CN112852693B

CN112852693B - 生产l-乳酸的重组大肠杆菌及其应用

Info

Publication number: CN112852693B
Application number: CN202011006212.2A
Authority: CN
Inventors: 张学礼; 刘萍萍; 唐金磊
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2040-09-17
Also published as: CN112852693A

Abstract

本发明公开了生产L‑乳酸的重组大肠杆菌及其应用。本发明所要保护的重组大肠杆菌不含有D‑乳酸脱氢酶基因，含有L‑乳酸脱氢酶突变体基因，所述重组大肠杆菌表达所述L‑乳酸脱氢酶突变体基因，所述L‑乳酸脱氢酶突变体基因编码氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。使用该重组大肠杆菌厌氧发酵48小时后，L‑乳酸产量达150g/L，产率达1.90mol/mol，光学纯度接近100％，表明本发明所构建获得的重组大肠杆菌可高产高光学纯度的L‑乳酸，可应用于在生物发酵领域中生产高品质L‑乳酸。

Description

生产L-乳酸的重组大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及工业微生物领域，具体涉及生产L-乳酸的重组大肠杆菌及其应用。

背景技术

L-乳酸作为一种重要的有机酸，被广泛用于食品、医药、烟草和化工等行业。另外，随着对绿色环保型材料需求的增加，未来L-乳酸最重要的用途是作为单体用于合成生物可降解材料聚乳酸(PLA)。聚乳酸作为一种新型的生物可降解材料，因其优异的综合性能被广泛用于服装、建筑、农林业和医药行业。同时，聚乳酸因使用后可以被自然界中的微生物完全降解生成二氧化碳和水而被公认为是一种环境友好材料。因此，随着PLA应用越来越广泛，L-乳酸在未来的市场潜力也将越来越大。

乳酸生产方式主要包括微生物发酵法、化学合成法和酶催化法。其中，酶催化法由于发酵方法复杂，尚未有工业化生产使用。化学法可实现乳酸的大规模连续化生产，且合成乳酸也已得到美国食品和药品管理局(FDA)的认可，但其原料主要是石油基化学品，因此受原油供应及价格波动影响较大。另外，化学合成涉及大量有毒物质且生产的乳酸没有光学特异性，因此工业中应用相对较少。以可再生原料，如玉米淀粉或木薯粉等为底物利用微生物通过发酵生产乳酸的方法可以高效合成特定光学特性的乳酸。目前发酵法生产的乳酸约占全球乳酸生产的70％以上。

自然界中有许多天然生产乳酸的细菌，这些细菌物种丰富多样，在自然界中分布广泛，如乳杆菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属和乳球菌属等。这些细菌耐酸性强，遗传改造后可以实现同型发酵生产L-乳酸。但是这些细菌发酵过程需要丰富培养基，不能利用五碳糖，这极大地提高了生产成本和下游分离纯化的成本。另外，该类菌通常使用氢氧化钙或碳酸钙作为中和剂来控制发酵pH，最终的发酵产物是乳酸钙。而乳酸钙在分离提取的过程中通常需要加入硫酸，会产生大量的硫酸钙废物，难以处理。更重要的是，该类菌生产的L-乳酸通常手性纯度都在98％以下，达不到聚乳酸生产的要求。

随着合成生物学和代谢工程的发展，通过理性设计和遗传改造获得的工程菌可以在L-乳酸手性、工程菌底物利用范围、菌株耐受性等方面显著改善乳酸生产的性能指标。因此，通过基因组范围代谢育种，设计并构建适应工业化生产需求，能够低成本、高转化率生产高光学纯度L-乳酸的工程菌株并用于生产高品质L-乳酸在生物发酵领域依旧具有很强的必要性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何高产高光学纯度高质量的L-乳酸或如何获得高转化率生产高光学纯度L-乳酸的工程菌株。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组大肠杆菌。

所述重组大肠杆菌不含有D-乳酸脱氢酶基因，含有L-乳酸脱氢酶突变体基因，所述L-乳酸脱氢酶突变体基因编码氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质。

所述L-乳酸脱氢酶突变体基因为下述任一种DNA分子：

c1、编码链的编码序列是序列表中序列3的89-1051位核苷酸的DNA或cDNA分子；

c2、在严格条件下与c1限定的DNA分子杂交且编码所述L-乳酸脱氢酶突变体的DNA或cDNA分子；

c3、与c1或c2限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码所述L-乳酸脱氢酶突变体的DNA或cDNA分子。

上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述L-乳酸脱氢酶突变体基因为ldhL*，其所编码的多肽在对应于序列表中序列4所示氨基酸序列中的第45位上含有用A置换T的修饰和第258位上含有用S置换G的修饰；任选地，所述重组大肠杆菌中所述ldhL*的表达增强、和/或所述ldhL*所编码的蛋白质的活性增强。

