JP2015512643A - 脂質生成を増大させるための遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中における細胞質リンゴ酸酵素の発現 - Google Patents

Abstract

細胞質リンゴ酸酵素をコードするポリヌクレオチドと、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量基準で少なくとも約３５質量％の脂質含量と、改変多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生合成経路とを含んでなり、細胞質リンゴ酸酵素の過剰発現が脂質含量を増大させる、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が開示される。

Description

本出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１２年４月３日に出願された米国仮特許出願第６１／６１９，５７４号明細書の優先権を主張する。

本発明は生物工学の分野にある。より具体的には、本発明は、脂質含量を増大させるための、細胞質リンゴ酸酵素を過剰発現する遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種に関する。

研究は、脂質および脂肪酸（ＦＡ）生合成経路の理解に向けられ、これらの生合成経路を宿主生物に導入するために、遺伝子工学が使用されている。例えば多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の商業的な生産手段として、植物、藻類、真菌、ストラメノパイル、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が調査されている。遺伝子工学は、天然ではリノール酸（ＬＡ、１８：２ ω−６）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ ω−３）脂肪酸生成に制限されているものであっても、いくつかの宿主の天然能力を実質的に改変して、様々な長鎖ω−３／ω−６ＰＵＦＡの高レベルの生成をもたらし得ることを実証している。

文献は、ＥＰＡ産生に関与するω−３／ω−６ ＰＵＦＡ生合成経路の様々な部分が、植物および非油性酵母に導入されるいくつかの最近の例を報告しているが、多大な努力は、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の使用に向けられている（特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４）。油性酵母は、天然に油を合成して蓄積する能力のある酵母と定義され、油の蓄積は細胞乾燥質量の少なくとも２５％であり、またはこれらの酵母は、油を合成して蓄積する能力を持つように遺伝子改変されて、油の蓄積は細胞乾燥質量の少なくとも２５％である。

真菌中で脂質蓄積を増大させることは、依然としてかなりの関心の対象である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞質ゾル中におけるリンゴ酸酵素の発現は、ＮＡＤＰＨ産生を増大させることが示されている（非特許文献１）。脂肪酸合成における還元剤としてのＮＡＤＰＨの役割を所与として、リンゴ酸酵素が、脂質産生を変化させる可能な因子として調査されている。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）は、野性型ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）中におけるリンゴ酸酵素の過剰発現が、脂質蓄積に２．５倍の増大をもたらすことを発見した。この所見に一致して、いくつかの研究は、Ｍ．シルシネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）およびモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）中におけるリンゴ酸酵素発現が、脂質蓄積と相関することを示した（非特許文献３；非特許文献４）。また、リンゴ酸酵素活性が欠損している変異アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）単離株は、リンゴ酸酵素を有するＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）株によって産生される量の半分の脂質を蓄積することが示された（非特許文献５）。

しかし野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における研究は、脂質産生において、リンゴ酸酵素がそれほど大きな役割を果たしていないかもしれないことを示唆する。Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（非特許文献６）は、ミトコンドリア形態のリンゴ酸酵素の過剰発現が、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質蓄積に影響を及ぼさないことを簡単に報告している。

米国特許第７，２３８，４８２号明細書 米国特許第７，９３２，０７７号明細書 米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書

２００４，ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３５２−３６３ ２００７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５３：２０１３−２０２５ １９９９，Ｗｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４５：１９１１−１９１７ ２００２，Ｒａｔｌｅｄｇｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：１０４７−１０５０ １９９７，Ｗｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：２５３−２５７ ２０１１，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９０：１１９３−１２０６

前述の開示にもかかわらず、驚くことに、改変多価不飽和脂肪酸生合成経路を含んでなり、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量の少なくとも約３５質量％の脂質含量を有する遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の脂質含量を、細胞質リンゴ酸酵素の過剰発現によって増大させ得ることが分かった。

一実施形態では、本発明は、（ｉ）細胞質リンゴ酸酵素をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量基準で少なくとも約３５質量％の脂質含量；および（ｉｉｉ）改変多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生合成経路を含んでなり、細胞質リンゴ酸酵素の過剰発現が脂質含量を増大させる、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種に関する。

第２の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質リンゴ酸酵素は、機能不全ミトコンドリア標的化配列を含んでなる。第３の実施形態では、細胞質リンゴ酸酵素は、ミトコンドリア標的化配列を欠く。

第４の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質リンゴ酸酵素は、配列番号５と少なくとも約９０％の配列同一性を有してリンゴ酸酵素活性を有する、アミノ酸配列を含んでなる。

第５の実施形態では、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量基準で、少なくとも約５０質量％の脂質含量を有する。

第６の実施形態では、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が含んでなる改変ＰＵＦＡ生合成経路は、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸などの少なくとも１つのＰＵＦＡを生成する。好ましくは、改変ＰＵＦＡ生合成経路は、エイコサペンタエン酸を生成する。

第７の実施形態では、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。

第８の実施形態では、本発明は、
ａ）本発明の遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を培養して、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油を生成させるステップと、
ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）の微生物油を回収するステップと
を含んでなる、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の脂質含量を増大させる方法に関する。

方法に関して、細胞質リンゴ酸酵素は機能不全ミトコンドリア標的化配列を含んでなってもよく、または細胞質リンゴ酸酵素はミトコンドリア標的化配列を含まない。さらに細胞質リンゴ酸酵素は、配列番号５と少なくとも約９０％の配列同一性を有してリンゴ酸酵素活性を有する、アミノ酸配列を含んでなってもよい。

方法のなおも別の態様では、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の脂質含量は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量基準で少なくとも約５０質量％である。

方法のさらに別の態様では、改変ＰＵＦＡ生合成経路は、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、少なくとも１つのＰＵＦＡを生成する。好ましくは、生成する少なくとも１つのＰＵＦＡは、エイコサペンタエン酸である。

サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＳｃＭＥ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（ＳｐＭＥ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＹｌＭＥ）によって発現される、ＭＥのアミノ酸配列のアラインメントが示される。描写されるＹｌＭＥ配列中の下線付きアミノ酸は、予測ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）に相当する。 図１−１の続き。 Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＭＥの異所性発現のためのプラスミドが示される。コンストラクトｐＭＥ（Ａ）が、完全長（天然）Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＭＥ（ＹｌＭＥ）の過剰発現のためのカセット（ＦＢＡＩＮ：：ＹｌＭＥ：：ＰＥＸ２０）を含有するのに対し、コンストラクトｐＭＥＴ２（Ｂ）は、トランケート型（細胞質）Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＭＥ（ＹｌＭＥ−Ｔ２）の過剰発現のためのカセット（ＦＢＡＩＮ：：ＹｌＭＥ−Ｔ２：：ＰＥＸ２０）を含有する。コンストラクトｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３（Ｃ）は、対照目的で使用された。 図２−１の続き。 ＹｌＭＥおよびＹｌＭＥ−Ｔ２のアミノ酸配列のアラインメントが示される。ＹｌＭＥのこのバージョンは、図１で示されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で天然で発現されるＭＥと比較して、１つの残基（第２のアミノ酸）が異なる。 ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で、ω−３およびω−６脂肪酸を生成する生合成経路が示される。 ゲノム中でＭＥ遺伝子座を妨害するための一般スキームが示される。簡単に述べると、ＭＥ欠失コンストラクトによって標的化された形質転換体が、Ｕｒａ^＋表現型について選択され、Ｕｒａ⁻表現型のための５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）による選択が、それに続く。次にその中でＭＥ遺伝子が、ＵＲＡ３遺伝子と共に、遺伝子組換えされてゲノムから除去された、Ｕｒａ⁻クローンについて、スクリーニングを実施した。 Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＭＥ遺伝子をノックアウトするためのプラスミドｐＭＥ−ＫＯが示される。

引用された全ての特許、特許出願、および刊行物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。

以下の定義が提供される。

「エイコサペンタエン酸」は、「ＥＰＡ」と略記される。

「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は、「ＡＴＣＣ」と略記される。

「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略記される。

「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略記される。

「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略記される。

「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略記される。

「乾燥細胞質量」は、「ＤＣＷ」と略記される。

「質量％」は、「ｗｔ％」と略記される。

本明細書の用法では「発明」または「本発明」という用語は、特許請求の範囲および本明細書に記載されるような、本発明の全ての態様および実施形態を指すことが意図され、いずれかの特定の実施形態または態様に制限されると理解すべきではない。

「リンゴ酸酵素」という用語は、（Ｓ）−リンゴ酸：ＮＡＤＰ^＋酸化還元酵素（脱炭酸する）、ピルビン酸リンゴ酸カルボキシラーゼ、ＮＡＤＰ^＋−特異的リンゴ酸酵素、またはＮＡＤＰ^＋−リンゴ酸酵素を指す。リンゴ酸酵素は、ＮＡＤＰ^＋からのＮＡＤＰＨ生成を伴う、リンゴ酸からピルビン酸への不可逆的脱炭酸を行う。リンゴ酸酵素は、酵素委員会登録ＥＣ １．１．１．３９およびＥＣ １．１．１．４０を有する。「細胞質リンゴ酸酵素」という用語は、リンゴ酸酵素が、細胞中の細胞質ゾル（細胞質）に標的化されることを指す。細胞質標的化は、リンゴ酸酵素が、ミトコンドリア標的化配列を欠く、または機能不全ミトコンドリア標的化配列を有する場合に生じ得る。「リンゴ酸酵素」および「ＭＥ」という用語は、本明細書で同義的に使用される。

「ミトコンドリア標的化配列」という用語は、ミトコンドリアへのタンパク質局在化を誘導するアミノ酸配列を指す。「ミトコンドリア標的化配列」、「ＭＴＳ」、および「ミトコンドリアシグナルペプチド」という用語は、本明細書で同義的に使用される。ＭＴＳは、通常、タンパク質のＮ末端に位置して、交互する疎水性アミノ酸と正に帯電したアミノ酸とを有する、１つまたは複数の両親媒性らせん（ｈｅｌｉｘｅｓ）を含んでなる。ＭＴＳの構造は、タンパク質とミトコンドリア表面受容体との相互作用、および引き続くミトコンドリア内膜および外膜層を通過する，ミトコンドリアマトリックス内への移行を可能にし、次にそこでＭＴＳが切断される。ＭＴＳは、通常、２０〜８０アミノ酸長である。ミトコンドリア標的化配列の生理機能は、説明されている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ：ＮＹ（２００２）。

「機能不全ミトコンドリア標的化配列」という用語は、ミトコンドリア標的化機能を有しないＭＴＳを指す。ＭＴＳは、ＭＴＳがミトコンドリア表面受容体と相互作用しないようにＭＴＳの構造的特徴を変化させ、またはＭＴＳをミトコンドリア膜移行させる、欠失、挿入、および／またはアミノ酸変化を含有するために、機能不全であってもよい。例えば、機能不全ＭＴＳは、ＭＴＳの１つまたは複数の両親媒性らせん（ｈｅｌｉｘｅｓ）を除去し、または構造的に損なうことで提供されてもよい。

「脂質」という用語は、あらゆる脂溶性（すなわち親油性）天然分子を指す。脂質の概説は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で提供される（その中の表２を参照されたい）。

「油」という用語は、２５℃で液体の脂質物質を指し；油は疎水性で、有機溶媒に可溶性である。油性生物では、油が総脂質の大部分を構成する。「油」は、トリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］で主に構成されるが、その他の中性脂肪、リン脂質、および遊離脂肪酸もまた含有してもよい。油中の脂肪酸組成と総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似しており；したがって総脂質中の脂肪酸濃度の増大または減少は、油中の脂肪酸濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。

「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］という用語は、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される、中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびに鎖長のより短い飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。

「全脂肪酸」［「ＴＦＡ」］という用語は、本明細書において、例えばバイオマスまたは油であってもよい所与のサンプル中で、（当該技術分野で公知の）塩基エステル交換法によって、脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ］に誘導体化し得る全ての細胞脂肪酸の合計を指す。したがって総脂肪酸は、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧをはじめとする）からの脂肪酸、および極性脂質画分（例えばホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分をはじめとする）からの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。

細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞質量（「ＤＣＷ」）のパーセントとしてのＴＦＡの尺度であるが、総脂質含量は、ＤＣＷのパーセントとしてのＦＡＭＥ（「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」）によって近似できる。したがって総脂質含量（「ＴＦＡ％ＤＣＷ」）は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。

