KR100293571B1 - 병원성대장균의신속검출을위한멀티플렉스pcr기법및이를위한pcr프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가축에서 설사를 일으키는 병원성 대장균이 지닌 장독소 생성유전자들을 신속하게 확인할 수 있는 멀티플렉스 PCR 기법(multiplex polymerase chain reaction-based method)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 공지의 이열성독소(LT : heat-labile enterotoxin) 생성유전자에 대한 PCR 프라이머(primer)와 함께 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 내열성독소(ST : heat-stable enterotoxin) 생성유전자에 대한 PCR 프라이머를 개발하고, 이들 프라이머들을 동시에 이용하는 대장균 장독소 유전자의 동시 검출을 위한 멀티플렉서 PCR 기법에 관한 것이다.

본 발명에 의해 제공되는 내열성독소(STIa) 생성유전자에 대한 PCR 프라이머는, 공지의 LT 생성유전자에 대한 PCR 프라이머와 함께 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있어, 1회의 PCR 수행으로 대장균의 병원성 인자인 2종의 장독소 생성유전자를 동시에 검출할 수 있으며, 각종 생화학적 시험과 혈청학적 시험을 거치지 않고서도 대장균 설사증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.

Description

병원성 대장균의 신속 검출을 위한 멀티플렉스 PCR 기법 및 이를 위한 PCR 프라이머{Multiplex polymerase chain reaction-based method for fast detecting of pathological Escherichia Coil and PCR primers used for this method}

본 발명은 가축에서 설사를 일으키는 병원성 대장균이 지닌 독소 생성유전자들을 신속하게 확인할 수 있는 멀티플렉스 PCR 기법(multiplex polymerase chain reaction-based method)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 공지의 이열성독소(LT) 생성유전자에 대한 PCR 프라이머(primer)와 함께 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 내열성독소(ST) 생성유전자에 대한 PCR 프라이머를 개발하고, 이들 프라이머들을 동시에 이용하는 대장균 장독소 유전자의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 PCR 기법에 관한 것이다.

대장균성 설사증은 어린 돼지와 송아지에서 설사를 주 증상으로 하며, 심한 경우에는 탈수로 인한 폐사를 일으키며, 세균성 설사병중 그 발생이 가장 높은 질병이다. 대장균성 설사증은 병원성 대장균이 오염된 사료, 물 및 기타 환경의 오염원으로부터 어린 돼지와 송아지의 경구를 통해서 감염되며, 일단 감염된 병원성 대장균은 소장 점막에 부착후 증식을 하며, 증식한 대장균은 장독소를 분비함으로써 설사를 유발시킨다. 이러한 병원성 발현 기전에 따라, 병원성 대장균은 크게 두가지 병원성 인자 -- 소장 점막에의 부착을 유도하는 부착인자로서 섬모항원과, 증식된 대장균으로부터 분비되는 장독소--를 갖고 있다.

증식된 병원성 대장균에 의해 분비되는 장독소는 장관내의 삼투압을 변화시켜서 설사를 유발시킨다. 장독소는 열의 저항성에 따라서 내열성독소(ST : heat-stable enterotoxin)와 이열성독소(LT : heat-labile enterotoxin)로 크게 나누며, 내열성독소(ST)는 그 기원에 따라 STIa(p), STIb(h), STⅡ로 나눌 수 있으며, 이중 STIa(p)는 소, 돼지 등의 동물에서 분리되는 대장균 균주에 의해 생산되며, STIb(h)는 오직 사람에서 분리되는 대장균 독소에 의해 생산된다.

대장균증의 진단을 위해서는, 우선 병원성 대장균과 정상적으로 장관내에 존재하는 비병원성 대장균과의 구별이 요구된다.

많은 연구자들은 가축에서 설사를 일으키는 병원성 대장균의 특성을 밝히기 위하여 대장균이 갖고 있는 O, K, H 항원을 이용하여 분류를 시도하였다. 이 방법은 가축에서 설사를 일으키는 대장균을 분리하여 혈청형을 조사해 본 결과 어느 정도 특정의 혈청형에 속함을 알고 개발된 것으로, 특정의 O, K, H 항원을 갖는 대장균은 병원성이 있고, 나머지는 비병원성인 것으로 구분하려는 시도였다. 그러나, 혈청형을 나타내는 O, K, H 항원은 직접적인 병원성 인자가 아니며, 병원성과 관련된 인자는 대부분이 대장균의 플라스미드(plasmid) 유전자를 통하여 전이가 되므로, 혈청형의 분류방법은 대장균의 병원성 유물를 밝히는데 적합하지 못하다.

