KR100894617B1 - 엔테로바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한엔테로바이러스 ｐｃｒ 검출 방법 - Google Patents

엔테로바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한엔테로바이러스 ｐｃｒ 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엔테로바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 역전사 반응 및 2단계 PCR로 구성된 검출 방법을 통하여 효과적으로 엔테로바이러스의 켑시드 단백질인 VP1 및 VP3 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머들과, 이들 프라이머들을 이용한 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 엔테로바이러스의 검출에 활용될 수 있는 프라이머들 및 이들을 이용한 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법을 제공한다. 본 발명은 현재 유행하는 모든 종류의 엔테로바이러스의 검출이 가능하여 일차적으로 엔테로바이러스의 감염 진단 및 엔테로바이러스 관련 질환의 진단에 효과적으로 활용될 수 있으며 또한 엔테로바이러스 감염 진단 키트로도 구현이 가능하다. 더 나아가 본 발명을 따르면, 각 검출된 엔테로바이러스의 종류의 판별을 위한 목적의 타이핑에도 활용될 수 있다.
엔테로바이러스, PCR, 프라이머, 검출, 감염, 질환, 진단, 타이핑

Description

엔테로바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 엔테로바이러스 ＰＣＲ 검출 방법{Primer capable of detecting enterovirus and PCR-based enterovirus detection method using the same}
본 발명은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 엔테로바이러스(Enterovirus)를 검출(detection)하고, 더 나아가 엔테로바이러스에 의한 감염(infection)을 진단(diagnosis)하는 방법 및 이에 필요한 프라이머(primer)에 관한 것이다. 구체적으로, 폴리오바이러스(poliovirus), 콕사키바이러스 A(Coxsackievirus A), 콕사키바이러스 B(Coxsackievirus B), 에코바이러스(Echovirus) 및 근래 새로운 번호를 부여하여 분류된 기타 엔테로바이러스(numbered enteroviruses)를 포함하는 모든 종류의 엔테로바이러스를 검출하는 데에 효과적으로 활용될 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 PCR 검출 방법에 관한 것으로서, 엔테로바이러스의 감염 진단에 활용될 수 있는 검출 기술에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각 검출된 엔테로바이러스의 종류의 판별을 위한 타이핑(typing)에도 활용 가능하다.
PCR은 DNA의 원하는 부분의 복사본(copy)의 수를 기하급수적(exponentially)으로 증폭시킬 수 있는 분자생물학적(molecular biological) 방법이다. DNA의 어느 부분이든지 그 서열(sequence)만 알면 PCR을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 처음 고안된 후, 유전자를 연구 및 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 활용되었으며 현재에도 널리 이용되고 있는 실험기법이다. PCR은 DNA 중합효소(polymerase)에 의한 DNA 복제(replication)의 특징을 이용한 기법이다. DNA 중합효소는 외가닥(single stranded) DNA를 주형(template)으로 해서 상보적인(complementary) DNA를 합성(synthesis)할 수 있는데, 이러한 외가닥 DNA는 두 가닥(double stranded) DNA를 끓임(boiling)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 이 과정을 DNA 변성(denaturation)이라 한다. DNA 중합효소가 DNA 합성을 시작하기 위해서는 시작 부위(start site)가 두 가닥 DNA 형태로 되어 있어야 한다. 따라서 PCR에서는 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단(terminus)에 주형 DNA와 상보적으로 결합(annealing)할 수 있는 작은 DNA 조각(fragment)을 함께 넣어 주어야 하며 이것이 특정 DNA 서열의 양 끝에 결합하여 특정 DNA의 양 끝이 두 가닥 DNA 형태가 된다. 이럴 경우에만 DNA 중합효소에 의한 DNA 합성이 개시될 수 있다. 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머 또는 줄여서 프라이머라 한다. 일단 프라이머가 주형 DNA에 결합한 후에는 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 신장(extension)된다. 이런 일련의 기작에 PCR 반응이 기반하기 때문에 PCR 주기(cycle)는
1) 두 가닥 주형 DNA를 외가닥 DNA로 바꾸어 주는 변성 단계,
2) 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 결합 단계, 및
3) DNA 중합효소의 작용으로 주형 DNA에 상보적 DNA가 합성되는 신장 단계
의 3단계로 구성된다. 최초 1회의 PCR 주기가 끝난 후에 그 다음으로 이어지는 PCR 주기에서는 최초(original) 주형과 PCR에 의해 새로 합성된 DNA인 PCR 산물(PCR product) 모두가 다음 PCR 주기에서는 PCR 주형(PCR template)이 된다. 이렇게 PCR은 주기가 계속적으로 반복될수록 PCR 주형으로 작용할 수 있는 분자(molecule)의 수는 계속 늘어나게 된다. 따라서 n번의 PCR 주기 후에는 이론적으로 2n 개의 두 가닥 DNA가 존재하게 된다. 즉, 1 개의 최초 주형 DNA로부터 (2n -1) 개의 복사본이 합성된 꼴이다.
최근까지 개발된 PCR 기법으로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료(sample)의 정제 과정을 생략하고자 하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응(reverse transcription)과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용하게 한 역전사 효소-PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitoring)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR), 1차 PCR과 2차 PCR로 구성된 두 단계의 PCR을 통하여 민감도(sensitivity)를 개선시킨 네스티드 PCR(nested PCR) 등이 있다. 이외에도 매우 많은 PCR 기법들과 PCR 관련 기술들이 개발 되었다. 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 현재 PCR은 다양한 연구 및 응용 분야에서 활용되고 있으며, 대부분의 생물학 관련 연구 분야에 있어 강력한 실험 기법이 되었다(Science 252: 1643-1651, 1991).
시료 중에 어떤 유전체(genome)의 존재 여부의 확인(identification)을 통하여 그 유전체를 가진 박테리아(bacteria)나 바이러스(virus)가 시료 속에 존재하고 있음을 판정하는 PCR에 기반한 박테리아나 바이러스의 검출 기술은 이제는 일반적인 기술이 되었다고 할 수 있으며, 현재 매우 널리 활용되고 있다. 이런 PCR에 기반한 박테리아나 바이러스의 검출 기술은 박테리아나 바이러스에 관련된 감염성 질환(infectious disease)의 진단 목적으로 질병 진단 분야에서 활발하게 활용되고 있다(Virol. Methods 66: 39-50, 1997; Clin. Microbiol. 35: 2076-2082, 1997). 이러한 감염 원인체의 유전체에 기반한 진단법인 PCR 진단은 PCR 주형인 유전체로부터 다수의 증폭 산물을 만들 수 있는 PCR의 고유한 특징으로 인하여 타 진단 방법에 비하여 매우 높은 진단 민감도를 제공해 줄 수 있다. 높은 민감도를 제공해 줄 수 있다는 점과 진단에 필요한 소요 시간이 타 방법에 비교하여 매우 짧다는 이유로 인하여 PCR을 이용한 진단 방법이 점차적으로 타 진단 방법을 대체해 가고 있다.
