CN112458090A

CN112458090A - 创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme与用途

Info

Publication number: CN112458090A
Application number: CN202011404091.7A
Authority: CN
Inventors: 吕明生; 范诗慧; 王淑军; 马小艺; 卢静; 武航婕; 秦铭灿; 田雪晴
Original assignee: Jiangsu Ocean University
Current assignee: Jiangsu Ocean University
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-12-04
Also published as: CN112458090B

Abstract

本发明公开了一种用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme。该DNAzyme共具有103个碱基和含有两个特殊loop环的二级结构，其对创伤弧菌具有高特异性，检测限可低至10³ CFU/mL,检测范围为2.2×10³ CFU/mL至2.2×10⁸ CFU/mL。本发明还对该DNAzyme进行了碱基突变改造，得到3条具有活性的突变体DNAzymes，并且通过对突变体进行动力学检测发现其切割速率活性提高了。本发明的RNA特异性切割的DNAzyme可被广泛的应用于水产养殖、食品加工检验、环境中的创伤弧菌的快速检测。

Description

创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme与用途

技术领域

本发明属病原微生物检测技术领域，具体涉及一种可用于创伤弧菌特异性RNA 切割DNAzyme，本发明还涉及其筛选与用途。

背景技术

创伤弧菌是海水中常见的弧菌致病菌群，革兰氏阴性嗜盐性菌，栖息在世界各地的沿海温暖的水域中无处不在，它是水产品污染的重要病原体，可导致水产养殖疾病。同时创伤弧菌也是人类致命的致病性病原体，可以引起的人类急性胃肠炎和原发性败血症、创伤感染和蜂窝织炎等临床症状，最致命的后果是原发性败血症，在免疫功能低下的人群中死亡率超过50％，即使经过及时诊断和治疗也可能导致24小时内死亡。人类感染创伤弧菌引起疾病的原因通常是由于人类食入生的或未煮熟的软体动物贝类或海产品。若皮肤有伤口的人游泳或接触被该菌污染的水域也可以引起人类的疾病，严重感染者需大面积清创甚至截肢。因此创伤弧菌又被称为“海洋中的无声杀手”。在美国，每年与海产品相关的死亡事件中95% 是由于人类感染了创伤弧菌，而中国的水产品种类繁多，每年都经常报告由水产品引起的食物中毒，急性胃肠炎或腹泻，因此带来严重的经济和社会负担。牡蛎是创伤弧菌最重要的传染源，创伤弧菌在牡蛎、贝类等海产品中的检出率为13% ～95%，我国内陆地区水产品中创伤弧菌的检出率一般在10%以内，沿海地区的检出率常在20% ～67%之间。在弧菌污染高的地区，海鲜（尤其是牡蛎）的安全性是一个普遍的问题。创伤弧菌感染不仅给水产养殖业造成经济损失，而且还危害人类健康。因此，建立创伤弧菌的快速检测方法非常重要。

DNAzyme是一类人工合成的具有催化作用的功能核酸分子，也是通过体外筛选的方法获得的。最早发现的DNAzyme是由Breaker 和Joyce通过利用金属离子设计的一种体外筛选技术得到，该DNAzyme在铅离子存在下催化酯交换反应，这同时也表明单链的DNA确实可以作为类似核酶和蛋白质酶的催化剂。此后，很多的DNAzyme被分离出来用于催化各类生物反应如：RNA的切割反应，DNA的切割反应，磷酸化反应。然而RNA切割活性的DNAzyme得到最广泛的应用，因为它们通常尺寸小，易分离且反应快速，它是将单个RNA嵌入到DNA的序列当中并保持最佳的特性。一般而言，这类DNAzyme通常由底物链和酶链组成，底物链修饰有单个RNA(rA)的连接点并且作为切割位点，酶链则是包含催化核心部分及两臂。酶链可以有不同主要和次要结构，独特的辅因子，pH值的依赖性和特殊的底物链。在含有催化反应的辅因子时，酶链催化切割底物链，使其断裂为两部分。辅因子包括金属离子和氨基酸，可以由此设计出基于不同辅因子的生物传感器。此外，DNAzyme对底物链表现出很高的特异性，高敏感性和高选择性识别，这些优良的性能激励人们不断的研究和发现新型的DNAzyme并将其应用于临床医药研究，希望能通过对编辑癌蛋白的RNA精准识别并定向切割来实现肿瘤、癌症等疾病的发生。目前，DNAzyme主要应用于金属离子检测、生物传感、医药研究及纳米材料研究等领域。