上述重组大肠杆菌是通过对受体大肠杆菌进行改造得到的，所述受体大肠杆菌为大肠杆菌Dlac-206,所述大肠杆菌Dlac-206在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7679。

上述重组大肠杆菌含有L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒，所述L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒含有启动子和所述启动子驱动的所述L-乳酸脱氢酶突变体基因。

上述启动子为M1-93，所述M1-93启动子为下述任一种DNA分子：

1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-88位核苷酸的DNA分子；

2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。

上述L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒可为一条链的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-1051位核苷酸的双链DNA分子。

上述L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒位于所述受体大肠杆菌的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点。

上述重组大肠杆菌可通过对大肠杆菌Dlac-206进行如下改造得到：将大肠杆菌Dlac-206的D-乳酸脱氢酶编码基因(简称ldhA)敲除，在大肠杆菌Dlac-206的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点引入L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒。该L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒的核苷酸序列为序列表中序列3。序列表中序列3由1051个核苷酸组成，第1-88位核苷酸为M1-93启动子，第89-1051位核苷酸为L-乳酸脱氢酶突变体基因的CDS。

其中，将大肠杆菌Dlac-206的D-乳酸脱氢酶编码基因(简称ldhA)敲除可通过同源重组实现。在大肠杆菌Dlac-206的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点引入L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒可通过同源重组实现。

上述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌Slac007，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19459。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括对所述受体大肠杆菌进行如下改造，得到所述重组大肠杆菌：敲除所述受体大肠杆菌的D-乳酸脱氢酶基因，并使所述L-乳酸脱氢酶突变体基因在所述受体大肠杆菌中进行表达。

所述构建方法具体可为将大肠杆菌Dlac-206的D-乳酸脱氢酶编码基因(简称ldhA)敲除，在大肠杆菌Dlac-206的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点引入所述L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒。该L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒的核苷酸序列为序列表中序列3。序列表中序列3由1051个核苷酸组成，第1-88位核苷酸为M1-93启动子，第89-1051位核苷酸为L-乳酸脱氢酶突变体基因的CDS。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了生产L-乳酸的方法，包括培养上文任一所述重组大肠杆菌，得到发酵产物；从所述发酵产物中得到L-乳酸。所述方法中，以氨水作为中和剂调节培养过程的pH值。

本发明还提供了一种蛋白质或与其相关的生物材料，其特征在于：所述蛋白质为氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质，所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因组织、或含有B2)所述表达盒的转基因组织；B7)含有B1)所述核酸分子的转基因器官、或含有B2)所述表达盒的转基因器官；B8)抑制或降低上述应用中所述蛋白质表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子具体可为如下b1)b2)或b3)所示的所述蛋白质的编码基因：

b1)编码链的编码序列(ORF)是序列表中序列3的第89-1051位核苷酸的DNA分子；

b2)编码链的核苷酸序列是序列表中序列3的DNA分子；

b3)在严格条件下与2)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

P1、上文任一所述的重组大肠杆菌或上文所述重组大肠杆菌的构建方法在生产L-乳酸中的应用，

P2、上文所述的蛋白质或与其相关的生物材料在生产L-乳酸中的应用，

P3、上文任一所述重组大肠杆菌或上文所述重组大肠杆菌的构建方法在制备L-乳酸脱氢酶中的应用；

P4、上文所述的L-乳酸脱氢酶突变体基因或上文所述的L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒在构建产L-乳酸脱氢酶的重组大肠杆菌的应用；

P5、上文所述的L-乳酸脱氢酶突变体基因或上文所述的L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒在制备L-乳酸脱氢酶中的应用；

P6、上文所述的蛋白质或与其相关的生物材料在制备L-乳酸脱氢酶制剂中的应用。

本发明构建了一种用于生产L-乳酸的经工程化的重组大肠杆菌，菌株号为Slac007，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.19459。使用该重组大肠杆菌厌氧发酵48小时后，L-乳酸产量达150g/L，产率达1.90mol/mol，光学纯度接近100％，表明本发明所构建获得的重组大肠杆菌可高产高光学纯度的L-乳酸，可应用于在生物发酵领域中生产高品质L-乳酸。

保藏说明

菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

菌株编号：Slac007

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年3月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19459

附图说明

图1为大肠杆菌Slac006发酵不同时间得到的发酵液的OD_550nm、葡萄糖和L-乳酸的含量。

图2为重组大肠杆菌Slac007的构建过程中的培养温度、发酵液的OD_550nm。

图3为标准品和重组大肠杆菌Slac007在500mL发酵罐中得到的发酵液液的HPLC图谱。上图为D-乳酸标准品和L-乳酸标准品的HPLC图谱；D-乳酸标准品的保留时间为8.189分钟；L-乳酸标准品的保留时间为9.035分钟。下图为重组大肠杆菌Slac007在500mL发酵罐中得到的发酵液的HPLC图谱；L-乳酸标准品的保留时间为9.055分钟。

