CN115896067A

CN115896067A - 一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体、其编码基因及用途

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Publication number: CN115896067A
Application number: CN202211337064.1A
Authority: CN
Inventors: 袁灿生; 刘斌; 王琳; 龙卫华; 柯壮; 唐雨晨; 何健
Original assignee: Nanjing Agricultural University; Jiangsu Open University of Jiangsu City Vocational College
Current assignee: Nanjing Agricultural University; Jiangsu Open University of Jiangsu City Vocational College
Priority date: 2022-10-28
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2042-10-28
Also published as: CN115896067B

Abstract

本发明公开了一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体、其编码基因及用途，所述突变体包含第270位的丙氨酸突变为精氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明提供的突变体M4（A270R）对磺酰脲类除草剂的比酶活较野生型提高了1.3‑3.2倍，因此在磺酰脲除草剂残留污染生物修复和抗磺酰脲类除草剂转基因工程中具有良好的应用前景。

Description

一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体、其编码基因及用途

技术领域

本发明属于蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体、其编码基因及用途。

背景技术

近年来，随着高毒性和长残留除草剂逐渐被限用和淘汰，除草剂市场逐渐进入低毒高效产品的时代。

磺酰脲类除草剂以其高效、广谱和低毒等优点发展迅速，已经成为继有机磷、乙酰胺类除草剂后的第三大除草剂。

据联合国粮食与农业组织（FAO）报道，磺酰脲类除草剂在1992年的使用量仅为129吨，但到2011年其使用量增加了17倍，在欧洲和北美地区，其用量甚至增加了100倍以上。

在我国，磺酰脲类除草剂每年的应用面积已超过200万公顷，并仍呈扩大的趋势。

目前，磺酰脲类除草剂全球年销售额超过 20 亿美元，约占全部除草剂销售额的10%。

虽然磺酰脲类除草剂对哺乳动物低毒，但部分磺酰脲类除草剂，如甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆和胺苯磺隆等化学性质较稳定，土壤残留期很长，尤其在碱性土壤其残留期可长达2-3年，对后茬作物产生严重的药害。

而部分残留期短的磺酰脲类除草剂，如苄嘧磺隆、噻吩磺隆和苯磺隆等，可作为抗除草剂转基因作物构建的靶标除草剂。

因此获得优良的磺酰脲类除草剂降解脱毒酶和基因资源对磺酰脲类除草剂残留污染的生物修复和抗除草剂转基因工程都具有重要的应用价值。

TsmE是从细菌 Hansschlegelia zhihuaiae S113中鉴定的，能够催化噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苄嘧磺隆、苯磺隆、胺苯磺隆和氯嘧磺隆等多种磺酰脲类除草剂水解去酯化脱毒的酯酶。

然而，TsmE对噻吩磺隆有极高的去酯化效率，但对其他磺酰脲类除草剂的去酯化效率则较低。

发明内容

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体、其编码基因及用途，能有效解决上述TsmE对噻吩磺隆以外的其他磺酰脲类除草剂的去酯化效率较低的不足之处。

技术方案：第一方面，本发明提供一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体，所述突变体包含第270位的丙氨酸突变为精氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

第二方面，本发明提供一种第一方面所述的磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体的编码基因，所述编码基因包含第808位的G突变为C和第809位的C突变为G，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第三方面，本发明提供含有第二方面所述的磺酰脲类除草剂水解酶突变体编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体是将第二方面所述的磺酰脲类除草剂水解酶突变体编码基因插入pET-29a(+)的Nde I和Hind Ⅲ位点之间所得。

第四方面，本发明提供含有第二方面所述的磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体编码基因的基因工程菌，所述基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

第五方面，本发明提供第一方面所述的突变体在制备降解磺酰脲类除草剂中的应用；

第一方面所述的突变体在去除土壤或水体中磺酰脲类除草剂残留中的应用；

第二方面所述的编码基因在制备降解磺酰脲类除草剂或构建抗磺酰脲类除草剂转基因作物中的应用；

第三方面所述的载体或第四方面所述的基因工程菌在制备降解磺酰脲类除草剂的应用，所述磺酰脲类除草剂为苯磺隆、甲嘧磺隆、噻吩磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。