目前国内外对创伤弧菌的研究主要体现在其溶血素、MARTX毒素、铁载体、荚膜多糖、脂多糖以及金属蛋白酶等方面的研究。国内外对创伤弧菌的检测方法有很多，例如：间接荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试纸条、环介导等温扩增技术、聚合酶链反应(PCR)检测等，但大都存在检测时间较长、过程复杂、成本高等问题，不能广泛的应用于基层养殖渔场。目前，DNAzyme的筛选主要集中在金属离子、微生物细胞、蛋白质以及小分子等方面。尽管已有大量的和细菌相关的DNAzyme被研究报道，但将创伤弧菌与DNAzyme切割原理相结合的应用研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于创伤弧菌特异性RNA切割的DNAzyme，为创伤弧菌的检测和鉴定提供简单、快速、精确的方法。

本发明的进一步目的是提供所述DNAzyme序列的筛选方法。

本发明的又一个目的是提供所述DNAzyme序列的用途。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明是一种用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme，其特点是：所述DNAzyme核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列(5’-3’)为：

VV-1：

TGGGGGCTGCTTGCAAAATCTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT。

本发明所述的用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme，其进一步优选的技术方案是：对核酸适配体进行突变或改造，使其能用于幽门螺旋杆菌的检测。

本发明所述的用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme，其进一步优选的技术方案是：DNAzymes 的序列的突变、改造包括：磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化；添加生物素、地高辛、荧光物质、淬灭集团、纳米材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。

本发明所述的用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme，其进一步优选的技术方案是：对所述的DNAzyme进行了碱基突变改造，得到3条具有活性的突变体DNAzymes，突变体DNAzyme核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列(5’-3’)为：

（1）VV-M1：

TGGGGGCTGCTTGCAAAATTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT

（2）VV-M2：

TGGGGGCTGCTTGTAAAATTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT

（3）VV-M3：

TGGGGGCTGCTTGTAATCGGTGCCACTGACGATCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT。

本发明还公开了一种创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme的筛选方法，其筛选步骤如下：

(1) 合成含有35个随机碱基的寡核苷酸文库和含有切割位点及含有生物素标签的前后向引物；

(2) 将要检测的创伤弧菌在LB液体培养基中进行培养；

(3) 将步骤（2）所得创伤弧菌菌体进行离心，保留上清液；

(4) 将初始文库通过PCR反应进行连接，引入含有切割位点和生物素标签，醇沉法纯化回收；

(5) 将步骤（4）所得的PCR产物和链霉素包被的磁珠在37℃连接；

(6) 连接结束后磁性分离弃去上清液，磁珠用亲和素反应缓冲液进行清洗；

(7) 用0.2 mol的NaOH洗涤磁珠，磁性分离以制备单链；

(8) 用去离子水清洗磁珠使pH接近于中性；

(9) 将等体积的创伤弧菌胞外产物与2×筛选缓冲液混合均匀，37℃孵育切割1小时，磁性分离，醇沉法回收上清；

(10) PCR扩增步骤(9)醇沉后所得产物用于下一轮筛选；

(11) 高通量测序和DNA序列分析；

(12) 候选DNAzyme VV-1活性及性质检测；

(13) DNAzyme碱基序列突变改造得到VV-M1、VV-M2和VV-M3；

(14) DNAzyme切割速率测定。

6. 根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于：Biotin生物素标签均标记在DNA序列的5’端；所使用的创伤弧菌菌体浓度为2.2×109 CFU每毫升；所有的结合和切割反应均在1.5毫升无菌无酶离心管中进行。DNA切割片段浓度测定中使用的仪器为超微量紫外分光光度计（Q5000，美国）。DNAzyme切割荧光强度检测实验的仪器为全波长多功能微孔板检测仪（M1000 Pro，瑞士）。DNAzyme切割和磁性分离的磁珠直径为0.5 μm。

