JP6577666B2 - 新規なカンジダ・インファンティコーラ菌株、その変異菌株及び形質転換菌株、及びそれを用いてジオイック酸類を生産する方法 - Google Patents
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Description
また、前記段階(B)の反応は、0.5〜5%の炭素源で10〜30時間進行しうる。
また、前記段階(C)の培養は、0.1〜2ml/L/hの基質及び1〜3g/L/hのグルコースで50〜100時間進行しうる。
本発明に使われた用語「遮断」とは、「阻害」と混用され、ある経路または反応などを防ぐことを意味する。
また、「炭化水素」は、炭素と水素のみでなされている有機化合物を称する。
また、「脂肪酸」は、鎖状の飽和または不飽和モノカルボン酸を称する。
前記カンジダ・インファンティコーラ菌株は、野生型菌株、突然変異菌株、形質転換菌株、及びこれらの組合わせから選択されたものを含みうる。
高濃度の多様な炭素源が含まれた石油化学工場の廃水を処理するために、オイルセパレータ(CPI、Coagulated Plate Interceptor)で一次的に処理を進行した後、均等槽、曝気槽、沈殿槽などを経ながら廃水処理を進行する石油化学工程の廃水処理施設のオイルセパレータ(CPI)、曝気槽、沈殿槽から試料を採取した。
前記実施例1から分離した分離菌株に対して18s rRNA塩基配列分析法で分析した。Yeast gDNA prep kit(PureHelix TM、NANOHELIX)を用いて、前記実施例1の分離菌株のゲノム(genomic)DNAを抽出し、前記抽出したgenomic DNAを鋳型として下記表2の18s ITS 1/4 primerを利用したPCR反応で増幅させた後、TAベクタークローニングさせた後、DNAシーケンシング反応を通じて18s rRNA塩基配列を得て、前記塩基配列は、配列番号1として図4に示した。
下記表3に示すように、前記分離菌株は、カンジダ・インファンティコーラCBS11940と高い相同性を有する近縁種であることを確認することができる。
前記菌株(カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)の炭素源資化能を調べるために、API 20c AUX(Biomerieux社)を使用して分析した。API 20c AUX(Biomerieux社)を用いて分析した実験結果は、従来のカンジダ・インファンティコーラkurtzman及びカンジダ・インファンティコーラsp.と比較分析し、その結果を下記表4に示した。
カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)の最適成長pHを調べるために、前記菌株をアミノ酸が含まれていないYNB(yeast nitrogen base(without amino acid))培地の初期pHを4〜7に多様に設定して培養した。前記実験結果は、図5に示した。
図5に示すように、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(KCTK 12820BP)の最適生長pHは、pH7であることを確認することができる。
カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)のアルカン(C12)基質培養でのアルカン(C12)消耗速度及び生産される菌体量に対して調べるために、下記表5に示されたように、20g/Lのドデカンを唯一の炭素源として含む酵母エキス培地に実施例1のカンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)及び比較標準菌株カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis;ATCC 20336)を培養した。前記実験結果は、図6に示した。
カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)及び前記菌株と同じ種に属し遺伝子操作されていない野生型菌株カンジダ・トロピカリス(Candida trpoicalis;ATCC 20336)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)及びピチア・カリビカ(Pichia caribbica)によるドデカンのDDDA(dodecanedioic acid)転換のための初期細胞集団(cell mass)を得るために、50g/Lのグルコースを含むラウリン酸メチル(methyl laurate)基質を使用した酵母エキス(yeast extract)培地に実施例1のカンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)を30℃、1v/v/m通気量、溶存酸素量(dissolved oxygen:DO)30%の撹拌速度(DO値によって100〜900rpm)及びpH5に24〜48時間培養した後、1%ドデカンを用いてpH7で12〜20時間ω酸化(ω-oxidation)誘導を進行した後、ラウリン酸メチル0.5〜1.0ml/L/h及びグルコース2g/L/hで入れ、96時間培養して、pH7〜pH8でDDDA転換を進行した。前記実験結果は、図7、図8及び下記表6に示した。
