNS试剂含0.5％(重量/重量)、15％酒石酸钠钾和1.6％(重量/重量)的氢氧化钠。进行测试时，将500μL底物与200μL的各种样品混合。在所需温度下温育所需时间后，加入700μL DNS试剂。将内含物混合并置于100℃下10分钟。使内含物冷却然后转移到比色皿中并在540nm处测量相对于已知浓度木糖的吸光度。酶的稀释、温育时间和温育温度的选择可由本领域技术人员掌握。
表8
| 活性木聚糖酶蛋白 | 无活性木聚糖酶蛋白 | 抑制剂 | 木聚糖酶活性(umol/min/mg) | ％残留活性 |
| Xy1A1A_E79A | 0.0 | 0.0 | ||
| WXI pH11.5 | 0.0 | 0.0 | ||
| Xy1A1A-E79A | WXI pH11.5 | 0.0 | 0.0 | |
| Xy1A1A | 4596 | 100.0 | ||
| Xy1A1A | Xy1A1A_E79A | 4454 | 96.9 | |
| Xy1A1A | WXIpH11.5 | 754 | 164 | |
| Xy1A1A | Xy1A1A_E79A | WXI pH11.5 | 4417 | 96.1 |
| Avizyme1310 | 5659 | 100.0 | ||
| Avizyme1310 | Xy1A1A_E79A | 7016 | 124.0 | |
| Avizyme1310 | WXIpH11.5 | 113 | 2.0 | |
| Avizyme1310 | Xy1A1A_E79A | WXIpH11.5 | 6875 | 121.4 |
在仅含WXI11.5和Xy1A1A_E79A的样品中没有检测到木聚糖酶活性。这两个样品的组合也没有显示出木聚糖酶活性。在两个木聚糖酶样品中加入巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A_E79A对Avizyme 1310造成轻微的活性提高(从5659u/mg到7016u/mg)而对巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A造成轻微的活性下降(从4596U/mg到4454U/mg)。在WXI11.5存在下，巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A和Avizyme 1310木聚糖酶的活性分别降低了84％和98％。在WXI11.5存在时在这两个木聚糖酶样品中加入巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A_E79A使活性分别提高到Avizyme 1310和巴斯德毕赤酵母产生的Xy1A1A未受抑制水平的98％和99％。这表明加入E79A可以有效地隔离抑制剂并使得在这些抑制剂存在时木聚糖酶活性能够接近100％的恢复。
实施例10：通过还原糖测试对pH5.3的饲料原料中可提取的木聚糖酶酶促活性的测定
该测试基于对通过木聚糖酶的水解酶促反应从小麦阿拉伯木聚糖(WAXY)底物释放的还原端的检测。底物与酶在37℃下温育240分钟，接着同时进行反应淬灭和比色检测。在540nm处以分光光度方式测量的色彩的形成是在碱性条件下DNS试剂与还原糖反应的结果。
试剂
小麦阿拉伯木聚糖
0.4M氢氧化钠
DNS试剂：将5.0g3，5-二硝基水杨酸和150g四水合酒石酸钠钾溶解到900mL0.4M氢氧化钠中。转移至1L容量瓶并用0.4M氢氧化钠将体积调整到1L。经0.2mm过滤器过滤。
醋酸钠缓冲液：200mM，pH5.3(2 x SABWOA)：叠氮化钠不能包含在用于饲料中的定量木聚糖酶测试(Quantum Xylanase in FeedAssays)的缓冲液中——这会干扰定量木聚糖酶添加剂(QuantumXylanase Additive)。
醋酸钠缓冲液，100mM，pH5.3(1 x SABWOA)。
1.40％(重量/体积)的小麦阿拉伯木聚糖的1 x SABWOA溶液(底物溶液)：称取1.40g小麦阿拉伯木聚糖置于120mL干燥耐热玻璃烧杯中。用8.0mL95％乙醇将样品润湿。加入50mL 2 x SABWOA和30mL水。用铝箔覆盖后将浆液置于电磁搅拌台上强力搅拌过夜或直至溶解。转移到100mL容量瓶中。用约10mL水洗涤烧杯然后将其与容量瓶的内容物合并。用水将体积调整到100mL。
木糖储备溶液，1.00mg/mL D(+)木糖的1 x SABWOA溶液：在50mL玻璃烧杯中在搅拌下将50.0±0.5mg D(+)木糖溶解到40mL1 x SABWOA中。将溶液转移到50mL容量瓶。用约5mL 1 x SABWOA洗涤烧杯然后并将其并入容量瓶中。用1 x SABWOA将体积调整到50mL。
样品提取物和稀释液的制备
饲料提取物：将约5.00g±0.05g饲料样品加入到50mL容量瓶中。记录所加饲料的质量。将50mL1 x SABWOA加入到容量瓶和饲料样品中。记录所加缓冲液的质量。对所有样品重复以上操作。在室温强力搅拌(800至1000r pm)下温育样品60分钟。溶液将呈现乳白色浑浊外观。在提取后，将约10mL酶样品从容量瓶转移到16×100mm玻璃试管中。将试管放入离心机并在室温(20至25℃)、1,000g下离心10分钟。将约5mL含提取的木聚糖酶的上清液转移到新的16×100mm玻璃试管中。对每个待分析饲料样品应该进行至少3次重复。
提取物的初级稀释
在归零后的天平上测量并记录16×100mm玻璃试管的质量。每个提取的样品需要一支试管。加入1.0mL第6.1(a)节的提取物。记录所加提取物的质量。加入4.0mL 1 x SABWOA。记录缓冲液和提取物的重量。涡旋样品1至2分钟以混合。
初级稀释因子的计算：将加入的提取物的质量(约1.0g)除以试管中液体的总质量(约5.0g)。此值的倒数为初级稀释因子。基于质量该值约为5。
测试工作稀释液：因为在本测试过程中会遇到不同的木聚糖酶浓度，所以可能需要进行快速范围查找研究以确定最佳稀释比从而使特定样品分析处于一定范围内。范围查找研究通过如上所述制备含有木聚糖酶的饲料提取物的初级稀释液来进行。根据下面所列的工作稀释液的制备对提取方法进行变更。
对于范围查找研究，在定容基础上配制了一系列提取的木聚糖酶的工作稀释液，并在经修改的木聚糖酶测试中进行测试。对于每个待检验的稀释液，范围查找测试可以仅用单一反应试管进行。一旦确定了最佳稀释比，根据下文具体描述的方案制备工作稀释液。540nm处的目标吸光度在0.4和1.2之间。作为经验法则，测试工作稀释可以根据期望的包含量(以DNS U/kg为单位)除以100来计算。因此，应有1600DNS U/kg的酶样品在初级稀释之后将额外稀释1:3.2。注意具有小于500DNS U/kg的样品仍要1:5稀释以产生小于0.4吸光度的背景吸光度。