图4为Slac007在5L罐中发酵不同时间得到的发酵液的OD₅₅₀nm、葡萄糖和L-乳酸的含量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的大肠杆菌Dlac-206，已于2013年6月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7679。已被2018年12月18日公开的公开号为CN 104278003 B的中国发明专利公开并授权(参见说明书第0212段和权利要求8)。CN 104278003 B公开了大肠杆菌Dlac-206发酵48小时后，乳酸产量达1133mM(相当于102g/L)，产率达1.94mol/mol(相当于0.97g/g)，D-乳酸光学纯度为>99.5％(参见说明书第0209段和第0030段)。

下述实施例以大肠杆菌Dlac-206作为受体大肠杆菌，进行如下改造，得到了高效生产高光学纯度L-乳酸的工程菌株，即重组大肠杆菌Slac007：将大肠杆菌Dlac-206的D-乳酸脱氢酶编码基因(简称ldhA)敲除，在大肠杆菌Dlac-206的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点引入L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒。该L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒的核苷酸序列为序列表中序列3。序列表中序列3由1051个核苷酸组成，第1-88位核苷酸为M1-93启动子，第89-1051位核苷酸为L-乳酸脱氢酶突变体基因的CDS序列。其中，将大肠杆菌Dlac-206的D-乳酸脱氢酶编码基因(简称ldhA)敲除可通过同源重组实现。在大肠杆菌Dlac-206的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点引入L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒也可通过同源重组实现。

实施例1、将L-乳酸脱氢酶编码基因整合入大肠杆菌Dlac-206

通过同源重组的方法将L-乳酸脱氢酶基因(简称ldhL)整合到大肠杆菌Dlac-206的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点获得重组工程菌Slac002，具体包括以下步骤：

(1)植物乳杆菌ATCC 14917基因组DNA的提取

自然界中有多种微生物可以直接合成L-乳酸。为了实现在大肠杆菌中高效生产L-乳酸，根据文献报道的L-乳酸脱氢酶的活性，选取来自植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的L-乳酸脱氢酶编码基因ldhL用于构建重组工程菌。其中，植物乳杆菌ATCC14917购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center，中国北京市朝阳区北辰西路1号院)，保藏号CGMCC 1.2437。植物乳杆菌ATCC 14917基因组DNA的提取使用Promega公司的DNA提取试剂盒(

Genomic DNA Purification Kit，货号A1120)完成，具体步骤按照试剂盒说明书完成。提取的基因组DNA保存于-20℃备用。

(2)通过两步同源重组的方法将ldhL整合到大肠杆菌Dlac-206中富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点，具体内容包括：

第一步，以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用引物Frd-cs-up/Frd-cs-down(由表2中的frd-cs-up和frd-cs-down组成)扩增出2719bp的DNA片段I，包含frd上游同源臂50bp核苷酸序列，cat-sacB表达盒和frd下游同源臂50bp核苷酸序列，用于第一步同源重组。

扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。

扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。

将上述DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko andWanner2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至大肠杆菌Dlac-206，得到含有pKD46的重组大肠杆菌，命名为pKD46/Dlac-206。然后将DNA片段I电转至pKD46/Dlac-206。

电转条件为：首先准备pKD46/Dlac-206的电转化感受态细胞(Dower et al.,1988,Nucleic Acids Res 16:6127-6145)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，所用引物XZ-frd-up/XZ-frd-down，正确的菌落扩增产物为3440bp的片段(包含frd基因上游426bp，cat-sacB表达盒2619bp和frd基因下游395bp)，挑选一个正确的单菌落，命名为大肠杆菌Slac001。

第二步，以植物乳杆菌ATCC 14917基因组DNA为模板，使用引物Frd-ldh14917-up/Frd-ldh14917-down(由表2中的frd-ldh14917-up和frd-ldh14917-down组成)扩增获得1063bp的DNA片段II(包含frd基因上游同源臂50bp，ldhL基因编码序列963bp和frd基因下游同源臂50bp)，用于第二步同源重组。扩增条件和体系同实施例1(2)第一步中所述。将DNA片段II电转至带有pKD46质粒的Slac001。