野生型カンジダ・インファンティコーラ(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)菌株の場合、ドデカン(dodecane)を単一炭素源として用いて生長が可能であるが、β酸化(β-oxidation)経路が遮断された突然変異菌株の場合、ドデカンを単一炭素源として用いて実質的に生長することができない。前記実質的に生長することができないということは、成長しないか、微弱に成長することを意味する。したがって、グルコース(glucose)またはドデカン(dodecane)を単一炭素源として含む固体培地での菌株生長性を比較して突然変異菌株を選別した。
カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株(受託番号:KCTC13099BP)によるラウリン酸メチル(methyl laurate)のドデカンジオイック酸(DDDA、dodecanedioic acid)転換のための初期細胞集団(cell mass)を得るために、50g/Lのグルコース(glucose)を含むラウリン酸メチル(methyl laurate)基質を使用した酵母エキス(yeast extract)培地にカンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株(Candida infanticola LC−DA01;受託番号:KCTC13099BP)を30℃、1v/v/m通気量、溶存酸素量(dissolved oxygen: DO)30%の撹拌速度(DO値によって100〜900rpm)及びpH5で24〜48時間培養した。培養中、12〜24時間に50g/Lのグルコースをいずれも消耗した後、1〜4g/L/hでグルコースを投入して培養終了まで進行した。
カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株(KCTC13099BP)によるドデカン(dodecane)とデカン(decane)とのジオイック酸(dioic acid)転換のための初期細胞集団(cell mass)を得るために、50g/Lのグルコース(glucose)を含むラウリン酸メチル(methyl laurate)基質を使用した酵母エキス(yeast extract)培地にカンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株(Candida infanticola LC−DA01;受託番号:KCTC13099BP)を30℃、1v/v/m通気量、溶存酸素量(dissolved oxygen: DO)30%の撹拌速度(DO値によって100〜900rpm)及びpH5で24〜48時間培養する。培養中、12〜24時間に50g/Lのグルコースをいずれも消耗した後、1〜4g/L/hでグルコースを投入して培養終了まで進行した。
形質転換菌株を獲得するために、外来遺伝子導入のための形質転換方法として酵母で主に使われるポリエチレングリコール(PEG)及び酢酸リチウムを利用した熱処理(heatshock)方法を利用した。YPED固体培地で30℃、20〜24時間培養した後、カンジダ・インファンティコーラ(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)2x106個の菌体を取って、50%ポリエチレングリコールと酢酸リチウムとを混ぜたバッファに懸濁させた後、30℃で45分反応、42℃で15分反応させ、上澄み液を除去した後、YPED培地に懸濁して30℃で6時間振盪培養後、抗生剤が含まれたYEPD培地に塗抹して、30℃に3日間培養した。形質転換効率を高めるために、熱処理(heatshock)過程でジチオトレイトール(DTT)及びジメチルスルホキシド(DMSO)のような化学物質を添加して、効率が最も高い方法を比較した結果、DMSOを処理した熱処理方法が最も効率が高いということを確認し、結果は、図14に示した。
DNA複製時に染色粉体を用いるS期、G2期で相同組替えが主に発生することができるので、相同組替えの確率を増加させるために、水酸化尿素(hydroxyurea)を用いて細胞周期を調節した。YEPD培地で生長中である107/20mlのカンジダ・インファンティコーラ(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)菌体に0.2Mの水酸化尿素処理後、2時間反応時に、S期の細胞が最も多く観察されることを確認し、結果は、図15に示した。
S期で細胞周期が停滞したカンジダ・インファンティコーラ(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)菌体を用いて、前記熱処理及び水酸化尿素処理方法で形質転換をさせた結果、URA3 gene位置に外来遺伝子が置き換えられたウラシル栄養要求体菌株(受託番号:KCTC13103BP)を獲得した。
β酸化の最初の段階である脂肪酸アシル−CoA(fatty acyl-CoA)から2trans-enoyl-CoAに転換する酵素であるacyl-CoA oxidase(pox gene)を除去するために、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)20336のPOX4、POX5、POX2遺伝子のアミノ酸配列を比較した結果、2つの遺伝子CINF_04670、CINF_13455の相同性が40%以上と最も高く出て、この遺伝子をCiPOX1、CiPOX2と名付け、下記表9にアミノ酸配列を比較して示した。また、CINF_04670に対して核酸配列は、配列番号4に、アミノ酸配列は、配列番号5に示した。また、CINF_13455に対して核酸配列は、配列番号6に、アミノ酸配列は、配列番号7に示した。
