KR101239178B1

KR101239178B1 - 푸마르산 고생산성 변이 균주, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 푸마르산의 생산 방법

Info

Publication number: KR101239178B1
Application number: KR1020100071079A
Authority: KR
Inventors: 김상용; 이도훈; 조진구; 박철환; 강성우; 이종호; 김승욱; 전계택
Original assignee: 한국생산기술연구원
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2013-03-05
Also published as: KR20120009934A

Abstract

본 발명은 푸마르산(fumaric acid) 생산 능력이 향상된 균주를 확보하기 위한 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는 균주를 돌연변이 유도 후 트리톤 X-100 및 브로모크레졸 퍼플이 포함된 선별배지에서 배양하여 푸마르산 생산 균주를 확인한 다음 이의 푸마르산 생산성을 확인하여 제조되는 푸마르산 고생산성 변이 균주 및 이를 이용하여 푸마르산을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

푸마르산 고생산성 변이 균주, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 푸마르산의 생산 방법{FUMARIC ACID HIGH PRODUCTIVE MUTANT STRAIN, METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME, AND METHOD FOR PRODUCING FUMARIC ACID USING THE SAME}

푸마르산은 식품첨가제, 폴리에스터를 비롯한 고분자 원료로 사용되는 불포화 디카르복실산(dicarboxylic acid)으로 말레산(maleic acid)의 이성질체이다. 일반적으로 푸마르산은 고에너지소모 공정인 원유의 정제를 통해 공급되는 벤젠 또는 부탄을 원료로 합성되는 말레산 또는 말레산 무수물의 촉매이용 이성질체화(isomerization)에 의해서 생산되며 연간 세계 생산량은 120,000톤 수준이다(Sauer 2008). 이러한 일련의 생산과정은 고온고압 조건에서 작용하는 화학촉매에 의존하며 때로 유기용매를 필요로 한다. 따라서 현재 생산 공정은 에너지를 많이 사용하며 각종 부산물도 다량 발생시키므로 개선이 필요한 상황이다(Engel 2008).

최근 화학제품 생산 공정의 화석연료에 대한 의존성 및 온실가스 배출을 줄이고 환경 영향을 최소화하고자 하는 노력의 일환으로 바이오매스(biomass)와 같은 재생가능 자원(renewable resources)으로부터 기존의 석유화학공정을 통해 얻어지는 제품들을 생산하고자 하는 노력이 다각도로 이루어지고 있다. 푸마르산의 경우 고등균류(fungi), 특히 라이조퍼스(Rhizopus) 속 균주를 이용한 발효를 통해 생산이 가능하며 이를 기반으로 기존의 화학공정과 경쟁할 수 있는 생물학적 공정을 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 생물학적 푸마르산 생산 공정의 생산성을 높이기 위해 주로 공정개선(배양 배지 및 공정 변수 최적화, 반응기 디자인 개선) 중심의 연구개발이 진행되었다. 배지 조성의 측면에서는 라이조퍼스의 푸마르산 생산을 촉진하기 위해서는 질소원 제어 및 탄소원/질소원의 비율을 적절히 조절하는 것이 중요하며(Rhodes 1959, Rhodes 1962), 마그네슘, 아연, 철 이온의 농도를 적절한 수준으로 유지함으로써 배양 중 균주의 형상(morphology)을 최적화하는 것이 푸마르산 생산성 향상에 중요하다는 연구결과가 보고된바 있다(Zhou 1999). 그리고 배지에 포함된 지방산 에스터(fatty acid esters)가 균주 세포막을 통한 물질 전달을 촉진시킴으로써 푸마르산 생산성을 향상시킨다는 연구 결과가 보고 되었다(미국특허 제4,564,594호). 균주의 형상 조절 측면에서, 라이조퍼스 속 균주의 경우 낮은 pH 조건에서 푸마르산 생산에 최적화된 형태인 펠릿(pellet) 형태로의 성장이 이루어진다는 사실이 확인된바 있으며(Zhou 2000), 라이조퍼스 속 균주가 쉽게 군락체를 이루는 특성에 기인하여 회전식 생물막 반응기(rotary biofilm contactor)를 이용하여 생산성을 향상시키는 연구가 진행되었다(Cao 1997). 공정의 측면에서는 고정화된(immobilized) 균주 및 유동상 반응기(fluidized-bed reactor)를 이용하여 푸마르산의 연속 생산을 추진하였으며(Buzzini 1995, Petruccioli 1996), 이온교환수지(ion-exchange resin)를 이용한 푸마르산의 분리/회수 공정에 대한 연구가 진행된바 있다(Cao 1996, Zhou 1999). 또한 균주의 성장 및 푸마르산 생산 과정에서 용존 산소를 서로 다른 수준으로 유지함으로써 생산성을 향상시킬 수 있다는 연구결과가 보고된바 있다(미국특허 제4,877,731호).