엔테로바이러스는 피코르나비리대 과(Picornaviridae family) 엔테로바이러스 속(Enterovirus genus)에 속하며 24-30 nm 크기를 가지는 매우 작은 정이십면체의 피막이 없는 바이러스이다. 유전체로 단일가닥의 RNA를 가지기 때문에 RNA 바이러스로 분류된다. 엔테로바이러스의 경우, 바이러스의 유전체를 둘러싸고 있는 단백질 껍질인 캡시드(capsid)는 12개의 펜타머(pentamer)로 구성되어 있으며, 각각의 펜타머는 VP1, VP2, VP3, VP4의 네 가지 폴리펩티드(polypeptide)로 이루어진 5개의 프로토머(protomer)로 구성되어 있다. 인간과 동물에게서 질환을 일으키는 엔테로바이러스는 폴리오바이러스(poliovirus)와 비폴리오 엔테로바이러스(non-polio enteroviruses)로 크게 구분되며, 비폴리오 엔테로바이러스는 다시 콕사키바이러스 A, 콕사키바이러스 B, 에코바이러스, 및 기타 엔테로바이러스로 구분된다.
상세하게, 콕사키바이러스 A에는 혈청형(serotype)에 따라 A1형부터 A22형까지와 A24형으로 나뉘어져 총 23종이 있으며, 콕사키바이러스 B에는 B1형부터 B6형까지로 나뉘어져 총 6종이 있다. 따라서 현재까지 알려진 콕사키바이러스의 혈청형은 모두 29종이다. 또 에코바이러스는 28개의 혈청형으로 구분된다. 근래에는 바이러스의 성상과 분류 사이에 일치하지 않는 경우가 자주 발생하여 이를 개선하기 위해 새로 분리된 엔테로바이러스를 에코바이러스나 콕사키바이러스로 분류하지 않고 새로운 번호를 부여하여 분류하고 있는데, 이를 본 명세서에서는 “기타 엔테로바이러스”로 지칭하였다. 이를 “신종 엔테로바이러스(new enterovirus)”라고 부르기도 한다. 기타 엔테로바이러스의 예로 엔테로바이러스 70, 엔테로바이러스 71, 엔테로바이러스 72, 엔테로바이러스 73 등을 들 수 있다. 엔테로바이러스 70은 급성출혈성 결막염의 원인 바이러스로 1969년에 아프리카의 가나에서 크게 유행한 바 있는데, 이 무렵 미국에서 아폴로 11호의 달 착륙이 있었기 때문에 이 바이러스에 의한 감염증을 아폴로 눈병이라 부르기도 했었다. 이후 이 엔테로바이러스 70은 전 세계로 전파되었으며 우리나라에서는 1971년에 대유행한 바 있다. 엔테로바이러스 71은 수막염 이외에 흔히 수족구병(hand-foot and mouth disease)이나 포진성 구협염을 일으키며, 드물게는 뇌나 폐에 심각한 합병증을 일으켜 사망에 이르 게 하기도 한다. 이 엔테로바이러스 71은 1997년에서 1998년에 걸쳐 대만에서 크게 유행한 적이 있으며 국내에서도 2000년에 유행한 바가 있다. 엔테로바이러스 72는 A형 간염 바이러스(hepatitis A)로 알려져 있으며, 이제는 더 이상 엔테로바이러스로 분류하지 않고 새로운 속인 헤파토바이러스(Hepatovirus)로 따로 분류한다. 엔테로바이러스 73은 최근에 보고된 형으로 무균성 수막염 환자에서 검출되었으며, 국내에서 스웨덴으로 입양된 아이에게서 검출이 보고된 바 있다. 따라서 국내에서도 유행하고 있을 것으로 추정된다.
엔테로바이러스는 인체 내에 들어오면 구인두(oropharynx)와 소장 점막세포에서 일차적으로 증식하며, 이후 혈류를 타고 중추신경계, 간, 호흡기, 심근, 피부, 점막 등 체내의 여러 기관으로 퍼지게 된다. 엔테로바이러스에 관련된 질환 또는 임상적 증상으로는 다음과 같은 것들이 있다. 폴리오바이러스에 의해서는 소아마비, 무균성 뇌(수)막염(aseptic meningitis), 발열증이 발생할 수 있으며, 콕사키바이러스 A에 의해서는 포진성 구협염, 급성 임파선 또는 인두염, 무균성 뇌(수)막염, 소아마비, 홍역, 수족구 질환, 소아성 폐렴, 감기, 간염, 유아성 설사, 급성 출혈성 결막염이 발생할 수 있으며, 콕사키바이러스 B에 의해서는 흉막염, 무균성 뇌(수)막염, 소아마비, 심막염, 심근염(myocarditis), 호흡기 질환과 폐렴, 발진, 간염, 만성피로증이 발생할 수 있으며, 에코바이러스에 의해서는 무균성 뇌(수)막염, 소아마비, 뇌염(encephalitis), 기능장애 또는 귈라인-베르(Guillain-Berre) 증후군, 홍역, 호흡기 질환, 설사, 유행성 류마티즘, 심막염, 심근염, 간장애가 발생할 수 있으며, 기타 엔테로바이러스에 의해서는 폐렴과 기관지염, 급성 출혈성 결막염, 소아마비, 무균성 뇌(수)막염, 수족구 질환이 발생할 수 있다.
엔테로바이러스의 전파는 원칙적으로 분변-구강 경로(fecal-oral route)에 의하지만 상부호흡기도의 감염증의 경우에는 비말감염이 가능하며, 감염된 사람이 대변을 본 후 또는 코를 만진 후 손을 잘 씻지 않고 다른 물건을 만지면 그 물건을 통해서도 전파될 수 있다. 미국 뉴욕시의 경우, 검사대상 어린이들의 분변으로부터 콕사키바이러스와 에코바이러스의 분리율이 2.4%에 불과했던 것에 비해, 저개발국의 어린이들을 대상으로 실시된 비슷한 검사에서는 분변 중 약 80%에서 콕사키바이러스나 에코바이러스가 존재한다는 보고가 있었다. 상당히 흔한 바이러스라 할 수 있다.
종래의 엔테로바이러스의 진단법으로는 세포배양과 중화시험에 의한 바이러스 분리(isolation) 동정(identification) 검사가 있다. 세포배양과 중화시험에 의한 바이러스 분리 동정 검사는 바이러스의 감염력을 확인할 수 있는 방법으로 WHO에서 권장하고 있는 엔테로바이러스 검사 방법이다. 그러나 이 방법은 실시 과정이 복잡하고 검사에 오랜 시일이 소요되며 특히, 최근에는 기존의 중화항체로는 동정이 되지 않는 바이러스 형들이 발견되고 있어 이의 활용에는 한계가 있다. 따라서 현재 유행하는 엔테로바이러스에 대한 검출이 가능하면서도 빠르게 진단할 수 있는 또 다른 검출 방법이 필요하다. 그 밖의 검출 방법으로는 급성 및 회복기의 혈액에 대한 혈청학적 검사가 있다. 그러나 혈청학적 검사는 엔테로바이러스의 혈청형이 매우 많고, 또한 교차반응이 빈번하기 때문에, 유행하고 있는 엔테로바이러 스의 혈청형을 알고 있지 않으면 효과적 진단법으로 이용하기가 어렵다는 문제가 있다.
