BRPI0710863A2 - gene codificando o fragmento geneticamente modificado curto da 6-fosfofruto-1-quinase, sem fosforilação da molécula de proteìna necessária para ativação,vetor de expressão, organismos, uso do referido gene bem como procedimento para a formação de bioprodutos - Google Patents

Abstract

GENE CODIFICANDO O FRAGMENTO GENETICAMENTE MODIFICADO CURTO DA 6~FOSFOFRUTO-1-QUINASE, SEM FOSFORILAçãO DA MOLéCULA DE PROTEìNA NECESSáRIA PARA ATIVAçãO, VETOR DE EXPRESSãO, ORGANISMOS, USO DO REFERIDO GENE BEM COMO PROCEDIMENTO PARA A FORMAçãO DE BIO-PRODUTOS. A presente invenção refere-se ao gene mX-pfkA cortado modificado codificando o fragmento mais curto da 6-fosfofruto-1-quinase (PFKI) sem necessidade de fosforilação da molécula de proteína para ativação, que não é significativamente inibida pelo ácido cítrico e/ou seus sais e moléculas de ATP. O fragmento de 49 a 52 KDa ativo codificado pelo gene mt-pfkA retém as propriedades regulatórias positivas da proteína natural e é ativado na presença de ativadores específicos, enquanto que ácido cítrico e ATP, importantes metabólitos que funcionam como inibidores da retroalimentação nos organismos superiores, não reduzem a sua atividade. A invenção lida com o uso do fragmento mais curto modificado em processos biotecnológicos para fabricar metabólitos primários e secundários.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENE CODI-FICANDO O FRAGMENTO GENETICAMENTE MODIFICADO CURTO DA6-FOSFOFRUTO-1 -QUINASE, SEM FOSFORILAÇÃO DA MOLÉCULA DEPROTEÍNA NECESSÁRIA PARA ATIVAÇÃO, VETOR DE EXPRESSÃO,ORGANISMOS, USO DO REFERIDO GENE BEM COMO PROCEDIMEN-TO PARA A FORMAÇÃO DE BIOPRODUTOS".

A presente invenção refere-se ao gene mt-pfkA cortado modificado codi-ficando a síntese de um fragmento mais curto ativo da 6-fosfofruto-1-quinase (PFK1)sem modificação pós-traducional necessária para induzir a atividade. O assunto dainvenção é o uso do gene cortado modificado e de seu produto de proteína para in-tensificar a taxa da síntese de biomassa celular e a excreção de enzimas extracelula-res, assim como aumentar a produtividade de metabólitos primários e secundários.A invenção está no campo da bioquímica e biotecnologia microbiana.

Nos processos biotecnológicos, um determinante crucial para opreço final do produto é a velocidade da formação de produto. Através daotimização dos processos, o objetivo fina! é alterar os microorganismos, as-sim como as condições de crescimento para conseguir quantidades maioresde substrato transformado no produto final por unidade de tempo.

Em microorganismos comerciais que são capazes de excretar produtosbiotecnológicos específicos com produtividade e rendimento aumentados, as reaçõesanapleróticas são de importância crucial. Tais reações levam a concentrações aumen-tadas de intermediários cíclicos tricarboxílicos (TCA), os quais são precursores parauma variedade de vias biossintéticas, uma vez que os ciclos de TCA representam aligação crucial entre as reações catabólicas e anabólicas nas células. Através da ele-vação dos intermediários do ciclo TCA devido às reações anapleróticas aumentadas,a síntese de blocos de construção celular chaves, tais como lipídeos, aminoácidos,porfirinas, etc. é intensificada, e conseqüentemente a taxa de síntese de metabólitosprimários e secundários de valor biotecnológico é aumentada.

Várias reações metabólicas específicas pertencem às reaçõesanapleróticas, entretanto o fluxo metabólico não-interrompido através da gli-cólise parece ser de maior importância. A enzima com o papel chave na re-gulação da glicólise é a 6-fosfofruto-1-quinase (PFK1). Em organismos euca-rióticos, a enzima é regulada pelo mecanismo de retroalimentação, por inibi-ção de ATP e citrato. Em outras palavras, sua atividade diminui quando onível de ácido cítrico, como um importante intermediário do ciclo TCA e ATP,como o produto final da fosforilação oxidativa, aumenta em um certo nível(Voet and Voet, 1995). De fato, a regulação negativa da atividade enzimáticadiminui a efetividade das reações anapleróticas e conseqüentemente reduza taxa de síntese dos produtos finais. Um aumento significativo na taxa deformação de produto poderia ser alcançado por ter um fluxo metabólico não-perturbado através da glicólise, o que poderia ser feito pela inserção de umaenzima PFK1 codificando um gene modificado que poderia ser resistente àinibição de citrato, porém sensível à ativação com efetores específicos.

No passado várias tentativas foram descritas como aumentandoo fluxo metabólico através da glicólise com o objetivo final de estimular asíntese dos produtos finais, entretanto, nenhum sucesso foi registrado. Paraintensificar a glicólise, esses genes codificando as enzimas reguladoras cha-ve aa via foram isolados do fungo Aspergillus niger incluindo o gene pfkAcodificando a 6-fosfofruto-1-quinase. Os genes foram reintroduzidos na cepade A. niger em um elevado número de cópias com o objetivo final de aumen-tar a concentração das enzimas chave e aumentar o fluxo de metabólitosatravés da glicólise. Entretanto, a análise detalhada dos transformantes nãoconfirmou os resultados esperados. Foi concluído que outros mecanismosregulatórios complexos compensaram a concentração aumentada das enzi-mas chave (Ruijter et al., 1996). Em outra tentativa de melhorar as proprie-dades da PFK1, células de Aspergiilus niger foram submetidas a mutaçõespara tornar a enzima resistente à inibição por citrato. Um mutante foi isoladoque apresentou inibição reduzida por citrato, entretanto a enzima reteve so-mente 20% de sua velocidade máxima quando o inibidor estava presente emuma concentração levemente aumentada de 10 mM. Uma resistência parci-almente aumentada para a inibição de citrato não teve efeito positivo na ele-vação da taxa de formação de produto (Schreferl et al., 1986). Em outra ten-tativa, a inibição reduzida por citrato de PFK1 foi obtida pela clivagem de 8resíduos de aminoácidos da parte C-terminal da enzima, isolada do músculode coelho. A enzima modificada somente perdeu a sua atividade quando 10mM de citrato estavam presentes no sistema, enquanto a enzima original foicompletamente inativada com 2,5 mM do inibidor (Valaitis et al., 1987).

A PFK1 isolada de células de Aspergillus niger apresentou maisresistência para a inibição do citrato em comparação com as enzimas deoutros organismos, ainda 10 mM de citrato quase preveniram a sua atividadecatalítica. A concentração fisiológica do ácido cítrico em células normais éem valores de mM, entretanto, em células de A. niger, a concentração decitrato pode alcançar até 10 mM (Legisa e Kidric, 1989). A enzima PFK1 iso-lada do fundo Aspergillus niger foi freqüentemente objeto de investigação noI passado (Habison et al., 1979; Habison et al., 1983; Schreferel et al. 1986;Arst et al., 1987), além disso, um gene codificando a PFK1 foi clonado e se-qüenciado. Pela análise do gene pfkA (número de acesso EMBL pfkAZ79690), pode ser concluído que a proteína tem uma massa molecular de 85KDa, enquanto que pelo estudo da cinética da enzima em uma proteína par-cialmente purificada, cujo peso molecular não foi determinado, confirmou oAMP, frutose-2,6-bisfosfato e íons amônio como efetores positivos (Habisonet al., 1983). Também foi sugerido que os íons amônio reduzem a inibiçãode PFK1 por citrato até certa extensão (Habison et al., 1983; Arst et al.,1987). No laboratório dos autores uma forma mais curta da PFK1 isolada deAspergillus niger foi descrita com massa molecular de cerca de 48 KDa, aqual não apresentou inicialmente atividade, porém se tornou ativa depois dafosforilação da molécula de proteína (Legisa e Bencina, 1994a). C.P. Kubi-cek, o qual conduziu investigações e medições cinéticas na enzima isoladade A. niger (Habison et al., 1979; Habison et al., 1983; Schreferel et al. 1986;Arst et al., 1987) categoricamente negou que em seu laboratório uma proteí-na de 48 KDa apresentando a atividade PFK1 foi alguma vez medida (Legisaand Bencina, 1994b). Em dois projetos diplomas conduzidos nos laboratóriosdo autor, o procedimento de isolamento do fragmento de 48 KDa foi descrito(Smerkolj, 2000) e a modificação pós-traducional da proteína natural foi pro-posta como um mecanismo da formação de enzima fragmentada (Mesojed-nik, 2003). Recentemente o peso molecular do fragmento mais curto ativo foideterminado com sendo de 49 KDa, assim como a modificação pós-traducional e parâmetros cinéticos do fragmento mais curto foram descritos(Mesojednik e Legisa, 2005). Através de um experimento in vitro foi demons-trado que o fragmento mais curto se tornou inativo imediatamente depois daclivagem proteolítica da proteína natural e recuperou a sua atividade somen-te após a fosforilação da molécula de proteína, mediada pela proteína quina-se dependente de AMPc. As medições dos parâmetros cinéticos revelaramque o fragmento mais curto era resistente à inibição de citrato (Mlakar, traba-lho de diploma), enquanto que o efeito negativo do ATP foi suprimido napresença de frutose-2,6-bisfosfato (Mesojednik and Legisa, 2005).

Na literatura, não há descrição de qualquer enzima PFK1 pós-traducionalmente modificada eucariótica com capacidade retida de ser su-pra-regulada por efetores específicos e tenha perdido a regulação negativa.Parece que o fragmento mais curto da enzima PFK1 de células de A. Niger éa forma mais eficiente da enzima PFK1 descrita até agora.

Para evitar modificações pós-traducionais complicadas, o frag-mento PFK1 mais curto foi preparado a partir de um gene pfkA cortado. Umavariedade de genes encurtados na extremidade 3' da cepa principal foi pre-parada e transferida para células de A. niger. Depois da fosforilação induzi-da, a atividade da PFK1 característica para o fragmento mais curto foi detec-tada no homogenato de transformantes carregando o gene t-pfkA de com-primento específico (Capuder, 2004). A fosforilação intracelular foi induzidapela adição de azida de sódio, um inibidor bem conhecido do transporte deelétrons no sítio da citocromo oxidase aa3, o qual interrompe a síntese deATP, o que diminui a atividade das bombas de próton transmembranas (H+-ATPases). Prótons que se acumulam nas células causam um decréscimo novalor do pH intracelular. É bem conhecido que uma queda do pH intracelulardesencadeia a síntese de AMPc nas células fúngicas, o que induz a ativida-de da proteína quinase dependente de AMPc que finalmente fosforila e ativao fragmento mais curto da enzima PFK1.

Embora o fragmento mais curto possa ser sintetizado in vivo apartir de um gene cortado, a enzima é inicialmente inativa. Ela é ativada so-mente após a fosforilação da molécula de proteína pela proteína quinasedependente de AMPc que é induzida por um aumento do nível de AMPc nascélulas. Durante o crescimento de Aspergillus niger, o AMP cíclico é sinteti-zado depois de alterações específicas que aparecem espontaneamente nomeio ou ele pode ser desencadeado artificialmente pela adição de inibidoresespecíficos, como azida, ao meio. De acordo com o nosso conhecimento, aqueda espontânea do pH intracelular ocorre somente em uma cepa de A.niger (A60), onde o fragmento mais curto poderia ser espontaneamente ati-vado da mesma forma. Em outra cepa de A. niger (A158), H+-ATPases maispoderosas estão presentes que previnem a acidificação intracelular e tam-bém a síntese de AMPc (Jernejc e Legisa, 2004). Em alguns microorganis-mos os mecanismos são conhecidos, que desempenham a formação deAMPc e a ativação de quinases que podem ativar o fragmento mais curto dePFK1, entretanto, tais condições ambientais são geralmente contraditóriasàs condições ótimas necessárias para a síntese de produtos biotecnológi-eos.