在归零后的天平上，称取并记录16×100mm玻璃试管的质量。如在范围查找研究中所确定的那样加入并记录适当质量的初级稀释液或者需要使用经验法则计算以得到约5mL工作稀释液。加入适当质量的1 x SABWOA以获取约5mL测试工作稀释液。记录所加缓冲液的质量。最后，在归零后的天平上测量并记录含有提取物和缓冲液的试管质量。
工作稀释液的计算：用初级稀释液的质量除以试管中液体的总质量。该数值的倒数即为工作稀释因子。
木糖标准样品的制备：使用1.00mg/mL木糖溶液(§5.8)制备下列木糖标样：
表9
这些溶液也可以更大的体积制备并且应该每天新鲜配制。
将200μL木糖标样1-8(列于上表)一式两份等分到13×100mm试管中。
在每个标样试管中加入0.5mL底物溶液，涡旋以混合，然后静置15分钟。
在每个标样试管中加入0.7mL DNS试剂并涡旋以混合。在加入所有试剂后每个标准曲线样品的最终体积将为1.4mL。每次进行一系列测试时都必须制备木糖标准曲线。木糖标准曲线的浓度范围为使得标样8在540nm处产生约1.2的吸光度。测试样品吸光度不应高于这个上限值。如果是这样，进一步稀释测试酶样品并重复测试。
木聚糖酶测试
将0.5mL底物溶液等分到13×100mm玻璃试管中并在37℃预温育10分钟(参见下文的样品/试剂添加总结)。为每个酶样品准备3个试管用于酶反应和1个用于空白反应(每个样品共4个底物试管)。
将约5mL工作稀释液酶样品在37℃预温育10分钟。该温育期使底物和酶平衡到反应起始前的温度。
在4个0.5mL底物试管里的第1个中加入0.7mL DNS试剂。涡旋然后放回水浴中。
在10分钟预温育后，在4个0.5mL底物试管里的第1个中加入0.2mL工作稀释液酶样品。以恒定速率(即每5秒将稀释酶加入试管中)将稀释的酶样品连续加入其他底物试管中。在本测试这部分所建立的恒定酶添加速率在反应淬灭步骤中仍然需要。在加入最后一份等分的稀释酶后，将所有反应试管涡旋然后将试管2至4放回37℃水浴中。温育240分钟。将反应空白试管放在室温下的架上。
在240分钟温育期后，用上述建立的恒定样品添加速率在每个酶反应试管中加入0.7mL显色终止溶液。恒定添加速率的使用可以确保每个样品经历相同的反应时间。涡旋以混合所有经淬灭的试管。
样品/试剂添加总结
酶反应样品
0.5mL底物(预温育10分钟，每个酶重复3个试管)
稀释的木聚糖酶样品(预温育10分钟，推荐样品体积5mL)
在底物试管中加入0.2mL稀释酶，37℃下温育240分钟
0.7mL显色终止溶液(在240分钟温育后加入)
酶样品空白
0.5mL底物(预温育10分钟，每个酶1个试管)
0.7mL显色终止溶液(在10分钟预温育后加入)
加入0.2mL稀释酶
木糖标准曲线样品
0.2mL各木糖标样(参见上表)
0.5mL底物，混合并在室温下静置240分钟
在240分钟后加入0.7mL显色终止溶液
分光镜测量和酶活性计算
使用塑料比色皿(1cm光程，半微量)，用水将分光光度计在540nm处置零。在540nm处读取所有反应、空白和木糖标准曲线样品并记录读数。
对于7个木糖标准曲线样品，将每个吸光度测量值减去0μmol木糖的读数(木糖标样1)。这通过减去试剂空白来校正所有木糖标准曲线读数。
将540nm处的吸光度作为木糖量的函数作图，然后使用线性回归程序计算数据组的“最佳拟合”线。
对于酶反应样品，取3个240分钟读数(它们彼此相差应该在5％以内且理想地处于木糖标样的吸光度范围内)的平均值并减去背景(0分钟)读数。
对每个重复取背景校正后的吸光度并用木糖标准曲线回归参数进行插值计算。插值以μmol为单位计算。
将每个插值μmol值除以反应时间240分钟和0.2mL 1 x SABWOA等分样品的质量(单位g)。此计算的单位为μmol/min/g或根据定义为每克稀释提取物的木聚糖酶单位(XU/g)。
用XU/g值乘以所用的稀释因子以按比例得到样品读数。稀释因子是初级稀释和测试工作稀释的乘积。
将稀释调整的XU/g乘以在木聚糖酶提取过程中使用的缓冲液的总质量，然后除以提取中使用的饲料的量。最终计算的活性是以每千克饲料的木聚糖酶单位表示的基于质量的活性。
实施例11：用含XyA1A1_E79A无活性的木聚糖酶分子的缓冲液对饲料中木聚糖酶酶促活性的提取及随后用还原糖测试对pH5.3时可提取的木聚糖酶酶促活性的测定
该测试基于对通过木聚糖酶的水解酶促反应从小麦阿拉伯木聚糖(WAXY)底物释放的还原端的检测。底物与酶在37℃下温育240分钟，接着同时进行反应淬灭和比色测定。在540nm处以分光光度方式测量的色彩的形成是在碱性条件下DNS试剂与还原糖反应的结果。本发明在提取缓冲液中使用了XyA1A1_E79A无活性的木聚糖酶分子，从而提高了饲料样品中所含的木聚糖酶的恢复。
试剂
XyA1A1_E79A
小麦阿拉伯木聚糖
0.4M氢氧化钠
DNS试剂：将5.0g3，5-二硝基水杨酸和150g四水合酒石酸钠钾溶解到900mL0.4M氢氧化钠中。转移至一个1L容量瓶中并用0.4M氢氧化钠将体积调整到1L。经0.2mm过滤器过滤。
醋酸钠缓冲液：200mM，pH5.3(2 x SABWOA)：叠氮化钠不能包含在用于饲料中的定量木聚糖酶测试的缓冲液中，因为它会干扰定量木聚糖酶添加剂。
醋酸钠缓冲液，100mM，pH5.3(1 x SABWOA)。
含XyA1A1_E79A的100mM pH5.3的醋酸钠缓冲液(含E79A的1 x SABWOA)：将1.00g XyA1A1_E79A加入到1000mL容量瓶中。将500mL 2 x SABWOA加入到500mL容量瓶中。转移至含XyA1A1_E79A的1000mL容量瓶中。用水洗涤500mL容量瓶并加入到含2 x SABWOA和E79A的1000mL容量瓶中。加水调整体积至1000mL。搅拌直至所有XyA1A1_E79A溶解。
1.40％(重量/体积)的小麦阿拉伯木聚糖的1 x SABWOA溶液(底物溶液)：准确称取1.40g小麦阿拉伯木聚糖到120mL干燥耐热玻璃烧杯中。用8.0mL95％乙醇将样品润湿。加入50mL 2 x SABWOA和30mL水。用铝箔覆盖后将浆液置于电磁搅拌台上强力搅拌过夜或直至溶解。转移到100mL容量瓶中。用约10mL水洗涤烧杯并将其与容量瓶的内容物合并。用水将体积调整到100mL。
木糖储备溶液，1.00mg/mL D(+)木糖的1 x SABWOA溶液：在50mL玻璃烧杯中在搅拌下将50.0±0.5mg D(+)木糖溶解到40mL含E79A的1 x SABWOA中。将溶液转移到50mL容量瓶。用约5mL含E79A的1 x SABWOA洗涤烧杯并将其合并入容量瓶中。用含E79A的1xSABWOA将体积调整到50mL。
样品提取物和稀释液的制备
饲料提取物：在归零后的天平上测量并记录50mL空容量瓶的质量。加入约5.00g±0.05g饲料样品。记录所加饲料的质量。将容量瓶和饲料归零。将50mL含E79A的1 x SABWOA加入到容量瓶和饲料样品中。记录所加缓冲液的质量。对所有样品重复以上操作。在室温强力搅拌(800至1000r pm)下温育样品60分钟。溶液呈现乳白色浑浊外观。在提取后，将约10mL酶样品从容量瓶转移到16×100mm玻璃试管中。将试管放入离心机并在室温(20～25℃)、1,000g下离心10分钟。将约5mL含提取的木聚糖酶的上清液转移到新的16×100mm玻璃试管中。对每个待分析饲料样品应该进行至少3次重复。