本发明所述的DNAzymesy的用途是将DNAzymes用于创伤弧菌的特异性识别或检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了多条特异性强、切割能力高、检测线低的创伤弧菌依赖性DNA-zyme，能够快速、有效的对创伤弧菌进行检测，可广泛的应用于与水产养殖中创伤弧菌病原微生物的快速检测，有效的保护水体免遭该病原菌污染，在水产养殖以及水体防污方面具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为本发明中高通量测序得到的前5条DNA序列及其占比图；

图2为本发明中所设计的荧光模拟分子信标原理切割图；

图3为本发明中对候选DNA序列的切割活性检测图；

图4为本发明中得到的两条具有切割活性的DNAzyme的活性大小比对图；

图5为本发明中筛选得到的创伤弧菌特异性RNA切割DNAzymes的二级结构模拟图；

图6为本发明中对创伤弧菌胞外产物反应浓度优化图；

图7为本发明中DNAzyme切割影响pH优化图；

图8为本发明中筛选缓冲液中Mg²⁺浓度优化图；

图9为本发明中不同二价金属离子对DNAzyme切割活性的检测图；

图10为本发明中VV-M2 DNAzyme菌种特异性检测图；

图11为本发明中VV-M2 DNAzyme敏感性检测图；

图12为本发明中创伤弧菌胞外产物靶标分子性质测定图；

图13为本发明中创伤弧菌胞外产物靶标物分子量测定图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，对本发明进行详细说明。

实施例1，创伤弧菌特异性RNA切割DNAzyme的筛选及性质鉴定

一、用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme

所述DNAzyme核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列(5’-3’)为：

VV-1：

TGGGGGCTGCTTGCAAAATCTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT。

对所述的DNAzyme进行了碱基突变改造，得到3条具有活性的突变体DNAzymes，突变体DNAzyme核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列(5’-3’)为：

（1）VV-M1：

TGGGGGCTGCTTGCAAAATTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT

（2）VV-M2：

TGGGGGCTGCTTGTAAAATTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT

（3）VV-M3：

TGGGGGCTGCTTGTAATCGGTGCCACTGACGATCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT。

二、筛选前准备

(1) 由上海生工合成含有35个随机碱基的DNA筛选文库及相关体外筛选用DNA序列(5’-3’)：

初始文库：pGGAAGCAGCCCCCACTGCTT-N₃₅-TTCTGTTGACGACCACGATT

引物1：AATCGTGGTCGTCAACAGAA

引物2：Biotin- GTCAACAGAATrAGGAAGCAGCCCCCA

FAM-Substrate：FAM-GTCAACAGAATrAGGAAGCAGCCCCCA

(2) 采用LB液体培养基对创伤弧菌进行培养，待其OD接近于0.6-0.7时停止培养，利用梯度稀释涂布法确定每毫升细菌数量。

(3) 将所有培养液按1 mL的量平均分装到1.5 mL的无菌离心管中，室温10000 g离心10 min，收集上清液并于-20 °C冰箱保存备用。

(4) 所有初始DNA文库及相关引物均需要经过15 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）进行纯化。

(5) 将随机文库、引物1和引物2按照以下方案进行PCR扩增以制备符合RNA切割要求的初始DNA文库：

(6) 通过醇沉法纯化回收所有产物并作为初始筛选文库进行体外筛选。

三、体外筛选

1、筛选步骤：

(1) 取50 μL浓度为50 mg/mL的链霉素包被的磁珠 (直径0.5 μm) 于1.5mL无菌离心管中，用500 μL亲和素反应缓冲液洗涤磁珠三次。

亲和素反应缓冲液：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1 M NaCl，0.01%~0.1% Tween-20，pH 7.5