이러한 기존 기술에서의 문제점을 해결하고자 새롭게 대두된 것이 PCR을 이용한 엔테로바이러스의 검출 기술이다. PCR에 기반한 검출 기술은 기본적으로 높은 민감도를 제공하며 검사에 소요되는 시간이 타 방법에 비교하여 상대적으로 매우 짧다. 이와 관련된 종래 기술로는 대한민국 공개특허 제2002-0000280호와 대한민국 공개특허 제2006-0073457호를 참조로 제시할 수 있다. 대한민국 공개특허 제2002-0000280호에는 환경수에 포함된 바이러스의 존재 유무를 확인하는 데에 있어 PCR을 활용하는 발명이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2006-0073457호에는 호흡기 질환을 야기 시키는 바이러스의 검출에 PCR을 사용하는 검출 기술이 개시되어 있다. 상기 발명들에서는, 엔테로바이러스 유전체의 5’-말단의 비전사 부분(5'-non-translated region; 5'-NTR. 이를 5'-non-coding region이라고도 하며 줄여 5'-NCR이라 함)을 이용하여 PCR에 사용하는 프라이머를 설계, 제작하였다. 그런데 이들 방법은 PCR 기반의 엔테로바이러스 검출 기술을 제안했다는 의미를 갖기는 하지만 검출 및 진단에 있어 충분한 효과를 제공한다고는 할 수는 없다. 상기 기술은 엔테로바이러스의 단순 검출의 목적으로는 활용이 가능하나, 올바른 감염 치료를 위해서 반드시 필요한 것이 감염 원인체인 엔테로바이러스의 종류(혈청형)를 판별하는 것인데, 이를 위한 타이핑에는 활용될 수 없다는 단점을 갖고 있다. 이는 프라이머 설계에 기반한 엔테로바이러스의 유전체의 서열부분이 엔테로 바이러스 종간에 차이가 없는 공통된 부분이기 때문이다. 따라서 검출 및 더 나아가 타이핑에도 활용될 수 있는 엔테로바이러스 종간의 차이가 확보될 수 있는 특이적 유전자 부위를 기반으로 한 새로운 서열의 프라이머의 설계가 필요하며, 적합한 프라이머의 확보가 PCR에 기반한 엔테로바이러스의 검출 및 타이핑을 효과적으로 실시할 수 있게 하는 데에 있어 가장 중요한 요소라 할 수 있다.
타이핑에까지 활용 가능한 PCR에 기반한 엔테로바이러스의 검출 방법으로는 미국특허 7,247,457호에 개시된 발명이 있다. 상기 발명에서는 엔테로바이러스 종간의 차이를 반영할 수 있도록 엔테로바이러스의 켑시드 단백질의 유전자를 기반으로 하여 프라이머가 설계되었다. 또한 가능한 많은 종의 엔테로바이러스를 검출할 수 있도록 하기 위해서 프라이머가 결합하는 유전체 부분에서의 변이를 극복하고자 이노신(inosine)이 포함된 프라이머(inosine-containing primer) 형태로 프라이머를 설계, 제작하였다. 상기 발명은 유의한 수준으로 엔테로바이러스 검출에 있어 효과를 제공하나, 이노신이 포함된 프라이머들에서 아주 흔하게 발견되는 문제점인 숙주(host cell)의 유전자에 기인한 비특이 증폭이 심하다는 문제점을 가지고 있다(Nucl. Acids Res. 26: 1628-1635, 1998). 또한 도 1에 제시된 것과 같이 일부 엔테로바이러스의 유전체의 서열과 상기 발명에서 개시된 프라이머 서열 사이에는 불일치(mismatch)되는 정도가 심한 경우가 있다. 즉, 충분한 정도의 상보성(sufficient degree of complementarity)이 결여되어 프라이머와 주형과의 안정한(stable) 그리고 특이적(specific) 결합(binding)이 제공되지 못한다. 이러한 경우는 PCR의 특이성이 떨어지며 심한 경우는 PCR 증폭이 되지 않는다. 실제 임상 시료에는 다양한 유전체가 포함되어 있는 것이 일반적이기 때문에 PCR의 특이성 확보는 검출이나 진단 목적의 PCR에서 매우 중요하다. 따라서 좀더 특이성을 제고해 줄 수 있는 새로운 PCR 검출 기술의 개발이 필요하다 할 것이다.
본 발명자들은 PCR에 기반하지 않은 종래 방법들에 비하여서 보다 민감하고 그 실시에 있어서도 용이성이 크게 개선된, 또한 5-' NTR에 기반한 프라이머를 활용하는 종래의 PCR 검출 방법에 비해서는 검출된 엔테로바이러스에 대한 타이핑에까지 활용 가능한, 더 나아가 이노신이 포함된 프라이머를 이용한 종래의 PCR 검출 방법에 비해서는 보다 정확하면서도 특이적으로 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법에 활용 가능한 프라이머들과 이들을 이용한 PCR 검출 기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명에서 개시한 신속하고 민감하고 특이적인 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법은 엔테로바이러스 감염 진단 및 엔테로바이러스 관련 질병에 대한 진단 키트 개발에 있어 효과적으로 활용될 수 있다. 또한 검출된 엔테로바이러스에 대한 타이핑에도 활용될 수 있어 적절한 치료법을 수립하는 데에 효과적으로 활용될 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
따라서 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 PCR을 이용하여 여러 질환과 관련된 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 A, 콕사키바이러스 B, 에코바이러스 및 근래 새로운 번호를 부여하여 분류된 기타 엔테로바이러스를 포함하는 모든 엔테로바이러스를 보다 간편하고 신속하게 검출하는 데에 활용 가능한 프라이머들 및 이 프라이머들을 이용한 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법을 제공하는 것이다.