提取物的初级稀释
在归零后的天平上测量并记录16×100mm玻璃试管的质量。每个提取的样品需要一支试管。在空试管置于天平上时将天平归零，然后加入1.0mL第6.1(a)节的提取物。记录所加提取物的质量。加入4.0mL含E79A的1 x SABWOA。记录缓冲液和提取物的重量。涡旋样品1至2分钟以混合。
初级稀释因子的计算：将加入的提取物质量(约1.0g)除以试管中液体的总质量(约5.0g)。此值的倒数为初级稀释因子。基于质量该值约为5。
测试工作稀释液：因为在本测试过程中会遇到不同木聚糖酶浓度的XyA1A1_E79A，可能需要进行快速范围查找研究以确定最佳稀释比从而使特定样品分析处于一定范围内。范围查找研究通过如上所述制备含有木聚糖酶的饲料提取物的初级稀释液来进行。根据下面所列的工作稀释液的制备对提取方法进行改变。
对于范围查找研究，在定容基础上配制了一系列提取的木聚糖酶的工作稀释液，并在经修改的XyA1A1_E79A测试中进行测试。对于每个待检验的稀释液，范围查找测试可以仅用单一反应试管进行。一旦测定了最佳稀释比，根据下文具体描述的方案制备工作稀释液。540nm处的目标吸光度在0.4和1.2之间。作为经验法则，测试工作稀释可以根据期望的包含量(以DNS U/kg为单位)除以100来计算。因此，应有1600DNS U/kg的酶样品在初级稀释之后将额外稀释1:3.2。注意具有小于500DNS U/kg的样品仍要1:5稀释以产生小于0.4吸光度的背景吸光度。
称取并记录16×100mm玻璃试管的质量。将天平归零，如在范围查找研究中所确定的那样加入并记录适当质量的初级稀释液或者需要使用经验法则计算以得到约5mL工作稀释液。加入适当质量的含E79A的1 x SABWOA以获取约5mL测试工作稀释液。记录所加缓冲液的质量。最后，测量并记录含有提取物和缓冲液的试管质量。
工作稀释液的计算：用初级稀释液的质量除以试验试管中液体的总质量。该数值的倒数即为工作稀释因子。
木糖标准样品的制备：使用1.00mg/mL木糖溶液(§5.8)制备下列木糖标样：
表10
这些溶液也可以更大的体积制备而且应该每天新鲜配制。
将200μL木糖标样1至8(列于上表)一式两份等分到13×100mm试验试管中。
在每个标样试管中加入0.5mL底物溶液，涡旋以混合，并静置15分钟。
在每个标样试管中加入0.7mL DNS试剂并涡旋以混合。在加入所有试剂后，每个标准曲线样品的最终体积将为1.4mL。每次进行一系列测试时都必须制备木糖标准曲线。木糖标准曲线的浓度范围为使得标样8在540nm处产生约1.2的吸光度。测试样品吸光度不能高于这个上限值。如果是这样，进一步稀释测试酶样品并重复测试。
木聚糖酶测试
将0.5mL底物溶液等分到13×100mm玻璃试管中并在37℃预温育10分钟(参见下文的样品/试剂添加总结)。为每个酶样品准备3个试管用于酶反应和1个用于空白反应(每个样品共4个底物试管)。
将约5mL工作稀释液酶样品在37℃预温育10分钟。这些温育期使底物和酶平衡到反应起始前的温度。
在4个0.5mL底物试管里的第1个中加入0.7mL DNS试剂。涡旋然后放回水浴中。
在10分钟预温育后，在4个0.5mL底物试管里的第1个中加入0.2mL工作稀释液酶样品。在第1个试管中加入稀释酶后开始计时。以恒定速率(即每5秒将稀释酶加入试管中)将稀释的酶样品连续加入其他底物试管中。在本测试这部分所建立的恒定酶添加速率在反应淬灭步骤中仍然需要。在加入最后一份等分的稀释酶后，将所有反应试管涡旋然后将试管2至4放回37℃水浴中。温育240分钟。将反应空白试管放在室温下的架上。
在240分钟温育期后，用上述建立的恒定样品添加速率在每个酶反应试管中加入0.7mL显色终止溶液。恒定添加速率的使用可以确保每个样品经历相同的反应时间。涡旋以混合所有经淬灭的试验试管。
样品/试剂添加总结
酶反应样品
0.5mL底物(预温育10分钟，每个酶重复3个试管)
稀释的木聚糖酶样品(预温育10分钟，推荐样品体积5mL)
在底物试管中加入0.2mL稀释酶，37℃下温育240分钟
0.7mL显色终止溶液(在240分钟温育后加入)
酶样品空白
0.5mL底物(预温育10分钟，每个酶1个试管)
0.7mL显色终止溶液(在10分钟预温育后加入)
加入0.2mL稀释酶
木糖标准曲线样品
0.2mL各木糖标样(参见上表)
0.5mL底物，混合并在室温下静置240分钟
在240分钟后加入0.7mL显色终止溶液
分光镜测量和酶活性计算
使用塑料比色皿(1cm光程，半微量)，用水将分光光度计在540nm处置零。在540nm处读取所有反应、空白和木糖标准曲线样品并记录读数。
对于7个木糖标准曲线样品，将每个吸光度测量值减去0μmol木糖的读数(木糖标样1)。这通过减去试剂空白来校正所有木糖标准曲线读数。
将540nm处的吸光度作为木糖量的函数作图，然后使用线性回归程序计算数据组的“最佳拟合”线。对于酶反应样品，取3个240分钟读数(它们彼此相差应该在5％以内且理想地处于木糖标样的吸光度范围内)的平均值并减去背景(0分钟)读数。
对每个重复取背景校正后的吸光度并用木糖标准曲线回归参数进行插值计算。插值以μmol为单位计算。
将每个插值μmol值除以反应时间240分钟和0.2mL含E79A的1 x SABWOA等分样品的质量(单位g)。此计算的单位为μmol/min/g或根据定义为每克稀释提取物的木聚糖酶单位(XU/g)。
用XU/g值乘以所用的稀释因子以按比例得到样品读数。稀释因子是初级稀释和测试工作稀释的乘积。
将稀释调整的XU/g乘以在木聚糖酶提取过程中使用的缓冲液的总质量，然后除以提取中使用的饲料的量。最终计算的活性是以每千克饲料的木聚糖酶单位表示的基于质量的活性。
实施例12：使用Xy1A1A_E79A增加粉碎和颗粒饲料样品中的木聚糖酶的恢复
饲料样品的制备
基于小麦的烘焙饲粮通过将表X中所示的组分混合来制备。制备了三个单独的饲粮批次：起始期(starter)、生长期(grower)和成熟期(finisher)饲粮。在每种饲粮中以如表XI所示的不同水平投入木聚糖酶，从而产生一系列亚批次的加入了不同水平木聚糖酶的各种粉碎饲料。从每个亚批次中取出样品进行酶促活性分析。
为制备颗粒饲料样品，将亚批次的粉碎饲料通过颗粒机。颗粒机以75℃的最高温度设定运行，饲粮表面在颗粒生产期间设定的平均温度为68.0±0.8℃。
表11：饲粮组成(g/kg)
| 成分 | 起始期 | 生长期/成热期 |
| 小麦 | 552.4 | 544.5 |
| 黑麦 | 50.0 | 70.0 |
| 大豆(热处理) | 75.0 | 100.0 |