(2) 将500 μL用亲和素反应缓冲液溶解的PCR纯化产物（含有生物素标签）与清洗后的磁珠进行混合(此时磁珠浓度为5 mg/mL)，将该反应管置于DNA混合仪上37℃连接30min。

(3) 利用磁性分离器去除没有结合的DNA（上清），弃上清，500 μL亲和素反应缓冲液清洗两次。

(4) 加入500 μL的0.2 N NaOH，混合均匀，室温静置2 min后进行磁性分离，去除不含生物素的DNA单链。

(5) 用去离子水对磁珠进行多次清洗以确保其pH值维持在7.0左右。

(6) 加入150 μL创伤弧菌胞外产物混合液（CEM-VV）和等体积的2×筛选缓冲液，混合均匀后置于DNA混合仪上37°C切割反应1 h。

2×筛选缓冲液：100 mM HEPES，300 mM NaCl，30 mM MgCl₂，0.02% Tween-20，pH7.0

(7) 磁性分离，醇沉法回收反应所得切割片段（上清），用Q5000紫外分光光度计检测浓度。

(8) 醇沉产物干燥后经PCR扩增后用于下一轮筛选。

2、高通量测序分析：

高通量测序由上海生工采用IIIumina公司的Miseq技术完成，共得到18万余条DNA原始序列，根据序列长度和所占百分比由高到低选择了前5条进行分析（图1）。

3、候选DNA序列活性检测：

1、荧光法。依据图2设计方案进行切割结果检测。根据测序结果选择合适的DNA序列进行合成。将3 μL 100 μM/L的 FAM-Substrate，2 μL 100 μM/L 的合成DNA序列（含淬灭集团）和35 μL 2×筛选缓冲液混合均匀，90 ℃变性1 min，自然冷却至室温以形成基质-DNAzyme复合物（终浓度为5μM/L）。取4 μL 5 μM/L 基质-DNAzyme复合物，10 μL CEM-VV，41μL ddH₂O和45μL 2×筛选缓冲液于96孔板中（每个样品含3个平行样），吹打混合均匀，以不含淬灭集团的DNA作为空白对照，37 ℃避光切割反应60 min。反应结束后利用酶标仪读取各自荧光值变化（激发波长488 nm，入射波长520 nm）并分别记其荧光值为F（样品组）和F ₀（空白对照），根据F/F ₀的比例大小判断各序列活性的高低（比值越大，活性越高，最大为1）。最终将各反应混合物用尿素终止液终止反应后通过15% dPAGE电泳检测，利用凝胶成像仪进行数据分析并量化切割产物以确定切割率，利用公式Y _t= Y _o + a(1− e^−kx)进行线性拟合，其中 Y _t和 Y _o 分别代表在不同的反应时间和反应时间为0时切割片段强度，k代表实时切割比率。

15 % dPAGE配方如下：

15 % dPAGE储存液	7 mL
		10 %过硫酸铵	32 μL
TEMED	5 μL

2、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法（15 % dPAGE）。

a. 添加45 μL 2×筛选缓冲液、41 μL ddH₂O、10 μL CEM-VV（OD₆₀₀ > 0.7）和4μL5 μM的基质-DNAzyme复合物，混合均匀后37 ℃避光切割反应60 min。

b. 向上述反应液中加入5 μL 3 M的NaOAc和135 μL的冰乙醇（100%），混合均匀后置于-20 ℃保藏至少1小时。10000 g离心20 min，清除上清并向沉淀中加入500 μL的70%的冰乙醇，10000 g再次离心10 min。37 ℃真空干燥15-30 min。

c. 15 μL去离子水溶解干燥产物并加入5 μL 3×尿素终止缓冲液，200 V电泳80min。

d. Gel Doc^TM EZ凝胶成像分析

检测结果如图3所示。

4、二级结构分析：

利用IDT Oligonanlyzer 3.1 (https://sg.idtdna.com/UNAFold) 寡核苷酸结构分析软件模拟了VV-1 DNA序列的二级结构，结果发现这条DNAzyme含有一个特殊的茎环结构（参照图5），该茎环上蓝色部分的序列高度保守，我们猜测该茎环可能与CEM-VV活性区域有关，基于此，我们通过对核心区域进行碱基剔除来判断其是否是靶标结合位点并提高切割活性。