상기한 바와 같이 지금까지 진행된 대부분의 연구들이 공정 최적화의 관점에서 푸마르산 생산성 향상을 추진하고 있으나, 유전적 형질 전환을 통한 균주 자체의 특성 개량 및 생산성 향상에 대한 연구는 거의 진행된 바 없어 해당 분야에 대한 연구개발이 절실히 필요하다.

미국특허 제4,564,594호 미국특허 제4,877,731호

Sauer, M.; Porro, D.; Mattanovich, D. & Branduardi, P., Microbial production of organic acids: expanding the markets. Trends Biotechnol., 2008, 26, pp. 100-108 Engel, C. A. R.; Straathof, A. J. J.; Zijlmans, T. W.; van Gulik, W. M. & van der Wielen, L. A. M., Fumaric acid production by fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2008, 78, pp. 379-389 Rhodes, R. A.; Moyer, A. J.; Smith, M. L. & Kelley, S. E., Production of Fumaric Acid by Rhizopus arrhizus, Appl. Environ. Microbiol., 1959, 7, pp. 74-80 Rhodes, R. A.; Lagoda, A. A.; Misenheimer, T. J.; Smith, M. L.; Anderson, R. F. & Jackson, R. W., Production of Fumaric Acid in 20-Liter Fermentors, Appl. Environ. Microbiol., 1962, 10, pp. 9-15 Zhou, Y, Fumaric acid fermentation by Rhizopus oryzae in submerged systems. PhD thesis. Purdue University. West Lafayette, Indiana, USA, 1999 Zhou, Y.; Du, J. & Tsao, G., Mycelial pellet formation by Rhizopus oryzae ATCC 20344, Appl. Biochem. Biotechnol., 2000, pp. 84-86, 779-789 Cao, N. J.; Du, J. X.; Chen, C. S.; Gong, C. S.; Tsao, G. T., Production of fumaric acid by immobilized Rhizopus using rotary biofilm contactor, Appl. Biochem. Biotechnol., 1997, 63, pp. 387-394. Buzzini, P.; Gobbetti, M.; Rossi, J.; Ribaldi, M., Comparison in different unconventional supports for the immobilization of Rhizopus arrhizus cells to produce fumaric acid on grape must. Ann. Microbiol. Enzymol., 1995, 43, pp. 53-60 Petruccioli, M.; Angiani, E. & Federici, F., Semi-continuous fumaric acid production by Rhizopus arrhizus immobilized in polyurethane sponge, Process Biochemistry, 1996, 31, pp. 463-469 Cao, N.; Du, J.; Gong, C. S. & Tsao, G. T., Simultaneous production and recovery of fumaric acid from immobilized Rhizopus oryzae with a rotary biofilm contactor and an adsorption column., Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62, pp. 2926-2931

따라서 본 발명은 균주의 돌연변이를 유도 후 고생산성 균주 선별함으로써 균주 자체의 특성 개량을 통한 푸마르산 고생산성 변이 균주를 제조하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한 본 발명은 푸마르산을 고효율로 제조할 수 있는 변이 균주를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 푸마르산 고생산성 변이 균주를 이용하여 푸마르산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 i) 균주의 돌연변이를 유도하는 단계;

ⅱ) 트리톤 X-100 및 브로모크레졸 퍼플이 포함된 선별배지에서 상기 돌연변이 유도된 균주를 배양하여 푸마르산 생산 균주를 확인하는 단계; 및

ⅲ) 상기 푸마르산 생산이 확인된 균주를 배양하고 푸마르산 생산성을 확인하여 고생산성 균주를 선별하는 단계를 포함하는 푸마르산 고생산성 변이 균주의 제조 방법을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 푸마르산을 고효율로 생산하는 변이 균주인 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) KACC93095P를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 i) 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) KACC93095P를 배양하는 단계; 및 ⅱ) 상기 배양액으로부터 푸마르산을 수득하는 단계를 포함하는 푸마르산의 생산 방법을 제공한다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

i) 균주의 돌연변이를 유도하는 단계;

ⅲ) 상기 푸마르산 생산이 확인된 균주를 배양하고 푸마르산 생산성을 확인하여 고생산성 균주를 선별하는 단계를 포함하는 푸마르산 고생산성 변이 균주의 제조 방법이 제공된다.