최근 분자생물학적 기법의 발달로, 게놈 DNA 중의 특정부위의 유전자만을 증폭시키는 것이 가능해졌으며, 증폭된 유전자 산물을 전기영동을 통하여 확인함으로써 특정 세균종의 DNA 다형성을 검출 지단하는 방법이 개발되었다. 이 방법은 프라이머(primer)라 불리우는 10-20bp로 구성된 특정 DNA 단편을 이용하는 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)에 기초한 것으로서, 민감도 및 특이성이 뛰어나며, 시료의 처리과정 및 수행과정이 비교적 간편하다.

병원성 대장균의 장독소 생성유전자의 검출에도 이러한 PCR기법이 도입되어, LT의 경우 많은 프라이머들이 개발되어, 이를 이용한 PCR기법들이 소개되었다. LT 생성유전자는 기원에 상관없이 상동성(homology)이 매우 높아서 그의 PCR용 프라이머는 소, 돼지 등의 동물 유래의 대장균이든지 사람 유래의 대장균이든지 상관없이 이용할 수 있다. 반면, ST 생성유전자는 그의 염기서열에 있어서 기원에 따라 약 70% 정도의 상동성을 나타내기 때문에 프라이머 자체 개발이 미진하며, 일반적으로 대장균의 기원에 따라 구분하여 사용하고 있다. 또한, ST 생성유전장 대한 PCR 프라이머의 개발에 있어서, 유전자의 크기가 매우 작아서(약 219bp) 프라이머의 개발을 더욱 어렵게 만든다.

이에, 본 발명자들은 가축에서의 설사를 일으키는 병원성 대장균의 신속 검출을 위하여 STIa(p) 유전자의 염기서열을 기초로하여 프라이머의 개발에 착수하였으며, 나아가 공지의 LT 생성유전자에 대한 PCR용 프라이머와 함께 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있도록 공통의 반응조건을 갖는 프라이머의 개발에 주력하여 왔다. 그 결과로서 STIa 유전자에 대한 PCR용 프라이머를 합성하였으며, 공지의 LT 프라이머와 본 발명에서 개발된 STIa 프라이머를 한번의 PCR 반응에 동시에 적용하여 1회의 PCR 수행으로 2중의 장독소를 동시에 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 내열성독소 STIa 유전자에 대한 PCR용 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 공지의 LT 프라이머와 함께 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 STIa 유전자에 대한 PCR용 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기한 STIa 프라이머와 공지의 LT 프라이머를 동시에 이용하는, 병원성 대장균의 2종의 장독소의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 PCR 기법을 제공하는 것이다.

제1도는 장독소 LT 또는 ST를 생성하는 3종의 표준균주에 대하여 본 발명의 멀티플렉스 PCR 기법을 수행한 결과로서, 특정부위의 유저자 증폭산물을 확인할 수 있다.

레인 1 ... 100bp 크기의 표지 DNA

레인 2 ... 장독소 LT 및 ST 생성유전자를 지닌 표준균주 S-97

레인 3 ... 내열성독소 ST 생성유전자를 지닌 표준균주 S-98

레인 4 ... 이열성독소 LT 생성유전자를 지닌 표준균주 S-99

제2도는 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 기법의 민감도 시험 결과로서, 병원성 대장균의 3종의 표준균주로부터 분리한 유전자를 각각 10배 단위로 희석하여 PCR을 수행한 결과, LT, ST 생성유전자 모두 0.1ng까지의 유전자를 검출할 수 있었다.

레인 1 ... 100bp 크기의 표지 DNA

레인 2∼5 ... 이열성독소 LT 생성유전자를 지닌 표준균주 S-99

레인 6∼9 ... 내열성독소 ST 생성유전자를 지닌 표준균주 S-98

본 발명에 따른 STIa 프라이머는 돼지로부터 분리해 낸 대장균의 STIa(p) 유전자의 염기서열을 기초로하여 합성된 것이다.

특정 유전자 검출을 위한 PCR 기법은 한쌍의 프라이머 - Forwrd 프아리머와 Reverse 프라이머 -를 이용하게 되는데, 이를 프라이머의 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg²⁺의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.

또, 본 발명에서와 같이 2종의 장독소에 대한 PCR 프라이머를 혼합하여 동시에 한번의 PCR을 수행함으로써 분리한 대장균이 2종의 장독소 유전자를 한번에 확인하는 멀티플렉서 PCR 반응에서는, 프라이머의 설계시 단독 PCR의 경우와 같은 조건이 더욱 엄격하게 요구되며, 또한 반응완료 후 겔상에서 증폭된 유전자 산물의 구별을 위해서는 유전자 산물의 크기가 각각 구별이 되어야 하는 크기의 제약까지 따른다. 반응조건의 설정에 있어서도 2쌍의 프라이머 모두에 대한 공통의 반응조건이 설정되어야 하므로 단독 PCR에 비해서 매우 어려운 조건 설정 과정이 요구된다.