5、突变体研究：

VV-1的催化核心序列含有35个碱基，并形成了两个未配对的loop环和一个成对的发夹结构（图5A）。我们首先尝试删除VV-1核心区域的第8号碱基并将其命名为VV-M1（图5B）。同时，我们将第2号碱基C替换成碱基G，并将其命名为VV-M2（图5C）。我们发现如果同时剔除第5号至7号碱基和第24号至26号碱基，会使其中一个loop环消失并形成简单的二级结构，形成一个新的长发卡结构（图5D）。

为了实现这些突变体活性的比较，我们接下来分别采用两种方法测量了它们在100mM HEPES，300mM NaCl，300mM MgCl₂，pH8.0反应缓冲液中反应1小时后的活性。其中VV-M1、VV-M2和VV-M3的活性均高于原始VV-1的活性，且活性有高到低排列为：VV-M2> VV-M3>VV-1> VV- M1>。在突变后，催化核心区域的序列碱基从原来的35个减少到28个。尽管突变后突变体活性高于原始VV-1的活性，但其仍然具有活性并通过这些突变掌握了关键碱基的作用位点，这不仅在DNA序列的合成上更加经济，而且有利于该DNAzyme在生物学上的结构和机械学研究。

切割速率对比：

基于以上研究，我们分别测定了VV-1 和VV-M2 DNA zyme切割反应动力学（图4），并通过一级反应速率方程Y _t= Y ₀+ a（1-e^-kx）来完成动力学线性曲线拟合，其中Y _t和Y ₀分别代表在给定的反应时间t和时间为0时DNAzyme切割片段强度，k代表反应速率常数。拟合结果表明，VV-1 和VV-M2均具有良性的切割性能，且经过碱基剔除后其DNAzyme切割活性提高了，该速率表明在特定条件下该DNAzyme可有效的完成对创伤弧菌菌体细胞的检测。

6、胞外产物浓度优化：

在相同浓度VV-M2的条件下以等体积的不同OD₆₀₀(0、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9)值的CEM-VV 为横坐标，通过线性曲线方程拟合公式F=Y ₀+a*x进行线性曲线拟合，其中F为不同OD₆₀₀浓度下VV-M2切割片段强度，Y ₀是OD₆₀₀为0时所对应的片段强度，a为常数。以切割产物片段荧光比值为纵坐标监测绘制如图6所示对比图。结果显示，随着OD₆₀₀值的增加切割片段强度也逐渐的加强并与OD₆₀₀等于0.8时进入平衡期，其相关系R²数为0.9915，说明OD值与切割片段强度之间具有很好的相关性。

切割反应pH优化：

以OD₆₀₀等于0.8时所对应的CEM-VV浓度为恒量，研究探测不同pH条件下VV-M2切割活性。由于反应液中的Mg²⁺在碱性环境中易形成沉淀从而影响实验的精确性，因此我们选择pH4.5-8为优化范围。如图7所示，在酸性环境中VV-M2活性较弱或受到抑制（如pH 4.5和5），而在较高的pH下（如pH 7.5和8）时显示出相对较高的切割活性，因此，我们选择pH 8.0为该DNAzyme反应最佳pH并以此来完成该酶的其他化学性能鉴定。

7、筛选缓冲液中Mg²⁺浓度优化:

DNAzyme在特异性金属离子的存在下能够展现出较强的的催化切割活性，不同浓度比例的二价金属离子能显著的影响DNAzyme的活性。因此，接下来我们测试了Mg²⁺不同浓度（0，1，2，5，10，15，20，25，30，60，90，120，150，180，210，240，270，300 mM）对VV-M2DNAzyme的活性的影响。结果如图8所示，VV-M2 DNAzyme的活性随着Mg⁺浓度的增加而先上升后不断下降；同时，Mg²⁺浓度在0至30 mM时VV-M2 DNAzyme活性呈递增趋势，但其浓度超过30 mM时活性急剧降低，这或许可能是DNA序列在高离子浓度下三维结构发生变化所致。