电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的Slac001的电转化感受态细胞(Dower etal.,1988,Nucleic Acids Res 16:6127-6145)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育4小时。将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-frd-up/XZ-frd-down(由表2中的XZ-frd-up和XZ-frd-down组成)，正确的菌落扩增产物为1784bp的片段(包含frd基因上游426bp，ldhL编码区序列963bp和frd基因下游395bp)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌Slac002(表1)。Slac002是将L-乳酸脱氢酶基因(核苷酸序列是序列表中序列1)整合到大肠杆菌Dlac-206的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点得到的重组菌。本研究中所构建的菌株和质粒详见表1，所用引物详见表2。

表1本发明所用的菌株和质粒

表2本发明所用的引物

实施例2、使用人工调控元件控制L-乳酸脱氢酶编码基因(简称ldhL)的表达

使用人工调控元件控制ldhL基因的表达强度，具体步骤包括：

第一步，以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用引物Frd-cs-up/14917-M93CS-down(由表2中的frd-cs-up和14917-m93cs-down组成)扩增出2719bp的DNA片段I(包含frd基因上游同源臂50bp核苷酸序列，cat-sacB表达盒2619bp和ldhL基因起始50bp)，用于第一步同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1(2)第一步中所述一致。

将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至实施例1中的大肠杆菌Slac002，得到含有pKD46的重组大肠杆菌，命名为pKD46/Slac002。然后将DNA片段I电转至pKD46/Slac002。

电转条件和步骤同实施例1中所述用于ldhL基因整合的第一步方法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-frd-up/14917-ProYZ346-down(由表2中的XZ-frd-up和14917-proyz346-down组成)进行验证，正确的PCR产物应该3391bp(包含frd基因上游同源臂426bp，cat-sacB表达盒2619bp和ldhL基因起始346bp)，挑选一个正确的单菌落，命名为大肠杆菌Slac003。

第二步，以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物Frd-M93-up/14917-M93-down(由表2中的frd-m93-up和14917-m93-down组成)扩增出188bp的DNA片段II(frd基因上游同源臂50bp，M1-93启动子序列88bp和ldhL基因起始50bp)。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Slac003。

电转条件和步骤同实施例1中所述用于ldhL基因整合的第二步方法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为XZ-frd-up/14917-ProYZ346-down(由表2中的XZ-frd-up和14917-proyz346-down组成)，正确的菌落扩增产物为860bp(frd基因上游同源臂426bp，M1-93启动子序列88bp，和ldhL基因起始346bp)的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌Slac004(表1)。大肠杆菌Slac004中含有核苷酸序列是序列表中序列2的第1-88位核苷酸的M1-93启动子。

实施例3、D-乳酸脱氢酶编码基因(简称ldhA)的敲除

使用两步同源重组的方法敲除大肠杆菌Slac004的D-乳酸脱氢酶编码基因(简称ldhA)以实现工程菌株高效生产L-乳酸，具体步骤包括：

第一步，以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用引物ldhA-delCS-up/ldhA-delCS-down(由表2中的ldhA-delcs-up和ldhA-delcs-down组成)扩增出2719bp的DNA片段I(ldhA基因上游同源臂50bp，cat-sacB表达盒2619bp和ldhA基因下游同源臂50bp)，用于第一步同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1(2)第一步中所述一致。

将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至实施例2中的大肠杆菌Slac004，得到含有pKD46的重组大肠杆菌，命名为pKD46/Slac004。然后将DNA片段I电转至pKD46/Slac004。电转条件和步骤同实施例1中所述用于ldhL基因整合的第一步方法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down(由表2中的XZ-ldhA-up和XZ-ldhA-down组成)进行验证，正确的PCR产物应该3448bp(ldhA基因上游同源臂426bp，cat-sacB表达盒2619bp和ldhA基因下游同源臂403bp)，挑选一个正确的单菌落，命名为大肠杆菌Slac005。

第二步，以大肠杆菌Dlac-206的基因组DNA为模板，用引物XZ-ldhA-up/ldhA-del-down(由表2中的XZ-ldhA-up和ldhA-del-down组成)扩增出476bp的DNA片段II(ldhA基因上游同源臂426bp和ldhA基因下游同源臂50bp)。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至大肠杆菌Slac005。

电转条件和步骤同实施例1中所述用于ldhL基因整合的第二步方法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，正确的菌落扩增产物为829bp的片段(ldhA基因上游同源臂426bp和ldhA基因下游同源臂403bp)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌Slac006(表1)。

大肠杆菌Slac006与大肠杆菌Dlac-206相比，大肠杆菌Slac006是对大肠杆菌Dlac-206进行如下改造得到的重组菌：将大肠杆菌Dlac-206的D-乳酸脱氢酶编码基因(简称ldhA)敲除，在大肠杆菌Dlac-206的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点引入L-乳酸脱氢酶基因表达盒。该L-乳酸脱氢酶基因表达盒的核苷酸序列为序列表中序列2。序列表中序列2由1051个核苷酸组成，第1-88位核苷酸为M1-93启动子，第89-1051位核苷酸为L-乳酸脱氢酶基因的CDS(编码序列)。