본 발명에서 상기 균주는 푸마르산 생산 능력이 있는 균주가 사용될 수 있고, 바람직하게는 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae)이다.

본 발명에서 상기 (i) 단계의 돌연변이 유도는 물리적, 화학적 돌연변이 유도 등과 같이 당 분야에 알려진 방법이 특별한 제한 없이 사용될 수 있다. 물리적 돌연변이 유도는, 예를 들면 자외선(UV) 또는 감마선(γ-ray) 조사를 통하여 돌연변이를 유도할 수 있다. 화학적 돌연변이 유도는, 예를 들면 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 처리함으로써 수행된다. NTG는 유전자 염기서열의 GC 염기쌍을 AT 염기쌍으로 변화시키는 물질로서 낮은 치사율을 보이는 반면에 염기서열 내에 높은 돌연변이율을 유도할 수 있다.

본 발명에서 상기 (ⅱ) 단계의 트리톤(Triton) X-100 및 브로모크레졸 퍼플(Bromocresol Purple)이 포함된 선별배지는 돌연변이 유도된 균주 중 푸마르산을 생산하는 균주를 쉽고 빠르게 선별할 수 있도록 해준다.

본 발명에서 트리톤 X-100은 기저층 균사(substrate mycelium)가 넓게 퍼지는 것을 억제하여 플레이트(plate)에 10 내지 15개의 콜로니가 형성시 균주끼리 서로 오염되는 것을 방지하는 역할을 한다. 본 발명에서 트리톤 X-100은 선별배지에 바람직하게는 0.05 내지 0.2 중량%, 가장 바람직하게는 0.1 중량%가 포함된다.

본 발명에서 브로모크레졸 퍼플은 pH 지시제(pH indicator)로 유기산인 푸마르산의 생산시 pH 값이 낮아지는 것을 색상 변화를 통하여 시각적으로 확인하는 것이 가능하도록 해주고, 이를 통해 다수의 돌연변이 균주로부터 푸마르산 생산이 가능한 균주를 쉽고 빠르게 선별할 수 있다. 또한 색상변화와 함께 나타나는 색상환(halo)의 크기로부터 푸마르산 생산량의 예측 및 고생산성 균주의 선별이 가능하다.

본 발명에서 상기 (ⅲ) 단계는 상기 (ⅱ) 단계에서 푸마르산 생산이 확인된 균주를 배양하여 생산된 푸마르산의 정량적 분석을 통하여 이루어지고, 푸마르산의 정량적 분석은 당 분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며 이에 대한 특별한 제한은 없다. 푸마르산의 정량적 분석은, 예를 들면 HPLC(high-performance liquid chromatography)를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서는 상기 (i) 내지 (ⅲ) 단계를 수회에 걸쳐 반복 적용을 함으로써 생산성이 더욱 향상된 균주를 확보하는 것도 가능하다.

본 발명의 다른 측면에 따르면 푸마르산을 고효율로 생산하는 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) 변이 균주가 제공된다.