즉 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법을 제공함으로써, 기존의 5-' NTR에 기반한 프라이머를 활용하는 PCR 검출 방법의 단점이었던 타이핑에 활용할 수 없다는 점을 해결하고, 더 나아가 이노신이 포함된 프라이머를 이용한 PCR 검출 방법의 단점이었던 낮은 특이성 문제를 해결하고 또, 역전사 반응과 1차 PCR 과정의 별도 수행의 필요성을 제거하는 데에 적합한 프라이머들 및 이들을 이용한 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 엔테로바이러스의 유전체와의 결합에서 불일치 서열의 빈도를 획기적으로 줄여 프라이머의 주형에의 결합이 개선되고 이로 인하여 결국 PCR의 특이성을 높일 수 있으면서, 종래의 엔테로바이러스 검출 방법에서 불편함을 감수하면서 따로 실시되던 역전사 반응과 1차 PCR 과정을 같은 단계에서 실시하게끔 할 수 있게 하는 데에 적합한 프라이머들을 제공하고, 더 나아가 이들을 이용한 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 엔테로바이러스의 캡시드 단백질인 VP1과 VP3를 코딩(coding)하고 있는 유전자로부터의 cDNA(complementary DNA) 합성 및 이 cDNA로부터 특정 부분을 특이적으로 PCR 증폭하는 데에 활용될 수 있는 프라이머로서 서열번호 1 내지 서열번호 7에 제시한 염기서열로 이루어진 프라이머 서열들을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열의 프라이머들을 이용한 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열의 프라이머들을 포함하는 엔테로바이러스의 PCR 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열의 프라이머들을 포함하는 엔테로바이러스 관련 질환 진단용 PCR 진단 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 A, 콕사키바이러스 B, 에코바이러스, 및 새로운 번호만을 부여하여 분류한 기타 엔테로바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 용어 ‘기타 엔테로바이러스’는 엔테로바이러스 70, 엔테로바이러스 71, 엔테로바이러스 72, 엔테로바이러스 73 등과 같이 에코바이러스나 콕 사키바이러스로 별도로 분류하지 않고 다만 새로운 번호만을 부여하여 분류한 기타 엔테로바이러스를 말한다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서의 프라이머들은 엔테로바이러스의 검출을 위하여, 엔테로바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하고 있는 유전자 부위에 해당하는 cDNA의 합성과 합성된 cDNA로부터 특정 부위를 증폭하는 데에 사용된다.
보다 구체적으로는 본 발명의 프라이머는 역전사 반응을 통하여 RNA로부터 cDNA가 합성되는 역전사 반응에 사용되고, 역전사 반응을 통하여 합성된 cDNA로부터 1차 PCR을 통하여 증폭하는 데에 이용된다. 1차 PCR에서 증폭되는 부위는 엔테로바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하고 있는 유전자 부위 중 VP3 부위에서 VP1 부위까지에 해당되는 부분이다. 2차 PCR에서 증폭되는 부위는 엔테로바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하고 있는 유전자 부위 중 VP1 부위에 해당되는 부분을 포함하고 있는 부분이다. 이는 도 2에 모식적으로 제시되어 있다. 이 증폭되는 부분은 기존의 5-' NTR에 기반한 프라이머를 활용하는 PCR 검출 방법에서 증폭하던 부분과는 완전히 다른 부분이며, 이노신이 포함된 프라이머를 이용하던 종래의 PCR 검출 방법에서 증폭하던 부위와는 비슷하긴 하지만 프라이머의 결합위치가 조금 달라 결국 다소 차이가 있다. 그런데 엔테로바이러스의 경우 유전자에서 변이가 매우 심하여, 어떤 부분을 증폭하는가와 그 증폭을 위해 사용한 프라이머가 어떻게 설계, 제작되었는가에 따라 PCR 검출 결과는 매우 달라질 수 있다. 대부분의 경우 적절 한 프라이머가 제작되지 않으면 증폭은 실패하게 되고 이로부터 잘못된 음성(false-negative)의 결과가 초래될 수도 있다. 따라서 증폭 부위, 즉 프라이머가 주형에 결합하는 위치의 차이는 PCR 결과에서 큰 영향을 미치기 때문에 절대로 무시되어서는 아니 되는 매우 중요한 요소라 할 수 있다. 물론 나중에 설명하겠지만, 상기 프라이머의 결합 위치가 미치는 영향에 비해서는 정도가 작기는 하지만 같은 위치이더라도 검출할 유전체의 변이를 극복하기 위해 어떻게 프라이머의 서열을 설계했는가도 PCR 결과에 큰 영향을 준다.
상기 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 다양한 조합을 통해 구현될 수 있다. 역전사 반응 및 1차 PCR에서 사용되는 프라이머 조합은 정방향(forward) 프라이머 2개와 역방향(reverse) 프라이머 1개로 이뤄져 있으며, 특히 1차 PCR에 사용되는 프라이머는 엔테로바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하고 있는 유전자 중 VP3 부위로부터 VP1 부위까지를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계되어 있으며, 이를 이용한 1차 PCR 증폭산물의 크기는 815 bp이다.
본 발명의 역전사 반응 및 1차 PCR에 사용되는 프라이머 조합에서의 각 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. 정방향 프라이머는 5‘-GCR ATG TTR GGR ACW CAT GT-3’ (20-mer, 서열번호 1)과 5‘-GCS ATG TTR GGM ACR CAY GT-3’ (20-mer, 서열번호 2)이며, 역방향 프라이머는 5‘-GGR TTB GWK GAN GTY TGC CA-3’ (20-mer, 서열번호 3)이다. 본 명세서에는 프라이머의 서열을 나타냄에 있어 IUB 중의성(ambiguity) 코드(codes)를 사용했다. 따라서 프라이머 서열에서 A는 아데 닌(adenine)을, G는 구아닌(guanine)을, C는 시토신(cytosine)을, T는 티민(thymine)을 나타내고, R은 아데닌과 구아닌 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, W는 아데닌과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, S는 시토신과 구아닌 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, M은 아데닌과 시토신 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, Y는 시토신과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, B는 시토신, 구아닌, 및 티민이 가능한 자리를 나타내고, K는 구아닌과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, N은 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 모두가 가능한 자리를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용하였다.
2차 PCR에서 사용되는 프라이머 조합은 정방향 프라이머 2개와 역방향 프라이머 2개로 이뤄져 있으며, 엔테로바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자 중 VP1 부위를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계되었고, 이 2차 PCR의 증폭 산물의 크기는 371 bp이다. 본 2차 PCR에서 사용되는 프라이머로, 정방향 프라이머는 5‘-CCH GCD CTH ACC GCW GTG GAR ACD GG-3’ (26-mer, 서열번호 4) 및 5‘-CCM ATM CTH CAA GCH GCH GAG AYY GG-3’ (26-mer, 서열번호 5)이며, 역방향 프라이머는 5‘-GGR SCN CCD GGW GGY ACA WAC AT-3’ (23-mer, 서열번호 6) 및 5‘-GGH GCV CCY GGY GGY ACR TAC AT-3’ (23-mer, 서열번호 7)이다. 상기 프라이머 서열에서 H는 아데닌, 티민, 및 시토신이 가능한 자리를 나타내고, D는 아데닌, 구아닌, 및 티민이 가능한 자리를 나타내고, V는 아데닌, 시토신, 및 구아닌이 가능한 자리를 나타낸다. 이것도 본 명세서의 모든 서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용하였다.