総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの特定の脂肪酸のミリグラムのように、ＴＦＡの質量％［「％ＴＦＡ」］として表される。本明細書中で特に断りのない限り、総脂質または油に対する特定脂肪酸のパーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば総脂質または油の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。

場合によっては、細胞中の特定脂肪酸含量をその乾燥細胞質量の質量％（「％ＤＣＷ」）として表すことが有用である。したがって、例えばＥＰＡ生産性の尺度［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は、次式に従って判定される：（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００。しかし乾燥細胞質量の質量％（「％ＤＣＷ」）としての細胞中ＥＰＡなどの脂肪酸含量は、以下のように近似し得る：（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００。

「脂質プロフィール」および「脂質組成」という用語は同義であり、総脂質または油中などの特定の脂質画分中に含有される個々の脂肪酸の量を指し、量はＴＦＡの質量％として表される。混合物中に存在する個々の脂肪酸の総和は、１００になるべきである。

「油性」という用語は、特定の実施形態における用法では、それらのエネルギー源を脂質の形態で貯蔵する傾向がある生物を記述する（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。油性微生物は、その乾燥細胞質量の約２５％以上を油として含んでなり得て、または蓄積し、または産生し得る（すなわち≧２５ ＴＦＡ％ＤＣＷ）。

「油性酵母」という用語は、油を産生する酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、例えばヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。

「脂肪酸」という用語は、約Ｃ_１２〜Ｃ_２２の様々な鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、鎖長のより長い酸およびより短い酸の双方も知られている。優勢な鎖長は、Ｃ_１６〜Ｃ_２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の簡易表記体系によって表され、式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合数である。「不飽和脂肪酸」に対する「飽和脂肪酸」、「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］に対する「一不飽和脂肪酸」、および「ω−３脂肪酸」［「ω−３」または「ｎ−３」］に対する「ω−６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］の区別に関する追加的な詳細は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供される。

本明細書でＰＵＦＡを記述するのに使用される命名法を表２に示す。「略記法」欄では、ω基準系を使用して、炭素数、二重結合数、そしてこの目的で１と番号付けされるω炭素から数えてω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表２の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸とそれらの前駆体の一般名、明細書全体を通じて使用される略称、および各化合物の化学名を要約する。

「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸に、およびＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に変換する代謝過程を指す。この過程は、文献に記載されている（例えば米国特許第７，９３２，０７７号明細書；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）。簡単に述べると、この方法は、小胞体膜に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される、一連の特殊な伸長および不飽和化酵素による、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の伸長と、二重結合の付加を通じた分子の不飽和化とを伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、ＰＵＦＡの生合成と関連付けられている以下の酵素（およびこれらの酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す：Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ_{１４／１６}エロンガーゼ、Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼ、Ｃ_{１８／２０}エロンガーゼおよび／またはＣ_{２０／２２}エロンガーゼ。

「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「単離核酸断片」という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸の形態で見られる）は、次のような一文字名によって言及される。「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」は任意のヌクレオチドである。

アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されるように、配列の手動評価、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータによる自動配列比較と同定のいずれかによって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。

「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。

「単離された」という用語は、特定の実施形態における用法では、その天然原料から完全にまたは部分的に精製されている、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を指す。場合によっては、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、より大きな組成物、緩衝系または試薬混合物の一部である。例えば、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、細胞または生物内に異種様式で含まれ得る。

「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみに言及してもよく、またはコード領域上流および／または下流の制御配列（例えばコード領域の転写開始部位上流の５’非翻訳領域、３’非コード領域）を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配置される制御配列とコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物内に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を構成し得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するように、そのコドン使用頻度がデザインされている遺伝子である。

「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「制御配列」は、コーディング配列の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列、５’非翻訳領域および３’非コード領域を指し、それは結合するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響してもよい。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造、および遺伝子発現調節に関与するその他の要素が挙げられる。

「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般に、プロモーター配列は、コード配列の５’上流である。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡ断片を含んでなってもよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプ中で、または細胞成長および／または発達の異なる段階で、または異なる環境的または生理的な条件に応じて、異なるプロモーターが、遺伝子発現を誘導してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。

「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」、および「ターミネーター」という用語は、コード配列３’下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列と、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードするその他の配列とを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことで特徴付けられる。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響し得る。

特定の実施形態における「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、それはコード配列と作動的に連結する。すなわちコード配列は、プロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動的に結合し得る。

「組み換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、さもなければ別々の２つの配列セグメントの人為的組み合わせを指す。「組換え」、「遺伝子組換え」、「形質転換」、「遺伝子操作」または「外来性遺伝子発現のための改変」という用語は、本明細書で同義的に使用される。

「発現」という用語は、本明細書での用法では、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も含む。

「増大」という用語は、特定の実施形態における用法では、例えば元の量よりわずかにより大きな量、または例えば元の量を大きく上回る量、およびその間の全ての量などのより大きな量を有することを意味する。代案としては、「増大」は、量または活性増大が比較される量または活性を、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％上回る量または活性を指してもよい。「増大」、「上回る」、および「改善」という用語は、本明細書で同義的に使用される。「増大」という用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現の特徴を描写するのに使用し得て、例えば「発現増大」は、「過剰発現」もまた意味し得る。

「形質転換」は、核酸分子の宿主生物への移入を指す。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってもよく；またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物または「形質転換体」と称される。

「安定した形質転換」は、遺伝子的に安定した遺伝形質をもたらす（すなわち核酸断片が「安定して組み込まれた」）、核および細胞小器官ゲノムの双方をはじめとする宿主生物ゲノム中への、核酸断片の移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は、組み込みなしのまたは安定遺伝形質なしの遺伝子発現がもたらされる、宿主生物の核、またはＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の移入を指す。

「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列を有してもよく、またあらゆる起源に由来する直線または環状の単鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が連結し、または組換えされて、細胞中に発現カセットを導入できるユニークな構造になっている。

「発現カセット」という用語は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子生成物の発現に要する、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）制御配列とを含んでなる、ＤＮＡ断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に、１）プロモーター；２）コード配列（すなわちＯＲＦ）；および３）通常は真核生物中でポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは通常はベクター内に含まれて、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対して妥当な制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする異なる生物に形質転換できる。

「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。典型的な配列解析ソフトウェアとしては、例えば、１）ＧＣＧスイートのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４）ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−１２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられる。本出願の文脈内では、特に断りのない限り、分析のために配列解析ソフトウェアが使用される場合、解析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメータのあらゆる組を意味する。

特定の実施形態における核酸またはポリペプチド配列の文脈で、「配列同一性」または「同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたって最大対応関係で配列比較すると同一である、２つの配列核酸中の塩基またはアミノ酸残基を指す。したがって「配列同一性の百分率」または「％同一性」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適整列配列を比較することで判定される値を指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列部分は、２つの配列の最適アラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列との比較で、付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列中で同一核酸塩基またはアミノ酸残基が起きる位置数を判定し、整合位置数を得て、整合位置数を比較ウィンドウ中の位置総数で除算し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることで、計算される。

「％同一性」および「％類似性」を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。％同一性および％類似性は、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって容易に計算され得る。

配列アラインメントおよび％同一性または類似性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムをはじめとするが、これに限定されるものではない、相同配列を検出するようにデザインされた多様な比較方法を使用して、判定されてもよい。代案としては、「ＢＬＡＳＴＮアラインメント法」は、デフォルトパラメータを使用して、ヌクレオチド配列を比較するために、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供されるアルゴリズムである一方で、「ＢＬＡＳＴＰアラインメント法」は、デフォルトパラメータを使用してタンパク質配列を比較するために、ＮＣＢＩによって提供されるアルゴリズムである。

本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載される。

様々なポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が、開示された発明の特定の実施形態の特徴として本明細書で開示される。本明細書で開示される配列と、少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％、または９０％〜９５％同一である、これらの配列の変種を、特定の実施形態で使用してもよい。代案としては、特定の実施形態では、変種アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、本明細書で開示される配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し得る。変種アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、開示された配列と同じ機能を有し、または開示された配列の機能の少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を有する。

下の実施例で示されるように、ミトコンドリアＭＥまたは細胞質ＭＥであるかどうかに関わりなく、野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質生成に対するリンゴ酸酵素の過剰発現の影響は、わずかまたは皆無であった。

驚くべきことに、そして意外にも、
（ｉ）細胞質リンゴ酸酵素をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量の少なくとも約３５％の脂質含量；および
（ｉｉｉ）改変多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生合成経路
を含んでなる、細胞質リンゴ酸の過剰発現は、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中における脂質生成を増大させ得ることが分かった。

具体的には、本発明の遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、特に、非天然細胞質リンゴ酸酵素（ＭＥ）をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。この意味では、ＭＥをコードするポリヌクレオチドは、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種にとって、異所性または異種であってもよい。

細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたは合成、非天然または変性ヌクレオチド（例えばヌクレオチド塩基類似体）を含有するヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種によって産生されたヌクレオチドを含有してもよい。ポリヌクレオチドは、直鎖断片の形態であっても、またはより大型のヌクレオチドコンストラクト（例えばプラスミド、ベクター、直鎖または円形コンストラクト）の構成要素であってもよい。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含有するコンストラクトは、染色体コンストラクトまたはエピソームコンストラクトであってもよい。代案としてはポリヌクレオチドは、遺伝子、遺伝子配列、核酸配列、ＤＮＡ配列、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列、またはＲＮＡ配列として特徴付けられてもよい。

ポリヌクレオチドは、細胞質ＭＥをコードする読み取り枠（ＯＲＦ）（すなわち細胞質ＭＥコード配列）、ならびに細胞質ＭＥ ＯＲＦの発現を調節する要素を含有してもよい。代案としては、ポリヌクレオチドは、遺伝子スプライシングによって除去し得る、１つまたは複数のイントロンを有するアミノ酸コード配列を有してもよい（例えば細胞質ＭＥ遺伝子ゲノムのコピー）。調節因子としては、プロモーターおよび／または３’転写終止配列（すなわちターミネーター配列）が挙げられる。その他の要素としては、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造および／または遺伝子発現調節に関与するその他の要素が挙げられる。

上の調節因子は、ＭＥ発現が因子によって機能的に調節されるように細胞質ＭＥコード領域と作動可能に連結してもよい。この意味では、因子はヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中で活性または動作可能である。またポリヌクレオチドは、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中で発現でき、または発現する能力があると見なされてもよい。プロモーターの活性は、（細胞質ＭＥ過剰発現について）構成的であり得て、または特定の環境刺激の対象となる（すなわち誘導性）比活性を有する。調節因子は、ポリヌクレオチドを含有するヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種にとって、天然または異種であってもよい。１つまたは複数の非リンゴ酸酵素遺伝子調節因子、および／または非ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）由来調節因子を有する、異種細胞質ＭＥ遺伝子カセットは、キメラとして特徴付けられてもよい。使用されてもよいプロモーターおよびターミネーター配列の例は、下の実施例セクションで提供され、どちらも参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００６／００３５３５１Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２０１０／００６８７８９Ａ１号明細書でもまた開示される。

ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中で細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドのアミノ酸コード配列の発現は、ポリヌクレオチドを導入する前のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種（すなわち対照ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ））に存在してもよい発現レベルと比較して、上方制御され、改善され、増大し、上昇し、または過剰発現されることで特徴付けられてもよい。ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、天然細胞質ＭＥ遺伝子を有しないと考えられるので、ポリヌクレオチドからの細胞質ＭＥの外来性発現のあらゆるレベルが、例えば細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドを含有するように改変される前のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種と比較して（または野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、または細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドを含有するが発現しない形質転換ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）などの別の適切な対照と比較して）、上方制御されまたは過剰発現されることで特徴付けられ得る。それでもなお、ポリヌクレオチドを含有するように改変されたヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の細胞質ＭＥ中における発現レベルの増大は、細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドを含有するように改変される前のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種（または対応するヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照）における細胞質ＭＥの発現を、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、または１０００％上回ることで特徴付けられてもよい。