TAGTGTCATGAAGCCTTTCTTCACCCGCAAGTTCAACGACGACCCTGATCTCAGTGCTCTTGAGGAAGAGGAGGCCGAGGAGAACGAGTAA
配列番号5(アミノ酸)
MTKSLSTNPANDVVIDGKKYNTFTEPPKAMAAERAKASFPVREMTYYLDGGEKVTEYNEAVWEQLERAPAFDNTDYYDVCGDHELLRARTLAKVGAIAEIVTDGRSERDIQKVLSFVSVIDPGAMTRIGVHFGLFLNGVRGSGTSEQFNYWVGEGAANLSNFFGCFCMTELGHGSNVAGVETTATFDRNTEEFVINTPTIAASKWWIGGAAHTATHGLVFARLIVDGKDYGVKNFVVPLRDRNTWNLMPGVSIGDIGKKMGRDGIDNGWVQFSNVRIPRLFMMMKYAKVSKDGKVTQPPLAQLAYGALISGRVSMVYDSYTWARRFLTIAIRYACCRRQFSSSPGGLETKLIDYTFHQRRLLPRLAYAYAMNAGSAELYKIYFAATDRLASTKPTDKEGLQSAIDDVKELFSVSAGLKAFSTWGTAQIIDECRQACGGLGYSGYNGFGQGYNDWVVQCTWEGDNNVLTLSAGRSLIQSGLAIRKGEHVGAAASYLKRELNAKLNGRSLEDLNVLIDGWEHVSAVGISQAVDRYVELEKEGVSQTEAFERLSQQRYDVTRVHTRMYLIKSFFENLKTASPALQPVLTDLALLFALWSIEIDASVFLRYGFLEPKDISTITVLVNKYTGKVREQAIPLTDAFNQSDFVINAPIGNYNGDVYNNYFAKTKAANPPINTHPPYYDSVMKPFFTRKFNDDPDLSALEEEEAEENE
CGCATTCTTCAAGCGCACTCCCTATGAGCAACCCAGGCTCGATGAGATTTAA
配列番号7(アミノ酸)
MKANNTASLLKDGKELNTFTRPASDMQAERDRTSFPVREMTHFFNNGKENTEFLEKLFERIQRDPAFNNKDFYDLDYKPLRQRTFEQIGRMWSYLDELGADSPLARRFLSPFGMINPSAQTRVSVHYGLFVSALRGQGTDKQYEFWKSQGCLSLNRFYGCFGMTELGHGSNVAELETTATFDRATDEFIIHTPNTAATKWWIGGAAHSSNHTVCFARLIVDGKDYGVRNFVVPLRDPESHNLLPGIAVGDIGKKMGRDGIDNGWIQFSNVRIPRTYMLMRYSQVTPEGKVIEPPLAQLTYGALINGRVAMAYDSWVWARRFLTIALRYAAVRRQFSSTEGREESKLLDYVLHQRRLIPLLAQAIGIEAAATELYRLFDEVTHHQASLDTSDRKAVSDMVDKTKELFSLSAGLKAFSTWATVDTIDECRQACGGLGYLSATGFGQGFDDWVVNCTWEGDNNVLCLSAGRSLIQSGCKVLDGKHVTGAADYLGRIKTLRGKSLASGDLRDPKVLVGAWESVAAQAVMDAAEAYKKLRARGVSDKAAFEELSIDRFNIARLHTRCFQIKALFRKIANANPSIQKVLTNVGLLFALWSIEKNGSPFLQYGFLTSDDMNKVIDLVTFYCGEVRDQVIGITDSFNISDFFLNSPIGNYDGNAYENLMDSVTERNVPGTPCPYQDAMNAFFKRTPYEQPRLDEI
CiPOX1遺伝子の両末端500bpの相同領域(homology region)を含んだURA3 pop-outベクターを用いてCiPOX1遺伝子除去カセットを製作した後、S期で調節されたウラシル栄養要求体菌株(受託番号:KCTC13103BP)に形質転換を通じてCiPOX1遺伝子除去カセットを導入した。URA3 pop-outベクターは、ウラシル除去培地で生存できるようにCandida tropicalisのURA3(Ct.URA3)遺伝子と、Ct.URA3遺伝子の除去(pop-out)のためのCt.URA3遺伝子の両末端のbacillus subtilis由来の反復配列(repeated sequence)が含まれており、形質転換された菌株は、Ct.URA3遺伝子によって表10のウラシル除去培地で選別可能である。配列番号8は、Candida tropicalisのURA3(Ct.URA3)配列、配列番号9は、bacillus subtilis由来の反復配列(repeated sequence)を示し、ベクターとカセット模式図及びgDNA PCRを利用した配列確認結果を図17に示した(受託番号:KCTC13104BP)。