본 발명의 상기 각 프라이머는 구성염기의 일부가 변경될 수는 있다. 이와 같은 변경은 구성염기 서열의 일부결실, 부가, 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 구현될 수 있으나, 이러한 염기서열의 변경은 프라이머의 특이적 주형과의 결합을 깰 수 있기 때문에 적용에 있어 상당한 주의를 요한다. 따라서 특이성을 훼손하지 않는 범위 내에서 실험적 또는 경험적으로 결정되어야 한다. 이는 당업자에게는 일반적인 사항이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명에서 제시된 프라이머의 서열을 유지하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 프라이머들의 서열들은 이노신이 포함된 프라이머를 이용하던 종래의 엔테로바이러스의 PCR 검출 방법에 비교하여 프라이머가 결합하는 위치에서 차이가 있는 것 외에도 프라이머에 이노신이 포함되어 있지 않다는 점과 몇 종류의 염기의 중복이 허용된 자리의 지정과 그 허용한 중복성에 있어서도 큰 차이가 있다. 이런 점이 종래 기술에서의 프라이머와 비교할 때 본 발명에서의 프라이머가 갖는 구조적, 기능적 차이점이다. 차이의 한 예로 도 3을 제시하였다. 도 1에서는 선행 기술인 이노신이 포함된 프라이머를 이용하던 PCR 검출 방법에서 일부 프라이머가 결합하는 부위에서 불일치가 많음을 제시한 바 있다. 같은 방법으로 본 발명에서 개시한 프라이머들의 주형과 결합하는 부위의 서열을 분석하면 도 3과 같다. 도 3에서 알 수 있듯이 도 1에서 제시된 것에 비하여 불일치가 많이 개선되었음을 알 수 있다. 이러한 사실로부터 본 발명에서 개시한 프라이머를 이용한 PCR이 이노신이 포함된 프라이머를 이용하던 선행 기술에 비교하여 개선된 특이성을 제공할 수 있음을 확인할 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 7의 프라이머들을 이용하여 엔테로바이러스를 검출 및 진단하는 방법은 모식적으로 도 4에 제시되어 있으며, 구체적인 내용은 다음과 같다.
(1) RNA를 추출하는 단계;
(2) 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 프라이머들로부터 구성되어지는 프라이머 조합 및 상기 추출된 RNA를 이용하여 역전사 반응 및 1차 PCR을 실시하는 단계;
(3) 상기 1차 PCR의 산물을 이용하여 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 프라이머들로부터 구성되어지는 프라이머 조합 및 1차 PCR 반응액을 이용하는 2차 PCR을 실시하는 단계; 및
(4) 상기 2차 PCR 산물을 분석하는 단계.
보다 상세히 설명하면, 먼저 분변 및 장조직 등의 시료에서 공지의 방법에 따라 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA를 함유한 추출액은 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 조합을 포함하고 있는 역전사 반응 및 1차 PCR 반응액에 첨가한다. 이때, 상기 역전사 반응 및 1차 PCR 반응액은 역전사 반응을 위한 역전사 효소와 PCR 증폭을 위한 DNA 중합효소를 동시에 포함하고 있다. 물론 역전사 반응과 1차 PCR은 별도로 구분하여 실시할 수도 있으나, 이는 실제 실시에 있어 번거로움이 초래되므로 한 번의 반응 단계에서 연속적으로 실시하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 실시예에 제시한 결과에서 알 수 있듯이 엔테로바이러스의 유전체를 이용한 역전사 반응과 PCR 반응은 본 발명의 프라이머들을 사용할 때 하나의 반응에서 일 련의 과정으로 실시될 수 있었다. 따라서 본 발명을 따르면 역전사 반응을 별도의 과정으로 분리하여 수행해야 하는 번거로움을 제거할 수 있다. 이런 점이 이노신이 포함된 프라이머를 이용하던 선행 기술과 비교하여 다른 점 중의 하나이다.
그런데 이러한 역전사 반응과 1차 PCR의 결합은 무조건 달성되는 것은 아니다. 적절한 프라이머들이 설계, 제작되어 적용되었을 경우에만 달성된다. 이는 실험적으로 결정되어야만 하며, 본 발명에서 개시된 프라이머 조합은 여러 번의 실험의 결과로부터 결정된 것이다.
다음으로, 상기 역전사 반응 및 1차 PCR 과정을 거친 반응액을 엔테로바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 함유하고 있는 2차 PCR 반응액에 첨가한다. 이때, 상기 2차 PCR 반응액은 역시 PCR 증폭을 위한 DNA 중합효소를 포함하고 있어야 한다. 2차 PCR을 실시한 후 최종적으로 얻어진 2차 PCR 반응액을 전기 영동하여 371 bp의 특이적 밴드가 있는가 또는 없는가에 대한 확인을 통하여 엔테로바이러스의 존재 여부를 판정한다. 즉, 371 bp 크기의 PCR 산물이 확인되면 최초 추출하여 준비한 시료에 엔테로바이러스의 RNA가 포함되어 있었다는 것을 나타내며, 이는 RNA 추출에 사용한 최초의 시료인 분변이나 조직 등이 엔테로바이러스에 감염되어 있었음을 나타낸다.
따라서 본 발명에 의하면, 상기 본 발명의 프라이머 조합을 이용한 역전사 반응을 포함하여 2단계로 구성된 PCR을 통하여 엔테로바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다.
또한 본 발명에 따라 얻어진 PCR 산물을 직접 서열분석(sequencing)하여 공지의 엔테로바이러스 서열과 비교하면 검출된 엔테로바이러스의 종류를 알 수 있다. 본 발명에서 제공되는 PCR 산물은 각 엔테로바이러스마다 차이를 가진다. 이의 실시는 당업자에게는 쉽게 이해될 수 있는 사항이므로 상세한 관련 설명의 제시는 생략한다.
본 발명의 방법에 따르면, 본 발명에서 제공된 엔테로바이러스의 특이 증폭용 프라이머들 및 이들을 이용한 PCR 방법을 통하여 종래 기술에 비해 정확하고 신속하게 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 A, 콕사키바이러스 B, 에코바이러스 및 근래 새로운 번호를 부여하여 분류된 기타 엔테로바이러스를 포함하는 모든 엔테로바이러스를 검출할 수 있다. 또, 본 발명은 높은 특이성을 제공할 수 있어 종래의 방법으로는 검출하기 힘들었던 엔테로바이러스 종까지도 검출할 수 있다. 따라서 본 발명은 엔테로바이러스의 검출 방법으로 유용하게 사용될 수 있으며 엔테로바이러스 진단용 제품 개발에도 효과적으로 활용될 수 있다. 더 나아가 본 발명을 따르면 각 검출된 엔테로바이러스의 종류의 판별을 위한 타이핑에도 활용할 수 있다. 검출된 엔테로바이러스의 종류의 판별로부터 엔테로바이러스 감염에 대한 적합한 치료 방법을 선택할 수 있게 된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해 당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 엔테로바이러스 특이 프라이머 제작
엔테로바이러스는 바이러스의 종류 및 바이러스 형에 따라 캡시드 단백질을 코딩하고 있는 유전자 부위의 변이, 결손 및 치환 정도가 다르다. 본 발명에서는 엔테로바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하고 있는 유전자 부위 중 엔테로바이러스 간의 차이가 적고 가장 유사한 염기서열을 나타내는 VP3 부위 및 VP1 부위를 첫 번째 증폭범위에 사용하였으며, 1차 PCR로 증폭시킨 부분 중 일부분인 VP1 부위를 두 번째 증폭범위로 사용하였다. 물론 증폭되는 부분의 서열에서는 각 엔테로바이러스 간에 차이가 있다.