| 大豆粉hipro | 185.0 | 150.0 |
| 玉米面筋粉(580cp.) | 25.0 | 25.0 |
| 马铃薯蛋白 | 10.0 | 10.0 |
| 鱼粉(700cp) | 15.0 | - |
| 大豆油 | 14.5 | 13.0 |
| 混合动物脂肪 | 35.0 | 55.0 |
| 预混料 | 5.0 | 5.0 |
| 石灰石 | 14.0 | 11.5 |
| 磷酸一钙 | 11.5 | 7.0 |
| 氯化钠 | 1.8 | 1.8 |
| 碳酸氢钠 | 2.0 | 2.1 |
| L-赖氨酸盐酸盐 | 1.8 | 2.6 |
| DL-甲硫氨酸 | 1.6 | 1.8 |
| L-苏氨酸 | 0.4 | 0.7 |
| 总计 | 1000.0 | 1000.0 |
所有饲粮都含有抑球菌剂
表12：木聚糖酶投料水平
| 饲粮编号 | 木聚糖酶水平(IU/g) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.4 |
| 3 | 0.8 |
| 4 | 1.6 |
| 5 | 3.2 |
| 6 | 32 |
木聚糖酶按上述比例加入起始期、生长期和成热期饲粮中。
用实施例10(不含XyA1A1_E79A的提取和测试)和实施例11(含有XyA1A1_E79A的提取和测试)中详细描述的方法提取饲料样品并进行检测以比较包含无活性的木聚糖酶对提取的酶的产量的影响。
结果
表13显示了从含有或不含XyA1A1_E79A蛋白(简写为E79A)的粉碎饲料中提取木聚糖酶的结果。测得的木聚糖酶平均增加了2.8倍，这是一个统计学上显著的增量(P<0.05)。
表14显示了从含有或不含E79A蛋白的颗粒饲料中提取木聚糖酶的结果。测得的木聚糖酶平均增加了2.9倍，这是一个统计学上显著的增量(P<0.05)。
粉碎和颗粒饲料数据合并后的数据组显示木聚糖酶酶促活性的恢复平均增加了统计学上显著的2.9倍(P<0.0005)。经含有E79A提取和测试的样品中木聚糖酶活性的平均恢复为所加木聚糖酶蛋白水平的72.5％。
当没有E79A时恢复仅为18.8％。因此XyA1A1_E79A当其包含于提取缓冲液和测试缓冲液中时极大地提高了粉碎和颗粒饲料样品中木聚糖酶的产量。
表13：在提取缓冲液中包含E79A蛋白对粉碎饲料中木聚糖酶活性恢复的影响
-样品用不含E79A的SABWOA提取&测试
+样品用含E79A的SABWOA提取&测试
表14：在提取缓冲输中包含E79A蛋白对颗粒饲料中木聚糖酶活性恢复的影响
-样品用不含E79A的SABWOA提取&测试
+样品用含E79A的SABWOA提取&测试
序列表
<110>先正达参股股份有限公司(Syngenta Participations AG)
<120>无催化活性的蛋白以及用于恢复来自植物源材料的酶的方法
<130>70608
<160>128
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>555
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(555)
<223>Xy1A1a_E79A
<400>1
<210>2
<211>185
<212>PRT
<213>合成序列
<400>2
<210>3
<211>185
<212>PRT
<213>环境样品
<220>
<221>Xy1A1A-木聚糖酶
<222>(1)..(185)
<400>3
<210>4
<211>211
<212>PRT
<213>斑点气单胞菌ME-1(Aeromonas punctata ME-1)
<400>4
<210>5
<211>227
<212>PRT
<213>豌豆壳二孢(Ascochyta pisi)
<400>5
<210>6
<211>120
<212>PRT
<213>鹰嘴豆壳二孢菌(Ascochyta rabiei)
<400>6
<210>7
<211>231
<212>PRT
<213>棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(231)
<400>7
<210>8
<211>211
<212>PRT
<213>泡盛曲霉(Aspergillus awamori)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(211)
<400>8
<210>9
<211>225
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus cf.niger)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(225)
<400>9
<210>10
<211>211
<212>PRT
<213>白曲霉(Aspergillus kawachii)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(211)
<400>10
<210>11
<211>225
<212>PRT
<213>白曲霉(Aspergillus kawachii)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(225)
<400>11
<210>12
<211>221
<212>PRT
<213>构巢曲霉(Aspergillus nidulans)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(221)
<400>12
<210>13
<211>211
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(211)
<400>13
<210>14
<211>211
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(211)
<400>14
<210>15
<211>225
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>15
<210>16
<211>225
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(225)
<400>16
<210>17
<211>221
<212>PRT
<213>米曲霉(Aspergi1lus oryzae)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(221)
<400>17
<210>18
<211>232
<212>PRT
<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(232)
<400>18