Através da introdução de mutações específicas no gene t-pfkAcortado, a necessidade pela fosforilação da molécula de proteína poderia seromitida.

Através da busca literária, alguns documentos foram encontra-dos que descrevem parâmetros cinéticos alterados da enzima PFK1 apósalterações induzidas nas seqüências de nucleotídeos. Entretanto, naquelaspublicações, os autores usaram mutagênese direcionada a sítio para a de-terminação dos sítios de ligação alostéricos para vários efetores. Por exem-pio, um documento de Li et al., 1999 resume estudos de sítios de ligação decitrato que foram determinados na enzima PFK1 de músculo de coelho, en-quanto que no documento de revisão de Kemp e Gunasekera, 2002, a evo-lução dos sítios alostéricos em enzimas PFK1 eucarióticas é apresentada.Nenhuma mutação foi introduzida para alterar os sítios de fosforilação naenzima PFK1 até agora. A regulação da atividade enzimática foi estudadaem maiores detalhes na 6-fosfofruto-2-quinase/frutose-2,6-bisfosfatase (Kur-land et al., 1992; Kurland e Pilkis, 1995), entretanto essa enzima não estádiretamente envolvida na glicólise.

Nenhuma patente pôde ser encontrada que poderia proteger ouso da enzima PFK1 com parâmetros cinéticos alterados, pela forma ativada enzima sintetizada somente a partir de um gene modificado.

De acordo com o estado da arte, o problema da síntese de umfragmento mais curto ativo da PFK1 com características enzimáticas melho-radas não está suficientemente resolvido. O objetivo da invenção é solucio-nar o problema pelo procedimento que elimina a necessidade pela fosforila-ção da molécula de proteína para a sua ativação e capacita a síntese in vivode uma proteína ativa pela inserção do gene MT-pfkA modificado.

O fluxo glicolítico desregulado é de maior importância em micro-organismos comerciais para alcançar altas taxas de produtividade específi-ca. Tais condições podem ser efetuadas pela inserção do gene MT-pfkAmodificado, cortado, codificando um fragmento mais curto ativo da enzimaPFK1 que seja resistente à inibição de citrato, enquanto outros efetores au-mentam a sua atividade até uma extensão maior em relação à enzima natural.

De acordo com a invenção, a tarefa é solucionada de acordocom reivindicações de patentes independentes.

A presente invenção endereça o gene modificado, o fragmentomais curto ativo codificador da 6-fosfofruto-1-quinase, onde a fosforilação damolécula de proteína não é necessária para a sua ativação, cuja massa mo-lecular monomérica está entre 30 e 55 KDa, cuja atividade enzimática não ésignificativamente inibida pelo ácido cítrico ou sais de citrato ou ATP. A pre-sente invenção se concentra no gene modificado codificando um fragmentomais curto de PFK1 que é ativo imediatamente após a sua síntese e não éinibido pelo ácido cítrico, ou sais de citrato na faixa de 0 mM até 10 mM oude ATP até 1,5 ATP na presença de frutose-2,6-bisfosfato. A invenção ende-reça o gene modificado codificando a síntese do fragmento mais curto ativode PFK1 que pode ser ativado por alguns metabólitos, tais como frutose-2,6-bisfosfato, íons amônio e AMP. O fragmento mais curto se origina da enzimanatural com N- e/ou C-terminal removido.A presente invenção é baseada na observação que o gene cor-tado modificado, codificando o fragmento ativo da 6-fosfofruto-1 -quinase queé resistente à inibição por ácido cítrico e/ou sais de citrato e ATP aumenta ataxa de síntese de metabólito primário e secundário nas células.

A invenção se concentra em um procedimento que inclui o usodo gene modificado para a síntese do fragmento PFK1 mais curto ativo, ou ainserção de um gene homólogo ou heterólogo nas células para aumentar ataxa de síntese de metabólito primário e secundário devido ao fluxo glicolíti-co aumentado.

Descrição das Figuras

Figura 1: Atividades específicas das enzimas PFK1 medidas emhomogenatos da cepa de origem de Aspergillus niger (A645, a qual é umaderivada da cepa A158) e dois transformantes (T12 e T14) com gene t-pfkAintegrado, antes e depois da indução da fosforilação por azida.

Figura 2: Atividades específicas das enzimas PFK1 medidas emhomogenatos da cepa de origem de Aspergillus niger (A645, a qual é umaderivada da cepa A158), transformante T12 com o gene t-pfkA integrado etransformante Na-TEGI-23 com gene mt-pfkA cortado modificado integrado.Nenhuma azida foi adicionada ao meio.

Figura 3: Acúmulo de ácido cítrico no meio por cepas de Asper-gillus niger transformadas com gene t-pfkA cortado. Figura 3A: transforman-tes originados da cepa A645 (derivada da cepa A158). Figura 3b: transfor-mantes originados da cepa A60.

Figura 4: Acúmulo de ácido cítrico no meio por transformantesde Aspergillus niger com gene mt-pfkA cortado modificado integrado. Comoa cepa de origem cepa A645, derivado da cepa A158 foi tomado.

Figura 5: Excreção das α-amilases pelo crescimento de A. niger(Cepa A158) e transformante Na-TEGI-23 no meio com amido como únicafonte de carbono. Depois de três dias de crescimento o amido remanescentefoi manchado com solução de iodo. Uma zona clara sem amido pode serobservada ao redor da colônia de Na-TEGI-23. Nenhuma zona clara apare-ceu ao redor da colônia da cepa de origem.Figura 6: Atividades das α-amilases extracelulares excretadaspela cepa de origem de A. niger(A158) e transformante Na-TEGI-23 detec-tado no filtrado do meio com amido como a única fonte de carbono.

Figura 7: Acúmulo de ácido itacônico no meio por transformantesde Aspergillus terreus com o gene MT-pfkA cortado modificado integrado(AT-TEGI1), gene t-pfkA cortado integrado (AT-44) e cepa de origem A156.

Definições

A abreviação PFK1 é usada para a enzima 6-fosfofruto-1-quinase (EC 2.7.1.11).

O termo "fragmento mais curto" é usado para a proteína cujonúmero de resíduos de aminoácidos é menor do que a da proteína natural.

O termo "fragmento PFK1 mais curto" é usado para a proteínaPFK1 cuja quantidade de resíduos de aminoácidos é menor do que a da 6-fosfofruto-1-quinase natural que é normalmente presente em células geneti-camente não-modificadas.

A abreviação "pfkA" é usada para o gene que codifica a 6-fosfofruto-1-quinase.

A abreviação "t-pfkA" é usada para o gene pfkA cortado, cujaquantidade de nucleotídeos é menor do que a do gene pfkA natural, codifi-cando a síntese do fragmento PFK1 mais curto, cuja quantidade de resíduosde aminoácidos é menor do que a da enzima PFK1 natural.

O termo "mutação" é usado para alterações permanentes naseqüência de nucleotídeos de um gene específico.

O termo "gene pfkA modificado" é usado para uma alteraçãopermanente de um ou mais nucleotídeos em qualquer lugar na seqüência dogene pfkA codificando a enzima PFK1 com alteração de um ou mais resí-duos de aminoácidos em qualquer lugar na proteína.

O termo "gene mt-pfkA modificado" é usado para a alteraçãopermanente de um ou mais nucleotídeos em qualquer lugar na seqüência dogene t-pfkA cortado codificando um fragmento PFK1 mais curto com altera-ção de um ou mais resíduos de aminoácidos em qualquer lugar na proteína.

O termo "6-fosfofruto-1-quinase" é usado para a enzima queconverte frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bisfosfato no gasto de ATP na pre-sença de íons Mg2+ e é uma enzima no processo de glicólise.

O termo "inibição por ácido cítrico" é usado para a ação negativado ácido cítrico ou de seus sais, tais como citratos, na atividade enzimáticada 6-fosfofruto-1 -quinase.

O termo "inibição por ATP" é usado para a ação negativa doATP na atividade da enzima da 6-fosfofruto-1-quinase.

O termo "ativação" é usado para aumentar a atividade da enzi-ma acima do nível básico na presença de componentes ativadores tais co-mo: metabólitos celulares, por exemplo, frutose-2,6-bisfosfato e íons amônioe AMP.

O termo "parte N- e/ou C-terminal" da proteína é usado para aparte da proteína do grupo NH2- ou início da proteína para a parte central daproteína e da parte central da proteína para o grupo -COOH ou a parte ter-minal da proteína.

O termo "modificação pós-traducional" é usado para a alteraçãona seqüência de aminoácidos da proteína pela clivagem da proteína por pro-teases ou pela ligação de outros grupos bioquimicamente funcionais na se-qüência de aminoácidos, tal como a adição do grupo fosfato por um proces-so de fosforilação catalisada pela proteína quinase. Modificações pós-traducionais são descritas na literatura científica.

O termo "metabólitos" é usado para os produtos do metabolismocelular.

O termo "originando ou a enzima natural ou o gene" é usado pa-ra a enzima 6-fosfofruto-1 -quinase e o gene codificando a enzima, que estápresente nas células.

O termo "origem recombinante" é usado para o gene ou proteínaque é modificado pelas técnicas de laboratório conhecidas pelos especialis-tas do campo.

O termo "origem sintética" é usado para o gene ou proteína sin-teticamente feita que seja preparada pelas técnicas conhecidas pelos espe-cialistas do campo. A proteína sintética poderia ser representada pela com-binação da proteína animal e microbiana.

O termo "restrição na parte 5' e/ou 3" do gene natural" é usadopara a remoção do gene da parte 5' para a parte central e/ou a remoção daparte central para a parte 3' do gene. A remoção é efetuada por técnicas co-nhecidas pelos especialistas do campo e pode ser feita por endonucleasesespecíficas, clivagem não-específica ou pela multiplicação do gene pelo mé-todo da Reação em Cadeia da Polimerase pelo uso de iniciadores de oligo-nucleotídeos, que são complementares ao gene na extremidade 5' e 3'.

O termo "gene recombinante homólogo modificado" é usado pa-ra o gene modificado codificando um fragmento mais curto, preparado portécnicas recombinantes e é introduzido nas células das mesmas espéciesque o gene natural é originário.

O termo "gene recombinante modificado" é usado para o genemodificado codificando um fragmento mais curto, preparado pelas técnicasrecombinantes e é introduzido nas células de outras espécies que o genenatural é originário.

A invenção lida com o gene codificando o fragmento mais curto,geneticamente modificado da 6-fosfofruto-1-quinase que é ativo imediata-mente depois da síntese, deste modo não é necessária nenhuma fosforila-ção da proteína para a sua ativação; e na presença de ácido cítrico e/ou saisde ácido cítrico até a concentração de 15 mM e ATP até a concentração de1,5 mM sua atividade é reduzida para menos do que 30%; e pode ser ativa-da pela frutose-2,6-bisfosfato, íons amônio e AMP; e está codificando umaproteína que difere de pelo menos um resíduo de aminoácido da seqüênciade aminoácidos original de fragmentos mais curtos e cujos genes estão pre-sentes nos genomas de origem microbiana, animal ou vegetal, preferivel-mente fúngica, preferivelmente das espécies Aspergillus, Tríchoderma, Peni-cillium, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Kluyve-romyces, Neurospora, preferivelmente Aspergillus niger. O gene codifica umfragmento geneticamente modificado mais curto a PFK1 com massa molecu-lar superior a 30 KDa e menor do que 55 KDa, o qual não tenha a parte N-e/ou C-terminal da 6-fosfofruto-1-quinase natural.A invenção se concentra no gene codificando o fragmento gene-ticamente modificado mais curto da PFK1 que é imediatamente ativo depoisda síntese, deste modo nenhuma fosforilação da molécula de proteína é ne-cessária para a sua ativação, e na presença de ácido cítrico e/ou sais deácido cítrico até a concentração de 15 mM e ATP até a concentração de 1,5mM sua atividade é reduzida para menos do que 30%; e pode ser ativadapela frutose-2,6-bisfosfato, íons amônio e AMP; e está codificando uma pro-teína com a seqüência de resíduos de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou SEQID NO: 2, que difere por pelo menos um resíduo de aminoácidos da seqüên-cia de aminoácidos do fragmento de PFK1 mais curto da seqüência SEQ IDNO: 3; cujo gene da seqüência SEQ ID NO: 4 está presente no genoma deAspergillus niger, e codifica uma proteína com massa molecular superior a30 KDa e menor do que 55 KDa, a qual não tem a parte N- e/ou C-terminalda 6-fosfofruto-1-quinase natural.