표 1에는 본 발명에 따라 설계된 프라이머들의 염기서열이 제시되어 있으며, 인간 폴리오바이러스 1 마호니(Human Poliovirus 1 Mahoney)의 유전자(NCBI accession number: V01149)를 기준으로 VP3 및 VP1의 염기서열의 해당위치를 나타 내었다.
서열번호 염기서열 위치 (bp)
1 5‘-GCR ATG TTR GGR ACW CAT GT-3’ 2207-2226
2 5'-GCS ATG TTR GGM ACR CAY GT-3' 2207-2226
3 5'-GGR TTB GWK GAN GTY TGC CA-3' 3002-3021
4 5'-CCH GCD CTH ACC GCW GTG GAR ACD GG-3' 2603-2628
5 5'-CCM ATM CTH CAA GCH GCH GAG AYY GG-3' 2603-2628
6 5'-GGR SCN CCD GGW GGY ACA WAC AT-3' 2951-2973
7 5'-GGH GCV CCY GGY GGY ACR TAC AT-3' 2951-2973
실시예 2: 분변 및 장조직에서의 RNA 준비
분변은 통상의 인산완충생리식염수(PBS)에 10%(w/v)가 되게 부유한 다음 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 장조직인 경우는 세포파쇄기(homogenizer)를 이용하여 PBS로 10%(w/v) 파쇄액을 만들고 난 후 이를 원심분리한 다음 상층액을 취한다. 이 상층액으로부터 엔테로바이러스의 RNA를 추출한다. RNA 추출은 (주)인트론바이오테크놀로지사의 Viral Gene-spinTM DNA/RNA Extraction Kit를 사용하여 제품 사용 설명에 따라 실시하였다.
실시예 3: 엔테로바이러스 검출
엔테로바이러스를 검출하기 위하여 통상 네스티드 PCR라 불리는 2단계 PCR로 구성된 PCR을 수행하였다. 2단계 PCR 중 첫 번째 단계의 PCR 단계에서 역전사 반응이 포함되어 일어나도록 하였다. 역전사 반응과 1차 PCR을 실시하는 반응액은 총 부피 20 μl로 준비하였고, 그 구성 성분은, 실시예 2에서 준비된 RNA 추출액 1 μl, 10 pmol/μl의 서열번호 1의 프라이머, 10 pmol/μl의 서열번호 2의 프라이머, 및 20 pmol/μl의 서열번호 3의 프라이머, 역전사 효소, PCR 반응액, 및 증류수이다. 상기 구성 성분 중 하나인 PCR 반응액으로는 (주)인트론바이오테크놀로지사의 MaximeTM RT-PCR PreMix를 사용하였으며, 제품의 사용 설명에 따라 실시하였다.
첫 번째 단계는 먼저 역전사 반응이 일어나게 하기 위하여 상기처럼 준비된 반응액을 42℃에서 45분간 정치시켰다. 이 과정에서 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성된다. 역전사 반응을 유도한 다음 95℃에서 5분간 정치하여 1차 PCR에서 주형이 될 cDNA를 변성시켰다. 그 후 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초로 구성된 PCR 주기를 40회 반복시키는 조건으로 1차 PCR 반응을 실시하였다. 40회 반복 후 PCR 반응액은 72℃에서 5분간 더 정치하였다.
이어서 상기 과정에서 얻어진 1차 PCR 반응액을 이용한 2차 PCR을 실시하였다. 2차 PCR 역시 총 부피 20 μl로 실시하였고, 그 구성 성분은, 1차 PCR 반응액 1 μl, 10 pmol/μl의 서열번호 4의 프라이머, 10 pmol/μl의 서열번호 5의 프라이머, 10 pmol/μl의 서열번호 6의 프라이머, 및 10 pmol/μl의 서열번호 7의 프라이머, PCR 반응액, 및 증류수이다. 상기 구성 성분의 하나인 PCR 반응액으로는 (주)인트론바이오테크놀로지사의 MaximeTM i-StarTaq PreMix를 사용하였으며, 제품의 사용 설명에 따라 실시하였다.
2차 PCR 반응은, 95℃에서 5분간 정치하여 2차 PCR에서 주형이 될 1차 PCR 산물을 변성시켰다. 그 후 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초로 구성된 PCR 주기를 40회 반복시키는 조건으로 PCR을 실시하였다. 40회 반복 후 PCR 반응액은 72℃에서 5분간 더 정치하였다.
이렇게 2차 PCR까지 완료하면 PCR 반응액을 DNA 염색을 위하여 DNA 염색 시료인 에티디움 브로마이드가 0.1 μg/ml의 농도로 포함된 1.5% 아가로즈 겔에 적하(loading)하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 PCR 산물을 분석하여 그 결과를 판독하였다.
(3-1) PCR 의 민감도 측정
본 발명에 따른 PCR 검출 방법에 있어 엔테로바이러스의 검출 민감도(sensitivity)를 조사해 본 결과, 엔테로바이러스의 종류에 따라 다소 차이를 나타내었으나 10 PFU/ml에서 0.01 PFU/ml의 범위였다. 이와 관련된 전기영동 사진 결과가 도 5(콕사키바이러스 A24), 도 6(콕사키바이러스 B2), 도 7(에코바이러스 30) 및 도 8(엔테로바이러스 71)에 제시되어 있다. 상기 결과에 의하면, 본 발명에 따른 프라이머들을 이용한 PCR 검출 방법은 엔테로바이러스에 특이적이며 엔테로바이러스 검출에 활용되기에 충분한 정도의 민감도를 제공해 줄 수 있음을 확인할 수 있다.
(3-2) 본 발명의 폴리오바이러스 검출에서의 효율 조사
본 발명에 따른 PCR 검출 방법을 이용하여 폴리오바이러스에 해당하는 바이러스를 검사한 결과, 다음의 표 2의 결과와 같이 검사한 모든 폴리오바이러스에서 특이적 PCR 증폭 산물을 확인할 수 있었다. 관련된 전기영동 결과가 도 9에 제시되어 있다.