「対照細胞」および「適切な対照細胞」という用語は、同義的に使用され、特定の改変（例えばポリヌクレオチドの過剰発現、ポリヌクレオチドの下方制御）が施された細胞（すなわち「試験細胞」）との比較で言及されてもよい。対照細胞は、試験細胞の特定の改変を有しない、またはそれを発現しない、あらゆる細胞であってもよい。したがって対照細胞は、非形質転換野性型細胞であってもよく、または遺伝子的に形質転換されているが、遺伝的形質転換を発現しない細胞であってもよい。例えば対照細胞は、試験細胞の直接の親であってもよく、この直接の親細胞は、試験細胞にある特定の改変を有しない。代案としては、対照細胞は、１つまたは複数世代を隔てた試験細胞の親であってもよい。なおも代案としては、対照細胞は、試験細胞の同胞細胞であってもよく、この同胞細胞は、試験細胞にある特定の改変を含まない。対照細胞としての役割を果たし得る同胞細胞は、その中にタンパク質過剰発現のためのプラスミドが挿入されている細胞であり得るが、同胞細胞中ではプラスミドが発現しないのに対し、試験細胞中では発現する。細胞が対照細胞になり得るかどうかを判定することは、十分に当該技術分野の技術範囲内である。

細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドのアミノ酸コード配列は、その中にポリヌクレオチドが入れられる、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種のタンパク質翻訳機構による認識のために、最適化されてもよい。例えば細胞質ＭＥ ＯＲＦは、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）以外の種に由来してもよいが、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中における発現のためにコドン最適化される。この様なコドン最適化は、米国特許第７，１２５，６７２号明細書で提供される、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用頻度プロファイルに従って実施し得る。

外来性ポリヌクレオチド発現の代案として、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で、天然ＭＥ遺伝子座それ自体から、細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドを発現させてもよいが、それは適切に改変されている。ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の天然ＭＥ遺伝子は、ミトコンドリアＭＥをコードするので、遺伝子標的化技術（例えば配列ノックアウト）を使用して、ミトコンドリア標的化配列の全部または一部を除去し、天然ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＥ ＯＲＦの５’末端でコードされるこの遺伝子を改変しなくてはならない。天然ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＥ遺伝子座中のその他の修飾としては、修飾遺伝子が細胞質に局在化するＭＥを生じるような、構成的プロモーターの付加、改変遺伝子過剰発現のための追加的な調節因子、および／または翻訳開始部位の修飾が挙げられる。

ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質ＭＥは、細胞質ＭＥのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドとして、特徴付けられてもよい。細胞質ＭＥはまた、細胞質（Ｓ）−リンゴ酸：ＮＡＤＰ^＋酸化還元酵素（脱炭酸する）、ピルビン酸−リンゴ酸カルボキシラーゼ、ＮＡＤＰ^＋−特異的リンゴ酸酵素、またはＮＡＤＰ^＋−リンゴ酸酵素（酵素委員会登録ＥＣ １．１．１．３９およびＥＣ １．１．１．４０）としても特徴付けられ得る。

リンゴ酸酵素は、生きている生物中で、様々な必須の生理学的な機能に関与する。ＭＥ反応の最終生成物（ピルビン酸、ＣＯ_２、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ；下記参照）は、ＴＣＡ回路および還元生合成過程などの多数の生物学的経路内に供給される。ＭＥの特定のＮＡＤＰ依存性イソ型は、細菌、酵母、真菌、鳥および哺乳類に見られ、主に、ＮＡＤＰＨの提供を通じた脂質生合成および不飽和化などの生合成反応において、役割を果たす。翻訳後修飾作用（部分的タンパク質分解的切断、リン酸化または脱リン酸化のいずれか）を通じて、ＮＡＤＰ依存性ＭＥのいくつかのイソ型が、真菌中に存在する（Ｓａａｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｓ．Ａｆｒ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．２７：１１３−１２２）。

リンゴ酸酵素活性は、
リンゴ酸＋ＮＡＤＰ^＋→ピルビン酸＋ＣＯ_２＋ＮＡＤＰＨ
の反応を触媒し、
これはまた、

としても表し得る。
この反応は、Ｌ−リンゴ酸からピルビン酸およびＣＯ_２への酸化脱炭酸を構成する。Ｌ−リンゴ酸はまた、（Ｓ）−リンゴ酸と称されてもよい。細胞質ＭＥ活性は、ＮＡＤＰ^＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）依存性であってもよく；この意味では、ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質ＭＥはまた、例えばＮＡＤＰ^＋依存性ＭＥ、ＮＡＤＰ^＋依存性細胞質ＭＥ、またはＮＡＤＰＨ産生ＭＥとして特徴付けられてもよい。細胞質ＭＥ活性を測定する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｐｏｎｇｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４５７：４２５−４５０；Ｇｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６５Ｂ：２５−３４；Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｒｃｈａｅａ．１：２９３−３０１）。

ＭＥによる触媒作用は、一般に、オキサロ酢酸を生成するリンゴ酸の脱水素化、エノールピルビン酸を生成するオキサロ酢酸の脱炭酸、およびピルビン酸を生成するエノールピルビン酸の互変異性化の３段階で進行する。ＭＥの活性部位残基は、大まかに（１）二価のカチオン結合残基；（２）基質結合残基；（３）ＮＡＤ（Ｐ）^＋補助因子結合残基；および（４）触媒残基の４つのカテゴリーに分類し得る。金属イオンは、リンゴ酸を活性部位に適切に配置させる架橋の役割を果たす（Ｓａａｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｓ．Ａｆｒ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．２７：１１３−１２２）。

本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質リンゴ酸酵素は、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）を含まない。細胞質ＭＥは、ＭＴＳが除去されたミトコンドリアＭＥに由来してもよい。細胞質ＭＥはＭＴＳを欠き、したがってそれはミトコンドリアＭＥでないので、このＭＥはミトコンドリアに位置せず、むしろ細胞の細胞質ゾル内に位置する。細胞質ＭＥはまた、原形質ＭＥとして、またはミトコンドリア外ＭＥとして特徴付けられ得る。代案としては、細胞質ＭＥは、その天然形態で細胞質ゾルに局在化する（すなわち細胞質局在化特性を与えるのに、遺伝子操作またはその他の改変が必要でない）リンゴ酸酵素に由来してもよく、またはそれに相当する。

ミトコンドリアＭＥのＭＴＳは、タンパク質のＮ末端に位置する。したがってミトコンドリアＭＥからのＭＴＳの除去は、Ｎ末端からのまたはその中のアミノ酸残基の欠失を伴う。この意味では、ミトコンドリアＭＥからＭＴＳを除去することで得られる細胞質ＭＥは、細胞質ＭＥがそれに由来するミトコンドリアＭＥと比較して、アミノトランケート型またはＮ末端トランケート型として特徴付けられ得る。

ＭＴＳは、水疎性アミノ酸と正に帯電したアミノ酸の交互のパターンを含んでなることで同定され得る。一般にＭＴＳは、一面に大量の正の荷電を含有し、別の面に疎水性残基を含有する、１つまたは複数のらせん配列（両親媒性らせん）を有する。操作されるＭＴＳの性質および配列に応じて、ミトコンドリアＭＥのＮ末端の最初のおよそ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０個のアミノ酸を除去して、細胞質ＭＥを提供し得る、またはミトコンドリアＭＥのＭＴＳ内の一続きの約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０個の連続アミノ酸を除去して、細胞質ＭＥを提供し得る。代案としては、ＭＴＳ下部構造のアミノ酸（参照によって本明細書に援用するＮｅｕｐｅｒｔ，１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：８６３−９１７を参照されたい）を挿入によって、改変させ、欠失させ、または中断してもよい。

本発明の別の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質リンゴ酸酵素は、機能不全ミトコンドリア標的化配列を含んでなる。例えば、細胞質ＭＥは、（ｉ）ＭＴＳの全部または一部を欠く、（ｉｉ）ＭＴＳ機能を阻害する１つまたは複数のアミノ酸変化（例えば遺伝子変異または改変に起因する）を含有する、および／または（ｉｉｉ）リンゴ酸酵素ＭＴＳ機能を阻害する要素（例えば小分子、抗体、抗原結合抗体断片、アプタマーなど）を細胞に提供し、またはその中で発現するために、機能性ＭＴＳが欠如していてもよい。細胞質ＭＥの一例は、機能性ＭＴＳを欠くＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ミトコンドリアＭＥである（例えばＭＴＳのアミノ酸のいずれかまたは全てを欠く、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ミトコンドリアＭＥ）。

ＭＴＳは、Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３００：１００５−１０１６）によって記載されるものなどのアルゴリズムを使用して、同定してもよい。タンパク質中でＭＴＳを同定するその他のアルゴリズムとしては、例えばＭｉｔｏＰｒｏｔ（Ｃｌａｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４１：７７９−７８６）、Ｐｒｅｄｏｔａｒ（Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ４：１５８１−１５９０）、およびｐＴＡＲＧＥＴ（Ｇｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１：３９６３−３９６９）が挙げられる。代案としては、ＭＴＳは、その他のタンパク質中で特性解析されている、１つまたは複数のＭＴＳアミノ酸配列と、クエリー配列を配列比較することで同定してもよい。

一般に、ＭＴＳは、最初に、ＭＴＳの疎水性表面を通じた相互作用によって、ミトコンドリア外膜上の受容体（外膜輸送体、または「Ｔｏｍ」）と結合することで機能する（Ｒｏｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：４５０９−４５１１）。次にＭＴＳは、その正に帯電した表面を通じて、チャンネルを含有する別のＴｏｍ受容体複合体に移動する（Ｂｒｉｘ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０７３０−２０７３５）。Ｔｏｍチャンネルを通じたミトコンドリア膜間空隙内への移行に続いて、ＭＴＳの塩基性残基は、高度に酸性の複合体（内膜輸送体、または「Ｔｉｍ」）との相互作用を媒介し，それはＭＴＳを含有するタンパク質のミトコンドリアマトリックス内への移入を媒介する（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ １００：５５１−５６０）。ひとたび輸送が完了したら，ＭＴＳは通常、タンパク質から切断される（Ｎｅｕｐｅｒｔ，１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：８６３−９１７）。

リンゴ酸酵素のＭＴＳは、これらの分子相互作用のいずれかに関して、機能不全と同定されてもよく、および／または機能不全にされてもよい。例えば、結合アッセイを実施して、推定ＭＴＳの特定のＭＥのＮ末端アミノ酸が、上記のミトコンドリアの外膜および内膜の受容体−チャンネル複合体に結合するかどうかを判定してもよい。これらの要素に対するＭＥの結合を媒介するアミノ酸の１つまたは複数の除去および／または改変は、ＭＴＳがミトコンドリアをＭＥ標的化するのを妨げてもよい。

細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドは、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種または異なる生物からのＭＥをコードするポリヌクレオチドに由来してもよい。リンゴ酸酵素は、自然界に広く分布しており、酵母Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｚ．バイリ（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびＣ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）中で報告されている。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、およびＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＭＥは二機能性であり、リンゴ酸およびオキサロ酢酸の双方と反応し得る。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＥは、電子受容体として、ＮＡＤ^＋およびＮＡＤＰ^＋の双方を利用し得て、ＮＡＤ^＋が好まれる。Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）ＭＥは、オキサロ酢酸の脱炭酸では、ＮＡＤ^＋またはＮＡＤＰ^＋のどちらかを利用するが、Ｌ−リンゴ酸の脱炭酸では、ＮＡＤＰ^＋のみを利用する。酵母ＭＥは、それらの基質親和性および金属要件に関して変動性を示す。Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＭＥは、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＥ（Ｋ_ｍ＝５０ｍＭ）とは対照的に、非常に高い基質親和性（Ｋ_ｍ＝３．２ｍＭ）を有する。Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）およびＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）細胞質ＭＥは、Ｍｎ^２＋を好むミトコンドリアＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＥとは対照的に、二価のカチオンＭｎ^２＋またはＭｇ^２＋を活性のために要求する（Ｓａａｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｓ．Ａｆｒ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．２７：１１３−１２２）。