实施例4使用重组大肠杆菌Slac006生产L-乳酸

种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：

大量元素：葡萄糖20g/L，NH₄H₂PO₄ 0.87g/L、(NH₄)₂HPO₄ 2.63g/L、MgSO₄·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl 0.15g/L。

微量元素：FeCl₃·6H₂O 1.5μg/L、CoCl₂·6H₂O 0.1μg/L、CuCl₂·2H₂O 0.1μg/L、ZnCl₂ 0.1μg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1μg/L、MnCl₂·4H₂O 0.2μg/L,H₃BO₃ 0.05μg/L。

发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为100g/L。

Slac006菌株的厌氧发酵，包括以下步骤：

(1)种子培养：250ml三角瓶中种子培养基为100ml，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠杆菌Slac006按照1％(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种子液按照终浓度OD₅₅₀＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm，发酵2天，得到发酵液。中和剂为5M氨水，使发酵罐的pH控制在7.0。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程中没有通任何气体。

分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对48小时的发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX–87H有机酸分析柱。乳酸光学纯度分析采用日本Sumika Chemical Analysis Service公司的SUMICHIRAL OA-6000手性柱分析。

结果发现(图1)，Slac006发酵48小时，OD₅₅₀达到2.36，L-乳酸产量达到60.6g/L，光学纯度接近100％，手性柱中未检测到D-乳酸的生成，糖酸转化率达到93％。

实施例5、重组大肠杆菌Slac007的构建

从大肠杆菌Slac006出发，通过进化代谢同步提高细胞生长和L-乳酸生产能力。

进化代谢所使用的发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水)：

大量元素：葡萄糖100g/L，NH₄H₂PO₄ 0.87g/L、(NH₄)₂HPO₄ 2.63g/L、MgSO₄·7H₂O0.18g/L、甜菜碱-HCl 0.15g/L。

微量元素：FeCl₃·6H₂O 2.4μg/L、CoCl₂·6H₂O 0.3μg/L、CuCl₂·2H₂O 0.15μg/L、ZnCl₂ 0.3μg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.3μg/L、MnCl₂·4H₂O 0.5μg/L,H₃BO₃ 0.072μg/L。

进化代谢过程使用500mL的发酵罐，发酵培养基为250ml。使用5M氨水为中和剂，使发酵罐的pH控制在7.0。

培养过程中没有通任何气体。

第1-13代，发酵温度为41℃,每24小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550nm达0.05。

第14-27代，发酵温度为43℃,每24小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550nm达0.05。

第28-70代，发酵温度为45℃,每24小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.05。

第71-105代，发酵温度为46℃,每24小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.05。

经过105代进化，获得重组大肠杆菌Slac007(图2)。重组大肠杆菌Slac007为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19459。

实施例6使用重组大肠杆菌Slac007在500mL发酵罐中发酵生产L-乳酸

种子培养基、分析方法如实施例4所述。

使用500mL的发酵罐，发酵培养基为250mL。发酵培养基基本上和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为100g/L，发酵温度46℃，使用的中和剂为5M氨水，使发酵罐的pH控制在7.0。

结果发现(图3)：Slac007发酵48小时后，L-乳酸产量达90g/L，产率达1.9mol/mol，光学纯度接近100％，在本发明条件下手性柱中未检测到D-乳酸生成。

实施例7、使用重组大肠杆菌Slac007在5L发酵罐中发酵生产L-乳酸

种子培养基和发酵液中的L-乳酸含量和L-乳酸光学纯度分析方法如实施例4所述。发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为180g/L。发酵培养基是将该种子培养基的葡萄糖浓度由20g/L替换为180g/L，其它成分不变得到的培养基。发酵培养基配置过程不需要调pH，在发酵过程中系统会自动调整pH。

重组大肠杆菌Slac007在5L发酵罐(上海保兴，BIOTECH-5BG)中的厌氧发酵，包括以下步骤：

(1)种子培养：500mL三角瓶中种子培养基为150mL，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠杆菌Slac007按照1％(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养：5L发酵罐中装入3L发酵培养基，115℃灭菌25min。将种子液接入发酵培养基，使接种后的发酵培养基的OD550nm＝0.2(以未接种的发酵培养基为空白对照)，46℃厌氧培养2天，搅拌转速200rpm，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程没有通任何气体。