No. 결과 Type No. 결과 Type
1 ＋ 폴리오바이러스 1 2 ＋ 폴리오바이러스 2
3 ＋ 폴리오바이러스 3
(3-3) 본 발명의 비폴리오 엔테로바이러스 검출에서의 효율 조사
본 발명에 따른 PCR 검출 방법을 이용하여 비폴리오 엔테로바이러스에 해당하는 바이러스를 검사한 결과, 다음의 표 3의 결과와 같이 검사한 모든 비폴리오 엔테로바이러스에서 특이적 PCR 증폭 산물을 확인할 수 있었다. 관련된 전기영동 결과가 도 10에 제시되어 있다.
No. 결과 Type No. 결과 Type
1 ＋ 에코바이러스 1 18 ＋ 콕사키바이러스 B4
2 ＋ 에코바이러스 3 19 ＋ 콕사키바이러스 B5
3 ＋ 에코바이러스 5 20 ＋ 콕사키바이러스 B6
4 ＋ 에코바이러스 6 21 ＋ 콕사키바이러스 A1
5 ＋ 에코바이러스 7 22 ＋ 콕사키바이러스 A2
6 ＋ 에코바이러스 9 23 ＋ 콕사키바이러스 A4
7 ＋ 에코바이러스 11 24 ＋ 콕사키바이러스 A5
8 ＋ 에코바이러스 13 25 ＋ 콕사키바이러스 A9
9 ＋ 에코바이러스 14 26 ＋ 콕사키바이러스 A10
10 ＋ 에코바이러스 16 27 ＋ 콕사키바이러스 A12
11 ＋ 에코바이러스 18 28 ＋ 콕사키바이러스 A16
12 ＋ 에코바이러스 25 29 ＋ 콕사키바이러스 A22
13 ＋ 에코바이러스 30 30 ＋ 콕사키바이러스 A24
14 ＋ 에코바이러스 33 31 ＋ 엔테로바이러스 71-K1
15 ＋ 콕사키바이러스 B1 32 ＋ 엔테로바이러스 71-K9
16 ＋ 콕사키바이러스 B2 33 ＋ 엔테로바이러스 74
17 ＋ 콕사키바이러스 B3
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 미국특허 7,247,457호에 개시된 프라이머들의 서열들을 몇몇 선별된 엔테로바이러스의 유전체의 유전자 서열과 비교해 본 결과이다. 엔테로바이러스 종류에서 ‘Pol’은 폴리오바이러스를 나타내며, ‘EV’는 기타 엔테로바이러스를 나타내며, ‘Echo’는 에코바이러스를 나타내며, ‘CA’는 콕사키바이러스 A를 나타내며, ‘CB’는 콕사키바이러스 B를 나타낸다. ‘2F’는 2차 PCR에서의 정방향 프라이머를 나타내고, ‘2R’은 2차 PCR에서의 역방향 프라이머를 나타낸다. 프라이머의 서열을 제시함에 있어 ‘프라이머 서열’이란 미국특허 7,247,457호에 개시된 발명에서 제시한 프라이머 서열을 나타내며, ‘변환서열’이란 제시된 역방향 프라이머의 서열을 해당 상보적 서열로 변환시킨 서열을 나타낸다. 프라이머 서열에서 ‘A’는 아데닌을, ‘G’는 구아닌을, ‘C’는 시토신을, ‘T’는 티민을 나타내고, ‘Y’는 시토신과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, ‘R’은 아데닌과 구아닌 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, ‘W’는 아데닌과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, ‘N’은 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 모두가 가능한 자리를 나타낸다. NCBI의 공지 서열에서 붉게 표시된 부분이 미국특허 7,247,457호에 개시된 발명에서 제시한 프라이머와 불일치가 있는 자리로 상보성이 훼손된 자리를 나타낸다.
도 2는 캡시드 단백질을 코딩하고 있는 유전자에서 역전사 반응 후 1차 PCR에서 증폭되는 부위와 2차 PCR을 통해서 증폭되는 부위를 표시한 그림이다. 도 2에서 ‘A’는 1차 PCR에서 증폭되는 부위에 해당하고, ‘B’는 2차 PCR에서 증폭되 는 부위에 해당한다.
도 3은 본 발명의 프라이머들의 서열들을 도 1에서 선별 비교했던 몇몇 엔테로바이러스의 유전체의 유전자 서열과 도 1에서 사용한 방법과 동일한 방법에 따라 비교한 결과이다. 엔테로바이러스 종류에서 ‘Pol’은 폴리오바이러스를 나타내며, ‘EV’는 기타 엔테로바이러스를 나타내며, ‘Echo’는 에코바이러스를 나타내며, ‘CA’는 콕사키바이러스 A를 나타내며, ‘CB’는 콕사키바이러스 B를 나타낸다. ‘2F’는 2차 PCR에서의 정방향 프라이머를 나타내고, ‘2R’은 2차 PCR에서의 역방향 프라이머를 나타낸다. 프라이머의 서열을 제시함에 있어 ‘프라이머 서열’이란 본 발명의 프라이머 서열을 나타내며, ‘변환서열’이란 본 발명의 역방향 프라이머의 서열을 해당 상보적 서열로 변환시킨 서열을 나타낸다. 프라이머 서열에서 ‘A’는 아데닌을, ‘G’는 구아닌을, ‘C’는 시토신을, ‘T’는 티민을 나타내고, ‘H’는 아데닌, 시토신, 및 티민이 가능한 자리를 나타내고, ‘D’는 아데닌, 구아닌, 및 티민이 가능한 자리를 나타내고, ‘W’는 아데닌과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, ‘R’은 아데닌과 구아닌 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, ‘M’은 아데닌과 시토신 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, ‘Y’는 시토신과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, ‘S’는 시토신과 구아닌 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, ‘N’은 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 모두가 가능한 자리를 나타내고, ‘V’는 아데닌, 시토신, 및 구아닌이 가능한 자리를 나타낸다. NCBI의 공지 서열에서 붉게 표시된 부분이 본 발명의 프라이머와 불일치가 있는 자리를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 PCR 검출 방법을 이용한 엔테로바이러스 검출 과정을 나타내는 순서도이다. 도 4에서 제시된 역전사 반응과 1차 PCR 반응은 따로 분리하여 개별적으로 실시할 수도 있고, 또 동일 반응 단계에서 실시할 수도 있다. 동일 반응 단계에서 실시하는 것이 보다 편리하다.