随后，我们评估了不同二价金属离子对切割活性的影响。首先，在Na⁺存在下，我们先判断了VV-M2 DNAzyme发生切割时是否需要二价金属离子的辅助，因此我们用EDTA先对反应缓冲液进行预处理，使其二价离子与EDTA形成络合物，随后与VV-M2进行反应，结果证明VV-M2要产生切割作用必须要二价离子的辅助，否则DNAzyme的活性将受到抑制。接着我们测试了不同二价金属离子（Mg²⁺，Ca²⁺，Sr²⁺，Ba²⁺，Mn²⁺，Co²⁺，Fe²⁺，Ni²⁺）对该酶活性的影响。检测结果如图11表明在Sr²⁺、Ba²⁺和Mn²⁺存在时VV-M2 DNAzyme均具有切割活性，其活性大小排布为Mg²⁺>Sr²⁺> Mn²⁺ > Ba²⁺。我们分析了这些金属离子，Mg²⁺，Ba²⁺和Sr²⁺来自ⅡA族，都是碱土金属。Mn²⁺是过度金属，此外，已有研究报道Mn²⁺具有强烈的荧光淬灭效果，因此，在使用荧光计对其检测使可显著的弱化荧光强度。由此可见，固有的Na⁺、Mg²⁺更适合于DNA三维结构催化核心区域结合的金属离子。

8、特异性检测：

本方案以创伤弧菌胞外产物（CEM-VV）的混合物为筛选靶标，因此，除去细菌自身代谢产物之外，培养基成分是影响反应的最大因素，为了消除由培养基引起切割的可能性，我们将DNAzyme和基质链混合物与不含CEM-VV的空白培养基一起温育进行验证。同时，我们也验证了VV-M2在不同细菌CEM中的特异性。如图9所示，结果证明空白培养基不能诱导切割反应（标记LB），这表明我们的DNAzyme靶标的确来自创伤弧菌细胞外产物。同时，我们还测试了VV-M2在7种细菌中的选择性，这些细菌分别是溶藻弧菌、鳗弧菌、铜绿假单胞菌、迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。结果证明除创伤弧菌能诱导部分切割之外，其余对照菌株均不能诱导切割，且创伤弧菌所诱导的切割高于创伤弧菌引起的切割约4倍（图9）。同时，我们采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对该数据进行了验证，结果与图9所述一致。因此，VV-M2 DNAzyme对创伤弧菌具有高度特异性，其在经过修饰之后可制备成用于创伤弧菌特异性检测的生物传感器，为今后创伤弧菌的检测提供便利。

9、敏感性检测：

为了构建用于创伤弧菌特异性检测的VV-M2 DNAzyme荧光生物传感器，我们采用梯度稀释法来稀释创伤弧菌初始培养液（2.2×10 ⁸ cfu / mL）以收集不同浓度下创伤弧菌的胞外产物，从而以此来检测该传感器对创伤弧菌的有效检测范围。首先将不同稀释度的CEM与相同浓度的VV-M2 DNAzyme复合物在上述确定的最佳条件下于30℃进行切割反应。参照图2所设计的分子信标生物传感器原理，当有CEM-VV存在时基质链会被切割成两段并促使淬灭集团和荧光集团分离，释放荧光信号。通过多功能全波长酶标仪来实时监测每个样品在1 h内的荧光值变化（图10）。结果表明，随着创伤弧菌浓度从2.2×10 ³增加到2.2×10 ⁸ cfu / mL，切割所产生的荧光强度也逐渐增强；同时，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果也显示VV-M2 DNAzyme的检测限可低至10 ³ cfu / mL，也说明该生物传感器可适用于基层养殖区对创伤弧菌的先期检测和预防。