본 발명자들은 라이조퍼스 오리재의 돌연변이 유도 후 트리톤 X-100 및 브로모크레졸 퍼플이 포함된 선별배지에서 상기 돌연변이 유도된 균주를 배양하여 푸마르산 생산 균주를 확인한 다음 이들을 배양하여 푸마르산 생산성을 확인함으로써 푸마르산 고생산성 균주를 선별하였으며, 이를 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) RUR709로 명명하였다. 상기 균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2010년 6월 7일자로 수탁번호 KACC93095P를 부여받았다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면 i) 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) KACC93095P를 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양액으로부터 푸마르산을 수득하는 단계를 포함하는 푸마르산의 생산 방법이 제공된다. 본 발명에서 배양 배지나 배양 방법은 그 필요에 따라 적절히 선택될 수 있고, 바람직하게는 배양 배지가 포도당, NZ-amine A, 질산칼륨, 탄산칼슘, 인산칼륨(dibasic, K₂HPO₄), 황산마그네슘 및 황산아연을 포함한다. 본 발명에서 배양 배지는 바람직하게는 포도당 7 내지 8 중량%, NZ-amine A 0.07 내지 0.13 중량%, 질산칼륨 0.07 내지 0.15 중량%, 탄산칼슘 2 내지 3 중량%, 인산칼륨(dibasic, K₂HPO₄) 0.07 내지 0.13 중량%, 황산마그네슘 0.02 내지 0.08 중량% 및 황산아연 0.001 내지 0.004 중량%, 가장 바람직하게는 포도당 7.5 중량%, NZ-amine A 0.1 중량%, 질산칼륨 0.11 중량%, 탄산칼슘 2.56 중량%, 인산칼륨(dibasic, K₂HPO₄) 0.1 중량%, 황산마그네슘 0.05 중량% 및 황산아연 0.002 중량%를 포함한다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 푸마르산 고생산성 변이 균주는 고효율로 푸마르산의 생산이 가능하고, 특히 최적화된 배양 조건에서는 더 효율적으로 고농도의 푸마르산을 생산할 수 있다.

도 1은 0.005%(A), 0.01%(B) 및 0.05%(C) 브로모크레졸 퍼플이 포함된 플레이트에서 유기산에 의해서 형성된 색상환 사진이다.
도 2는 0.05%, 0.1%, 그리고 0.2% 트리톤 X-100이 포함된 플레이트에서 형성된 콜로니 사진이다.
도 3은 선별배지에서 모균주(왼쪽)와 변이 균주(오른쪽)가 형성한 색상환 비교 사진이다.
도 4는 선별된 변이균주들의 푸마르산 생산성 그래프이다.
도 5는 반응표면의 중심합성설계(CCD) 실험에 의해 최적화된 2차원 등고선을 도시한 그래프이다.
도 6은 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) RUR709 균주의 플라스크(●■)와 교반식 반응기(○□) 배양에서 푸마르산 생산성 그래프이다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 다만 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시되는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실험방법

(1) 균주 및 보관

라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) KCTC 6946을 모균주로 사용하였으며, 균주보관은 포자 형성배지인 YMS(yeast extract-malt extract-salt) agar 배지(2 중량% YM broth, 0.5 중량% 염화나트륨, 0.2 중량% 황산마그네슘)가 포함된 플라스크(flask)에 접종하여 7일 동안 30℃에서 배양한 후 4℃에서 보관하였다.

(2) 배지 및 배양 조건

사용된 배지는 배양 목적에 따라 포자 형성배지(YMS agar), 액상 종균배지(2% 맥아 추출물(malt extract)), 액상 생산배지(포도당 10 g/ℓ, 옥수수 농침액(corn steep liquor) 5 ㎖/ℓ, 인산칼륨(dibasic, K₂HPO₄) 1.0 g/ℓ, 황산마그네슘 0.5 g/ℓ, 황산아연 0.02 g/ℓ, 탄산칼슘 20.0 g/ℓ, pH 6.5)로 구분하였으며, 습식 멸균시 침전과 갈변현상을 방지하기 위해 배지의 당과 무기염류는 농축용액으로 만들어 멸균한 뒤 무균상태에서 나머지 배지 용액과 혼합하여 사용하였다. 플라스크를 이용한 생산 배양시 성장 배양은 포자 형성 배지인 YMS agar에 균을 접종 후 30℃에서 7일간 배양하여 형성된 포자를 종균으로 사용하였으며 이 포자를 0.2% 트윈(Tween) 80이 포함된 증류수로 회수하여 80 ㎖의 성장배지가 들어있는 250 ㎖ 플라스크에 20%(v/v)의 부피로 접종하였다. 그리고 이를 30℃ 진탕 배양기에서 12시간 배양하였다. 생산 배양은 성장배양에서 얻은 균사체를 100 ㎖의 생산배지가 들어있는 250 ㎖ 플라스크에 4%(v/v)의 부피로 접종하여 35℃에서 4일간 배양하였다. 5 ℓ 교반식 반응기에서 푸마르산 생산은 성장배양에서 얻은 균사체를 3.0 ℓ의 최적 생산배지가 들어있는 반응기에 4%(v/v)의 부피로 접종하여 온도 35℃, 교반속도 400 rpm 및 통기량 1.0 vvm으로 4 내지 5일간 운전하였다.