도 5는 본 발명에 따른 프라이머들을 이용한 콕사키바이러스 A24형에 대한 검출 민감도를 조사한 전기영동 사진이다. 레인 0은 1×105 PFU/ml, 레인 -1은 1×104 PFU/ml, 레인 -2는 1×103 PFU/ml, 레인 -3은 1×102 PFU/ml, 레인 -4는 1×101 PFU/ml, 레인 -5는 1 PFU/ml인 콕사키바이러스 A24형의 양에 해당하는 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 프라이머들을 이용한 콕사키바이러스 B2형에 대한 검출 민감도를 조사한 전기영동 사진이다. 레인 0은 1×105 PFU/ml, 레인 -1은 1×104 PFU/ml, 레인 -2는 1×103 PFU/ml, 레인 -3은 1×102 PFU/ml, 레인 -4는 1×101 PFU/ml, 레인 -5는 1 PFU/ml인 콕사키바이러스 B2형의 양에 해당하는 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 프라이머들을 이용한 에코바이러스 30형에 대한 검출 민감도를 조사한 전기영동 사진이다. 레인 0은 1×105 PFU/ml, 레인 -1은 1×104 PFU/ml, 레인 -2는 1×103 PFU/ml, 레인 -3은 1×102 PFU/ml, 레인 -4는 1×101 PFU/ml, 레인 -5는 1 PFU/ml인 에코바이러스 30형의 양에 해당하는 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 프라이머들을 이용한 엔테로바이러스 71형에 대한 검 출 민감도를 조사한 전기영동 사진이다. 레인 0은 1×105 PFU/ml, 레인 -1은 1×104 PFU/ml, 레인 -2는 1×103 PFU/ml, 레인 -3은 1×102 PFU/ml, 레인 -4는 1×101 PFU/ml, 레인 -5는 1 PFU/ml인 엔테로바이러스 71형의 양에 해당하는 결과이다.
도 9는 폴리오바이러스를 분리 배양한 후 이로부터 RNA를 추출한 다음 이를 주형으로 하여 본 발명에 따른 프라이머가 이용된 PCR을 실시한 후 PCR 반응액을 1.5% 아가로스 겔을 이용한 전기영동을 통하여 분석한 사진이다. 레인 1은 폴리오바이러스 1, 레인 2는 폴리오바이러스 2, 레인 3은 폴리오바이러스 3, 레인 M은 DNA 크기 마커를 나타낸다.
도 10은 비 폴리오 엔테로바이러스를 분리 배양한 후 이로부터 RNA를 추출한 다음 이를 주형으로 하여 본 발명에 따른 프라이머가 이용된 PCR을 실시한 후 PCR 반응액을 1.5% 아가로스 겔을 이용한 전기영동을 통하여 분석한 사진이다. 레인 1은 에코바이러스 1, 레인 2는 에코바이러스 3, 레인 3은 에코바이러스 5, 레인 4는 에코바이러스 6, 레인 5는 에코바이러스 7, 레인 6은 에코바이러스 9, 레인 7은 에코바이러스 11, 레인 8은 에코바이러스 13, 레인 9는 에코바이러스 14, 레인 10은 에코바이러스 16, 레인 11은 에코바이러스 18, 레인 12는 에코바이러스 25, 레인 13은 에코바이러스 30, 레인 14는 에코바이러스 33, 레인 15는 콕사키바이러스 B1, 레인 16은 콕사키바이러스 B2, 레인 17은 콕사키바이러스 B3, 레인 18은 콕사키바이러스 B4, 레인 19는 콕사키바이러스 B5, 레인 20은 콕사키바이러스 B6, 레인 21은 콕사키바이러스 A1, 레인 22는 콕사키바이러스 A2, 레인 23은 콕사키바이러스 A9, 레인 24는 콕사키바이러스 A10, 레인 25는 콕사키바이러스 A16, 레인 26은 콕사키바이러스 A22, 레인 27은 콕사키바이러스 A24, 레인 28은 엔테로바이러스 71-K1, 레인 29는 엔테로바이러스 71-K9, 레인 30은 엔테로바이러스 74, 레인 M은 DNA 크기 마커를 나타낸다.
<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Primer capable of detecting enterovirus and PCR-based enterovirus detection method using the same <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first forward primer 1 for human Poliovirus 1 Mahoney <400> 1 gcratgttrg gracwcatgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first forward primer 2 for human Poliovirus 1 Mahoney <400> 2 gcsatgttrg gmacrcaygt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first reverse primer for human Poliovirus 1 Mahoney <400> 3 ggrttbgwkg angtytgcca 20 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second forward primer 1 for human Poliovirus 1 Mahoney <400> 4 cchgcdctha ccgcwgtgga racdgg 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second forward primer 2 for human Poliovirus 1 Mahoney <400> 5 ccmatmcthc aagchgchga gayygg 26 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second reverse primer 1 for human Poliovirus 1 Mahoney <400> 6 ggrscnccdg gwggyacawa cat 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second reverse primer 2 for human Poliovirus 1 Mahoney <400> 7 gghgcvccyg gyggyacrta cat 23

Claims (12)

  1. cDNA 합성단계, 1차 PCR 단계, 및 2차 PCR 단계로 구성되는 엔테로바이러스 검출방법에 있어서,
    상기 cDNA 합성단계 및 1차 PCR 단계는 동일한 프라이머를 사용하여 한 번의 반응에서 구현되며, 상기 1차 PCR용 프라이머가 이노신이 포함되지 않은 것을 특징으로 하는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 프라이머 조합이며, 상기 2차 PCR용 프라이머가 서열번호 4 내지 7로 구성된 프라이머 조합인 것을 특징으로 하는, 엔테로바이러스 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 A, 콕사키바이러스 B, 에코바이러스, 및 기타 엔테로바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 엔테로바이러스 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 기타 엔테로바이러스는 엔테로바이러스 70, 엔테로바이러스 71, 엔테로바이러스 72, 엔테로바이러스 73을 포함하는 새로운 번호만을 부여하여 분류한 기타 엔테로바이러스인 것을 특징으로 하는, 엔테로바이러스 검출 방법.
  4. 이노신이 포함되지 않은 것을 특징으로 하는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 프라이머 조합의 1차 PCR용 프라이머 및 서열번호 4 내지 7로 구성된 프라이머 조합의 2차 PCR용 프라이머를 포함하는, 엔테로바이러스 검출용 PCR 키트.
  5. 이노신이 포함되지 않은 것을 특징으로 하는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 프라이머 조합의 1차 PCR용 프라이머 및 서열번호 4 내지 7로 구성된 프라이머 조합의 2차 PCR용 프라이머를 포함하는, 엔테로바이러스 관련 질환 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 엔테로바이러스 관련 질환은 엔테로바이러스의 감염에 의해 유발되는 소아마비, 무균성 뇌막염, 발열증, 포진성 구협염, 급성 임파선, 인두염, 홍역, 수족구질환, 소아성 폐렴, 감기, 간염, 유아성 설사, 급성출혈성 결막염, 흉막염, 심막염, 심근염, 호흡기질환, 폐렴, 발진, 만성피로증, 뇌염, 기능장애, 귈라인-베르 증후군, 설사, 유행성류마티즘, 간장애 또는 기관지염인 것을 특징으로 하는, 엔테로바이러스 관련 질환 진단용 키트.
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