A invenção lida com um vetor de expressão que carrega o geneacima mencionado funcionalmente conectado às seqüencias de controle,promotor e outras seqüências de DNA relevantes que permitem a síntese deproteína, a qual é codificada pelo gene e vetor de expressão que capacita aexpressão do gene em células hospedeiras eucarióticas ou em células hos-pedeiras procarióticas, preferivelmente em células de tecido animal, em cul-turas de tecido vegetal, em fungos filamentosos, leveduras, bactérias, prefe-rivelmente fungos filamentosos, preferivelmente dos gêneros Aspergillus,Trichoderma, Penicillium, e preferivelmente leveduras, preferivelmente dogênero Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, e preferivelmentebactérias, preferivelmente dos gêneros Acetobacter, Escherichia, Bacillus,Streptomyces, Zymomonas, preferivelmente nos fungos filamentosos do gê-nero Aspergillus, preferivelmente Aspergillus niger, Aspergillus terreus, As-pergillus oryzae.

As invenções lidam com organismos que contêm o gene acimamencionado e/ou o vetor de expressão acima mencionado e que o vetor deexpressão acima mencionado que corresponde a um organismo específico éinserido no organismo acima mencionado pelas técnicas de laboratório co-nhecidas pelos especialistas do campo de um modo que permita a expres-são do gene acima mencionado e os organismos são de origem microbiana,preferivelmente, fungos filamentosos, preferivelmente dos gêneros Aspergil-lus, Trichoderma, Penicillium, e leveduras, preferivelmente do gênero Pichia,Saccharomycesl Schizosaccharomyces, ou fungos filamentosos do gêneroAspergillus, preferivelmente Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergil-Ius oryzae, ou bactérias, preferivelmente dos gêneros Acetobacter, Eseheri-chia, Bacillus, Streptomyces, Zymomonas e de origem vegetal e animal, pre-ferivelmente culturas de tecidos de origem vegetal e animal.

A invenção se concentra no uso do gene e/ou vetores de ex-pressão acima mencionados e/ou organismos acima mencionados para aelevação do fluxo metabólico através da glicólise para intensificar a reaçãoanaplerótica durante o processo de formação de bioprodutos, preferivelmen-te de biomassa celular, proteínas homólogas e heterólogas; metabólitos pri-mários, tais como etanol, acetato, lactato, ácidos orgânicos, aminoácidos,polióis; metabólitos secundários, tais como antibióticos, alcalóides da ergoti-na, estatinas, vitaminas, imunomoduladores, citostáticos, inseticidas, herbi-cidas.

A invenção se concentra no processo para a formação de bio-produtos que incluem o uso do gene acima mencionado que é inserido nosvetores de expressão acima mencionados que é introduzido nos organismosacima mencionados e que o organismo acima mencionado é cultivado de ummodo a sintetizar o bioproduto.

A descrição dos métodos no texto a seguir é meramente de na-tureza informativa e serve para a explicação da invenção. Para os procedi-mentos outros materiais e métodos relevantes podem ser usados conheci-dos pelos especialistas do campo.

1. PROJETO E TESTAGEM DO GENE mt-pfkA CORTADO

1.1.1. Crescimento do fungo Aspergillus niger

Esporos do fungo Aspergillus niger, cepa A60 (MZKI, Coleçãomicrobiológica do Instituto Nacional de Química, Eslovênia), que se desen-volveram no agar mosto inclinado depois de 7 dias de incubação a 30 eCforam suspensos em 25 mL de solução Tween 80 estéril (0,1%, p/v). A con-centração final dos esporos foi de cerca de 107 esporos por mL.

Para o rápido crescimento de biomassa, o meio complexo foiinoculado pelos esporos que continham em 1 litro: 2 g de glicose, 0,5 g deextrato de levedura, 0,2 g de hidrolisado ácido de caseína, 6 g de NaNO3,1,5 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4X 7H20, 0,5 g de KCI, 10 mL de soluçãode metal traço (Vishniac e Santer, 1957), pH= 6,0.

Para a determinação da cinética enzimática o micélio da cepa deorigem e os transformantes cresceram no meio que continha em 1 litro: 20 gde glicose, 5 g de NH4(SO4)2, 5 g de KH2PO4, 1 g de MgSO4 χ 7H20, 0,5 gde NaCI, 10 mg de MnCI2, 10 mg de peptona, pH = 6,0.

Todos os meios (100 mL) em 500 mL de frascos Erlenmeyercom chicana foram inoculados por 5 mL de inóculo de esporo e incubadosem um agitador giratório a 100 rpm e 30SC.

1.1.2. Preparo dos mutantes auxotróficos pyrG"

Mutantes auxotróficos individuais de Aspergillus niger adequa-dos para a transformação homóloga foram preparados depois do rompimen-to do gene pyrG na cepa A158 (MZKI, Coleção microbiológica do InstitutoNacional de Química, Eslovênia) pelo método de substituição em uma etapaconforme descrito anteriormente (Rothstein, 1983). O plasmídeo pGWII quefoi usado para o silenciamento do gene pryG foi preparado a partir do plas-mídeo pGW635 (Goosen ET AL., 1987) carregando o gene pyrG de A. nigere pBluescript Il KS+ (Stratagene, La Jolla, CA). A partir de um digesto Kp-n\/Xba\ de 3,9 Kpb de comprimento de pGW635 um fragmento BglIl/BamHIde 0,8 Kpb do gene pyrG foi cortado, enquanto as regiões flanqueadorasremanescentes (KpnUBgIW de 1,3 Kbp e BamH\/Xba\ de 1,8 Kbp) foram liga-das e inseridas no vetor pBs. Depois da transformação com o plasmídeopGWII, os protoplastos foram regenerados no meio mínimo na presença deuridina (5 mM) e ácido 5-fluorórtico (1 mg/mL). As colônias recuperadas fo-ram verificadas quando à auxotrofia. O mutante pyrG" auxotrófico preparadoa partir da cepa A158 foi designado como A645.

1.1.3. Preparo do plasmídeo pMOJO04O vetor de expressão pMOJOCM se origina do plasmídeo pBlues-cript Il KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) com a região promotora integrada dogene codificando gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpdA) e a região determinação do gene codificando a glutamina amido transferase (trpC) dofungo Aspergillus nidulans. O promotor gpdA (Z32524) foi amplificado pelométodo de PCR pelo uso do vetor pAN7-1 (Z32698) como molde e os inicia-dores de oligonucleotídeo específicos gpdA: 5'-G AGCTCGTG ACCG GTG ACTCTTTC-31 (SEQ ID No: 5) e 5'-TCTAGATGCATATGGGTGATGTCTGCTCAAGC-3' (SEQ ID No: 6), quesimultaneamente capacitaram a inserção dos sítios de restrição Sstl e Xbal-Ndel na extremidade 5'. Semelhantemente a região terminadora trpC(X023390) foi amplificada pelo uso dos seguintes iniciadores de oligonucleo-tídeos: 5'-

CCATGGGTCTAGACGGATCCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTC-3' (SEQID No: 7) e 5'-GAATTCAAGCTTCCGCGGCCGGGTATTGGGTG-3' (SEQ IDNo: 8) que permitiram simultaneamente a inserção dos sítios de restriçãoXbaMBamVW e Xho\ na extremidade 5'. Para preparar o promotor gpdA osprodutos de PCR foram cortados pelas enzimas Sstl e Xbal1 enquanto quepara a região terminadora trpC a restrição foi feita pela enzima Xhol e Xbal.Pelo uso do kit de extração QIAquick GEL (Qiagen) fragmentos de compri-mento de 0,9 e 1,5 Kpb foram isolados do gel de agarose. Finalmente osprodutos de PCR foram ligados no pBluescript Il KS+ aberto com a ajuda daT4DNA polimerase (New England Biolabs, Promega) e o plasmídeo recen-temente formado foi designado como o vetor de expressão pMOJ004.1.1.4. Construção do gene t-pfkA cortado

Os fragmentos NdeUApal-ATT-BamVW do gene pfkA de A. niger(No. De acesso EMBL pfkA Z79690) foi amplificado pela reação de PCR u-sando os seguintes iniciadores: 5'-CCG CGG ATG CAT ATG GCT CCCCCC CAA GC-31 (SEQ ID No: 9) e 5'-TGG ATC CTT ACC CGG GAT CATAGT GCC GGC ACA GAC C-3' (SEQ ID No: 10) e subclonado no digestoEcoRV do pBluescript Il KS+ (pBS)(Stratagene, La Jolla, CA). Depois daamplificação do plasmídeo pBS-t-pfkA em DH5a de E. coli e do isolamentodo plasmídeo pelo kit GeneEIute Plasmid Mini Prep (Sigma), a seqüência t-pfkA foi determinada pelo MWG-Biotech AG (Ebersberg, Alemanha) emplasmídeos positivamente orientados para excluir o aparecimento de quais-quer mutações. O digesto NdeUBamHl do pBS-t-p//cA foi finalmente ligado noplasmídeo pET3a para a expressão em bactérias e/ou pMC)J004 para a ex-pressão em fungos filamentosos.

O gene t-pfkA cortado codificou uma proteína de 452 aminoáci-dos com massa molecular de 49,8 KDa. A proteína reteve a seqüência deaminoácidos idêntica da parte N-terminal da proteína natural, entretanto osresíduos de aminoácidos na posição 451 e 452 foram adicionados para em-parelhar o sítio de restrição apropriado. Depois de verificar a seqüência denucleotídeos, o gene t-pfkA cortado foi inserido na cepa auxotrófica de As-pergillus niger (pyrG').

1.2.1. Introdução de mutações direcionadas a sítio no gene t-pfkA

Através do estudo da estrutura tridimensional da enzima PFK1 epelo prognóstico dos sítios de fosforilação dos resíduos de aminoácidos daenzima usando o programa de computador NetPhos 2.0, o resíduo de treo-nina no sítio 89 da parte N-terminal da enzima aparentou ser o candidatomais provável para a fosforilação e ativação do fragmento PFK1 mais curto.Através da mutagênese direcionada a sítio os tripletes de nucleotídeos foramalterados no gene t-pfkA para substituir resíduos de aminoácidos específicoscom resíduos análogos encontrados na enzima PFK1 de E. coli. A mutagê-nese foi efetuada pelo kit de mutagênese direcionada a sítio QuikChange IlXL (Stratagene, La Jolla, CA) pelo uso das seguintes seqüências de nucleo-tídeos: para alterar T89E, 5' -CC GCC CGC TGC ATG GAG TTC CGT GAGCGC CC-3' (SEQ ID No: 11) e 5'-GG GCG CTC ACG GAA CTC CAT GCAGCG GGC GG-3' (SEQ ID No: 12); para alterar G95I, 5'-C CGC TGC ATGGAG TTC CGT GAG CGC CCC ATC CGT CTG CGG G-3' (SEQ ID No: 13)e 5'-C CCG CAG ACG GAT GGG GCG CTC ACG GAA CTC CAT GCAGCG G-3' (SEQ ID No: 14). Depois da amplificação do gene t-pfkA modifica-do carregando o plasmídeo pET3a, a seqüência do gene t-pfkA modificadafoi verificada (MWG-Biotech, Eberberg, Alemanha) para confirmar a precisãoda alteração genética. O gene tpfk-A modificado foi designado como genemt-pfkA.