細胞質ＭＥは、例えば配列番号１、配列番号２、または配列番号３（図１）で提供されるポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０１２８９６、ＡＢＬ６７７２５、ＸＰ＿５０４１１２、ＸＰ＿００１６８３５９２．１、ＡＡＦ５４８６０．１、ＡＡＦ５４８５９．１、ＮＰ＿７３１７３９．１、ＮＰ＿５２４８８０．２、ＥＨＱ５８３０５．１、ＡＥＹ６４４２７．１、ＥＨＰ６９６９２．１、ＥＨＰ６９５３５．１、ＡＥＸ５１０４７．１、ＺＰ＿０９４１３９４０．１ＥＨＭ１２７３８．１、ＥＨＭ１０７０１．１、ＡＥＶ６９８２６．１、ＡＥＶ２４９５６．１、ＡＥＶ２４５５３．１、ＺＰ＿０９２０１７９８．１、ＡＥＶ２９１７６．１、ＡＥＶ３３７１５．１、ＡＣＵ９８０３８．１、ＥＡＺ８９７１９．１、ＡＥＴ６８２３８．１、ＡＥＴ６５９１４．１、ＥＨＩ４８４３６．１、ＹＰ＿００３５４３２９３．１、ＹＰ＿００３１３４８６５．１、ＡＤＥ３５４２９．１、ＡＣＬ０２３１５．１、ＺＰ＿０８１８７９２４．１、ＺＰ＿０８１８２５０２．１、ＺＰ＿０８１７７６３０．１、ＥＧＤ１９８６５．１、ＥＧＤ１４４１１．１、ＺＰ＿０１７３０８５８．１、ＡＡＢ０７７０９．１、ＡＡＡ４１５６３．１、ＸＰ＿００１９１３４０６．１、ＡＤＸ７４４５３．１、ＡＣＺ２３２３５．１、ＡＣＵ９８３８５．１、ＹＰ＿００３３１６０６９．１、ＹＰ＿００３１４８８５７．１、ＹＰ＿００３１５４２６５．１、ＺＰ＿０９６２９８６２．１、ＡＣＲ４７７４３．１、ＥＨＰ３７７０８．１、ＡＥＸ５１３５８．１、ＹＰ＿００４０６３２２７．１、ＡＤＲ２７８７４．１、ＡＤＮ７０２７９．１、ＡＤＮ６３２６７．１、ＮＰ＿４３９９８３．１、ＹＰ＿００４０７６１４８．１、ＺＰ＿０９５１７１８６．１、ＥＨＮ２７３３１．１、ＺＰ＿０９３２９４１６．１、ＥＨＬ５８３６０．１、ＡＤＴ９８３１３．１、ＺＰ＿０９２８９２６４．１、ＺＰ＿０９２８５８６６．１、ＺＰ＿０９２６７８５７．１、ＢＡＬ２７８３２．１、ＹＰ＿００１６５５８００．１、ＥＨＫ７４８４４．１、ＹＰ＿００４５１０１０７．１、ＹＰ＿００３１４２９１２．１、ＥＨＪ９７５４３．１、ＥＢＡ１４９４５．１、ＺＰ＿０９０９１４２０．１、ＺＰ＿０８４２９３６１．１、ＡＢＶ７８８８５．１、ＺＰ＿０５１２０２９９．１、ＥＧＪ３１５２３．１、ＡＤＪ１５３３１．１、ＡＤＩ８９９６２．１、ＥＧＪ２３０８９．１、ＺＰ＿０８６６３６９８．１、ＺＰ＿０５５８６１６６．１、ＺＰ＿０４４６６９５８．１、ＡＢＭ４５９３３．１、ＺＰ＿０６８６２９８２．１、ＺＰ＿０３８３３４１９．１、ＺＰ＿０３５１３８５１．１、ＺＰ＿０２３３１７０８．１、ＺＰ＿０７４４８６２２．１、ＺＰ＿０２１５３１２３．１、ＺＰ＿０２１５１２０６．１、ＺＰ＿０１９１６０２２．１、ＺＰ＿０１８８３６２５．１、ＺＰ＿０１８７０７８９．１、ＡＡＣ４７３９６．１、ＢＡＥ４７５１４．１、ＥＨＱ
６０５２３．１、ＮＰ＿８３８０１４．１、ＹＰ＿００１０１９４０４．１、ＹＰ＿９８４２８３．１、ＡＡＦ３７５７７．１、ＣＡＡ３９６９０．１、ＣＣＣ７４３７６．１、ＢＡＢ７６２９５．１、ＹＰ＿６４７２８１．１、ＮＰ＿４２２３４３．１、ＮＰ＿２４４０３４．１、ＹＰ＿００１２３９８５６．１、ＸＰ＿００２２８３８１４．１、ＡＥＷ６２５６５．１、ＹＰ＿００１２３２２１２．１、ＹＰ＿００１２３５４０３．１、ＹＰ＿００１００２６０７．１、ＥＥＵ８７６１１．１、ＮＰ＿００２３８６．１、ＮＰ＿００１１５５０５８．１、ＥＦＧ９１７４６．１、ＡＡＦ５４８６０．１、ＮＰ＿５２４８８０．２、ＡＥＣ０６２４２．１、ＮＰ＿００１１０５３８３．１、ＡＡＡ４１５６３．１、ＥＡＴ４２７１７．１、ＡＡＫ９７５３１．１、ＸＰ＿００２５７２６１１．１、ＮＰ＿００１１３８３２５．１、ＮＰ＿００１０１５６９０．１、ＮＰ＿００１１２８６９２．１、ＮＰ＿００１２３１１８７．１、ＮＰ＿００１０８２５８２．１、ＮＰ＿００１００３６２７．２、ＸＰ＿５３２２１７．３、ＸＰ＿８４８７７０．１、ＸＰ＿００１４９９８５３．２、ＸＰ＿００１４９９４２４．２、ＸＰ＿５１８６１０．３、ＡＤＫ５６１０９．１、ＥＤＮ５９８７７．１、ＡＢＬ６７７２５．１、ＧＡＡ８６３９３．１、ＸＰ＿００１２６７７５３．１、ＡＢＭ３０１５４．１、ＣＡＸ４１１０１．１、ＸＰ＿００１８２５５１５．１、ＥＨＡ５５３３８．１、ＸＰ＿００１３９５１０５．２、ＸＰ＿００１３９０６７０．２、ＸＰ＿００３２３６０１３．１、ＥＥＡ２５９７８．１、ＸＰ＿００２５４８５７８．１、ＥＧＵ７７６６０．１、またはＸＰ＿４４８８５８．１のいずれかに由来し得る。これらのＭＥポリペプチドのいずれかで、ミトコンドリアＭＥであるものは、適切に改変して（上記を参照されたい）、細胞質を標的化させまたはそれに局在化させてもよい。これらのポリペプチドのいずれかの変種を使用してもよいが、ＭＥ酵素活性（例えば上記を参照されたい）および細胞質局在化を有するべきである。このような変種は、参照ＭＥのアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなってもよい。好ましくは変種ＭＥは、参照ＭＥと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる。これらの参照ＭＥの１つがミトコンドリアＭＥである場合、細胞質ゾルに局在化するその変異体は、ＭＴＳ標的化活性を妨げる、ＭＴＳ中の変異、欠失、および／または挿入を含有してもよいものと理解すべきである（上記を参照されたい）。

ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質ＭＥは、原核生物ＭＥまたは真核生物ＭＥであってもよく、細菌、真菌、酵母、植物、動物、原虫、または藻類に由来してもよい。ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、同一のまたは異なる組み合わせの細胞質ＭＥポリペプチドをコードする、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のポリヌクレオチドを含有してもよい。

ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質ＭＥポリペプチドは、配列番号５を含んでなってもよい（図３）。配列番号５は、最初の５３個のアミノ酸が除去された、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ミトコンドリアＭＥに相当する。代案としては、この細胞質ＭＥの変種は、配列番号５と、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなってもよい。このような変種は、ＭＥ酵素活性（例えば上記を参照されたい）および細胞質局在化を有するべきである。本発明の一実施形態では、細胞質リンゴ酸酵素は、配列番号５と少なくとも約９０％の配列同一性を有してリンゴ酸酵素活性を有する、アミノ酸配列を含んでなる。

ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質ＭＥポリペプチドは、配列番号７と少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなってもよく（図３）；このような変種は、細胞質ゾルに局在化して、ＭＥ酵素活性を有すべきである（例えば上記を参照されたい）。配列番号７がミトコンドリアＭＥに相当することを考えると、細胞質ゾルに局在化するその変異体は、ＭＴＳ標的化活性を妨げる変異、欠失、および／または挿入をＭＴＳ中に有するものと理解すべきである（上記を参照されたい）。

細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の一例は、配列番号５をコードする、配列番号４を含んでなるものである。代案としては、遺伝コードの縮重を考慮して、ポリヌクレオチドは、配列番号５をコードする、配列番号４の変種を含んでなってもよい。例えばこのような変種ポリヌクレオチドは、配列番号４と、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、配列番号５をコードしてもよい。別のポリヌクレオチドは、上述の変種ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＥポリペプチドをコードする配列を有してもよい。

国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトにおいて、オンラインで利用できる、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用して、本明細書で開示される２種以上のポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）またはポリペプチド配列（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）間の％同一性を測定してもよい。代案としては、配列間の％同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えばＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌＶ）を使用して、遂行されてもよい。アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法を使用する複数のアラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当してもよい。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の％同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であってもよい。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４であってもよい。

細胞のコンテクストで、代案としては細胞質ＭＥは、ミトコンドリアＭＥのＭＴＳと相互作用するタンパク質を改変して（例えばアミノ酸変異、欠失、または挿入）、ミトコンドリア輸送をもたらすことで提供され得る。このような改変は、ＭＴＳ−相互作用タンパク質がＭＴＳドメインに結合するのを阻害してもよく、したがってＭＥのミトコンドリア輸送を妨げる。したがって、「ミトコンドリアＭＥ」は、ミトコンドリアに標的化されないために、細胞質ＭＥになってもよい。ＭＥミトコンドリア標的化において役割を果たし、上記目的のために改変され得る、ＭＴＳ−相互作用タンパク質の例は、Ｎｅｕｐｅｒｔ（１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：８６３−９１７）によって開示されている。

ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質ＭＥは、あらゆるその変異体（例えば同族体、変異、欠失体など）を含めて、リンゴ酸酵素活性を有する（上記を参照されたい）。変種が、その参照ＭＥ（例えば天然ＭＥ、野性型ＭＥ、非改変ＭＥ、内在性ＭＥなど）と比較して、より低い活性を有する場合、変種ＭＥの活性は、参照ＭＥの活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を有するべきである。

ポリヌクレオチドによってコードされる細胞質ＭＥのアミノ酸配列は、ＭＥが、容易に検出または単離され得る標識タンパク質（すなわち融合タンパク質）として発現されるように、付加されたタンパク質タグまたはエピトープを含んでなってもよい。タグまたはエピトープは、ＭＥ酵素活性（例えば上記を参照されたい）および細胞質標的化を妨げるべきではない。

本発明の実施において使用される好ましいヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。本明細書で提供される遺伝子組換えヤロウィア属（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を調製するのに利用し得るＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の例は、株の名称ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃８８６２、＃８６６１、＃８６６２、＃９７７３、＃１５５８６、＃１６６１７、＃１６６１８、＃１８９４２、＃１８９４３、＃１８９４４、＃１８９４５、＃２０１１４、＃２０１７７、＃２０１８２、＃２０２２５、＃２０２２６、＃２０２２８、＃２０３２７、＃２０２５５、＃２０２８７、＃２０２９７、＃２０３１５、＃２０３２０、＃２０３２４、＃２０３３６、＃２０３４１、＃２０３４６、＃２０３４８、＃２０３６３、＃２０３６４、＃２０３７２、＃２０３７３、＃２０３８３、＃２０３９０、＃２０４００、＃２０４６０、＃２０４６１、＃２０４６２、＃２０４９６、＃２０５１０、＃２０６２８、＃２０６８８、＃２０７７４、＃２０７７５、＃２０７７６、＃２０７７７、＃２０７７８、＃２０７７９、＃２０７８０、＃２０７８１、＃２０７９４、＃２０７９５、＃２０８７５、＃２０２４１、＃２０４２２、＃２０４２３、＃３２３３８、＃３２３３９、＃３２３４０、＃３２３４１、＃３４３４２、＃３２３４３、＃３２９３５、＃３４０１７、＃３４０１８、＃３４０８８、＃３４９２２、＃３８２９５、＃４２２８１、＃４４６０１、＃４６０２５、＃４６０２６、＃４６０２７、＃４６０２８、＃４６０６７、＃４６０６８、＃４６０６９、＃４６０７０、＃４６３３０、＃４６４８２、＃４６４８３、＃４６４８４、＃４６４３６、＃６０５９４、＃６２３８５、＃６４０４２、＃７４２３４、＃７６５９８、＃７６８６１、＃７６８６２、＃７６９８２、＃９０７１６、＃９０８１１、＃９０８１２、＃９０８１３、＃９０８１４、＃９０９０３、＃９０９０４、＃９０９０５、＃９６０２８、＃２０１２４１、＃２０１２４２、＃２０１２４３、＃２０１２４４、＃２０１２４５、＃２０１２４６、＃２０１２４７、＃２０１２４９、または＃２０１８４７で、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手できる。