<210>19
<211>211
<212>PRT
<213>塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(211)
<400>19
<210>20
<211>221
<212>PRT
<213>出芽短梗霉melanigenum变种(Aureobasidium pullulans var.melanigenum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(221)
<400>20
<210>21
<211>221
<212>PRT
<213>出芽短梗霉Y-2311-1(Aureobasidium pullulans Y-2311-1)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(221)
<400>21
<210>22
<211>221
<212>PRT
<213>Bacillus agaradhaerens AC13
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(221)
<400>22
<210>23
<211>213
<212>PRT
<213>环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(213)
<400>23
<210>24
<211>210
<212>PRT
<213>坚强芽胞杆菌(Bacillus firmus)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(210)
<400>24
<210>25
<211>210
<212>PRT
<213>坚强芽孢杆菌K-1(Bacillus firmus K-1)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(210)
<400>25
<210>26
<211>210
<212>PRT
<213>耐盐芽孢杆菌C-125(Bacillus halodurans C-125)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(210)
<400>26
<210>27
<211>228
<212>PRT
<213>短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(228)
<400>27
<210>28
<211>228
<212>PRT
<213>短小芽孢杆菌HB030(Bacillus pumilus HB030)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(228)
<400>28
<210>29
<211>213
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属的种(Bacillus sp.)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(213)
<400>29
<210>30
<211>213
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属的种YA-14(Bacillus sp.YA-14)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(213)
<400>30
<210>31
<211>355
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属的种YA-335(Bacillus sp.yA-335)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(355)
<220>
<221>misc_feature
<222>(294)..(294)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>31
<210>32
<211>205
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌B230(Bacillus subtilis B230)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(205)
<400>32
<210>33
<211>213
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌亚种subtilis str.168(Bacillus subtilis subsp.subtilis str，168)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(213)
<400>33
<210>34
<211>361
<212>PRT
<213>热解纤维素菌属的种Rt69B.1(Caldicellulosiruptor sp.Rt69B.1)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(361)
<400>34
<210>35
<211>644
<212>PRT
<213>粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(644)
<400>35
<210>36
<211>335
<212>PRT
<213>Cellulomonas pachnodae
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(335)
<400>36
<210>37
<211>660
<212>PRT
<213>Cellvibrio japonicus
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(660)
<400>37
<210>38
<211>656
<212>PRT
<213>混合纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(656)
<400>38
<210>39
<211>219
<212>PRT
<213>细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(219)
<400>39
<210>40
<211>241
<212>PRT
<213>细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(241)
<400>40
<210>41