有益效果：本发明以磺酰脲类除草剂水解酶TsmE的野生型为模板，通过定向进化技术，获得了酶活提升的突变体M4，其第270位的丙氨酸突变为精氨酸。

突变体M4对甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆和胺苯磺隆的比酶活分别提高了1.3、1.8、2.0、2.2、1.9和3.2倍。

所述突变体M4及其编码基因可用于构建抗磺酰脲类除草剂转基因作物，也可用于土壤、水体中磺酰脲类除草剂的去除，具有非常重要的理论和应用价值。

附图说明

图1为磺酰脲类除草剂水解酶TsmE催化甲磺隆水解生成无毒的酸产物的反应式；

图2为突变体M4重组表达载体的构建图；

图3为磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体的SDS-PAGE图谱；其中，泳道1为蛋白Marker，泳道2为野生型TsmE，泳道3为突变体M4。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明：

实施例1：定向进化筛选酶活显著提高的TsmE突变体

1.1 野生型TsmE基因的合成

合成的野生型TsmE基因的核苷酸序列(1197bp)，如SEQ ID NO.1所示，其编码TsmE蛋白的398个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

将合成的野生型TsmE基因克隆至pUC57载体上，重组载体命名为pUC-tsmE，然后转化至大肠杆菌DH5α中。

1.2 构建TsmE基因突变文库

以质粒pUC-tsmE为模板，用引物1（SEQ ID NO.5）和引物2（SEQ ID NO.6）进行易错PCR，使得TsmE基因由于碱基随机错配而发生突变。

易错PCR产物克隆至pMD19-T载体，酶连产物热击转化至对甲磺隆敏感的大肠杆菌DH10B (ilvG+)中。

随机突变文库涂布于添加有100 mg/L Amp，200 mg/L IPTG和200 mg/L X-Gal的LB平板中，37℃过夜培养；

所用PCR引物序列如下所示：

SEQ ID NO.5：

ATGGAAACCGATAAAAAAACCG

SEQ ID NO.6：

TCAGCTTTCGTTCTGATCTAAG

所用易错PCR扩增体系为：

PCR 扩增程序：

a. 95℃预变性 3min；

b. 94℃ 变性 0.5min，52℃退火1.0 min，72℃延伸1.5 min，进行30个循环；

c. 72℃ 延伸10 min，冷却到室温。

1.3 对TsmE基因突变文库进行筛选

将上述构建的突变文库中的转化产物接种于含有浓度为50 µM的甲磺隆的基础盐培养基，并添加5g/L的葡萄糖、200 mg/L缬氨酸、200 mg/L亮氨酸和100 mg/L的氨苄青霉素，培养3天。

鉴于大肠杆菌DH10B (ilvG+)对高浓度甲磺隆非常敏感，抗性基因能够将甲磺隆转化为对细菌无毒的酸产物，反应式如图1所示，从而解除对大肠杆菌DH10B (ilvG+)生长的抑制作用，因而利用此原理对上述突变文库进行高通量筛选。

挑选能在筛选平板上生长良好的重组菌株菌落。

测定挑选菌株对磺酰脲类除草剂的抗性和去酯化能力，从中筛选对磺酰脲类除草剂去酯化活性显著提高的重组菌株，分析重组菌株中的TsmE序列突变情况，

上述基础盐培养基配方为：1.0 g NH₄Cl，0.5g NaCl，1.5g K₂HPO₄，0.5g KH₂PO₄，0.2g MgSO₄•7H₂O，加去离子水定容至1L，固体培养基添加2%的琼脂粉，灭菌后使用。

1.4 获得突变的抗性基因

经过几轮筛选获得一个酶活提高的TsmE突变体，命名为M4，所述突变体M4的核苷酸序列第808位和第809位由原来的GC突变为CG，编码突变体M4的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，导致其氨基酸序列第270位由原来的丙氨酸突变为精氨酸，突变体M4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2：TsmE突变体基因在BL21(pET-29a (+))中的高效表达

2.1 TsmE突变体基因的PCR扩增

以筛选到的突变体重组菌株为模板，用引物3（SEQ ID NO.7）和引物4（SEQ IDNO.8）扩增所述TsmE突变体基因，且含Nde I和Hind Ⅲ酶切位点，所用PCR引物序列如下所示：