Através do uso do kit de mutagênese direcionada a sítio Quik-Change Il XL (Stratagene, La Jolla1 CA), os nucleotídeos de dois códons fo-ram alterados que permitiram a substituição de dois resíduos de aminoáci-dos: treonina (T) no sítio 89 com ácido glutâmico (E) e glicina (G) no sítio 95com isoleucina (I). Depois de verificar a seqüência do gene cortado modifi-cado, o constructo foi inserido nas células de A. niger.1.2.2. Inserção das modificações adicionais no gene mt-pfkA. Construção dogene MT-pfkA.

Mutações adicionais foram inseridas no gene mt-pfkA codifican-do o fragmento PFK1 mais curto modificado do fungo Aspergillus niger parafornecer uma proteína com 14 resíduos de aminoácidos ao redor do sítio defosforilação inicial da proteína A. niger para ser idêntica à proteína E. coli. Ostripletes de nucleotídeo para a síntese de mais cinco resíduos de aminoáci-dos tiveram que ser alterados conforme demonstrados na Tabela 1.

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Tabela 1: Alterações adicionais introduzidas no fragmento PFK1 genetica-mente modificado codificado pelo gene MT-pfkA.

Mutações adicionais no gene mt-pfkA foram efetuadas pelo mé-todo de PCR de dois fragmentos sobreponíveis com 297 e 1128 bases queformaram 23 bases complementares. Para a amplificação de ambos osfragmentos, pMOJ004-mt-pfkA foi tomado como molde. Para permitir a in-serção do gene MT-pfkA no plasmídeo pALTER-Ex1 (Promega), o sítio derestrição BamHI não teve que ser substituído com o sítio de restrição Xbalna extremidade 3' do gene Mt-pfkA. O gene Mt-pfkA foi finalmente construí-do pela ligação em PCR de ambos os fragmentos. Os iniciadores de oligo-nucleotídeos usados estão mostrados na Tabela 2.

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Tabela 2: Iniciadores de oligonucleotídeos usados para a cons-trução do gene Mt-pfkA.

O gene Mt-pfkA foi ligado no plasmídeo pALTER-Ex1 sob o con-trole do promotor TAC. Depois de clonar a seqüência do gene Mt-pfkA inse-rida no vetor pALTER-Ex1 o vetor foi verificado (MWG-Biotech, Edberg, A-lemanha).

1.3.1. Transformação das células de A. niger com o plasmídeo pMC)J004-t-pfkA e pMOJ004-mt-p/r/cA.

O micélio de A. niger foi coletado depois de 16 a 18 horas decrescimento submerso em um meio complexo. A formação e a transforma-ção de protoplasto foram efetuadas conforme reportado anteriormente (Kus-ters-van Someren et al., 1991), somente que a enzima Iftica Cailase-4 ((Ca-yla, Toulouse, França) foi usada ao invés da Novozyme 234. Como um mar-cador de seleção o gene pyrA localizado no plasmídeo pGW635 foi usado. Aco-transformação da cepa auxotrófica A645 foi efetuada com 1 μg depGW635 e 15 μg de pMOJ004-t-pfkA ou pMOJ004-mt-pflcA carregando ogene cortado modificado ou o cortado para a síntese do fragmento PFK1mais curto modificado. Os transformantes foram isolados depois da reinocu-lação no meio sem uridina.

1.3.1.1. Análise southern

O DNA cromossomal (3 μς) dos transformantes foi degradado deum dia para o outro por 30U da enzima de restrição BamHI em um volumefinal de 200 μL. As moléculas de DNA foram separadas em 0,5% de gel deagarose (1 χ tampão de tris-acetato-EDTA com 2 μL/mL de brometo de etí-dio) e marcadas em membrana de náilon (Hybond™-N+, Amersham). DNAde fita única foi reticulado à membrana por luz ultravioleta (Biometra Ti3, Bi-ometra, Goetingen, Alemanha). A sonda de DNA foi preparada a partir deNde\/BamH\ cortado do plasmídeo pRCR-pflcA e marcada com o sistema demarcação de DNA BioPrime (Life Technologies) de acordo com as instru-ções. A detecção por quimiluminescência com CDP-Star (Roche AppliedScience) foi feita pela exposição das membranas ao filme X-Omat AR (Kodak).

Dezessete transformantes com genes cortados integrados per-mitindo a síntese do fragmento PFK1 foram isolados. Análise southern apre-sentou uma quantidade diferente de plasmídeos integrados em onze trans-formantes. A quantidade estimada de cópias de genes integrados está apre-sentada na Tabela 3.

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Tabela 3: Quantidade estimada de cópias do gene t-pfkA cortado conformedetectado depois de análise southern no DNA total isolado de vários trans-formantes.

Depois da co-transformação do gene mt-pfkA cortado modificadona cepa auxotrófica de Aspergillus niger, diferentes quantidades de cópiasintegradas foram detectadas por análise Southern. As quantidades estima-das de cópias estão apresentadas na Tabela 4.

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Tabela 4: Quantidade estimada de cópias de genes mt-pfkA cor-tadas modificadas conforme detectado por análise Southern no DNA totalI isolado a partir de vários transformantes.

1.3.2. Transformação de Aspergillus terreus com o plasmídeopMOJ004-mt-p/AA.

O micélio de A. terreus foi coletado depois de 16 - 18 horas decrescimento submerso em um meio complexo. A formação de protoplasto e atransformação foram efetuadas conforme reportado anteriormente (Kusters-van Someren et al., 1991), exceto que a enzima Iftica Cailase-4 (Cayla, Tou-louse, França) foi usada ao invés de Novozyme 234. Os transformantes de A.terreus com genes mt-pfkA integrados foram isolados depois de os protoplas-tos serem co-transformados com o plasmídeo pMOJ004-mt-p/AA e com oplasmídeo pUT270, carregando o gene para a resistência à fleomicina.

1.3.2.1. Análise southern

Em cinco cepas, a presença de mt-pfkA foi confirmada pelo méto-do de PCR. Análise southern revelou uma quantidade diferente de genes in-tegrados em transformantes individuais conforme apresentado na Tabela 5.

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Tabela 5. Quantidade estimada de cópias de gene mt-pfkA cortado modifi-cadas conforme detectado por análise southern no DNA total isolado a partirde vários transformantes de Aspergillus terreus.

1.3.3. Transformação da cepa de E. coli bacteriana DF 1010 com o plasmí-deo pALTER-Ex1 carregando o gene Mt-pfkA.

O plasmídeo pAlter-Ex1 carregando o gene Mt-pfkA foi inseridona cepa de E. coli DF 1010 com os genes pfkA e pfkB bacterianos anulados.A eficácia da transformação foi testada pelo crescimento das bactérias nomeio seletivo. O plasmídeo pALTER-Ex1 contém um gene para a expressãoda resistência à tetraciclina em células bacterianas.

1.4.1. Detecção da atividade do fragmento mais curto sintetizado do gene t-pfkA.

Transformantes com o gene t-pfkA integrado cresceram em meiomínimo por 14 horas conforme descrito em 1.1.1. Azida de sódio foi adicio-nada ao meio na concentração final de 1 mM e a cultura foi incubada pormais 15 minutos. Azida, um inibidor bem conhecido do transporte de elétronspelos citocromos, faz com que os prótons se acumulem nas células, o queresulta em uma queda do pH intracelular. As células respondem pela síntesede uma molécula sinalizadora - AMP cíclico à leve acidificação. O AMP cícli-co ativa a proteína quinase dependente de AMPc que, enfim, fosforila ofragmento mais curto da PFK1 codificado pelo gene t-pfkA. Diferentes parâ-metros cinéticos da PFK1 foram detectados em extratos livres de células detransformantes após a indução da fosforilação, enquanto nenhuma alteraçãona cinética pôde ser observada na cepa de origem, apesar da fosforilaçãoinduzida.

1.4.2. Detecção da atividade do fragmento mais curto codificado pelo genemt-pfkA.Os transformantes com o gene mt-pfkA integrado que permitirama síntese do fragmento PFK1 mais curto modificado cresceram por 14 horasem um meio mínimo conforme descrito em 1.1.1. Nenhuma azida de sódiofoi adicionada ao meio antes da medição da cinética de PFK1 nos extratoslivres celulares. A presença do fragmento mais curto ativo da PFK1 foi con-firmada pela detecção da cinética da PFK1 característica para o fragmentomais curto.

1.5.1. Testes enzimáticos

1.5.1.1. Preparação do homogenato

Micélio foi coletado por filtração por sucção e lavado com tam-pão fosfato 50 mM gelado contendo 0,5 mM de ditioeritritol (DTE) e 1 mM deEDTA.

Aproximadamente 50 g de peso úmido de micélio foram conge-lados sob nitrogênio líquido e rompidos por 1 minuto em um desintegradorde contas de vidro (Braun, Melsungen). Depois do descongelamento, as cé-lulas rompidas foram extraídas com 5 mL de tampão fosfato 50 mM gelado,pH = 7,8, contendo 0,5 mM de DTE e 10 μί de coquetel inibidor da protease(Sigma). Finalmente o extrato foi centrifugado por 15 min a 15.000 rpm. Aconcentração de proteína no sobrenadante excedeu 5 mg/mL.

1.5.1.2. Medição da cinética enzimática

A atividade da PFK1 foi medida espectrofotometricamente a 340nm de acordo com o procedimento levemente modificado de Legisa andMattey, 1988, usando um sistema reacional acoplado. A reação foi executa-da no volume final de 1 mL e na presença de: 50 mM de tampão Tris-HCI,pH = 7,8, 0,5mM de DTE, 200 mM de KCI, 5 mM de MgCI2, 0.2 mM de NA-DH, 20 μΙ de homogenato, várias concentrações de frutose-6-fosfato, 0,9U/mL de aldolase (Roche Molecular Biochemicals, lndianapolis, Ind.), 2,4U/mL de triosefosfato isomerase e glicerol-3-fosfato desidrogenase (Sigma,4,5 U/mL de aldolase (Sigma).

Para remover os íons amônio, as enzimas auxiliares foram diali-sadas contra 50 mM de tampão Tris-HCI pH=7,8, 0,5 mM de DTE, 30% deglicerol, de um dia para o outro a 4 sC com uma alteração de tampão depoisde 8 horas. As enzimas auxiliares permaneceram ativas por várias semanasquando estocadas no refrigerador.

Quando os parâmetros cinéticos do fragmento mais curtos foramdeterminados, todas as medições foram efetuadas em um tampão contendo5 mg/mL de albumina, o qual foi adicionado ao sistema exatamente antesdas medições.

Para diferenciar entre s cinéticas da enzima natural e o fragmen-to mais curto, as medições se inicaram com a adição de frutose-6-fosfato eATP 0,1 mM ao sistema, seguido pelo aumento da concentração de ATP até1 mM e finalmente na presença de 4 μΜ de frutose-2,6-bisfosfato.