(3) 푸마르산의 분석 방법

배양액의 푸마르산을 측정하기 위해 진탕 배양된 혼합물에 푸마르산의 용해도를 향상시키고 여분의 탄산칼슘을 녹이기 위하여 1N 염산 50 ㎖와 증류수 50 ㎖를 가하고 80℃ 오븐에서 6시간 열처리 한 후 GF/C 필터에 여과시켜 이물질이 제거된 상등액 1 ㎖을 0.2 ㎛의 마이크로필터에 통과시킨 후 이를 HPLC 정량분석시료로 이용하였다. HPLC를 이용한 푸마르산의 분석 조건은 다음과 같다:

컬럼(column): Aminex HPX-87H (300 × 7.8 ㎜, BioRad)

이동상(mobile phase): 0.006N H₂SO₄

오븐 온도: 45℃

검출기: HP 1047 RI detector

이동상 속도: 0.6 ㎖/min

시료 분석량: 20 ㎕

실시예

(1) 돌연변이의 유도

(i) 자외선(UV) 돌연변이 유도

자외선을 이용한 돌연변이를 유도하기 위하여 포자형성 배지인 YMS agar 배지에서 자란 포자를 0.2% 트윈(Tween) 80이 포함된 증류수로 수거한 후 여과를 통해 잔여물을 제거하고 순수 포자 현탁액을 준비하였다. 수거한 포자를 멸균수로 희석한 후 0.1 ㎖을 선별배지 플레이트에 도말하여 자외선을 5분간 처리하였다.

(ii) 감마선(γ-ray) 돌연변이 유도

감마선을 통한 돌연변이를 유도하기 위하여 포자형성 배지인 YMS agar 배지에서 자란 포자를 0.2% 트윈(Tween) 80이 포함된 증류수로 수거한 후 여과를 통해 잔여물이 제거된 순수 포자 현탁액을 준비하였다. 수거한 포자 현탁액을 ⁶⁰Co를 이용하여 감마선을 7.0 KGy로 처리하였다.

(2) 선별배지에서 균주의 선별

(i) 선별배지의 제조

유기산 생산 정도를 육안으로 쉽게 확인하기 위하여 지시약(dye)인 브로모크레졸 퍼플을 사용하였다. 유기산인 1% 푸마르산, 1% 말릭산 및 1% 숙신산을 종이디스크(8 ㎜)에 50 ㎕씩 침지시킨 후 브로모크레졸 퍼플이 첨가된 배지 플레이트에 올려놓았을 때 0.05 중량% 브로모크레졸 퍼플이 첨가된 플레이트에서 색상환(halo)이 형성되는 크기가 가장 좋았다(도 1). 또한 트리톤 X-100을 0.1 중량%로 사용하였을 때 적당한 크기의 콜로니를 얻을 수 있었다(도 2). 상기 결과에 따라 최종적으로 제조된 선별배지의 조성은 2 중량%의 YM broth, 0.1 중량%의 트리톤 X-100, 0.05 중량%의 브로모크레졸 퍼플 및 1.7 중량%의 agar이였다.

(ii) 균주의 선별

상기한 방법에 따라 자외선 처리된 선별배지 플레이트를 30℃ 배양기에서 3일간 배양한 후 큰 색상환을 나타내는 균주를 선별하였으며, 상기 방법에 따라 감마선 처리된 포자 현탁액을 한 개의 플레이트 당 콜로니가 10개 정도 자라도록 멸균수로 희석한 후 0.1 ㎖을 선별배지에 도말한 다음 30℃ 배양기에서 3일간 배양하여 큰 색상환을 나타내는 푸마르산 고생산성 변이 균주를 선별할 수 있었다(도 3).