細胞質リンゴ酸酵素をコードするポリヌクレオチドに加えて、本発明の遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種はまた、改変ＰＵＦＡ生合成経路を含んでなる。

例えばオレイン酸がＥＰＡに変換される代謝過程は、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは小胞体膜中に存在する一連の特有な不飽和化および伸長酵素を必要とする。しかし下述するように、ＥＰＡ生成のための複数の代案の経路が存在する。

具体的には、図４は後述の経路を描写する。全ての経路は、オレイン酸がΔ１２デサチュラーゼによって、第１のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に変換されることを要する。次に「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」および基質としてＬＡを使用して、長鎖ω−６脂肪酸が次のように形成される。１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」］に変換され；２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換され；３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換され；４）ＡＲＡがＣ_{２０／２２}エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換され；５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。

Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路はまた、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を使用して、長鎖ω−３脂肪酸を次のように生成し得る。１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって第１のω−３脂肪酸ＡＬＡに変換され；２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」］に変換され；３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換され；４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換され；５）ＥＰＡがＣ_{２０／２２}エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換され；６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。任意選択的に、ω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に変換されてもよい。例えばＥＴＡおよびＥＰＡはΔ１７デサチュラーゼ活性によって、それぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。本明細書の目的で有利には、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路は、顕著な量のγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］を欠く、ＥＰＡ油の生成を可能にする。

ω−３／ω−６脂肪酸生合成の代わりの経路は、Δ６デサチュラーゼおよびＣ_{１８／２０}エロンガーゼを利用し、すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」である。より具体的には、Δ６デサチュラーゼによって、ＬＡおよびＡＬＡがそれぞれＧＬＡおよびステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換されてもよく、次にＣ_{１８／２０}エロンガーゼが、ＧＬＡをＤＧＬＡにおよび／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。

組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種宿主細胞中におけるＥＰＡの経済的な商業的生産は、ＥＰＡ濃度［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］および総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］をはじめとする、多様な変数の検討を要する。さらに所望の脂肪酸、すなわちＥＰＡの生成を最大化するために、中間体脂肪酸と、最終油生成物中の副産物脂肪酸の生成とを低下させることが望ましい。

中間体脂肪酸は、その他の代謝経路酵素の作用によって、ＥＰＡにさらに変換し得る脂肪酸（例えばオレイン酸、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ）である。対照的に、副産物脂肪酸（例えばシアドン酸、ジュニペロン酸）は、ＥＰＡでもなく、またはＥＰＡにさらに変換され得る中間体でもない、生成するあらゆる脂肪酸を指す。

米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書は、約２３．６ ＬＡ％ＴＦＡ未満で、少なくとも約４３．３ ＥＰＡ％ＴＦＡ（１．８３のＥＰＡ：ＬＡ比）を含んでなる微生物油の産生能力を有する、組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の最適化株を記載する。好ましい株はＹ４３０５であり、その最大生産量は、ＥＰＡ：ＬＡ比３．０３で５５．６ ＥＰＡ％ＴＦＡであった。一般に、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書のＥＰＡ株は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の以下の遺伝子を含んでなる：
ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；
ｄ）Δ１７デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；
ｅ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；
ｆ）Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；および
ｇ）任意選択的に、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ１）をコードする少なくとも１つの遺伝子。

上述の酵素機能を有する好ましい遺伝子の例は、（これらの遺伝子は、制限を意図するものではないが）表３に記載される。

当業者は前述の考察から理解するであろうように、上記ＰＵＦＡ生合成経路酵素の１つまたは複数は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）および／または１つまたは複数の油性生物に由来してもよい。このようなその他の油性生物は、油糧微生物、酵母、カビ、真菌、卵菌類、細菌、藻類、ストラメノパイル、または原生生物（例えばユーグレナ属）として特徴付けられてもよい。ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の他に油性酵母の例としては、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）の種が挙げられる。油糧真菌の例としては、全て糸状菌である、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）（例えばフザリウム・ラテリチウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、モルティエラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）（例えばモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、およびケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）（例えばムコール・ルキシー（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）およびムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））の種が挙げられる。油糧藻類の例としては、ハエカビ属（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、およびチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）の種が挙げられる。

本発明の一実施形態では、改変ＰＵＦＡ生合成経路は、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、およびω−６ドコサペンタエン酸からなる群から選択される、少なくとも１つのＰＵＦＡを生成する。好ましくは、生成されるＰＵＦＡは、エイコサペンタエン酸である。

（ｉ）細胞質リンゴ酸酵素をコードするポリヌクレオチド、および（ｉｉ）改変多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生合成経路に加えて、本発明の遺伝子組換えヤロウィア属（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｙａｒｒｏｗｉａ）種はまた、前記ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量基準で少なくとも約３５％である脂質含量を含んでなる。

このような高脂質含有遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の例は、Ｚ１９７８、Ｌ２５０、Ｌ２５８、Ｚ５５６５、Ｚ５５６７、Ｚ５５７５、Ｚ５５７６、Ｚ５６２０、Ｚ５６２３、Ｚ５６２５、Ｚ５５８１、Ｚ５５８２、Ｚ５５８３、Ｚ５５８４、Ｚ５５７０、Ｚ５５７１、Ｚ５５７２、Ｚ５５７４、Ｚ５５８５およびＺ５６２７であり、それらは全て、その開示を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２／００５２５３７Ａ１号明細書で開示される。本発明の実施で使用し得る高脂質含有遺伝子組換えヤロウィア属（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｙａｒｒｏｗｉａ）株のその他の例は、それらの全てを参照によって本明細書に援用され、米国特許出願公開第２０１０／０３１７０７２Ａ１号明細書（例えばＹ８６４７、Ｙ９０２８、Ｙ９０２９、Ｙ９０３１、Ｙ９４８１、Ｙ９５０２、Ｙ９５０８、およびＹ９５１０株）で開示される。これらの例示的なヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株は全て、それぞれの株の乾燥細胞質量基準で、約３５％を超える脂質含量を産生できる。

遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種のＤＣＷの質量基準で、少なくとも約３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、または６５％の脂質含量（すなわち総脂質または油）を有してもよい。本発明の好ましい実施形態では、脂質含量は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量基準で少なくとも約５０％である。

遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種によって産生される総脂質または油（ＴＦＡ％ＤＣＷ）のレベルは、細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドの挿入前に、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中にあった総脂質／含油量と比較して（または野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）または細胞質ＭＥをコードするポリヌクレオチドを含有するが発現しない形質転換ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）などの別の適切な対照と比較して）、少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％増大してもよい。

対象遺伝子を含んでなるコンストラクトまたはベクターは、あらゆる標準技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１））、遺伝子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または対象遺伝子を宿主細胞に導入するあらゆるその他の方法が挙げられる。一例として、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２−２３５（１９９７））は、直線化ＤＮＡ断片に基づくヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための組み込み技術を記載する。

便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されているヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞を「形質転換された」、「遺伝子操作された」、「形質転換体」または「組み換え体」と本明細書で称する。形質転換宿主は、発現カセットがゲノムに組み込まれるのか、または複数のコピーを有する染色体外要素上に存在するのかに応じて、発現カセットの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換宿主細胞は、例えば米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，２５９，２５５号明細書に記述されるように、様々な選択技術によって同定し得る。

本明細書で使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンが欠如している培地上で増殖する能力である。代案の実施形態では、５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）が、酵母Ｕｒａ⁻変異株（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）の選択のために使用され、またはスルホニル尿素除草剤耐性を与える天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（またはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）が、形質転換体選択のために利用される。部位特異的リコンビナーゼシステムの使用によって、複数の逐次形質転換で使用するために好ましい選択マーカーのペアを「再利用する」ユニークな方法もまた、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で教示される。

転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性、およびタンパク質位置、酸素制限、および宿主細胞からの分泌の側面を制御する、いくつかの異なる遺伝要素を操作することが望ましいことがある。より具体的には、特定の実施形態における遺伝子発現では、以下を改変することによって制御されてもよい：関連するプロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローン遺伝子のコピー数；遺伝子がプラスミド由来であるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか；合成外来性タンパク質の最終的細胞内所在；宿主生物中における翻訳効率；宿主細胞内のクローン遺伝子タンパク質の固有の安定性；およびその使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようなクローン遺伝子内のコドン使用頻度。これらの過剰発現法のいくつかは下で考察され、遺伝子を過剰発現する手段として、組換え微生物宿主細胞の遺伝子操作中に有用である。

微生物宿主細胞中における異種遺伝子発現を駆動する有用なプロモーターは多数あり、当業者に知られている。発現は、誘導性または構成的様式で達成され得る。誘導性発現が、対象の遺伝子と作動可能に結合する調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成され得る一方、構成的発現は、対象の遺伝子と作動可能に結合する構成的プロモーターの使用によって達成され得る。実質的に、遺伝子発現を誘導する能力を持つあらゆるプロモーター（すなわち天然、合成、またはキメラ）が適切であるが、宿主種からの転写および翻訳領域が特に有用である。

一般に、ターミネーターは、それからプロモーターが得られる遺伝子の３’領域、または異なる遺伝子に由来し得る。多数のターミネーターが知られており、それらが由来したのと同じおよび異なる属および種のどちらで使用した場合も、多様な宿主中で満足に機能する。ターミネーターは、通常いかなる特性のためでもなく、便宜のために選択される。好ましくは、ターミネーターは酵母遺伝子から誘導される。当業者は、入手できる情報を利用してターミネーターをデザインおよび合成し得るので、ターミネーターはまた合成もされ得る。ターミネーターは不要なこともあるが、それは高度に好ましい。

制限を意図するものではないが、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の組換え微生物宿主細胞で使用される好ましいプロモーターおよびターミネーターは、それぞれの開示を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１０−００６８７８９−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１１−００５９４９６−Ａ１号明細書、米国仮特許出願第６１／４６９，９３３号明細書、米国仮特許出願第６１／４７０，５３９号明細書、米国仮特許出願第６１／４７１，７３６号明細書、および米国仮特許出願第６１／４７２，７４２号明細書で教示されるものである。

ＰＵＦＡ生合成経路デサチュラーゼ、エロンガーゼなどの遺伝子の追加的なコピー（すなわち２つ以上のコピー）を組換え微生物宿主細胞に導入して、それによってＥＰＡ生成と蓄積を増大させてもよい。具体的には、遺伝子の追加的なコピーを単一発現コンストラクト内でクローン化してもよく；および／またはプラスミドコピー数を増大させることで、またはクローン遺伝子のゲノム中への複数組み込みによって、クローン遺伝子の追加的なコピーを宿主細胞に導入してもよい。

本明細書の方法に従って最適化された組換え微生物宿主細胞を調製する際に、さまざまなデサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＤＧＬＡシンターゼなどのコピーが頻繁に参照されることに留意されたい。例えばΔ９エロンガーゼの２つのコピーが必要である場合、これは以下を指し得る。１）単一種から単離された、特定のΔ９エロンガーゼの同一コーディング配列の２つのコピー；または２）集合的に２つのΔ９エロンガーゼがもたらされる、「Ａ」種から単離されたΔ９エロンガーゼの１つのコード配列と、「Ｂ」種から単離されたΔ９エロンガーゼの１つのコード配列。

一般に、ひとたび組換え微生物宿主細胞中における発現に適したＤＮＡカセット（例えばプロモーター、ＯＲＦおよびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子を含んでなる）が得られたら、それを宿主細胞中の自律複製能力のあるプラスミドベクターに入れ、または宿主細胞ゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に生じ得て、または宿主遺伝子座との組換えを標的とするのに十分な、宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的化し得る。本明細書では、依存はしないが、転写および翻訳調節領域の全部または一部は内在性遺伝子座によって提供され得て、コンストラクトは内在性遺伝子座を標的とする。

遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、特定の実施形態では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）酵素をコードする、異種ポリヌクレオチドをさらに含んでなってもよい。換言すれば、細胞質ＭＥは、ＭＤＨと共に同時発現させ得る。特定の実施形態では、ＭＤＨはＭＤＨ（ＥＣ１．１．１．３７）であり、これは、ＮＡＤ^＋からＮＡＤＨへの還元を利用して、リンゴ酸のオキサロ酢酸への酸化を可逆的に触媒する酵素である。ＭＤＨ（ＥＣ１．１．１．３７）は、この反応の逆方向（すなわちオキサロ酢酸からリンゴ酸）もまた触媒するので、ＭＤＨの発現は、細胞質ＭＥが利用できるリンゴ酸基質の量を増大させ得る。続いてこれは、リンゴ酸をピルビン酸に変換する場合に、ＮＡＤＰＨの細胞質ＭＥ生成を維持するのを助け得る。このＭＤＨと細胞質ＭＥ反応の交差点は（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ）は、以下のように図示され得る（図中ＭＡＥはリンゴ酸酵素であり、ＰＹＣはピルビン酸カルボキシラーゼである）。