<211>261
<212>PRT
<213>嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(261)
<400>41
<210>42
<211>231
<212>PRT
<213>嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(231)
<220>
<221>misc_feature
<222>(189)..(189)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>42
<210>43
<211>224
<212>PRT
<213>嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(224)
<400>43
<210>44
<211>216
<212>PRT
<213>紫麦角菌(Claviceps purpurea)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(216)
<400>44
<210>45
<211>520
<212>PRT
<213>噬纤维梭菌(C1ostridium cellulovorans)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(520)
<400>45
<210>46
<211>261
<212>PRT
<213>Clostridium saccharobutylicum P262
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(261)
<400>46
<210>47
<211>512
<212>PRT
<213>粪堆梭菌F-9(Clostridium stercorarium F-9)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(512)
<400>47
<210>48
<211>683
<212>PRT
<213>热纤维梭菌F1/YS(Clostridium thermocellum F1/YS)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(683)
<400>48
<210>49
<211>457
<212>PRT
<213>热纤维梭菌F1/YS(Clostridium thermocellum F1/YS)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(457)
<400>49
<210>50
<211>221
<212>PRT
<213>玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(221)
<400>50
<210>51
<211>231
<212>PRT
<213>玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(231)
<400>51
<210>52
<211>222
<212>PRT
<213>玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(222)
<400>52
<210>53
<211>231
<212>PRT
<213>禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(231)
<400>53
<210>54
<211>209
<212>PRT
<213>隐球酵母属的种S-2(Cryptococcus sp.S-2)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(209)
<400>54
<210>55
<211>360
<212>PRT
<213>嗜热网球菌Rt46B.1(Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(360)
<400>55
<210>56
<211>225
<212>PRT
<213>构巢裸胞壳菌(Emericella nidulans)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(225)
<400>56
<210>57
<211>608
<212>PRT
<213>产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(608)
<400>57
<210>58
<211>231
<212>PRT
<213>番茄尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(231)
<400>58
<210>59
<211>295
<212>PRT
<213>番茄尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(295)
<400>59
<210>60
<211>210
<212>PRT
<213>嗜热脂肪地芽胞杆菌No.236(Geobacillus stearothermophilus No.236)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(210)
<400>60
<210>61
<211>231
<212>PRT
<213>玉蜀黍赤霉180378(Gibberella zeae 180378)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(231)
<400>61
<210>62
<211>227
<212>PRT
<213>大斑病长蠕孢(Helminthosporium turcicum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(227)
<400>62
<210>63
<211>227
<212>PRT
<213>灰色腐质霉高温变种60849(Humicola grisea var.thermoidea 60849)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(227)
<400>63
<210>64
<211>227
<212>PRT
<213>特异腐质霉(Humicola insolens)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(227)
<400>64
<210>65
<211>229
<212>PRT