1.5.2. Demonstrando a síntese do fragmento mais curto do gene t-pfkA.

Uma vez que nenhum fragmento mais curto ativo pode ser sinte-tizado a partir do gene t-pfkA, devido à necessidade pela fosforilação da mo-lécula de proteína, a fosforilação intracelular deve ter sido induzida por umestímulo externo. Isso foi conseguido pela adição de azida de sódio ao meio.A azida inibe o transporte de elétrons pelos citocromos, o que causa acúmu-lo de prótons. A leve acidificação é sentida como um estresse nas células,que respondem pela formação da molécula de sinalização AMPc. O nívelaumentado de AMPc ativa a proteína quinase dependente de AMPc que fos-forila o fragmento de PFK1 mais curto, codificado pelo gene t-pfkA. Nos ho-mogenatos celulares contendo o fragmento PFK1 mais curto inativo, a ciné-tica enzimática alterada foi detectada depois da fosforilação induzida (Figura1) que foi característica para o fragmento mais curto. Nenhuma alteração nacinética enzimática pôde ser observada no homogenato das cepas de ori-gem, apesar da fosforilação induzida pela azida. Uma série de outros genespfkA cortados foi testada que codificou proteínas encurtadas na parte C-terminal, com massas moleculares entre 40 e 52 KDa e que diferiam por 8resíduos de aminoácidos. Entretanto, nenhum dos outros genes inseridosnas células de A. niger permitiram a síntese de uma enzima PFK1 ativa comcinética modificada.

1.5.3. Demonstração da síntese do fragmento PFK1 mais curto ativo a partirdo gene mt-pfkA.Para a testagem do gene mt-pfkA a fosforilação intracelular nãofoi induzida pela adição de azida de sódio ao meio antes do micélio ser ho-mogeneizado e a atividade da PFK1 ser medida. A cepa de origem, trans-formantes com o gene t-pfkA inserido e as células com o gene mt-pfkA foramtestadas para a atividade PFK1 alterada. A cinética enzimática característicado fragmento PFK1 mais curto foi detectada somente em extratos a partirdos transformantes carregando o gene mt-pfkA, enquanto que a atividadePFK1 normal foi observada na cepa de origem e nos transformantes da t-pfkA.

1.5.4. Determinação da atividade α-amilolítica no filtrado

A atividade alfa-amilolítica foi medida no meio filtrado conformedescrito no Exemplo 2.2, pelo uso do kit comercial para avaliação da ativida-de α-amilolítica de acordo com o método Ceralpha (Megazyme, Bray, Irlanda).

2. Exemplos

2.1 Testagem dos transformantes de Aspergillus niger para a produtividadede ácido cítrico aumentada.

Para testar o acúmulo de ácido cítrico por cepas de Aspergillusniger o fungo cresceu em um meio que continha os seguintes ingredientesem 1 litro: 150 g de sacarose, 2,5g de (NH4)2SO4, 1,5 g de KH2PO4, 0,5 g deMgS04x7H20, 6,5 mg de FeSO4, 1,3 mg de ZnS04.7H20 com valor de pHajustado para 2,5.

A quantidade de ácido cítrico no meio filtrado foi determinadaconforme anteriormente reportado (Legisa and Jernejc, 2002). Os dados sãoas médias de cinco experimentos independentes inoculados com ce-pa/transformante individual.

Todos os transformantes com gene t-pfkA cortado não-modificado inserido excretaram ácido cítrico mais lentamente e acumularammenos ácido em relação à cepa de origem A158 (Figura 3a). Na cepa deAspergillus niger A158 foram descritas potentes H+-ATPases (Jernejc andLegisa, 2004) que podem manter a homeostase do pH (Hesse et al., 2002).

A falta de uma leve acidificação intracelular previne o desencadeamento dasíntese de AMPc e a ativação da proteína quinase dependente de AMPc,conseqüentemente nenhuma fosforilação e ativação do fragmento PFK1mais curto inativo pode ocorrer. Ao contrário da cepa A158, os transforman-tes da cepa A60 com gene t-pfkA inserido apresentaram uma produção deácido cítrico aumentada em relação à sua cepa de origem (Figura 3b). H+-ATPases menos ativas foram descritas na cepa A60 (Jernejc and Legisa,2002) que causa uma queda do pH intracelular durante o crescimento nomeio produzindo ácido cítrico, o que finalmente induz a síntese de AMPc e afosforilação do fragmento PFK1 mais curto.

Por outro lado, a maioria dos transformantes com genes mt-pfkAcortados modificados inseridos acumularam ácido cítrico de modo mais efi-ciente em relação à cepa A158. Com algumas cepas foi registrado um au-mento de produtividade maior do que 50%, assim como os rendimentos deproduto no final da fermentação foram aumentados em comparação com acepa de origem (Figura 4). Algumas cepas com genes mt-pfkA inseridos defato produziram menos ácido cítrico, entretanto deve ser notado que durantea transformação os plasmídeos devem induzir modificações durante a inser-ção no cromossomo. Em alguns transformantes, uma cópia de plasmídeopode ser inserida no sítio que causa a mutação negativa no sentido de umaboa produção de ácido cítrico.

2.2. Testagem dos transformantes de Aspergillus niger quanto à produtivida-de aumentada de a-amilase

Para testar a produção de α-amilase o meio com a seguintecomposição foi usado que continha em 1 litro: 20 g de amido, 6,0 g de Na-NO3, 1,5 g de KH2PO4, 0,5 g de MgS04.7H20, 0,5 g de KCI, 0,1 g de EDTA,44 mg de ZnSO4, 10 mg de MnCMH2O, 3,2 mg de CoCI2.6 H2O, 3,2 mg deCuS04.5 H2O1 2,2 mg de (NH4)6Mo7024.4 H2O, 14,7 mg de CaCI2.2H20, 10mg de FeS04.7H20, agar 1,5% (p/v). As placas de Agar contendo o meioforam inoculadas com 5 μL de suspensão de esporos tanto da cepa de A.niger A158 quanto do transformante Na-TEGI23. Depois de três dias de in-cubação a 30 qC as placas foram vertidas com solução de iodo (J2 0,4M/KJ0,4M) e as zonas claras foram medidas ao redor das colônias (Figura 5).O transformante com os genes mt-pfkA integrados crescerammais rápido e o diâmetro da colônia alcançou 26 mm, enquanto que o diâ-metro da cepa de origem foi menor - 22 mm. Depois de marcação com asolução de iodo, uma zona clara pôde ser observada ao redor da colônia dotransformante, enquanto que nenhum amido foi degradado ao redor da colô-nia, somente abaixo do micélio da cepa parenteral.

A atividade alfa-amilolítica da cepa de A. niger parenteral (A158)e o transformante com genes mt-pfkA integrados (Na-TEGI23) foi detectadadurante o crescimento submergido no meio conforme descrito acima, semAgar adicionado. A atividade foi determinada no filtrado dos caldos de fer-mentação de acordo com o método Ceralpha. Os dados são as médias detrês experimentos independentes e estão apresentados na Figura 6.

2.3. Testagem dos transformantes de Aspergillus niger para a produtividadede ácido itacônico aumentada.

Para testar a excreção do ácido itacônico, as cepas de Aspergil-Ius terreus cresceram no meio produtivo conforme descrito anteriormente(Riscaldati et al., 2000) e continham em 1 litro: 150 g de glicose, 2,36 g de(NH4)2SO4, 0,11 g de KH2PO4, 208 mg de MgSO4XTH2O1 130 mg de KCI, 74mg de NaCI, 0,2 mg de CuS04.5H20, 5,5 mg de FeS04.7H20, 0,7 mg deMnCI2.4H20, 1,3 mg de ZnS04.7H20, pH ajustado para 3,4.

A quantidade de ácido itacônico foi determinada por cromatogra-fia de íons pelo uso de discos CIM e itaconato como padrão. Os dados sãoas médias de cinco experimentos independentes inoculados com a mesmacepa/transformante. Figura 6 mostra a quantidade de itaconato acumuladapela cepa de origem e o transformante At-TEGI-1. No transformante carre-gando uma quantidade maior de genes mt-pfkA integrados, os rendimentosdo ácido itacônico foram aumentados em até 40%.

2.4. Testagem dos transformantes da bactéria E. coli (DF 1020) quanto aocrescimento de substratos específicos.

As cepas de origem e os transformantes duplos da bactéria E.coli cresceram em meio mínimo na presença dos seguintes carboidratoscomo únicas fontes de carbono: glicose, frutose, manose e manitol. IPTG foiadicionado ao meio que promoveu a expressão constitutiva do gene Mt-pfkA.

Além da cepa de E. coli carregando o gene Mt-pfkA as seguintes cepas deE. coli foram testadas. A cepa BL21, a cepa DF 1020, a cepa DF 1020 comgene pfkA natural integrado de Aspergillus niger, a cepa DF 1020 com o ge-ne t-pfkA integrado. Depois da incubação a 37 9C por vários dias, o cresci-mento de colônias individuais foi observado. As taxas de crescimento dascolônias foram avaliadas e estão mostradas na Tabela 6.

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Tabela 6: Crescimento de transformantes de E. coli no meio mí-nimo com várias fontes de carbono. Mais pulsos indicam uma maior taxa decrescimento específico. Sinal negativo significa ausência de crescimento.Listagem de Referências

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Schreferl, G. et al., J. Bacteriol. 165, 3 (1986), p. 1019-102.Smerkolj, S. Bachelor Thesis. Ljubljana. University of Ljubljana,Biotechnical Faculty, Department of Microbiology, (2000), 32.

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Wang, X./Kemp, R.G. Biochemistry, 40 (2001): 3938-3942.

SeqüênciasSEQ ID NO: 1

MAPPQAPVQPPKRRRIGVLTSGGDAPGMNGVVRAVVRMAIHSDCEAFAVYEGYEGLVNGGDMIRQLHWEDVRGWLSRGGTLIGSARCMEFRERPIRLRAAKNMVLRGIDALVVCGGDGSLTGADVFRSEWPGLLKELVETGELTEEQVKPYQILNIVGLVGSIDNDMSGTDATIGCYSSLTRICDAVDDVFDTAFSHQRGFVI