结果发现(图4)：发酵48小时后，L-乳酸产量达150g/L，产率达1.90mol/mol，光学纯度接近100％，在本发明条件下手性柱中未检测到D-乳酸生成。

实施例8、重组大肠杆菌Slac007的基因组分析

对实施例3的大肠杆菌Slac006和实施例5的重组大肠杆菌Slac007的基因组测序，包括以下步骤：

实施例3的大肠杆菌Slac006和实施例5的重组大肠杆菌Slac007的基因组DNA分别用Promega公司的DNA提取试剂盒(

Genomic DNA Purification Kit，货号A1120)完成，具体步骤按照试剂盒说明书完成。DNA浓度的检测通过Qubit Fluorometer和琼脂糖凝胶电泳定量完成。

基因组重测序由诺禾致源生物科技有限公司完成。通过构建微生物小片段文库进行测序，每个样品期望数据量为2Gb。序列分析的参考序列为ATCC 8739的基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010468.1)。

通过基因组重测序分析发现，实施例5的重组大肠杆菌Slac007在实施例3的大肠杆菌Slac006的富马酸还原酶编码基因(简称frd)位点处的L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)发生2个点突变，核苷酸序列中第133位核苷酸由A变成G，第772位核苷酸由G变成A，相应的第45位氨基酸由苏氨酸(Threonine)变成丙氨酸(alanine)，第258位氨基酸由甘氨酸(Glycine)变成丝氨酸(Serine)。将突变后的基因命名为L-乳酸脱氢酶突变体基因(简称ldhL*)，将ldhL*编码的蛋白质命名为L-乳酸脱氢酶突变体。L-乳酸脱氢酶突变体的氨基酸序列为序列表中序列4。该L-乳酸脱氢酶突变体与L-乳酸脱氢酶相比，序列4所示氨基酸序列中的第45位上含有用A置换T的修饰和第258位上含有用S置换G的修饰。

实施例9、重组大肠杆菌Slac006和Slac007中L-乳酸脱氢酶活性测定

(1)发酵培养：

Slac006的种子培养和发酵培养与实施例4中的方法相同。

Slac007的种子培养和发酵培养与实施例6中的方法相同。

(2)细胞粗酶液的准备：

发酵液培养到对数生长期。4℃离心收集对数生长期的发酵液15ml。用预冷的Tris-HCl(pH7.5)洗2次；并将菌体重悬于1.5ml的Tris-HCl(pH7.5)中。用超声细胞粉碎机(SCIENTZ-II0，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，超声强度为30％，时间为7min，超声过程为超声1sec，停2sec。最后，将破碎的细胞于4℃，12000rpm离心20min，去除细胞碎片。

粗酶液总蛋白浓度的测定：粗酶液总蛋白浓度用Bio-Rad Protein Assay(伯乐生物技术有限公司)试剂盒进行测定，操作按试剂盒提供的说明书进行。

(3)L-乳酸脱氢酶的活性测定

1mL反应液中含有100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，0.5mM NADH，10mM丙酮酸，10μl粗酶液。由于丙酮酸在L-乳酸脱氢酶的作用下可被NADH还原为L-乳酸。因此可以测定NADH在340nm处吸收值的减少确定乳酸脱氢酶的酶活性；消光系数为6.3mM^-1cm^-1。酶活力单位定义为：在上述条件下，反应1min，减少1μmol NADH所需的酶量，为一个酶活力单位。L-乳酸脱氢酶的比活力以每单位总蛋白中酶的活力进行计算，单位为U/mg。

结果发现，重组大肠杆菌Slac007中L-乳酸脱氢酶的酶活性为1.9U/mg蛋白，是出发菌株Slac006中L-乳酸脱氢酶活性(酶活性为1U/mg蛋白)的1.9倍。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 生产L-乳酸的重组大肠杆菌及其应用