代案としては、ＭＤＨは特定の実施形態では、「リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）」であり、それはまた「（Ｓ）−リンゴ酸：ＮＡＤＰ^＋酸化還元酵素」とも称され得る。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ１．１．１．８２）は、化学反応（Ｓ）−リンゴ酸＋ＮＡＤＰ^＋→オキサロ酢酸＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋を触媒する酵素である。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）は、酸化還元酵素ファミリー、特にＮＡＤ^＋またはＮＡＤＰ^＋を受容体として、供与体のＣＨ−ＯＨ基に作用するものに属する。この反応から生成されるＮＡＤＰＨは、脂肪酸合成のためのＮＡＤＰＨの供給源に相当する。

ＭＤＨ（ＥＣ１．１．１．３７またはＥＣ１．１．１．８２）は、特定の実施形態では、原核生物または真核生物であり得て、細菌、真菌、酵母、植物、動物、原虫、藻類、またはストラメノパイルに由来してもよい。ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、同一のまたは異なる組み合わせのＭＤＨ酵素をコードする、１、２、３、４、５、６、７、８個以上の異種ポリヌクレオチドを含有してもよい。ＭＤＨは、例えばミトコンドリアＭＤＨ、細胞質ＭＤＨ、またはペルオキシソームＭＤＨであり得る。ＥＣ１．１．１．３７およびＥＣ１．１．１．８２双方のいくつかのＭＤＨ酵素は、当該技術分野で公知である。

本発明の特定の実施形態では、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中の細胞質ＭＥと同時現されるＭＤＨは、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＤＨであってもよい。このようなＭＤＨでは、ＭＤＨの天然遺伝子発現を考慮に入れて、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中の異種ポリヌクレオチドを使用して、過剰発現させ得る。ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＤＨは、例えば配列番号２５を含んでなり得る。配列番号２５は、ミトコンドリアＭＤＨである。代案としては、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＤＨは、配列番号２５と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、ＭＤＨ活性（例えばオキサロ酢酸をリンゴ酸に変換する）を有するアミノ酸配列を含んでなり得る。例えば配列番号２４などの、これらのＭＤＨアミノ酸配列のいずれかをコードするポリヌクレオチドを使用し得る。特定の実施形態では、ＭＤＨは、配列番号２５と１つのアミノ酸残基が異なる（２位のフェニルアラニン残基の代わりにバリン残基を含有する）、配列番号３０を含んでなる。

ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＤＨは、本発明の特定の実施形態では、配列番号２７または配列番号２９を含んでなり得る。配列番号２７および配列番号２９は、ペルオキシソームＭＤＨ酵素である。代案としては、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＤＨは、配列番号２７または配列番号２９と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、ＭＤＨ活性（例えばオキサロ酢酸をリンゴ酸に変換する）を有するアミノ酸配列を含んでなり得る。例えば配列番号２６または配列番号２８などの、これらのＭＤＨアミノ酸配列のいずれかをコードするポリヌクレオチドを使用し得る。

遺伝子改変組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞に関しては、この微生物宿主中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主ゲノムへの線状ＤＮＡ断片の組み込みによる。ゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベルの発現が所望される場合に、特に有用である。好ましい遺伝子座としては、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で教示されるものが挙げられる。

さらにＪｕｒｅｔｚｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｙｅａｓｔ，１８：９７―１１３（２００１））は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に組み込まれたＤＮＡ断片の安定性が、使用される個々の形質転換体、受容者株、および標的プラットフォームに左右されることを指摘する。したがって当業者は、所望の発現レベルとパターンを示す株を得るために、特定の組換え微生物宿主の複数の形質転換体をスクリーニングしなくてはならないことを認識する。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析ブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウエスタン分析、ＰＵＦＡ産物の表現型解析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。

本発明は、
ａ）少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油が生成される、本発明の遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を培養するステップと、
ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）の微生物油を回収するステップと
を含んでなる、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の脂質含量を増大させる方法にも関する。

油は、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油を産生するヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を、約１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、または２００時間培養した後に、遺伝子組換えヤロウィア属（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｙａｒｒｏｗｉａ）種から回収され、またはそれから得られてもよい。

本開示の遺伝子組換えヤロウィア属（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｙａｒｒｏｗｉａ）種は、（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼなどをコードする）キメラ遺伝子の発現が最適化される条件下で増殖させて、１つまたは複数のＰＵＦＡの最大かつ最も経済的な収率を生産することができる。一般に培地条件は、炭素源のタイプと量、窒素源のタイプと量、炭素対窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産期の長さ、油の蓄積期の長さ、および細胞収穫の時間と方法を変更することで、最適化されてもよい。例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に、酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス［「ＹＰＤ」］、または増殖に必要な成分を欠き、したがって所望の発現カセットの選択を強制する、規定最少培地（例えば酵母窒素原礎（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））などの複合培地中で培養される。

本明細書に記載される方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４−Ａ１号明細書に記載されるものなどの、適切な炭素源を含まなくてはならない。本発明で利用される炭素源は、多種多様な炭素含有原料を包含してもよいことが意図されるが、好ましい炭素源は、糖類（例えばグルコース、転化糖、フルクトースおよびその組み合わせ）、グリセロールおよび／または脂肪酸（例えば１０〜２２個の炭素を含有するもの）である。

窒素は、無機（例えば（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）原料から供給されてもよい。適切な炭素窒素源に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、そして微生物宿主細胞の生長およびＥＰＡ生成のための酵素経路促進に適することが当業者に知られている、その他の成分もまた含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進する、Ｆｅ^＋２、Ｃｕ^＋２、Ｍｎ^＋２、Ｃｏ^＋２、Ｚｎ^＋２、およびＭｇ^＋２などのいくつかの金属イオンが、特に注目される（Ｎａｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ ａｎｄ Ｒ．Ｃｏｌｉｎ，ｅｄｓ．ｐｐ ６１−９７（１９９２））。

本明細書に記載される方法および宿主細胞に好ましい増殖培地は、酵母窒素原礎培地またはコーンスティープリカーなどの一般的な商業的に調製された培地である。その他の規定または合成成長培地もまた、使用してもよい。発酵のための適切なｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、初期成長条件範囲としてはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実行されてもよく、微好気条件が好ましい。

典型的に、代謝状態は、増殖と脂肪合成／貯蔵の間で「平衡状態」でなくてはならないので、油性酵母細胞中の高レベルのＰＵＦＡ蓄積は、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのＥＰＡ生成のために、二段階発酵過程が必要である。このアプローチは米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載され、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、流加、および連続）および増殖中の配慮についても同様である。

米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の実施例１０は、（１６２時間にわたる最大生産量が１２．１ ＥＰＡ％ＤＣＷである［５５．６ ＥＰＡ％ＴＦＡ、ＥＰＡ％ＴＦＡ対ＬＡ％ＴＦＡ比３．０３］）組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株の２Ｌ発酵に必要なパラメータの詳細な説明もまた提供する。本開示は、凍結培養物から接種菌液を調製して種培養を作成し、最初に高い細胞密度への迅速な成長を促進する条件下で酵母を培養し、次に酵母を（窒素を枯渇させ、グルコースを継続的に供給することで）培養して、脂質およびＰＵＦＡ蓄積を促進する手段の説明を含む。標準操作条件に従って、温度（３０〜３２℃に制御される）、ｐＨ（５〜７に制御される）、溶存酸素濃度、およびグルコース濃度をはじめとする、プロセス変量をモニターして制御し、一貫した工程性能および最後のＰＵＦＡ油の品質を確実にした。

本発明のいくつかの態様では、一次産物は組換え微生物バイオマスである。したがって微生物バイオマスからのＰＵＦＡ含有油の単離および精製は、必要ないこともある（すなわちホールセルバイオマスが産物である）。しかし特定の最終用途および／または最終産物形態は、微生物バイオマスからのＥＰＡ含有油の部分的および／または完全単離／精製を要することもあり、部分的精製微生物バイオマス、精製油、および／または精製ＥＰＡがもたらされる。これらの態様についてさらに詳しくは、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書を参照されたい。

本明細書に別段の記載がない限り、実施例では以下の手順を使用した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を培養し、その乾燥細胞質量、脂質含量および脂肪酸プロファイルを測定する手順は、一般に、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８／０２５４１９１号明細書および米国特許出願公開第２００９／００９３５４３号明細書に記載されるようにして実施した。プラスミド発現ベクターがあるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を形質転換する手順は、一般に、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９／００９３５４３号明細書に記載されるようして実施した。組換えＤＮＡクローニングおよび操作は、標準分子生物学手順を使用して実施した。

実施例１
天然またはトランケート型（細胞質）Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）リンゴ酸酵素過剰発現のためのベクター構築
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）リンゴ酸酵素（ＭＥ）のアミノ酸配列を解析して、その中にミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）が含有されるかどうかを判定した。推定ＭＴＳを同定した後、完全長（ミトコンドリア）ＭＥ、およびトランケート型（細胞質）ＭＥ発現のためのベクターを構築した。

リンゴ酸酵素ＭＴＳ同定
Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３００：１００５１０１６）によって記述されるようにして、ＴａｒｇｅｔＰ １．１ Ｓｅｒｖｅｒ配列解析予測プログラム（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｌｙｎｇｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を利用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＭＥ配列（ＹｌＭＥ、配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５０４１１２）を解析し、このタンパク質が、ＭＴＳなどのいずれかの特定の細胞内局在化配列を含有するかどうかを判定した。この解析は、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＥが、２６アミノ酸残基長の推定ＭＴＳを含有することを示唆した（図１、ＹｌＭＥ配列中の下線付部分）。

サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）リンゴ酸酵素（ＳｃＭＥ、配列番号２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＤＮ５９８７７）が、ミトコンドリア酵素である一方で、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）中のリンゴ酸酵素（ＳｐＭＥ、配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿５８７７６０）は、細胞質酵素であることが報告された（Ｓａａｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｓ．Ａｆｒ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．２７（２）：１１３−１２２）。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのリンゴ酸酵素の配列を比較すると、ＹｌＭＥおよびＳｃＭＥの最初の５５および８５個のアミノ酸は、それぞれＳｐＭＥ中に明らかな対応物を有しないことを示した（図１）。これはＭＴＳが、ＹｌＭＥの最初の５５アミノ酸残基の長さであってもよく、またはその中に収容されていることを示唆した。

リンゴ酸酵素過剰発現のためのベクターの構築
５’末端プライマーＭＥ−Ｆ（配列番号１１、付加されたＮｃｏＩ部位を含有する）、および３’末端プライマーＭＥ−Ｒ（配列番号１２、添加されたＮｏｔＩ部位を含有する）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって、完全長ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＥ（ＹｌＭＥ）ＯＲＦを得た。これらのプライマーは、付加されたＮｃｏＩ部位を操作するために、２番目のコドンをＴＴＡ（ｌｅｕ）からＧＴＡ（ｖａｌ）に変化させたこと以外は、ＡＴＧ開始コドンから停止コドンまでのコード領域を増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１μＬのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡ、（２０μＭの原液から）それぞれ１μＬのプライマーＭＥ−ＦおよびＭＥ−Ｒ、２２μＬの水、および２５μＬのＥｘＴａｑ（商標）プレミックス２×Ｔａｑ ＰＣＲ溶液（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を含有した。増幅は、以下のように実施した。９４℃で２分間の初期変性、それに続く９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のプライマーアニーリング、および７２℃で９０秒間の伸長を３０サイクル。７２℃で７分間の最終伸長期間を実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。製造業者のプロトコルに従ってＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、反応によって増幅されたＤＮＡ断片を精製した。精製ＤＮＡをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化して、ｐＺＰ２ベースのベクター主鎖を有するＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−ｃｕｔプラスミド中にクローン化した（ｐＭＥ（配列番号１３）発現ベクターの生成については、米国特許出願公開第２０１０／０１５９５５８号明細書を参照されたい（図２Ａ）。

ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＥの細胞質バージョンを構築するために、ＹｌＭＥのＮ末端トランケート型バージョンをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作成した。このトランケーションはＹｌＭＥの最初の５３個のアミノ酸を除去し；この領域内の予測されたＭＴＳは、この配列欠失で結果的に除去された。Ｎ末端アミノ酸１〜５３を欠くＹｌＭＥ ＯＲＦ（「ＹｌＭＥ−Ｔ２」）を以下のように作成した。上記ＰＣＲ条件を利用して、５’末端プライマーＭＥ−ＴＮ２（配列番号８、付加されたＮｃｏＩ部位を含有する）および３’末端プライマーＭＥ−Ｔ２（配列番号９、付加されたＮｏｔＩ部位を含有する）を使用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡからのＹｌＭＥ−Ｔ２ ＯＲＦと、ＭＥ遺伝子の３’非翻訳領域の２０３塩基対を増幅した。増幅断片を上記のように精製して、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−ｃｕｔｐＭＥベクターにクローン化して、ｐＭＥＴ２を得た（図２Ｂ、配列番号１０）。

ｐＭＥおよびｐＭＥＴ２の双方で、クローン化したコード配列（それぞれ完全長またはトランケート型ＹｌＭＥ）は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）フルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼ遺伝子（「ＦＢＡＩＮ」、米国特許第７，２０２，３５６号明細書を参照されたい）のＦＢＡＩＮプロモーターの転写制御下にある。このプロモーターは、例えばヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種において、下流遺伝子配列の過剰発現を可能にする。また、どちらのコード配列でも、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＥＸ２０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０５４６１３）からのターミネーター配列が、それらの３’末端の側面に位置する。ｐＭＥＴ２は、ＭＥ−Ｔ２コード領域とＰＥＸ２０ターミネーター間の２０３ｂｐのＹｌＭＥ遺伝子の３’非翻訳配列を有した。正しくライゲートされたコンストラクトをプラスミド少量調製と、それに応じた消化分析によって確認した。

構築されたキメラ遺伝子発現カセットは、ＦＢＡＩＮ：：ＹｌＭＥ：：ＰＥＸ２０およびＦＢＡＩＮ：：ＹｌＭＥ−Ｔ２：：ＰＥＸ２０という省略表現で特徴付け得る。翻訳されたＹｌＭＥおよびＹｌＭＥ−Ｔ２ポリペプチドのアラインメントを図３に示す。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＭＥ遺伝子のコード領域は、イントロンを含まないことを考えると、上記のように増幅された配列はまた、ｃＤＮＡ配列を表すとも見なし得る。ＹｌＭＥおよびＹｌＭＥ−Ｔ２ ＯＲＦの配列は、それぞれ配列番号６および４に記載される。

実施例２
ＭＥ過剰発現、およびそのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質生成に対する効果
異なるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株脂質含量に対する、野性型（完全長）または細胞質ＭＥ過剰発現の効果は、実施例１に記載されるコンストラクトを利用して判定した。

以下の遺伝子過剰発現試験では、ＢｓｓＨＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたプラスミドｐＭＥまたはｐＭＥＴ２をそれぞれ使用して、ＦＢＡＩＮ：：ＹｌＭＥ：：ＰＥＸ２０またはＦＢＡＩＮ：：ＹｌＭＥ−Ｔ２：：ＰＥＸ２０キメラ遺伝子発現カセットのいずれかで、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を形質転換した。形質転換対照の目的で、各実験で使用された株を、ＫｐｎＩおよびＳａｌＩで消化されたプラスミドｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３（図２Ｃ、配列番号１４）で形質転換した。プラスミドｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）−ＳＫ（−）多重クローニング部位にヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＵＲＡ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ３０６４２１）を含有するように改変された、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）−ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬＡ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に由来した。実験的および対照ベクターは、さもなければＵｒａ⁻である細胞にＵｒａ^＋表現型を与えるので、ウラシルを欠くプレート上で形質転換体を選択した。これらの分析では、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４が使用され；Ｙ２２２４は野性型株ＡＴＣＣ＃２０３６２のＵｒａ⁻株であり、野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に典型的な脂質含量を有する。Ｙ２２２４株の単離は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８／０２５４１９１号明細書に記載される。

形質転換体を発酵培地（ＦＭ、１リットルあたり：６．７０ｇの酵母窒素原礎、６．００ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２．００ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、１．５０ｇのＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、２０ｇのグルコース、５．００ｇの酵母抽出物［ＢＢＬ］）中で２日間培養し、高グルコース培地（ＨＧＭ、１リットルあたり：８０ｇのグルコース、２．５８ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、５．３６ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．５［調節は必要ない］）中での５日間の培養がそれに続いた。この培養期間後、米国特許出願公開第２００８／０２５４１９１号明細書に記載されるようにして、形質転換体の脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）および脂肪酸プロファイルをガスクロマトグラフィーによって測定した。

Ｙ２２２４株中における脂質生成
ｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３（対照）、ＹｌＭＥ、またはＹｌＭＥ−Ｔ２配列で形質転換されたヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２２２４株の脂質および脂肪酸プロファイルを表４に列挙する。ＹｌＭＥまたはＹｌＭＥ−Ｔ２過剰発現のための、４個の（１〜４）異なる対照形質転換体、および８個の（１〜８）異なる形質転換体を分析した。検出された脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）および１８：２（リノール酸）を含み；各脂肪酸濃度をＴＦＡの質量％（すなわち「％ＴＦＡ」）として表４に提示する。

表４に示されるように、ＹｌＭＥおよびＹｌＭＥ−Ｔ２過剰発現のための大部分の形質転換体は、対照プラスミドｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３を保有するものと同様の量の総脂質を産生した。

これらの結果は、全体的にみて完全長ＭＥまたは細胞質ＭＥの過剰発現が、どちらも野性型脂質生成能力を有するヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株中における脂質生成を実質的に変化させないことを意味する。特に、完全長または細胞質ＭＥ過剰発現は、どちらも、記述される分析的条件下で、約１５ＴＦＡ％ＤＣＷの野性型の基線レベルから、脂質生成を有意に上昇させない。

Ｚ１９７８Ｕ株中における脂質生成
ｐＭＥおよびｐＭＥ−Ｔ２過剰発現ベクターはまた、Ｚ１９７８のＵｒａ⁻株である、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）改変株Ｚ１９７８Ｕの形質転換においても使用された。Ｚ１９７８株は、約５２ ＥＰＡ％ＴＦＡである、約３５ ＴＦＡ％ＤＣＷを超える脂質含量を産生し得る。Ｚ１９７８およびＺ１９７８Ｕ株の開発の詳細については、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２／００５２５３７Ａ１号明細書で提供される。Ｚ１９７８Ｕ形質転換体の脂質および脂肪酸プロファイルは、表５に列挙される。ＹｌＭＥまたはＹｌＭＥ−Ｔ２過剰発現のための、４個の（１〜４）異なる対照形質転換体、および８個の（１〜８）異なる形質転換体を分析した。全脂肪酸中に検出された脂肪酸は、１８：０、１８：１、１８：２、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含んだ。

表５に示されるように、ｐＭＥ形質転換体の大部分は、対照形質転換体と比較して、脂質含量に中程度の増大（約５％）を示した。しかしｐＭＥ−Ｔ２形質転換体の大部分は、対照形質転換体と比較して、顕著により高い脂質含量（＞１０％）を産生し；特定の例は、表に太字で列挙される。ｐＭＥ−Ｔ２形質転換体中のＥＰＡ含量（ＥＰＡ％ＤＣＷ）は、総脂質含量の上昇と共に一般に増大した。したがって細胞質ＭＥの発現は、Ｚ１９７８Ｕ株中における脂質の生成を増大させた。この結果は、平均して、細胞質ＭＥ過剰発現に伴う脂質生成の著しい増強を示さなかった、Ｙ２２２４株（野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に典型的な脂質レベルを有する）に関する上の観察と対照的である。

これらの結果は、全体的にみて細胞質ＭＥの過剰発現が、約３５ＴＦＡ％ＤＣＷを超える脂質生成能力を有する、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の脂質生成を有意に増大させ得ることを示唆する。具体的には、この株における細胞質ＭＥ過剰発現は、対照と比較して、１０％を超えて脂質生成を増大させた。

Ｚ５５６７Ｕ株中における脂質生成
上のプラスミドを同様に使用して、Ｚ５５６７のＵｒａ⁻株である、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の別の改変株Ｚ５５６７Ｕを形質転換した。Ｚ５５６７株は、約２７．０のＥＰＡ％ＤＣＷである、約５５．０ ＴＦＡ％ＤＣＷを超える脂質含量を産生し得る。Ｚ５５６７およびＺ５５６７Ｕ株の開発の詳細については、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２／００５２５３７Ａ１号明細書で提供される。表６に示されるように、Ｚ５５６７Ｕ中におけるＹｌＭＥまたはＹｌＭＥ−Ｔ２過剰発現のための、４個（１〜４）の異なる対照形質転換体（ｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３）、および１０個の（１〜１０）異なる形質転換体を脂質生成について分析した。全脂肪酸中で検出される脂肪酸は、１８：０、１８：１、１８：２、ＤＧＬＡ、およびＥＰＡを含んだ。対照およびｐＭＥ（完全長ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＥ）Ｚ５５６７Ｕ形質転換体は、同様のレベルの総脂質を生成する。しかしｐＭＥＴ２（細胞質ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＭＥ）形質転換体は、対照およびｐＭＥ形質転換体と比較して、有意により多くの総脂質を産生した。ｐＭＥＴ２形質転換体中で上昇した総脂質レベルの特定の例は、表６に太字で列挙される。

したがって細胞質ＭＥの発現は、Ｚ５５６７Ｕ株中における脂質の生成もまた増大させた。したがってこれらの結果は、細胞質ＭＥの過剰発現が、約３５ ＴＦＡ％ＤＣＷを超える脂質生成能力を有する、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の脂質生成を有意に増大させ得ることをさらに示唆する。この特定の例では、細胞質ＭＥ過剰発現は、記載される分析的条件下で、５０ ＴＦＡ％ＤＣＷを超える脂質生成能力を有する株中における脂質生成を増大させた。

改変高脂質株を利用して得られた結果は、平均して、細胞質ＭＥ過剰発現に伴う脂質生成の著しい増強を示さなかった、Ｙ２２２４株（野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に典型的な脂質レベルを有する）に関する上の観察と対照的である。別の違いは、細胞質ＭＥとの対比で、完全長ＭＥによって誘導される、Ｙ２２２４およびＺ５５６７Ｕ中における脂質含量に対する効果である。Ｙ２２２４では、脂質含量に対する完全長ＭＥおよび細胞質ＭＥの過剰発現のそれぞれの効果は、対照との比較で、比較的類似していた。しかしＺ５５６７Ｕ株における完全長ＭＥ過剰発現は、対照と比較して、一般に脂質含量を低下させた一方で、細胞質ＭＥは、脂質レベルの上昇を誘導した。けれどもＺ１９７８株では、完全長ＭＥが脂質含量を中程度に増大させた一方で、細胞質ＭＥは、脂質レベルの増大に対して顕著により明白な効果を有した。これらのデータは、全体的にみて、細胞質ＭＥがヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の高脂質産生株の脂質生成能力を向上させることを示唆する。

これらのデータに基づいて、細胞質ＭＥによって生産されたＮＡＤＰＨ還元等価物は、ほぼ３５ ＴＦＡ％ＤＣＷ以上を産生し得るヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株における脂質生合成の要因であると思われる。脂質産生がより低いヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株中で、細胞質ＭＥによって生成されるＮＡＤＰＨは、脂質生成において顕著な役割は果たさないようである。これらの観察は、細胞質ＭＥによって生成されたＮＡＤＰＨが、株中の脂質生成能力の増大につれて、脂質生合成のためより多く必要になることを示唆し得る（すなわちより多くの脂質合成は、より多くの還元能力を要してもよい）。しかし興味深いことに、Ｚ５５６７Ｕは、Ｚ１９７８Ｕよりも多量の脂質を産生するにもかかわらず、脂質生成に対する細胞質ＭＥ過剰発現の効果は、Ｚ５５６７Ｕと比較して、Ｚ１９７８Ｕ中でより明白であった。例えば細胞質ＭＥ過剰発現は、対照と比較して（上で論じた）Ｚ１９７８Ｕ中で１０％を超えて脂質生成を増大させた一方で、Ｚ５５６７Ｕ中では約３％を超えて脂質生成を増大させた。