EVMGRHCGWLALMSAISTGADWLFVPEMPPKDGWEDDMCAIITKNRKER

GKRRTIVIVAEGAQDRHLNKISSSKIKDILTERLNLDTRVTVLGHTQRGGAAC

AYDRWLSTLQGVEAVRAVLDMKPEAPSPVITIRENKILRMPLMDA VQHTKT

VTKHIQNKEFAEAMALRDSEFKEYHFSYINTSTPDHPKLLLPENKRMRIGIIH

VGAPAGGMNQATRAAVAYCLTRGHTPLAIHNGFPGLCRHYDPG#

SEQ ID NO: 2

MAPPQAPVQPPKRRRIGVLTSGGDAPGMNGVVRAVVRMAIHSDCEAFAVY

EGYEGLVNGGDMIRQLHWEDVRGWLSRGGTLIGSARCMEFRERPGRLRA

AKNMVLRGIDALVVCGGDGSLTGADVFRSEWPGLLKELVETGELTEEQVK

PYQILNIVGLVGSIDNDMSGTDATIGCYSSLTRICDAVDDVFDTAFSHQRGF

VIEVMGRHCGWLALMSAISTGADWLFVPEMPPKDGWEDDMCAIITKNRKE

RGKRRTIVIVAEGAQDRHLNKISSSKIKDILTERLNLDTRVTVLGHTQRGGAA

CAYDRWLSTLQGVEAVRAVLDMKPEAPSPVITIRENKILRMPLMDA VQHTK

TVTKHIQNKEFAEAMALRDSEFKEYHFSYINTSTPDHPKLLLPENKRMRIGII

HVGAPAGGMNQATRAAVAYCLTRGHTPLAIHNGFPGLCRHYDPG#

SEQ ID NO: 3 ·

MAPPQAPVQPPKRRRIGVLTSGGDAPGMNGVVRAVVRMAIHSDCEAFAVY

EGYEGLVNGGDMIRQLHWEDVRGWLSRGGTLIGSARCMTFRERPGRLRA

AKNMVLRGIDALVVCGGDGSLTGADVFRSEWPGLLKELVETGELTEEQVK

PYQILNIVGLVGSIDNDMSGTDATIGCYSSLTRICDAVDDVFDTAFSHQRGF

VIEVMGRHCGWLALMSAISTGADWLFVPEMPPKDGWEDDMCAIITKNRKE

RGKRRTIVIVAEGAQDRHLNKISSSKIKDILTERLNLDTRVTVLGHTQRGGAA

CAYDRWLSTLQGVEAVRAVLDMKPEAPSPVITIRENKILRMPLMDA VQHTK

TVTKHIQNKEFAEAMALRDSEFKEYHFSYINTSTPDHPKLLLPENKRMRIGII

HVGAPAGGMNQATRAAVAYCLTRGHTPLAIHNGFPGLCRHYDDTPICSVR

EVAWQESDAWVNEGGSDIGTNRGLPGDDLATTAKSFKKFGFDALFVVGGF

EAFTA VSQLRQAREKYPEFKIPMTVLPATISNNVPGTEYSLGSDTCLNTLIDF

CDAIRQSASSSRRRVFVIETQGGKSGYIATTAGLSVGAVAVYIPEEGIDIKML

ARDIDFLRDNFARDKGANRAGKIILRNECASSTYTTQVVADMIKEEAKGRFE

SRAAVPGHFQQGGKPSPMDRIRALRMATKCMLHLESYAGKSADEIAADEL

SASVIGIKGSQVLFSPMGGETGLEATETDWARRRPKTEFWLELQDTVNILSGRASVNNATWSCYENAPG#SEQ ID NO: 4

ATGGCTCCCCCCCAAGCTCCCGTGCAACCGCCCAAGAGACGCCGCATCGGTGTCTTGACCTCTGGTGGCGATGCTCCCGGTATGAACGGTGTCGTCCGGGCCGTCGTCCGGATGGCTATCCACTCCGACTGTGAGGCTTTCGCCGTCTACGAAGGTTACGAGGGTCTCGTCAATGGCGGCGACATGATCCGTCAGCTTCACTGGGAGGATGTTCGCGGCTGGTTGTCCCGTGGTGGTACCTTGATCGGTTCCGCCCGCTGCATGACCTTCCGTGAGCGCCCCGGTCGTCTGCGGGCTGCCAAGAACATGGTCCTCCGTGGCATTGACGCCCTTGTCGTCTGTGGTGGTGATGGCAGTTTGACTGGTGCCGACGTTTTTCGTTCCGI AGTGGCCCGGTCTGTTGAAGGAATTGGTCGAGACGGGCGAGTTGACCGAAGAGCAGGTCAAGCCATACCAGATTCTGAACATCGTCGGTTTGGTGGj GTTCGATCGATAACGACATGTCCGGCACCGACGCCACCATCGGTTGCTACTCCTCCCTCACTCGCATCTGTGACGCCGTCGACGACGTCTTCGATACTGCCTTTTCCCACCAGCGTGGATTCGTCATTGAGGTCATGGGTCGTCACTGCGGTTGGCTGGCCTTGATGTCTGCTATCAGTACCGGTGCCGACTGGCTGTTCGTGCCCGAGATGCCGCCCAAGGACGGATGGGAGGATGACATGTGCGCTATCATTACCAAGGTGGGTTGATCGGAACTTGGTGGAGAGAACTCAGAGGCATCACTAACTCCCCGCAGAACAGAAAGGAGCGTGGAAAGCGTAGGACGATCGTCATCGTGGCCGAGGGTGCCCAGGATCGCCATCTCAACAAGATCTCGAGTTCGAAGATCAAGGATATTTTGACGGAGCGGTTGAACCTGGATACCCGTGTGACTGTGTTGGGTCACACTCAGAGAGGTGGAGCCGCCTGTGCGTACGACCGCTGGCTGTCCACACTGCAGGGTGTCGAGGCTGTCCGCGCGGTGCTGGACATGAAGCCCGAAGCCCCGTCCCCGGTCATCACCATCCGTGAGAACAAGATCTTGCGCATGCCGTTGATGGACGCCGTGCAGCACACCAAGACTGTCACCAAGCACATTCAGAACAAGGAGTTCGCCGAAGCCATGGCCCTCCGCGACTCGGAATTCAAAGAGTACCACTTTTCCTACATCAACACTTCCACGCCCGACCACCCGAAGCTGCTCCTCCCAGAGAACAAGGTTTGTCGCCACAGTAGCTGCTTCGGTGCTGAGCTAACAAAAGGCAGAGAATGCGCATCGGTATTATTCACGTTGGCGCCCCCGCTGGTGGTATGAACCAGGCTACCCGCGCGGCCGTTGCCTACTGCCTGACTCGTGGCCACACCCCCCTGGCCATTCACAACGGTTTCCCCGGTCTGTGCCGGCACTATGATGACACCCCGATCTGCTCTGTGCGCGAGGTGGCATGGCAGGAATCGGACGCCTGGGTCAACGAGGGTGGTTCGGATATCGGTACCAACCGTGGTCTGCCCGGCGATGACCTCGCGACCACGGCGAAGAGCTTCAAGAAGTTCGGATTCGATGCGTTGTTCGTCGTGGGTGGATTTGAGGCGTTCACCGCCGTCAGCCAGCTTCGCCAGGCGCGCGAGAAGTACCCCGAATTCAAGATTCCCATGACCGTGCTGCCGGCGACCATTTCCAACAACGTGCCGGGCACAGAATACTCTCTGGGTAGCGACACCTGCCTTAACACCTTGATCGACTTCTGCGACGCCATCCGCCAGTCGGCCTCGTCCTCTCGTCGCCGTGTGTTCGTCATCGAGACGCAGGGTGGCAAGTCGGGTTACATCGCCACGACGGCTGGTCTGTCGGTGGGCGCGGTAGCCGTGTACATTCCCGAGGAGGGCATCGACATTAAGATGCTGGCCCGCGACATTGACTTCCTGCGTGACAACTTTGCGCGCGACAAGGGAGCGAACCGCGCCGGTAAGATCATCCTGCGTAACGAGTGCGCGTCCAGCACGTACACGACACAGGTGGTGGCCGACATGATCAAGGAGGAAGCCAAGGGACGTTTCGAGAGTCGTGCGGCGGTGCCGGGACACTTCCAGCAGGGTGGCAAGCCGTCGCCGATGGACCGTATCCGGGCGTTGCGGATGGCCACCAAGTGTATGCTGCACCTGGAGAGCTATGCGGGCAAGTCGGCGGATGAGATTGCGGCCGATGAGCTGTCTGCGTCGGTCATTGGTATCAAGGGCTCGCAGGTGTTGTTCTCGCCGATGGGTGGAGAGACCGGCCTGGAGGCGACCGAGACGGACTGGGCGCGCCGTCGACCCAAGACGGAGTTCTGGCTGGAGCTGCAGGACACGGTGAACATTCTGTCGGGACGGGCGAGCGTGAACAACGCGACGTGGAGTTGCTATGAGAATGCTCCCGGGTAAListagem de Seqüência

<110> Kemijski Institut

<120> Gene mt-pfkA cortado modificado para a síntese de fragmentos maiscurtos ativos de 6-fosfofruto-l-quinase<130> 3 01-P01PC/07<140> PCT/SI2007/000007<141> 2007 02 27<150> SI P-200600107<151> 2006 04 26<160> 20<210> 1<211> 452<212> PRT

<213> Aspergillus niger<220>

<223> Fosfofruto-l-quinase modificada curta<400> 1

Met Ala Pro Pro Gln Ala Pro Val Gln Pro Pro Lys Arg Arg Arg Ile1 5 10 15

Gly Val Leu Thr Ser Gly Gly Asp Ala Pro Gly Met Asn Gly Val Val

20 25 30

Arg Ala Val Val Arg Met Ala Ile His Ser Asp Cys Glu Ala Phe Ala

35 40 45

Val Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Leu Val Asn Gly Gly Asp Met Ile Arg

50 55 60

Gln Leu His Trp Glu Asp Val Arg Gly Trp Leu Ser Arg Gly Gly Thr65 70 75 80

Leu Ile Gly Ser Ala Arg Cys Met Glu Phe Arg Glu Arg Pro Ile Arg

85 90 95

Leu Arg Ala Ala Lys Asn Met Val Leu Arg Gly Ile Asp Ala Leu Val

100 105 110

Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Leu Thr Gly Ala Asp Val Phe Arg Ser115 120 125

Glu Trp Pro Gly Leu Leu Lys Glu Leu Val Glu Thr Gly Glu Leu Thr

130 135 140

Glu Glu Gln. Val Lys Pro Tyr Gln Ile Leu Asn Ile Val Gly Leu Val145 150 155 160

Gly Ser Ile Asp Asn Asp Met Ser Gly Thr Asp Ala Thr Ile Gly Cys

165 170 175

Tyr Ser Ser Leu Thr Arg Ile Cys Asp Ala Val Asp Asp Val Phe Asp180 185 190

Thr Ala Phe Ser His Gln Arg Gly Phe Val Ile Glu Val Met Gly Arg195 200 205

His Cys Gly Trp Leu Ala Leu Met Ser Ala Ile Ser Thr Gly Ala Asp

210 215 220

Trp Leu Phe Val Pro Glu Met Pro Pro Lys Asp Gly Trp Glu Asp Asp225 230 235 240

Met Cys Ala Ile Ile Thr Lys Asn Arg Lys Glu Arg Gly Lys Arg Arg

245 250 255

Thr Ile Val Ile Val Ala Glu Gly Ala Gln Asp Arg His Leu Asn Lys260 265 270

Ile Ser Ser Ser Lys Ile Lys Asp Ile Leu Thr Glu Arg Leu Asn Leu275 280 285

Asp Thr Arg Val Thr Val Leu Gly His Thr Gln Arg Gly Gly Ala Ala

290 295 300

Cys Ala Tyr Asp Arg Trp Leu Ser Thr Leu Gln Gly Val Glu Ala Val305 310 315 320

Arg Ala Val Leu Asp Met Lys Pro Glu Ala Pro Ser Pro Val Ile Thr

325 330 335

Ile Arg Glu Asn Lys Ile Leu Arg Met Pro Leu Met Asp Ala Val Gln340 345 350

His Thr Lys Thr Val Thr Lys His Ile Gln Asn Lys Glu Phe Ala Glu355 360 365

Ala Met Ala Leu Arg Asp Ser Glu Phe Lys Glu Tyr His Phe Ser Tyr370 375 380

Ile Asn Thr Ser Thr Pro Asp His Pro Lys Leu Leu Leu Pro Glu Asn385 390 395 400

Lys Arg Met Arg Ile Gly Ile Ile His Val Gly Ala Pro Ala Gly Gly405 410 415

Met Asn Gln Ala Thr Arg Ala Ala Val Ala Tyr Cys Leu Thr Arg Gly

420 425 430

His Thr Pro Leu Ala Ile His Asn Gly Phe Pro Gly Leu Cys Arg His435 440 445

Tyr Asp Pro Gly450 452

<210> 2<211> 452<212> PRT<213> Aspergillus niger<220>

<223> Fosfofruto-l-quinase modificada curta<400> 2

Met Ala Pro Pro Gln Ala Pro Val Gln Pro Pro Lys Arg Arg Arg Ile

1 5 10 15

Gly Val Leu Thr Ser Gly Gly Asp Ala Pro Gly Met Asn Gly Val Val

20 25 30

Arg Ala Val Val Arg Met Ala Ile His Ser Asp Cys Glu Ala Phe Ala35 40 45

Val Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Leu Val Asn Gly Gly Asp Met Ile Arg50 55 60

Gln Leu His Trp Glu Asp Val Arg Gly Trp Leu Ser Arg Gly Gly Thr65 70 75 80

Leu Ile Gly Ser Ala Arg Cys Met Glu Phe Arg Glu Arg Pro Gly Arg85 90 95

Leu Arg Ala Ala Lys Asn Met Val Leu Arg Gly Ile Asp Ala Leu Val100 105 110Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Leu Thr Gly Ala Asp Val Phe Arg Ser