SEQ ID NO.7：

TGCAGACATATGGAAACCGATAAAAAAAC(下划线为Nde I酶切位点)

SEQ ID NO.8

CCCAAGCTTTCAGCTTTCGTTCTGATCTAAGCCGTGC (下划线为Hind Ⅲ酶切位点)

PCR扩增体系为：

PCR 扩增程序：

a. 98℃预变性3min；

b. 98℃变性0.5min，55℃退火0.5 min，72℃延伸1.0 min，进行30个循环；

c. 72℃延伸10 min，冷却到室温。

2.2 细菌表达载体的构建和重组微生物的获得

使用凝胶纯化回收试剂盒对PCR产物进行回收提纯，具体方法参考试剂盒说明书。

纯化后的PCR产物与pET-29a (+)质粒分别用限制性内切酶Nde I和Hind Ⅲ进行酶切，酶切体系如下：

37℃酶切12h，然后将切下的突变体基因片段与酶切后的表达载体pET-29a (+)进行酶连，构建好的重组表达载体如图2所示，命名为pET29a-M4。

将重组表达载体转化到表达宿主菌BL21(DE3)中，获得重组微生物BL21(M4)。

2.3 TsmE突变体的表达和纯化

将BL21(M4)接种于LB培养基中，37℃，200rpm 摇床培养至OD_600nm为 0.4-0.6，加IPTG至浓度0.4 mM，16℃诱导培养12个小时。

取100mL菌液离心收集菌体，采用PBS (50 mM，pH 7.4) 将菌体洗两遍，用10mL的PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎(Auto Science, UH-650B ultrasonic processor，30%intensity) 5-10 分钟，12000rpm离心30min，收集上清，用镍离子亲和层析柱对TsmE突变体进行纯化，纯化后的酶进行蛋白质电泳，如图3所示，说明突变体M4成功表达。

实施例3：TsmE突变体酶活力测定

酶活反应体系（1mL）：在50 mM PBS缓冲液（pH 7.4）中添加纯化的TsmE突变体酶和100 μM磺酰脲类除草剂底物。

每个反应从加入反应酶开始计时，在30℃反应10min后迅速添加等体积的乙腈终止反应。

以不添加酶作为对照，利用高效液相色谱(HPLC)检测每种磺酰脲底物的减少量来测定突变体的活性。

HPLC条件为：UltiMate ®3000 Titanium System高效液相色谱仪；ThermoScientific Syncronis C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相为乙腈/水（60/40，v/v），水中添加了0.5%乙酸；流速1 mL/min；进样体积20 µL；检测波长为230 nm和255 nm；柱温40℃。

一个酶活力单位定义为：在pH7.4、温度30℃条件下1min催化水解1.0 μmol底物所需的酶量定义为1个酶活力单位（U），实验结果如表1所示，

表1 野生型TsmE和突变体M4对各种磺酰脲除草剂的酶活

上述实验结果表明：与野生型TsmE相比，纯化后的M4对甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆和胺苯磺隆的比酶活分别提高了1.3、1.8、2.0、2.2、1.9和3.2倍。

以上实施例中使用的微生物来源如下：大肠杆菌 DH5α购自宝生物工程（大连）有限公司，大肠杆菌高表达载体pET-29a(+)购自Novegen公司，表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体，其特征在于：所述突变体包含第270位的丙氨酸突变为精氨酸，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种权利要求1所述的磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体的编码基因，其特征在于：所述编码基因包含第808位的G突变为C和第809位的C突变为G，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.含有权利要求2所述的磺酰脲类除草剂水解酶突变体编码基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：将权利要求2所述的磺酰脲类除草剂水解酶突变体编码基因插入pET-29a(+)的Nde I和Hind Ⅲ位点之间所得。

5.含有权利要求2所述的磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体编码基因的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求1所述的突变体在制备降解磺酰脲类除草剂中的应用。

8.权利要求1所述的突变体在去除土壤或水体中磺酰脲类除草剂残留中的应用。

9.权利要求2所述的编码基因在制备降解磺酰脲类除草剂或构建抗磺酰脲类除草剂转基因作物中的应用。

10.权利要求3所述的载体或权利要求5所述的基因工程菌在制备降解磺酰脲类除草剂的应用。