<130> GNCSQ201794

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum

<400> 1

atgtcaagca tgccaaatca tcaaaaagtt gtgttagtcg gcgacggcgc tgttggttct 60

agttacgctt ttgccatggc acaacaagga attgctgaag aatttgtaat tgtcgatgtt 120

gttaaagatc ggacaaaggg tgacgccctt gatcttgaag acgcccaagc attcaccgct 180

cccaagaaga tttactcagg cgaatattca gattgtaagg acgctgactt agttgttatt 240

acagccggtg cgcctcaaaa gcctggtgaa tcacgtttag acttagttaa caagaattta 300

aatatcctat catccattgt caaaccagtt gttgactccg gctttgacgg catcttctta 360

gttgctgcta accctgttga catcttaact tacgctactt ggaaattctc aggtttccca 420

aaggatcgtg tcattggttc agggacttcc ttagactctt cacgtttacg cgttgcgtta 480

ggcaaacaat tcaatgttga tcctcgttcc gttgatgctt acatcatggg tgaacacggt 540

gattctgaat ttgctgctta ctcaactgca accatcggga cacgtccagt tcgcgatgtc 600

gctaaggaac aaggcgtttc tgacgaagat ttagccaagt tagaagatgg tgttcgtaac 660

aaagcttacg acatcatcaa cttgaagggt gccacgttct acggtatcgg gactgcttta 720

atgcggattt ccaaagccat tttacgtgat gaaaatgccg ttttaccagt aggtgcctac 780

atggacggcc aatacggctt aaacgacatt tatatcggga ctccggctgt gattggtgga 840

actggtttga aacaaatcat cgaatcacca ctttcagctg acgaactcaa gaagatgcaa 900

gattccgccg caactttgaa aaaagtgctt aacgacggtt tagctgaatt agaaaataaa 960

taa 963

<210> 2

<211> 1051

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 2

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cgtattgtta 60

gcatgtacgt ttaaaccagg aaacagctat gtcaagcatg ccaaatcatc aaaaagttgt 120

gttagtcggc gacggcgctg ttggttctag ttacgctttt gccatggcac aacaaggaat 180

tgctgaagaa tttgtaattg tcgatgttgt taaagatcgg acaaagggtg acgcccttga 240

tcttgaagac gcccaagcat tcaccgctcc caagaagatt tactcaggcg aatattcaga 300

ttgtaaggac gctgacttag ttgttattac agccggtgcg cctcaaaagc ctggtgaatc 360

acgtttagac ttagttaaca agaatttaaa tatcctatca tccattgtca aaccagttgt 420

tgactccggc tttgacggca tcttcttagt tgctgctaac cctgttgaca tcttaactta 480

cgctacttgg aaattctcag gtttcccaaa ggatcgtgtc attggttcag ggacttcctt 540

agactcttca cgtttacgcg ttgcgttagg caaacaattc aatgttgatc ctcgttccgt 600

tgatgcttac atcatgggtg aacacggtga ttctgaattt gctgcttact caactgcaac 660

catcgggaca cgtccagttc gcgatgtcgc taaggaacaa ggcgtttctg acgaagattt 720

agccaagtta gaagatggtg ttcgtaacaa agcttacgac atcatcaact tgaagggtgc 780

cacgttctac ggtatcggga ctgctttaat gcggatttcc aaagccattt tacgtgatga 840

aaatgccgtt ttaccagtag gtgcctacat ggacggccaa tacggcttaa acgacattta 900

tatcgggact ccggctgtga ttggtggaac tggtttgaaa caaatcatcg aatcaccact 960

ttcagctgac gaactcaaga agatgcaaga ttccgccgca actttgaaaa aagtgcttaa 1020

cgacggttta gctgaattag aaaataaata a 1051

<210> 3

<211> 1051

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 3

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cgtattgtta 60

gcatgtacgt ttaaaccagg aaacagctat gtcaagcatg ccaaatcatc aaaaagttgt 120

gttagtcggc gacggcgctg ttggttctag ttacgctttt gccatggcac aacaaggaat 180

tgctgaagaa tttgtaattg tcgatgttgt taaagatcgg gcaaagggtg acgcccttga 240

tcttgaagac gcccaagcat tcaccgctcc caagaagatt tactcaggcg aatattcaga 300

ttgtaaggac gctgacttag ttgttattac agccggtgcg cctcaaaagc ctggtgaatc 360

acgtttagac ttagttaaca agaatttaaa tatcctatca tccattgtca aaccagttgt 420

tgactccggc tttgacggca tcttcttagt tgctgctaac cctgttgaca tcttaactta 480

cgctacttgg aaattctcag gtttcccaaa ggatcgtgtc attggttcag ggacttcctt 540

agactcttca cgtttacgcg ttgcgttagg caaacaattc aatgttgatc ctcgttccgt 600

tgatgcttac atcatgggtg aacacggtga ttctgaattt gctgcttact caactgcaac 660

catcgggaca cgtccagttc gcgatgtcgc taaggaacaa ggcgtttctg acgaagattt 720

agccaagtta gaagatggtg ttcgtaacaa agcttacgac atcatcaact tgaagggtgc 780

cacgttctac ggtatcggga ctgctttaat gcggatttcc aaagccattt tacgtgatga 840

aaatgccgtt ttaccagtaa gtgcctacat ggacggccaa tacggcttaa acgacattta 900