10、靶标性质及分子量预测:

Yingfu Li 等人利用大肠杆菌（E. coli）和艰难梭菌（C. diffcile）进行DNAzyme筛选时发现其胞外产物中与DNAzyme作用的靶标物质类型为蛋白质。因此，为了对CEM-VV中能与VV-M2 DNAzyme结合的靶标物进行大致的种类判断，我们首先假设它是一类蛋白质。随后，我们选择用胰蛋白酶对CEM-VV进行预处理，然后再使用这些CEM-VV在上述所确定的最佳条件下与VV-M2 DNAzyme进行孵育。通过两种不同方法的检测，结果显示经胰蛋白酶处理后的CEM-VA不能诱导切割，（图12）。这证明响应VV-M2 DNAzyme的靶标是一种或多种蛋白质。接下来，我们尝试使用不同孔径的离心过滤管来估量该蛋白质的分子量，我们分别使用了10K（1万道尔顿）、30K、50K和100K的离心柱过滤CEM-VV，并将滤液分别于VV-M2进行孵育，结果显示仅100K的滤液可以诱导VAE-2的切割，其他均不能引起切割反应（图13），该数据显示目标蛋白的分子量在5万道尔顿和10万道尔顿之间。

序列表

<110> 江苏海洋大学

<120> 创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme与用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgggggctgc ttgcaaaatc tcggtgccac tgacgaattt cccatgcttc tgttgacgac 60

cacgatt 67

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgggggctgc ttgcaaaatt cggtgccact gacgaatttc ccatgcttct gttgacgacc 60

acgatt 66

<210> 3

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggggctgc ttgtaaaatt cggtgccact gacgaatttc ccatgcttct gttgacgacc 60

acgatt 66

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgggggctgc ttgtaatcgg tgccactgac gatcccatgc ttctgttgac gaccacgatt 60

Claims

1.一种用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme，其特征在于：所述DNAzyme核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列(5’-3’)为：

VV-1：

TGGGGGCTGCTTGCAAAATCTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT。

2.根据权利要求1所述的用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme，其特征在于：对核酸适配体进行突变或改造，使其能用于幽门螺旋杆菌的检测。

3.根据权利要求2所述的用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme，其特征在于：DNAzymes 的序列的突变、改造包括：磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化；添加生物素、地高辛、荧光物质、淬灭集团、纳米材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。

4.据权利要求1或2所述的用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme，其特征在于：对所述的DNAzyme进行了碱基突变改造，得到3条具有活性的突变体DNAzymes，突变体DNAzyme核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列(5’-3’)为：

（1）VV-M1：

TGGGGGCTGCTTGCAAAATTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT

（2）VV-M2：

TGGGGGCTGCTTGTAAAATTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT

（3）VV-M3：

TGGGGGCTGCTTGTAATCGGTGCCACTGACGATCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT。

5.一种创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme的筛选方法，其特征在于：DNAzymes序列为权利要求1或4所述的序列，筛选步骤如下：

(2) 将要检测的创伤弧菌在LB液体培养基中进行培养；

(3) 将步骤（2）所得创伤弧菌菌体进行离心，保留上清液；

(7) 用0.2 mol的NaOH洗涤磁珠，磁性分离以制备单链；

(8) 用去离子水清洗磁珠使pH接近于中性；

(10) PCR扩增步骤(9)醇沉后所得产物用于下一轮筛选；

(11) 高通量测序和DNA序列分析；

(12) 候选DNAzyme VV-1活性及性质检测；

(13) DNAzyme碱基序列突变改造得到VV-M1、VV-M2和VV-M3；

(14) DNAzyme切割速率测定。

6. 根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于：Biotin生物素标签均标记在DNA序列的5’端；所使用的创伤弧菌菌体浓度为2.2×109 CFU每毫升；所有的结合和切割反应均在1.5毫升无菌无酶离心管中进行。

7.一种如权利要求1－4中所述的DNAzymesy的用途，其特征在于：该用途为于将DNAzymes用于创伤弧菌的特异性识别或检测。