cgggacatggggggtagagaagaagggtttgattggatcatcatgacgcctggtgtggggttggatgataaaggcgatgcgttgggccagcagtataggactgttgatgaggtggttctgactggtaccgatgtgattattgtcgggagagggttgtttggaaaaggaagagaccctgaggtggagggaaagagatacagggatgctggatggaaggcatacttgaagagaactggtcagttagaataaatattgtaataaataggtctatatacatacactaagcttctaggacgtcattgtagtcttcgaagttgtctgctagtttagttctcatgatttcgaaaaccaataacgcaatggatgtagcagggatggtggttagtgcgttcctgacaaacccagagtacgccgcctcaaaccacgtcacattcgccctttgcttcatccgcatcacttgcttgaaggtatccacgtacgagttgtaatacaccttgaagaacggcttcgtctgacccttgagcttcgcctcgttgtaatgattatacacatccaacgcttccaacctcgataaatggatcttctgcacttttgaaatcgggtactggatcgcaagcaacgagaacgccgccgatgctccggcaagcaacacaaacgaggacttcaagatc
gtttaatactggttttcggagaagcgcctgtacctccgtcatagccgctgatcacaatgacatctgcagtcgctttggcaacacctgcagcgattgttcctacacctgcttttgacaccagctttacgctgattcttgcgtcacggttggcatttttcaaatcgtggatcagctgggctaaatcctcaatcgaataaatgtcatggtgtggcggaggtgagattaatccgacacctggcgttgacccacggacatcggcaacccatggatataccttgttgccaggaagctgcccgccttcacccggcttagcaccttgagccattttaatctgcagctcatcagcattgacgaggtaatggcttttgacaccaaaccgtccggatgcaatttgtttgatcgcacttcttctatcatcgccgttctcatctggaacaaagcgtttgggatcttctccgccttcaccgctgttgctttttcctccaagacggttcattgcgattgctaaagcttcgt
CiPOX2遺伝子の両末端500bpの相同領域(homology region)を含んだURA3 pop-outベクターを用いてCiPOX2遺伝子除去カセットを製作した後、S期で調節されたウラシル栄養要求体菌株(受託番号:KCTC13103BP)に形質転換を通じてCiPOX2遺伝子除去カセットを導入した。URA3 pop-outベクターは、ウラシル欠損培地で生存できるようにCandida tropicalisのURA3(Ct.URA3)遺伝子と、Ct.URA3遺伝子の除去(pop-out)のためのCt.URA3遺伝子の両末端のbacillus subtilis由来の反復配列(repeated sequence)が含まれており、形質転換された菌株は、Ct.URA3遺伝子によってウラシル除去培地で選別可能である。ベクターとカセット模式図及びgDNA PCRを利用した配列確認結果を図18に示した(受託番号:KCTC13105BP)。
CiPOX2遺伝子の両末端500bpの相同領域(homology region)を含んだURA3 pop-outベクターを用いてCiPOX2遺伝子除去カセットを製作した後、S期で調節されたCiPOX1及びCtURA3除去菌株に形質転換を通じてCiPOX2遺伝子除去カセットを導入した。CiPOX1及びCtURA3除去菌株は、CiPOX1除去菌株(受託番号:KCTC13104BP)からCt.URA3をpop-outしたものである。URA3 pop-outベクターは、ウラシル欠損培地で生存できるようにCandida tropicalisのURA3(Ct.URA3)遺伝子と、Ct.URA3遺伝子の除去(pop-out)のためのCt.URA3遺伝子の両末端のbacillus subtilis由来の反復配列(repeated sequence)が含まれている。形質転換された菌株は、Ct.URA3遺伝子によってウラシル除去培地で選別可能である。ベクターとカセット模式図及びgDNA PCRを利用した配列確認結果を図19に示した(受託番号:KCTC13106BP)。
本発明の形質転換菌株に対するジカルボン酸生産能を調べるために、それぞれの菌株を(野生型菌株(受託番号:KCTC12820BP)、POX1遺伝子除去菌株(受託番号:KCTC13104BP)、CiPOX2遺伝子除去菌株(受託番号:KCTC13105BP)、CiPOX1/CiPOX2遺伝子除去菌株(受託番号:KCTC13106BP))フラスコ培養施行した。500mlbaffledフラスコを用いて50ml液体培養を実施した。培養条件は、YPED培地利用、総培養時間72時間、30℃、200rpm、pHは、6〜7.5である。十分な量の菌体増殖確保のために、グルコースを炭素源として用いて24時間培養した後、ドデカン1%添加、pH7.5調節のために、リン酸カリウム(potassium phosphate)を添加した。ドデカンを添加した時点から6時間周期でグルコースを0.5%ずつ添加した。転換されたドデカンジオイック酸の濃度を確認した結果、72時間基準野生型菌株(受託番号:KCTC12820BP)0g/L、POX1遺伝子除去菌株(受託番号:KCTC13104BP)9.39g/L、POX1及びPOX2遺伝子除去菌株(受託番号:KCTC13106BP)9.32g/Lであって、CiPOX1が除去された菌株がドデカンを炭素源として使用せず、ドデカンジオイック酸に92%(mol/mol)以上転換されることを確認し、結果は、図20に示した。