<213>红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(229)
<400>65
<210>66
<211>222
<212>PRT
<213>红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(222)
<400>66
<210>67
<211>190
<212>PRT
<213>Hypocrea lixii E58
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(190)
<400>67
<210>68
<211>283
<212>PRT
<213>埃杜拉Stamets CS-2(Lentinula edodes Stamets CS-2)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(283)
<400>68
<210>69
<211>233
<212>PRT
<213>稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(233)
<400>69
<210>70
<211>266
<212>PRT
<213>Neocallimastix frontalis
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(266)
<400>70
<210>71
<211>337
<212>PRT
<213>Neocallimastix patriciarum
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(337)
<400>71
<210>72
<211>607
<212>PRT
<213>Neocallimastix patriciarum
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(607)
<400>72
<210>73
<211>607
<212>PRT
<213>Neocallimastix patriciarum MCH3
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(607)
<400>73
<210>74
<211>220
<212>PRT
<213>粗糙脉孢菌OR74A(Neurospora crassa OR74A)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(220)
<400>74
<210>75
<211>293
<212>PRT
<213>粗糙脉孢菌OR74A(Neurospora crassa OR74A)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(293)
<400>75
<210>76
<211>344
<212>PRT
<213>Nonomuraea flexuaosa
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(344)
<400>76
<210>77
<211>362
<212>PRT
<213>Orpinomyces sp.PC-2
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(362)
<400>77
<210>78
<211>194
<212>PRT
<213>宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti Bainier)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(194)
<400>78
<210>79
<211>282
<212>PRT
<213>绳状青霉(Penicillium funiculosum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(282)
<400>79
<210>80
<211>223
<212>PRT
<213>绳状青霉(Penicillium funiculosum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(223)
<400>80
<210>81
<211>208
<212>PRT
<213>产紫青霉(Penicillium purpurogenum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(208)
<400>81
<210>82
<211>217
<212>PRT
<213>辣根猿叶甲(Phaedon cochleariae)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(217)
<400>82
<210>83
<211>290
<212>PRT
<213>黄孢原毛平革菌ME446(Phanerochaete chrysosporium ME446)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(290)
<400>83
<210>84
<211>381
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母(Pichia stipitis)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(381)
<400>84
<210>85
<211>625
<212>PRT
<213>Piromyces sp<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(625)
<400>85
<210>86
<211>235
<212>PRT
<213>Polyplastron multivesiculatum
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(235)
<400>86
<210>87
<211>346
<212>PRT
<213>假单胞菌属的种ND137(Pseudomonas sp.ND137)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(346)
<400>87
<210>88
<211>680
<212>PRT
<213>白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)
<220>
<221>木聚糖酶.