115 120 125

Glu Trp Pro Gly Leu Leu Lys Glu Leu Val Glu Thr Gly Glu Leu Thr

130 135 140

Glu Glu Gln Val Lys Pro Tyr Gln Ile Leu Asn Ile Val Gly Leu Val145 150 155 160

Gly Ser Ile Asp Asn Asp Met Ser Gly Thr Asp Ala Thr Ile Gly Cys

165 170 175

Tyr Ser Ser Leu Thr Arg Ile Cys Asp Ala Val Asp Asp Val Phe Asp

180 185 190

Thr Ala Phe Ser His Gln Arg Gly Phe Val Ile Glu Val Met Gly Arg

195 200 205

His Cys Gly Trp Leu Ala Leu Met Ser Ala Ile Ser Thr Gly Ala Asp

210 215 220

Trp Leu Phe Val Pro Glu Met Pro Pro Lys Asp Gly Trp Glu Asp Asp225 230 235 240

Met Cys Ala Ile Ile Thr Lys Asn Arg Lys Glu Arg Gly Lys Arg Arg

245 250 255

Thr Ile Val Ile Val Ala Glu Gly Ala Gln Asp Arg His Leu Asn Lys

260 265 270

Ile Ser Ser Ser Lys Ile Lys Asp Ile Leu Thr Glu Arg Leu Asn Leu

275 280 285

Asp Thr Arg Val Thr Val Leu Gly His Thr Gln Arg Gly Gly Ala Ala

290 295 300

Cys Ala Tyr Asp Arg Trp Leu Ser Thr Leu Gln Gly Val Glu Ala Val305 310 315 320

Arg Ala Val Leu Asp Met Lys Pro Glu Ala Pro Ser Pro Val Ile Thr

325 330 335

Ile Arg Glu Asn Lys Ile Leu Arg Met Pro Leu Met Asp Ala Val Gln

340 345 350

His Thr Lys Thr Val Thr Lys His Ile Gln Asn Lys Glu Phe Ala Glu355 360 365Ala Met Ala Leu Arg Asp Ser Glu Phe Lys Glu Tyr His Phe -Ser Tyr

370 375 380

Ile Asn Thr Ser Thr Pro Asp His Pro Lys Leu Leu Leu Pro Glu Asn385 390 395 400

Lys Arg Met Arg Ile Gly Ile Ile His Val Gly Ala Pro Ala Gly Gly

405 410 415

Met Asn Gln Ala Thr Arg Ala Ala Val Ala Tyr Cys Leu Thr Arg Gly

420 425 430

His Thr Pro Leu Ala Ile His Asn Gly Phe Pro Gly Leu Cys Arg His

435 440 445

Tyr Asp Pro Gly450 452<210> 3<211> 785<212> PRT

<213> Aspergillus niger<220>

<223> Fosfofruto-l-quinase<400> 3

Met Ala Pro Pro Gln Ala Pro Val Gln Pro Pro Lys Arg Arg Arg Ile1 5 10 15

Gly Val Leu Thr Ser Gly Gly Asp Ala Pro Gly Met Asn Gly Val Val

20 25 30

Arg Ala Val Val Arg Met Ala Ile His Ser Asp Cys Glü Ala Phe Ala

35 40 45

Val Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Leu Val Asn Gly Gly Asp Met Ile Arg

50 55 60

Gln Leu His Trp Glu Asp Val Arg Gly Trp Leu Ser Arg Gly Gly Thr65 70 75 80

Leu Ile Gly Ser Ala Arg Cys Met Thr Phe Arg Glu Arg Pro Gly Arg

85 90 95

Leu Arg Ala Ala Lys Asn Met Val Leu Arg Gly Ile Asp Ala Leu Val100 105 110

Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Leu Thr Gly Ala Asp Val Phe Arg Ser

115 120 125

Glu Trp Pro Gly Leu Leu Lys Glu Leu Val Glu Thr Gly Glu Leu Thr

130 135 140

Glu Glu Gln Val Lys Pro Tyr Gln Ile Leu Asn Ile Val Gly Leu Val145 150 155 160

Gly Ser Ile Asp Asn Asp Met Ser Gly Thr Asp Ala Thr Ile Gly Cys

165 170 175

Tyr Ser Ser Leu Thr Arg Ile Cys Asp Ala Val Asp Asp Val Phe Asp

180 185 190

Thr Ala Phe Ser His Gln Arg Gly Phe Val Ile Glu Val Met Gly Arg

195 200 205

His Cys Gly Trp Leu Ala Leu Met Ser Ala Ile Ser Thr Gly Ala Asp

210 215 220

Trp Leu Phe Val Pro Glu Met Pro Pro Lys Asp Gly Trp Glu Asp Asp225 230 235 240

Met Cys Ala Ile Ile Thr Lys Asn Arg Lys Glu Arg Gly Lys Arg Arg

245 250 255

Thr Ile Val Ile Val Ala Glu Gly Ala Gln Asp Arg His Leu Asn Lys

260 265 270

Ile Ser Ser Ser Lys Ile Lys Asp Ile Leu Thr Glu Arg Leu Asn Leu

275 280 285

Asp Thr Arg Val Thr Val Leu Gly His Thr Gln Arg Gly Gly Ala Ala

290 295 300

Cys Ala Tyr Asp Arg Trp Leu Ser Thr Leu Gln Gly Val Glu Ala Val305 310 315 320

Arg Ala Val Leu Asp Met Lys Pro Glu Ala Pro Ser Pro Val Ile Thr

325 330 335

Ile Arg Glu Asn Lys Ile Leu Arg Met Pro Leu Met Asp Ala Val Gln

340 345 350

His Thr Lys Thr Val Thr Lys His Ile Gln Asn Lys Glu Phe Ala Glu355 360 365

Ala Met Ala Leu Arg Asp Ser Glu Phe Lys Glu Tyr His Phe Ser Tyr

370 375 380

Ile Asn Thr Ser Thr Pro Asp His Pro Lys Leu Leu Leu Pro Glu Asn385 390 395 400

Lys Arg Met Arg Ile Gly Ile Ile His Val Gly Ala Pro Ala Gly Gly

405 410 415

Met Asn Gln Ala Thr Arg Ala Ala Val Ala Tyr Cys Leu Thr Arg Gly

420 425 430

His Thr Pro Leu Ala Ile His Asn Gly Phe Pro Gly Leu Cys Arg His

435 440 445

Tyr Asp Asp Thr Pro Ile Cys Ser Val Arg Glu Val Ala Trp Gln Glu

450 455 460

Ser Asp Ala Trp Val Asn Glu Gly Gly Ser Asp Ile Gly Thr Asn Arg465 470 475 480

Gly Leu Pro Gly Asp Asp Leu Ala Thr Thr Ala Lys Ser Phe Lys Lys

485 490 495

Phe Gly Phe Asp Ala Leu Phe Val Val Gly Gly Phe Glu Ala Phe Thr

500 505 510

Ala Val Ser Gln Leu Arg Gln Ala Arg Glu Lys Tyr Pro Glu Phe Lys

515 520 525

Ile Pro Met Thr Val Leu Pro Ala Thr Ile Ser Asn Asn Val Pro Gly

530 535 540

Thr Glu Tyr Ser Leu Gly Ser Asp Thr Cys Leu Asn Thr Leu Ile Asp545 550 555 560

Phe Cys Asp Ala Ile Arg Gln Ser Ala Ser Ser Ser Arg Arg Arg Val

565 570 575

Phe Val Ile Glu Thr Gln Gly Gly Lys Ser Gly Tyr Ile Ala Thr Thr

580 585 590

Ala Gly Leu Ser Val Gly Ala Val Ala Val Tyr Ile Pro Glu Glu Gly

595 600 605

Ile Asp Ile Lys Met Leu Ala Arg Asp Ile Asp Phe Leu Arg Asp Asn610 615 620

Phe Ala Arg Asp Lys Gly Ala Asn Arg Ala Gly Lys Ile Ile Leu Arg625 630 635 640

Asn Glu Cys Ala Ser Ser Thr Tyr Thr Thr Gln Val Val Ala Asp Met645 650 655

Ile Lys Glu Glu Ala Lys Gly Arg Phe Glu Ser Arg Ala Ala Val Pro

660 665 670

Gly His Phe Gln Gln Gly Gly Lys Pro Ser Pro Met Asp Arg Ile Arg675 680 685

Ala Leu Arg Met Ala Thr Lys Cys Met Leu His Leu Glu Ser Tyr Ala690 695 700

Gly Lys Ser Ala Asp Glu Ile Ala Ala Asp Glu Leu Ser Ala Ser Val705 710 715 720

Ile Gly Ile Lys Gly Ser Gln Val Leu Phe Ser Pro Met Gly Gly Glu725 730 735

Thr Gly Leu Glu Ala Thr Glu Thr Asp Trp Ala Arg Arg Arg Pro Lys

740 745 750

Thr Glu Phe Trp Leu Glu Leu Gln Asp Thr Val Asn Ile Leu Ser Gly755 760 765

Arg Ala Ser Va. 1 Asn Asn Alci Thr Trp Ser Cys Tyr Glu Asn Ais. Pro770 775 780

Gly785

<210> 4

<211> 2461

<212> DNA

<213> Aspergillus niger<220><400> 4

1 atggctcccc cccaagctcc cgtgcaaccg cccaagagac gccgcatcgg tgtcttgacc 6061 tctggtggcg atgctcccgg tatgaacggt gtcgtccggg ccgtcgtccg gatggctatc 120121 cactccgact gtgaggcttt cgccgtctac gaaggttacg agggtctcgt caatggcggc 180181 gacatgatcc gtcagcttca ctgggaggat241 ttgatcggtt ccgcccgctg catgaccttc301 aagaacatgg tcctccgtgg cattgacgcc361 actggtgccg acgtttttcg ttccgagtgg421 ggcgagttga ccgaagagca ggtcaagcca481 ggttcgatcg ataacgacat gtccggcacc541 actcgcatct gtgacgccgt cgacgacgtc601 ttcgtcattg aggtcatggg tcgtcactgc661 accggtgccg actggctgtt cgtgcccgag721 atgtgcgcta tcattaccaa ggtgggttga781 tcactaactc cccgcagaac agaaaggagc841 ccgagggtgc ccaggatcgc catctcaaca901 tgacggagcg gttgaacctg gatacccgtg961 gagccgcctg tgcgtacgac cgctggctgt1021 cggtgctgga catgaagccc gaagccccgt1081 tcttgcgcat gccgttgatg gacgccgtgc1141 agaacaagga gttcgccgaa gccatggccc1201 tttcctacat caacacttcc acgcccgacc1261 tttgtcgcca cagtagctgc ttcggtgctg1321 tattattcac gttggcgccc ccgctggtgg1381 ctactgcctg actcgtggcc acacccccct1441 ccggcactat gatgacaccc cgatctgctc1501 cgcctgggtc aacgagggtg gttcggatat1561 cctcgcgacc acggcgaaga gcttcaagaa1621 tggatttgag gcgttcaccg ccgtcagcca1681 attcaagatt cccatgaccg tgctgccggc1741 atactctctg ggtagcgaca cctgccttaa1801 ccagtcggcc tcgtcctctc gtcgccgtgt1861 gggttacatc gccacgacgg ctggtctgtc1921 ggagggcatc gacattaaga tgctggcccg1981 gcgcgacaag ggagcgaacc gcgccggtaa2041 cacgtacacg acacaggtgg tggccgacat