(3) 돌연변이 균주의 액상 생산배양을 통한 고생산성 균주의 선별

상기에서 분리한 균주들의 푸마르산 생산성을 액상 생산배양을 통하여 확인하였다. 실험 결과 5개의 변이균주의 경우 총 푸마르산의 생산 평균은 약 18.0 g/ℓ로 모균주와 생산성이 유사한 돌연변이 균주들도 다수 존재한 반면, 8개의 변이 균주는 푸마르산의 생산성이 향상된 약 19.3 내지 20.8 g/ℓ로 나타났다(도 4). #12 변이 균주의 경우는 모균주에 비해 생산성이 약 1.4배 높아 이를 고생산성 푸마르산 생산 균주로 선별할 수 있었다. 상기 푸마르산 고생산성 균주를 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) RUR709로 명명한 다음 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2010년 6월 7일자로 수탁번호 KACC93095P를 부여받았다.

(4) 푸마르산 생산의 최적화

(i) 통계학적 분석방법(statistical analysis method)을 통한 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) RUR709의 최적 생산 조건 확립

푸마르산 생산을 위해 통계학적 분석방법을 통해 설계한 배지는 실험설계(표 1)에 따라 제조되었다. 통계학적 실험설계(statistical experimental designs)를 이용하여 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) RUR709의 푸마르산 생산의 최적조건을 확립하기 위하여, 실험설계는 28개 세트로 구성된 분류변수 설계를 실시하였고, 푸마르산 생산에 영향을 주는 가장 중요한 요소를 결정하는데 사용되었다. 각 변수는 다음의 식 1에 따라 할당되었다.

xi = (x_i-x₀)/△x_i (1)

상기 식에서, xi는 독립변수의 코드화된 값(coded value), x_i는 독립변수의 실제치(real value), x₀는 중앙점(center point)에서 독립변수의 실제치이며, △x_i는 단계별 변화치(step change value)를 나타낸다. 본 발명에서 조사되는 변수들의 범위와 수치는 표 1에 나타내었다. 실험데이터의 실험적 적합성은 분산분석(analysis of variance)을 통하여 산출된 다항식 회귀(polynomial regression)에 따랐다.

2차 다항식 모델(empirical second-order polynomial model)을 적합화하기 위해, 5개의 코드화 수준을 가진 중심합성설계(central composite design, CCD)를 실시하였으며, 통계적 실험설계의 거동은 다음과 같은 2차 다항식(식 2)으로 설명할 수 있다.

y = β₀ + ∑β_ix_i + ∑β_iix_i ² + ∑β_ijx_ix_j (2)

단, y는 반응 변수이고, β는 회귀변수(regression coefficient), x는 독립변수의 코드화 수준(coded level)이다. 얻어진 실험값의 통계학적 분석을 위해 SAS 9.1.3 package를 사용하였다. 2차 다항식의 통계적 유의성은 F-값에 따라 결정하였으며, 상기 식에 따라 설명된 편차는 복합결정계수(multiple coefficient of determination), R²에 따라 제공되었다.

푸마르산 생산에 중요한 인자인 포도당, NZ-amine A, 질산칼륨 및 탄산칼슘을 선별하고, 각각 독립변수들의 최적 조건을 결정하기 위해 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 도입하였다. 나머지 변수는 인산칼륨(dibasic, K₂HPO₄) 1.0 g/ℓ, 황산마그네슘 0.5 g/ℓ, 황산아연 0.02 g/ℓ에 배치하였다. 실험은 중앙값에 8개의 star point(star point, α=±2)와 중앙값(center point)의 4회 반복(four replicates)을 포함하는 2⁴ full factorial design experiment를 이용하여 4개의 독립변수로 설계된 28가지 배양조합으로 수행하였다(표 2).

4변수, 5수준의 중심합성설계(CCD)로 실험한 결과를 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램을 이용하여 분석한 결과를 표 3에 나타내었다. 분산분석으로부터 모델식의 F-값은 7.03이며 P-값은 0.0006으로서 통계학적으로 유의한 범위에 있음을 알 수 있었으며, 변동계수(coefficient of variation, CV)의 값은 16.83으로 실험의 정확성과 신뢰도가 높았다. 또한 결정계수인 R ²은 0.88로 실제 값과 모델이 예상한 값이 거의 일치하다는 것을 알 수 있었고, 신뢰구간이 98% (P-값 < 0.02) 이상 되는 변수로는 x₂ (NZ-amine A)와 x₄ (CaCO3) 변수가 각각 0.0022와 0.001로 가장 작은 값을 나타내었으므로, 다른 2개의 변수보다도 푸마르산 생산에 더욱 더 많은 영향을 미쳤다. 반응 방정식은 푸마르산 생산 실험의 반응면에 적합한 모델을 제공하였으며, 다음의 식 3과 같다.