tatcgggact ccggctgtga ttggtggaac tggtttgaaa caaatcatcg aatcaccact 960

ttcagctgac gaactcaaga agatgcaaga ttccgccgca actttgaaaa aagtgcttaa 1020

cgacggttta gctgaattag aaaataaata a 1051

<210> 4

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工合成（Artificial Sequence）

<400> 4

Met Ser Ser Met Pro Asn His Gln Lys Val Val Leu Val Gly Asp Gly

1 5 10 15

Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Met Ala Gln Gln Gly Ile Ala

20 25 30

Glu Glu Phe Val Ile Val Asp Val Val Lys Asp Arg Ala Lys Gly Asp

35 40 45

Ala Leu Asp Leu Glu Asp Ala Gln Ala Phe Thr Ala Pro Lys Lys Ile

50 55 60

Tyr Ser Gly Glu Tyr Ser Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile

65 70 75 80

Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Ser Arg Leu Asp Leu Val

85 90 95

Asn Lys Asn Leu Asn Ile Leu Ser Ser Ile Val Lys Pro Val Val Asp

100 105 110

Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Asp Ile

115 120 125

Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val

130 135 140

Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ser Arg Leu Arg Val Ala Leu

145 150 155 160

Gly Lys Gln Phe Asn Val Asp Pro Arg Ser Val Asp Ala Tyr Ile Met

165 170 175

Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Ala Tyr Ser Thr Ala Thr Ile

180 185 190

Gly Thr Arg Pro Val Arg Asp Val Ala Lys Glu Gln Gly Val Ser Asp

195 200 205

Glu Asp Leu Ala Lys Leu Glu Asp Gly Val Arg Asn Lys Ala Tyr Asp

210 215 220

Ile Ile Asn Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Leu

225 230 235 240

Met Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Arg Asp Glu Asn Ala Val Leu Pro

245 250 255

Val Ser Ala Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp Ile Tyr Ile

260 265 270

Gly Thr Pro Ala Val Ile Gly Gly Thr Gly Leu Lys Gln Ile Ile Glu

275 280 285

Ser Pro Leu Ser Ala Asp Glu Leu Lys Lys Met Gln Asp Ser Ala Ala

290 295 300

Thr Leu Lys Lys Val Leu Asn Asp Gly Leu Ala Glu Leu Glu Asn Lys

305 310 315 320

Claims

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌不含有D-乳酸脱氢酶基因，含有L-乳酸脱氢酶突变体基因，所述重组大肠杆菌表达所述L-乳酸脱氢酶突变体基因，所述L-乳酸脱氢酶突变体基因编码氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；

所述重组大肠杆菌是通过对受体大肠杆菌进行改造得到的，所述受体大肠杆菌为大肠杆菌Dlac-206, 所述大肠杆菌Dlac-206在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7679；

所述L-乳酸脱氢酶突变体基因在所述受体大肠杆菌的富马酸还原酶编码基因位点引入。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述L-乳酸脱氢酶突变体基因为编码序列是序列表中序列3的89-1051位核苷酸的DNA或cDNA分子；

或，

所述L-乳酸脱氢酶突变体基因为ldhL*，其所编码的多肽在对应于序列表中序列4所示氨基酸序列中的第45位上含有用A置换T的修饰和第258位上含有用S置换G的修饰。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒，所述L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒含有启动子和所述启动子驱动的所述L-乳酸脱氢酶突变体基因。

4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述启动子为M1-93启动子，所述M1-93启动子为一条链的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-88位核苷酸的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌Slac007，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.19459。

6.权利要求1-5中任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括对所述受体大肠杆菌进行如下改造，得到所述重组大肠杆菌：敲除所述受体大肠杆菌的D-乳酸脱氢酶基因，并使所述L-乳酸脱氢酶突变体基因在所述受体大肠杆菌中进行表达，所述受体大肠杆菌为大肠杆菌Dlac-206, 所述大肠杆菌Dlac-206在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7679；

7.生产L-乳酸的方法，包括培养权利要求1-5中任一所述重组大肠杆菌，得到发酵产物；从所述发酵产物中得到L-乳酸。

8.一种蛋白质或与其相关的生物材料，其特征在于：所述蛋白质为氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质，所述生物材料为下述任一种：

B1）编码所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物。

9.下任一种应用：

P1、权利要求1-5中任一权利要求所述的重组大肠杆菌或权利要求6所述的方法在生产L-乳酸中的应用；

P2、权利要求8所述的蛋白质或与其相关的生物材料在生产L-乳酸中的应用；

P3、权利要求1-5中任一权利要求所述重组大肠杆菌或权利要求6所述的方法在制备L-乳酸脱氢酶中的应用；

P4、权利要求1或2中所述的L-乳酸脱氢酶突变体基因或权利要求3中所述的L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒在构建产L-乳酸脱氢酶的重组大肠杆菌的应用；

P5、权利要求1或2中所述的L-乳酸脱氢酶突变体基因或权利要求3中所述的L-乳酸脱氢酶突变体基因表达盒在制备L-乳酸脱氢酶中的应用；

P6、权利要求8所述的蛋白质或与其相关的生物材料在制备L-乳酸脱氢酶制剂中的应用。