本発明の形質転換菌株に対するジカルボン酸生産能を調べるために、CiPOX1及びCiPOX2遺伝子欠損菌株(受託番号:KCTC13106BP)を利用した5L規模の発酵器培養を実施した。1次培養条件は、培養体積2L、pH5〜pH6、温度30℃、aeration 1vvm、agitation 200rpmであり、pH調節のために、10N NaOHを使用し、培養液内の溶存酸素が減ることによって、rpmを調節して溶存酸素を30%以上保持させた。初期培地内の細胞生長のためのグルコースが消耗する時点である12時間以後にジオイック酸の転換のための2次培養のために、ω酸化誘導物質であるドデカン20ml添加、還元力提供のために、グルコースを4g/hrの速度で添加し、培養条件は、pH7.5、aeration 0.5vvmに変更した。2次培養12時間後に基質であるラウリン酸メチルを1.2〜1.5ml/hrの速度で投入して、総48時間培養した。転換されたドデカンジオイック酸は、48時間基準17.64g/L生産及び90%(mol/mol)以上の転換収率を確認し、結果は、図21に示した。
Claims (8)
- カンジダ・インファンティコーラ(Candida infanticola)菌株を用いて炭化水素または脂肪酸を含む基質からジオイック酸類(dioic acids)を生産する方法であって、
前記カンジダ・インファンティコーラ菌株が、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)、カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株(Candida infanticola LC−DA01;KCTC13099BP)、カンジダ・インファンティコーラ形質転換菌株(Candida infanticola;KCTC13103BP、KCTC13104BP、KCTC13105BP、KCTC13106BP)またはこれらの組合わせである、前記方法。 - 前記ジオイック酸類を生産する方法が、
(A)初期細胞集団を確保するための炭化水素または脂肪酸を含む基質を添加した酵母エキスグルコース培地(yeast extract glucose medium;YG medium)でカンジダ・インファンティコーラ菌株を培養する段階と、
(B)前記段階(A)の培養液に炭化水素、脂肪酸またはこれら誘導体を含む炭素源または基質を添加して、ω酸化(ω-oxidation)反応を誘導する段階と、
(C)前記段階(B)の反応液に炭化水素または脂肪酸を含む基質及びグルコースを添加しながら培養する段階と、
を含む請求項1に記載の方法。 - 前記段階(A)の培養が、30±5℃、溶存酸素量10%以上の条件で20〜50時間進行する、請求項2に記載の方法。
- 前記段階(B)の反応が、0.5〜5%の炭素源で10〜30時間進行する、請求項2に記載の方法。
- 前記段階(C)の培養が、0.1〜10ml/L/hの基質及び1〜3g/L/hのグルコースで50〜100時間進行する、請求項2に記載の方法。
- 前記ジオイック酸類が、エタンジオイック酸(ethanedioic acid)、プロパンジオイック酸(propanedioic acid)、ブタンジオイック酸(butanedioic acid)、ペンタンジオイック酸(pentanedioic acid)、ヘキサンジオイック酸(hexanedioic acid)、オクタンジオイック酸(octanedioic acid)、ノナンジオイック酸(nonanedioic acid)、デカンジオイック酸(decanedioic acid)、ウンデカンジオイック酸(undecanedioic acid)、ドデカンジオイック酸(dodecanedioic acid)、及びヘキサデカンジオイック酸(hexadecanedioic acid)からなる群から選択されるか、これらの組合わせである、請求項1に記載の方法。
- 炭化水素または脂肪酸を含む基質からジオイック酸類(dioic acids)を生産する、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)、カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株(Candida infanticola LC−DA01;KCTC13099BP)、カンジダ・インファンティコーラ形質転換菌株(Candida infanticola;KCTC13103BP、KCTC13104BP、KCTC13105BP、KCTC13106BP)またはこれらの組合わせ。
- カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株(Candida infanticola DS02;KCTC12820BP)に水酸化尿素(hydroxyurea)処理及び熱処理(heatshock)する段階と、
ウラシルを含む培地を使用してウラシル栄養要求体菌株を製作し、選別する段階と、
β酸化(β-oxidation)遺伝子を欠損させる段階と、
を含むカンジダ・インファンティコーラ(candida infanticola)形質転換菌株(Candida infanticola;KCTC13103BP、KCTC13104BP、KCTC13105BP、KCTC13106BP)またはこれらの組合わせの製造方法。
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