gttcgcggct ggttgtcccg tggtggtacc 240cgtgagcgcc ccggtcgtct gcgggctgcc 300cttgtcgtct gtggtggtga tggcagtttg 3 60cccggtctgt tgaaggaatt ggtcgagacg 420taccagattc tgaacatcgt cggtttggtg 480gacgccacca tcggttgcta ctcctccctc 540ttcgatactg ccttttccca ccagcgtgga 600ggttggctgg ccttgatgtc tgctatcagt 660atgccgccca aggacggatg ggaggatgac 720tcggaacttg gtggagagaa ctcagaggca 780gtggaaagcg taggacgatc gtcatcgtgg 840agatctcgag ttcgaagatc aaggatattt 900tgactgtgtt gggtcacact cagagaggtg 960ccacactgca gggtgtcgag gctgtccgcg 1020ccccggtcat caccatccgt gagaacaaga 1080agcacaccaa gactgtcacc aagcacattc 1140tccgcgactc ggaattcaaa gagtaccact 1200acccgaagct gctcctccca gagaacaagg 1260agctaacaaa aggcagagaa tgcgcatcgg 1320tatgaaccag gctacccgcg cggccgttgc 1380ggccattcac aacggtttcc ccggtctgtg 1440tgtgcgcgag gtggcatggc aggaatcgga 1500cggtaccaac cgtggtctgc ccggcgatga 1560gttcggattc gatgcgttgt tcgtcgtggg 1620gcttcgccag gcgcgcgaga agtaccccga 1680gaccatttcc aacaacgtgc cgggcacaga 1740caccttgatc gacttctgcg acgccatccg 1800gttcgtcatc gagacgcagg gtggcaagtc 1860ggtgggcgcg gtagccgtgt acattcccga 1920cgacattgac ttcctgcgtg acaactttgc 1980gatcatcctg cgtaacgagt gcgcgtccag 2040gatcaaggag gaagccaagg gacgtttcga 21002101 gagtcgtgcg gcggtgccgg gacacttcca gcagggtggc aagccgtcgc cgatggaccg 21602161 tatccgggcg ttgcggatgg ccaccaagtg tatgctgcac ctggagagct atgcgggcaa 22202221 gtcggcggat gagattgcgg ccgatgagct gtctgcgtcg gtcattggta tcaagggctc 22802281 gcaggtgttg ttctcgccga tgggtggaga gaccggcctg gaggcgaccg agacggactg 23402341 ggcgcgccgt cgacccaaga cggagttctg gctggagctg caggacacgg tgaacattct 24002401 gtcgggacgg gcgagcgtga acaacgcgac gtggagttgc tatgagaatg ctcccgggta 24612461 a 2461<210> 5<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo especifico gpdA sentido<400> 5

1 gagctcgtga ccggtgactc tttc 24<210> 6<211> 32

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo específico gpdA anti-sentido<400> 6

1 tctagatgca tatgggtgat gtctgctcaa gc 32<210> 7<211> 43<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo específico trpC sentido<400> 7

1 ccatgggtct agacggatcc tagtgattta atagctccat gtc 43<210> 8<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo especifico trpC anti-sentido<400> 8

1 gaattcaagc ttccgcggcc gggtattggg tg 32<210> 9<211> 29<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo específico Ndel/Apal ATT BaroHI sentido da pfk<400> 9

1 ccgcggatgc atatggctcc cccccaagc 29<210> 10<211> 37<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo específico Ndel/Apal ATT BamHI antisentido da pfk<400> 10

1 tggatcctta cccgggatca tagtgccggc acagacc 37<210> 11<211> 31<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo T89E sentido da pfk<400> 11

1 ccgcccgctg catggagttc cgtgagcgcc c 31<210> 12<211> 31<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo Τ89Ε anti-sentido da pfk<400> 12

1 gggcgctcac ggaactccat gcagcgggcg g 31<210> 13<211> 41<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo G95I sentido da pfk<400> 13

1 ccgctgcatg gagttccgtg agcgccccat ccgtctgcgg g<210> 14<211> 41<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo G95I anti-sentido da pfk<400> 14

1 cccgcagacg gatggggcgc tcacggaact ccatgcagcg g<210> 15<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<22 0>

<223> Oligonucleotídeo 297 sentido da pfk<400> 15

1 ccatcgcacg catatggctc c 21<210> 16<211> 45<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotideo 297 anti-sentido da pfk<400> 16

atgttctcgt cacggaactc ggggaagcgg gcggaaccga tcaag<210> 17<211> 39<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotideo 1128 sentido da pfk<400> 17

cccgagttcc gtgacgagaa catccgtctg cgggctgcc 39<210> 18<211> 46<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotideo 1128 anti-sentido da pfk<400> 18

taggcgttta tcgctgcttc tagaggatcc ttacccggga tcatag<210> 19<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotideo de ligação 1 da pfk<400> 19

ccatcgcacg catatggctc c 21<210> 20<211> 46<212> DNA

<213> Seqüência artificial220>

223> Oligonucleotídeo de ligação 2 da pfk400> 20taggcgttta tcgctgcttc tagaggatcc ttacccggga tcatag

Claims (25)

1. Gene codificando o fragmento geneticamente modificado cur-to da 6-fosfofruto-1-quinase, sem fosforilação da molécula de proteína ne-cessária para ativação,caracterizado pelo fato de que perde menos de 30% da atividadeenzimática na presença de ácido cítrico e/ou sais de ácido cítrico em umaconcentração de até 15 mM e ATP em uma concentração de até 1,5 mM,que é ativado pela frutose-2,6-bisfosfato, íons amônio e AMP1que está codificando uma proteína a qual difere de pelo menosum resíduo de aminoácido de uma proteína do fragmento PFK1 mais curto,cujo gene está presente nos genomas de origem microbiana, animal e vege-tal.

2. Gene codificando o fragmento PFK1 geneticamente modifica-do curto, sem fosforilação da molécula de proteína necessária para ativação,de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a massamolecular da proteína codificante é maior do que 30 KDa e menor do que 55KDa.

3. Gene codificando o fragmento PFK1 geneticamente modifica-do curto, sem fosforilação da molécula de proteína necessária para ativação,de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteínado fragmento mais curto não contém a parte N- e/ou C-terminal da 6-fosfofruto-1-quinase natural.

4. Gene codificando o fragmento PFK1 geneticamente modifica-do curto, sem fosforilação da molécula de proteína necessária para ativação,de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelofato de que a proteína codificante difere por pelo menos um resíduo de ami-noácidos da seqüência de aminoácidos do fragmento PFK1 mais curto, cujogene está presente nos genomas de origem microbiana, animal ou vegetal.

5. Gene codificando o fragmento PFK1 geneticamente modifica-do curto, sem fosforilação da molécula de proteína necessária para ativação,de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteínacodificante difere em pelo menos um resíduo de aminoácido da seqüênciade aminoácidos do fragmento PFK1 mais curto, cujo gene está presente emgenomas de origem microbiana, preferivelmente fungos e leveduras.

6. Gene codificando o fragmento PFK1 geneticamente modifica-do curto, sem fosforilação da molécula de proteína necessária para ativação,de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteínacodificante difere em pelo menos um resíduo de aminoácido da seqüênciade aminoácidos do fragmento PFK1 mais curto, cujo gene está presente emgenomas de origem fúngica, preferivelmente em fungos filamentosos e leve-duras.

7. Gene codificando o fragmento PFK1 geneticamente modifica-do curto, sem fosforilação da molécula de proteína necessária para ativação,de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteínacodificante difere em pelo menos um resíduo de aminoácido da seqüênciade aminoácidos do fragmento PFK1 mais curto, cujo gene está presente emgenomas de fungos filamentosos, leveduras, preferivelmente dos gênerosAspergillus, Trichoderma, Penicillium, Pichia, Saccharomyces, Sehizosae-eharomyees, Candida, Kluyveromyces, Neurospora.

8. Gene codificando o fragmento PFK1 geneticamente modifica-do curto, sem fosforilação da molécula de proteína necessária para ativação,de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelofato de que a proteína codificante difere em pelo menos um resíduo de ami-noácido da seqüência de aminoácidos do fragmento PFK1 mais curto, cujogene está presente no genoma de fungos filamentosos, preferivelmente emAspergillus niger.

9. Gene codificando o fragmento PFK1 geneticamente modifica-do curto, sem fosforilação da molécula de proteína necessária para ativação,de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 8, caracterizadopelo fato de que a codificação de uma proteína com a seqüência de resíduosde aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:2, que difere em pelo menosum resíduo de aminoácido da seqüência de aminoácidos do fragmento PFK1mais curto da seqüência SEQ ID NO: 3, cuja seqüência do gene SEQ ID NO:-4 está presente no genoma do fungo Aspergillus niger.

10. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que carrega ogene como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 que está fun-cionalmente conectado às seqüências de controle, promotor e outras se-qüências de DNA relevantes, permitindo a expressão do gene como definidoem qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 10, ca-racterizado pelo fato de que permite a expressão do gene como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 9 em células hospedeiras eucarióticasou em células hospedeiras procarióticas.

12. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 10 ou 11,caracterizado pelo fato de que permite a expressão do gene como definidoem qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em células hospedeiras eucarióti-cas, preferivelmente em leveduras e fungos filamentosos.

13. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que permite a expressão dogene como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em fungosfilamentosos, preferivelmente nos gêneros Aspergillus, Trichoderma, Penicil-lium; leveduras, preferivelmente nos gêneros Pichia, Saccharomyces, e bac-térias nos gêneros Acetobacter, Escherichia, Bacillus, Streptomyces e Zy-momonas.

14. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma reivindica-ções 10 a 13, caracterizado pelo fato de que permite a expressão do genecomo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em fungos filamen-tosos dos gêneros Aspergillus, preferivelmente em Aspergillus niger, Asper-gillus terreus e Aspergillus oryzae.

15. Organismos, caracterizados pelo fato de que possuem o ge-ne codificando o fragmento PFK1 geneticamente modificado mais curto co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e/ou o vetor de ex-pressão como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 14, em queo gene e/ou vetor de expressão que corresponde a um organismo específicoé inserido em um organismo específico com técnicas apropriadas conheci-das pelos especialistas do campo, permite a expressão do gene como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

16. Organismos, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-dos pelo fato de que são de origem microbiana, animal ou vegetal.

17. Organismos, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, carac-terizados pelo fato de que são de origem microbiana.

18. Organismos, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, carac-terizados pelo fato de que são de cultura tecidual de origem vegetal.

19. Organismos, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, carac-terizados pelo fato de que são de cultura tecidual de origem animal.

20. Organismos, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 15 a 17, caracterizados pelo fato de que são fungos filamentosos, leve-duras e bactérias.

21. Organismos, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 15 a 17, caracterizados pelo fato de que são fungos filamentosos, pre-ferivelmente dos gêneros Aspergillus, Trichoderma, Penicillium·, leveduras,preferivelmente dos gêneros Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomycese bactérias dos gêneros Acetobacter, Escherichia, Bacillus, Streptomyces,Zymomonas.

22. Organismos, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 15 a 17, caracterizados pelo fato de que são fungos filamentosos, pre-ferivelmente dos gêneros Aspergillus, preferivelmente Aspergillus niger, As-pergillus terreus, Aspergillus oryzae.

23. Uso do gene codificando fragmentos PFK1 geneticamentemodificados curtos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a-9, e/ou do vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindi-cações 10 a 14 e/ou do organismo como definido em qualquer uma das rei-vindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de ser para preparar uma com-posição para aumentar o fluxo metabólico através da glicólise para intensifi-car a reação anaplerótica durante os processos de formação de bioprodutos.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelofato de que os bioprodutos são preferivelmente biomassa celular; proteínashomólogas e heterólogas; metabólitos primários tais como etanol, acetato,lactato, ácidos orgânicos, aminoácidos, polióis; metabólitos secundários taiscomo: antibióticos, alcalóides da ergotina, estatinas, vitaminas, imunomodu-ladores, citostáticos, inseticidas e herbicidas.

25. Procedimento para a formação de bioprodutos caracterizadopelo fato de que inclui o uso do gene como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, que é inserido no vetor de expressão como definido emqualquer uma das reivindicações 10 a 14 e transferido para o organismocomo definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 22 e que o orga-nismo cresce de modo que permita a síntese de bioprodutos.