要約すると、上の結果は、細胞質ＭＥの過剰発現が、約３５ ＴＦＡ％ＤＣＷを超える脂質生成能力を有する遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株中における脂質生成を有意に増大させ得ることを示唆する。

実施例３
ＭＥをコードする遺伝子の欠失およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質生成に対するその影響
天然ＭＥ遺伝子を欠くヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、およびその脂質産生増大形質転換体中の脂質生成を測定した。増大脂質生成は、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素２（ＤＧＡＴ２）の過剰発現によって誘導される。

リンゴ酸酵素遺伝子欠失
プラスミドｐＭＥ−ＫＯ（図６、配列番号１５）を構築し、相同組換えを通じて野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中のＭＥ遺伝子を欠失させた。図５は、中断ストラテジーの一般スキームを示す。ＭＥ遺伝子の５’および３’側面に位置する領域は、以下のプライマー対を利用してＰＣＲによって増幅された：５’隣接領域ではＹＭＥ−５−１（配列番号１６）／ＹＭＥ−５−２（配列番号１７）、３’隣接領域ではＹＭＥ−３−１（配列番号１８）／ＹＭＥ−３−２（配列番号１９）。

ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡテンプレートとしてヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムを利用して実施した。反応混合物は、１μＬのゲノムＤＮＡ、１μＬの各プライマー（２０μＭ原液から）、２２μＬの水、および２５μＬのＥｘ Ｔａｑ（商標）プレミックス２×ＴａｑＰＣＲ溶液を含有した。増幅は、以下のように実施した。９４℃で２分間の初期変性、それに続く９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒間の伸長を３０サイクル。７２℃で７分間の最終伸長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。

３断片連結反応において、ｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間で、２つのＰＣＲ産物をクローン化した。５’隣接領域のＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、３’隣接領域のＰＣＲ産物は、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化した。プラスミドｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。２つのＰＣＲ産物がＸｈｏＩ部位で共に連結し、連結ＰＣＲ産物がベクターのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間にあるように、３つのＤＮＡ断片を共にライゲートした。得られたプラスミドｐＭＥ−ＫＯ（配列番号１５）は、図６で示される。

Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４（典型的なＵｒａ⁻野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、上記を参照されたい）をｐＭＥ−ＫＯで形質転換して、ＳｐｈＩで消化した。形質転換体をＵｒａ除去プレート上に播種して、コンストラクトの組み込みについて選択した。Ｕｒａ^＋形質転換体は、プライマーＹＭＥ−５−ｃｏｎｆｉｒｍ−１（配列番号２０）およびＹＭＥ−５−ｃｏｎｆｉｒｍ−２（配列番号２１）を利用して、コロニーＰＣＲによってスクリーニングした。

反応混合物は、０．５μＬの各プライマー（２０μＭ原液）、１４μＬの水、および１５μＬのＥｘ Ｔａｑ（商標）プレミックス２×Ｔａｑ ＰＣＲ溶液を含有した。小量の細胞をプレートから選択して、反応混合物に添加した。ＰＣＲ条件は次のとおりであった：９５℃で５分間の初期変性、それに続く９４℃で２０秒間の変性、５５℃で２０秒間のアニーリング、および７２℃で６０秒間の伸長を３５サイクル。７２℃で７分間の最終伸長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。

消化プラスミドが、ＭＥ遺伝子座でヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに組み込まれる場合、約１ｋｂの断片がＰＣＲによって生じるはずである。３６個の形質転換体中３個が、予期されたＰＣＲ産物を生じた。これらの３つの形質転換体は、３５０μｇ／ｍＬの５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３号明細書）を含有する最少培地プレート上にパッチに植えて、２回目の組換えを経てＵｒａ⁻になる細胞について選択した。２回目の組換えを経た細胞は、（ｉ）欠失コンストラクトと共に野性型ＭＥ遺伝子が欠失し、または（ｉｉ）欠失コンストラクトのみが欠失しており、その場合は、ＭＥ遺伝子は無傷である（図５を参照されたい）。

５−ＦＯＡプレートから１６個のコロニーを選択し、プライマーＹＭＥ−３−ｃｏｎｆｉｒｍ−１（配列番号２２）およびＹＭＥ−３−ｃｏｎｆｉｒｍ−２（配列番号２３）を利用したコロニーＰＣＲによって試験した。ＭＥ遺伝子が株から欠失した場合、約１．３ｋｂの断片が予測された。ＰＣＲ条件は上記と同様であり、１回目の組換えのための確認ＰＣＲを実施した。Ｕｒａ⁻株の内２つは、正しいサイズ（約１．３ｋｂ）を有するＰＣＲ産物を生じ、これらの形質転換体が欠失を有することが示唆された。プライマーＹＭＥ−５−ｃｏｎｆｉｒｍ−２およびＹＭＥ−３−ｃｏｎｆｉｒｍ−１を利用したＰＣＲによって、双方の形質転換体をＭＥ遺伝子欠失についてさらに確認した。ＭＥ遺伝子がノックアウトされた場合、このプライマー対は２５０ｂｐの産物を増幅し、ＭＥ遺伝子座が野性型である場合、約１．７ｋｂの産物を増幅するはずである。どちらのＵｒａ⁻株も２５０ｂｐのＰＣＲ断片を生じ、したがってそれらがＹ２２２４株のＭＥ欠失誘導体であることが確認された。

ＭＥ欠失ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の脂質生成
ＭＥ欠失株中で脂質測定を実施して、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）脂質生成中におけるＭＥの役割を判定した。下述するように、ｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３、ｐＭＥ、またはｐＭＥ−Ｔ２で形質転換されたＭＥ欠失Ｙ２２２４細胞は、天然脂肪酸合成と比較してこの評価ができるようにした。

Ｙ２２２４のＵｒａ⁻、ＭＥ⁻株を（ｉ）ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化されたｐＢ
ｌｕｅ−ＹＵＲＡ３、（ｉｉ）ＢｓｓＨＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたｐＭＥ、または（ｉｉｉ）ＢｓｓＨＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたｐＭＥ−Ｔ２で形質転換した。形質転換体（Ｕｒａ除去プレート上で選択された）をＦＭ中で２日間培養し、ＨＧＭ中での５日間の培養がそれに続いた。ｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３、ｐＭＥおよびｐＭＥ−Ｔ２形質転換のそれぞれから選択された、２つの形質転換体の脂質含量および脂肪酸プロファイルは、下の表７に示され；測定はまた、野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株の２つの別の培養物でも実施した。全脂肪酸中で検出された脂肪酸は、１６：０、１６：１、１８：０、１８：１、および１８：２を含んだ。

ＴＦＡ％ＤＣＷおよび％ＴＦＡ値は、野性型株ＡＴＣＣ＃２０３６２およびＹ２２２４−ＭＥ⁻＋ｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３形質転換体の間で同様であったので、ＭＥ欠失は、野性型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のコンテクストにおいて、脂質生成および脂肪酸プロファイルに対して、いかなる影響も有しなかったようである（表７）。Ｙ２２２４−ＭＥ⁻形質転換体は、ＭＥ欠失以外は、ＡＴＣＣ＃２０３６２とは、ＵＲＡ３遺伝子座と、ｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３対照ベクターの一部を含有したことだけが異なったことを考えると、これは公正な比較である。

ｐＭＥまたはｐＭＥ−Ｔ２による、Ｙ２２２４−ＭＥ⁻株の形質転換は、天然完全長ＭＥによってもたらされるいかなるバックグラウンドもなしに、脂質代謝に対する、細胞質ＭＥまたは完全長ＭＥの過剰発現の影響を比較できるようにした。ｐＭＥまたはｐＭＥ−Ｔ２のいずれかで形質転換されたＹ２２２４株中で脂質含量が顕著に変化しなかった上述の結果と一致して、Ｙ２２２４−ＭＥ⁻中で完全長ＭＥまたは細胞質ＭＥのいずれかが過剰発現された場合、脂質代謝に対する明らかな影響はなかった（表７）。

最後に、Ｙ２２２４−ＭＥ⁻＋ｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３形質転換体の脂質プロファイルとＹ２２２４−ＭＥ⁻＋ｐＭＥまたはｐＭＥ−Ｔ２形質転換体の脂質プロファイルとの比較において、Ｙ２２２４中におけるＭＥ（細胞質または完全長）発現の救出による、脂質含量に対する顕著な影響はなかった。これは、ＡＴＣＣ＃２０３６２とＹ２２２４−ＭＥ⁻＋ｐＢｌｕｅ−ＹＵＲＡ３の間で、脂質代謝に識別可能な違いがないことに一致し；すなわちＭＥの除去が脂質生成影響を及ぼさなかった場合、ＭＥの付加も同様にいかなる影響も及ぼさなかった。

Ｙ２２２４株について本実施例で得られた結果は、全体的にみて、遺伝子組換え株Ｚ１９７８ＵおよびＺ５５６７Ｕと同様に、ＭＥは、完全長であるかまたは細胞性であるかにかかわらず、脂質生成を増大させるように改変されていないヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の脂質代謝に顕著に、影響を及ぼさないことを示唆する。

実施例４
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中において、細胞質リンゴ酸酵素およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの異種同時発現
本実施例は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における、１つは細胞質ＭＥをコードし、もう１つはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）をコードする、ポリヌクレオチドの異種様式での同時発現を説明する。この分析を実施して、乾燥細胞重量の少なくとも約３５％の脂質含量を有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中において、細胞質ＭＥを発現させる際に起こる脂質生成の増大を、ＭＤＨ発現が増強し得るかどうかを判定する。

プライマーＹＭＤＨ１−Ｆ（配列番号３１）およびＹＭＤＨ１−Ｒ（配列番号３２）を使用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ミトコンドリアＭＤＨ（配列番号３０）をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅する。このポリヌクレオチドが、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中でポリヌクレオチドを発現するための適切なプロモーターおよびターミネーター配列を有する発現カセット内に収容されるように，それをベクター中にクローン化させる。

形質転換手順を実施して、乾燥細胞重量の少なくとも約３５％の脂質含量を有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中で、ＹｌＭＥ−Ｔ２およびヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ミトコンドリアＭＤＨを同時発現させる。形質転換体の脂質プロファイルは、上述したように評価される。

Claims (15)

1. （ｉ）細胞質リンゴ酸酵素をコードするポリヌクレオチド；
   （ｉｉ）ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量基準で少なくとも約３５質量％の脂質含量；および
   （ｉｉｉ）改変多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生合成経路
   を含んでなり、前記細胞質リンゴ酸酵素の過剰発現が、脂質含量を増大させる、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
2. 前記細胞質リンゴ酸酵素が、機能不全ミトコンドリア標的化配列を含んでなる、請求項１に記載のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
3. 前記細胞質リンゴ酸酵素がミトコンドリア標的化配列を含まない、請求項１に記載のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
4. 前記細胞質リンゴ酸酵素が、配列番号５と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、リンゴ酸酵素活性を有する、請求項１に記載のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
5. 前記脂質含量が、前記ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量基準で少なくとも約５０質量％である、請求項１に記載のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
6. 前記改変ＰＵＦＡ生合成経路が、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、少なくとも１つのＰＵＦＡを生成する、請求項１に記載のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
7. 前記改変ＰＵＦＡ生合成経路がエイコサペンタエン酸を生成する、請求項６に記載のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
8. 前記種がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項１に記載のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
9. ａ）請求項１に記載の遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を培養して、少なくとも１つのＰＵＦＡを含んでなる微生物油を生成させるステップと、
   ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）の微生物油を回収するステップと
   を含んでなる、遺伝子組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の脂質含量を増大させる方法。
10. 前記細胞質リンゴ酸酵素が、機能不全ミトコンドリア標的化配列を含んでなる、請求項９に記載の方法。
11. 前記細胞質リンゴ酸酵素がミトコンドリア標的化配列を含まない、請求項９に記載の方法。
12. 前記細胞質リンゴ酸酵素が、配列番号５と少なくとも約９０％の配列同一性を有して、リンゴ酸酵素活性を有する、アミノ酸配列を含んでなる、請求項９に記載の方法。
13. 前記脂質含量が、前記ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の乾燥細胞質量基準で少なくとも約５０質量％である、請求項９に記載の方法。
14. 前記改変ＰＵＦＡ生合成経路が、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、少なくとも１つのＰＵＦＡを生成する、請求項１に記載の方法。
15. 前記改変ＰＵＦＡ生合成経路がエイコサペンタエン酸を生成する、請求項１４に記載の方法。

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