y = 24.85 + 1.479 x₁ + 2.249 x₂ + 0.288 x₃ - 3.554 x₄ - 0.893 x₁x₁

- 4.105 x₂x₂ - 0.18 x₃x₃ - 1.805 x₄x₄ + 0.569 x₁x₂ + 0.256 x₁x₃

+ 0.019 x₁x₄ - 0.006 x₂x₃ + 1.256 x₂x₄ + 0.244 x₃x₄ (3)

상기 식에서, y는 푸마르산의 생산 농도, x₁은 코드화된 포도당의 값, x₂는 코드화된 NZ-amine A의 값, x₃은 코드화된 질산칼륨의 값, 그리고 x₄는 코드화된 탄산칼슘의 값을 나타낸다.

도 5(a~f)는 반응표면의 중앙 합성 설계 실험에 의해 최적화된 2차원 등고선 그래프이다. 2차원 등고선 그래프는 반응표면 회귀식에서 4개의 독립변수 중 2개 변수는 코드화된 값을 zero(0)로 놓고 나머지 2개 변수를 이용하여 도식화하였다. 푸마르산 생산을 위해 얻어진 포도당(x₁), NZ-amine A(x₂), 질산칼륨(x₃), CaCO₃(x₄)의 최적값은 각각 0.469, 0.113, 0.163, -0.440였다. 상기 결과들에 따라 7.47 중량% 포도당, 0.105 중량% NZ-amine A, 0.107 중량% 질산칼륨 및 2.56 중량% 탄산칼슘이 푸마르산 생산을 위한 최적값으로 최적화되었다. 통계학적 모델에 의하여 예측되는 푸마르산의 최대 생산량은 27.4 g/ℓ였다. 결론적으로 7.47 중량% 포도당, 0.105 중량% NZ-amine A, 0.107 중량% 질산칼륨, 2.56 중량% 탄산칼슘, 0.1 중량% 인산칼륨(dibasic, K₂HPO₄), 0.05 중량% 황산마그네슘 및 0.002 중량% 황산아연이 푸마르산을 대량생산하기 위한 최적조건임을 확인하였다.

(ii) 교반식 반응기에서 생산

상기 통계학적 실험 설계에 따라 설정된 푸마르산 최적 생산조건을 증명하기 위해, 상기 최적 조건인 7.5 중량% 포도당, 0.1 중량% NZ-amine A, 0.11 중량% 질산칼륨, 2.56 중량% 탄산칼슘, 0.1 중량% 인산칼륨 (dibasic, K₂HPO₄), 0.05 중량% 황산마그네슘 및 0.002 중량% 황산아연의 배지 조건하에서 푸마르산을 생산하였다. 플라스크 배양에서는 최적 조건에서 발효 4일에 얻어진 푸마르산 농도는 26.2 g/ℓ로서 모균주인 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) KCTC 6946로부터 얻어진 푸마르산 농도보다 54% 증가되었다. 또한, 최적화된 배지를 이용한 교반식 반응기에서 푸마르산을 생산한 결과 발효 4일에 30.2 g/ℓ로서 모균주로부터 얻어진 푸마르산 농도보다 1.8배 증가되었다(도 6).

농업생명공학연구원

KACC93095

20100607

Claims

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i) 라이조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae) KACC93095P를 포도당, NZ-amine A, 질산칼륨, 탄산칼슘, 인산칼륨(dibasic, K₂HPO₄), 황산마그네슘 및 황산아연을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
ⅱ) 상기 배양액으로부터 푸마르산을 수득하는 단계를 포함하는 푸마르산의 생산 방법.
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제6항에 있어서, 상기 배지가 포도당 7 내지 8 중량%, NZ-amine A 0.07 내지 0.13 중량%, 질산칼륨 0.07 내지 0.15 중량%, 탄산칼슘 2 내지 3 중량%, 인산칼륨(dibasic, K₂HPO₄) 0.07 내지 0.13 중량%, 황산마그네슘 0.02 내지 0.08 중량% 및 황산아연 0.001 내지 0.004 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 푸마르산의 생산 방법.