<222>(1)..(680)
<400>88
<210>89
<211>828
<212>PRT
<213>白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(828)
<400>89
<210>90
<211>792
<212>PRT
<213>黄色瘤胃球菌17(Ruminococcus flavefaciens 17)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(792)
<400>90
<210>91
<211>954
<212>PRT
<213>黄色瘤胃球菌17(Ruminococcus flavefaciens 17)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(954)
<400>91
<210>92
<211>781
<212>PRT
<213>黄色瘤胃球菌17(Ruminococcus flavefaciens 17)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(781)
<400>92
<210>93
<211>802
<212>PRT
<213>黄色瘤胃球菌17(Ruminococcus flavefaciens 17)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(802)
<400>93
<210>94
<211>789
<212>PRT
<213>瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(789)
<400>94
<210>95
<211>197
<212>PRT
<213>裂褶菌(Schizophyllum commune)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(197)
<400>95
<210>96
<211>205
<212>PRT
<213>嗜酸色串菌(Scytalidium acidophilum)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(205)
<400>96
<210>97
<211>235
<212>PRT
<213>嗜热色串菌Af101-3(Scytalidium thermophilum Af101-3)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(235)
<400>97
<210>98
<211>231
<212>PRT
<213>大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(231)
<400>98
<210>99
<211>241
<212>PRT
<213>天蓝色链霉菌A3(Streptomyces coelicolor A3)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(241)
<400>99
<210>100
<211>335
<212>PRT
<213>天蓝色链霉菌A3(Streptomyces coelicolor A3)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(335)
<400>100
<210>101
<211>335
<212>PRT
<213>变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(335)
<400>101
<210>102
<211>240
<212>PRT
<213>变铅青链霉菌(Streptomycesli vidans)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(240)
<400>102
<210>103
<211>191
<212>PRT
<213>橄榄绿链霉菌E-86(Streptomyces olivaceoviridis E-86)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(191)
<400>103
<210>104
<211>240
<212>PRT
<213>链霉菌属的种EC3(Streptomyces sp.EC3)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(240)
<400>104
<210>105
<211>228
<212>PRT
<213>链霉菌属的种S38(Streptomyces sp.S38)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(228)
<400>105
<210>106
<211>335
<212>PRT
<213>热蓝紫色链霉菌(Streptomyces thermocyaneoviolaceus)
<220>
<221>木聚糖酶
<222>(1)..(335)
<400>106
<210>107
<211>335
<212>PRT
<213>热紫链霉菌OPC-520(Streptomyces thermoviolaceus OPC-520)
<220>
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Claims (19)
1.经修饰的木聚糖酶多肽，其中，该修饰位于由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的第78位氨基酸残基处或者在其他同源性木聚糖酶多肽中的等效位置，其中所述经修饰的木聚糖酶多肽是无活性的但保留其与木聚糖酶抑制剂结合的能力。
2.如权利要求1所述的经修饰的木聚糖酶多肽，其中，所述修饰位于由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的第78位氨基酸残基处或者在第11类木聚糖酶多肽中的等效位置。
3.如权利要求1所述的经修饰的木聚糖酶多肽，其中，所述修饰位于由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的第78位氨基酸残基处或者由SEQ ID NO.4至114表示的木聚糖酶氨基酸序列中的等效位置。
4.编码权利要求1所述的经修饰的木聚糖酶多肽的分离的核酸分子。
5.编码权利要求2所述的经修饰的木聚糖酶多肽的分离的核酸分子。
6.编码权利要求3所述的经修饰的木聚糖酶多肽的分离的核酸分子。
7.一种表达盒，其包含如权利要求4所述的编码无活性的木聚糖酶蛋白的核酸分子。
8.一种载体，其包含至少一个如权利要求7所述的表达盒。
9.一种重组宿主细胞，其包含如权利要求8所述的载体。
10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌、酵母或真菌细胞。
11.如权利要求10所述的重组宿主细胞，其中所述细菌、酵母或真菌细胞是克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)、毛孢子菌属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansuela)、埃希氏菌属(Eschericia)、假单胞菌属(Psudomonas)、乳杆菌属(Lactobaci1lus)、芽孢杆菌属(Baci1lus)、曲霉属(Aspergi1lus)、根霉属(Rhizopus)、木霉属(Trichoderma)、链孢霉属(Neurospora)、毛霉属(Mucor)、或青霉属(Penicillium)细胞。
12.如权利要求10所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
13.具有氨基酸序列SEQ ID NO.2的经修饰的木聚糖酶。
14.编码权利要求13所述的经修饰的木聚糖酶的分离的核酸分子。
15.用于恢复木聚糖酶活性的方法，其包括以下步骤：
a)提供能与木聚糖酶抑制剂分子结合的无活性的木聚糖酶分子；
b)将所述无活性的木聚糖酶分子与含有木聚糖酶和木聚糖酶抑制剂的植物源材料在足以使所述无活性的木聚糖酶分子与所述木聚糖酶抑制剂直接或间接结合到一起的条件下混合；
c)测量所述木聚糖酶的活性。
16.如权利要求15所述的用于恢复木聚糖酶活性的方法，其中所述无活性的木聚糖酶分子含有无活性的催化亲核体。
17.如权利要求16所述的用于恢复木聚糖酶活性的方法，其中所述无活性的催化亲核体对应于SEQ ID NO.3的第78位。
18.如权利要求16所述的用于恢复木聚糖酶活性的方法，其中所述无活性的催化亲核体是通过在活性位点的突变中造成无活性的氨基酸取代而变为无活性的。
19.如权利要求15所述的用于恢复木聚糖酶活性的方法，其中所述木聚糖酶分子选自SEQ ID NO.3至115。
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