본 발명에 의해 제공되는 STIa 프라이머는 공지의 LT 프라이머와 함께 멀티플렉스 PCR 기법에 적용될 수 있도록 개발된 것으로서, 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있어 1회의 PCR 수행으로 2종의 장독소를 동시에 고감도로 검출할 수 있다. 본 발명에서 이용한 공지의 LT 프라이머와, 본 발명에서 개발된 STIa 프라이머는 다음과 같다.

본 발명의 2종의 장독소에 대한 각쌍의 프라이머들은 공통의 PCR 조건을 갖고 있어 한번의 PCR 반응에 동시에 적용하는 것을 가능케한다. 본 발명의 프라이머들의 PCR 조건은 다음과 같다.

PCR 반응은 특별한 언급이 없는 한, 우선 주형이 되는 DNA를 1본쇄로 변성시키기 위하여 95℃에서 5분간 열처리를 한 후, 95℃에서 1분간 DNA를 변성시키는 단계(denaturation); 54℃에서 1분간 프라이머와 접촉시키는 단계(annealing); 72℃에서 1분간 DNA를 합성하는 단계(extension)를 총 35회 반복하여 PCR 증폭을 실시하여, 마지막 DAN 합성단계는 72℃에서 5분간 실시한다. 반응이 끝난 PCR 증폭 산물을 1.8∼2%의 아가로스 겔에서 전기영동을 실시한 다음, 브로모에티듐으로 염색한후 DNA 다형성을 확인한다.

본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 기법은 단 한번의 PCR을 수행함으로써 분리된 대장균이 2종의 장독소 유전자를 동시에 확인할 수 있으며, 특허 2종의 장독소를 동시에 생성하는 균주에 대해서도 한번에 확인이 가능하다. 즉, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 기법은 대장균 설사증의 진단에 효과적으로 사용될 수 있으며, 대장균 설사증으로 인한 경제적 피해를 최소하하는데 크게 기여할 것으로 기대된다.

이하, 실시예를 기초로 하여 본 발명이 개발한 멀티플렉스 PCR 기법의 작용 효과를 구체적으로 설명한다.

[실시예 1] 멀티플렉스 PCR 기법의 표준균주 적용시험 :

장독소 LT 또는 ST를 생성하는 3종의 표준균주에 대하여 본 발명의 멀티플렉스 PCR 기법을 수행하였다. 표준균주 S-97은 이열성독소 LT 및 내열성독소 ST 생성 유전자를 모두 지닌 균주이며, S-98은 내열성독소 ST 생성유전자를, S-99는 이열성 독소 LT 생성유전자를 지닌 균주이다. 이들 표준균주로부터 주형이 되는 유전자를 추출하여 상기한 PCR 조건으로 PCR 증폭을 실시하였다. 반응 종료후 2%의 아가로스 겔을 이용하여 전기영동을 실시하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.

LT 생성유전자는 417bp에서, ST 생성유전자는 165bp에서 확인되었다.

[실시예 2] 민감도 시험 :

병원성 대장균의 2종의 표준균주로부터 분리한 유전자를 각각 10배 단위로 희석항 본 발명의 멀티플렉스 PCR 기법을 수행한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, LT, ST 생성유전자 모두 0.1ng까지의 유전자를 검출할 수 있었다.

[실시예 3] 멀티플렉스 PCR 기법의 야외분리주 적용시험 :

강원도 지역 돼지 설사발생 농장에서 분리된 대장균 29주를 대상으로 본 발명의 멀티플렉스 PCR 기법을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

이상에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 내열성독소(STIa) 생성유전자에 대한 PCR 프라이머는, 공지의 LT 생성유전자에 대한 PCR 프라이머와 함께 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있어, 1회의 PCR 수행으로 대장균의 병원성 인자인 2종의 장독소 생성유전자를 동시에 검출할 수 있다.

정리하면, 본 발명에서 개발한 멀티플렉스 PCR 기법은 가축의 대장균성 설사증의 최종 진단방법으로 이용할 수 있으며, 균을 의심되는 재료에서 분리하거나 혹은 바로 재료에 본 발명의 멀티플렉스 PCR 기법을 직접 적용함으로써, 병원성 대장균의 확인을 위한 각종 생화학적 시험과 혈청학적 시험을 거치지 않고서도, 대장균 설사증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있으며, 대장균 설사증으로 인한 경제적 피해를 최소화할 수 있다.

Claims (2)

1. 가축의 병원성 대장균의 신속 검출을 위한 멀티플렉스 PCR 기법에 있어서, 이열성독소(LT) 및 내열성독소(ST) 생성유전자에 대한 PCR용 프라이머로서, 하기의 염기서열을 갖는 프라이머를 동시에 사용하을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 기법 :
2. 제 1 항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 내열성독소(ST) 생성유전자를 검출하기 위한, 하기 염기서열을 갖는 PCR용 프라이머 :