CN115725796A

CN115725796A - 一种病毒真菌三联核酸检测试剂盒及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN115725796A
Application number: CN202211368060.XA
Authority: CN
Inventors: 曾真; 周泽文; 陈思
Original assignee: Hunan Labsci Medical Robot Co ltd
Current assignee: Hunan Labsci Medical Robot Co ltd
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开一种病毒真菌三联核酸检测试剂盒及其检测方法和应用，病毒真菌三联核酸检测试剂盒包括如下组分：MIX反应液1、MIX反应液2、阳性对照以及阴性对照，所述MIX反应液2包括一条检测疱疹病毒的第一探针、一条检测巨细胞病毒的第二探针以及一条检测弓形虫的第三探针。本试剂盒采用多重荧光定量PCR技术，设计疱疹病毒，巨细胞病毒和弓形虫特异性探针及引物，在同一个反应体系中实现同时检测疱疹病毒，巨细胞病毒和弓形虫，解决了现有产品只能在一个反应管中检测一种病毒或真菌的问题。

Description

一种病毒真菌三联核酸检测试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及一种病毒真菌三联核酸检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

背景技术

疱疹病毒(HSV)和巨细胞病毒(CMV)均属于DNA病毒。HSV病毒是生殖器疱疹的主要病因，一旦感染，患者将终身携带这种病毒，并周期性的出现生殖器疱疹性损伤，并且，疱疹病毒的感染还会增加HIV-1传播风险。巨细胞病毒是一种疱疹病毒组DNA病毒，具有典型的疱疹病毒形态，产妇感染CMV后，其泌尿道和宫颈能排出CMV，可能导致婴儿在分娩时感染，影响儿童健康。弓形虫感染导致的妇科疾病其实质即是女性生殖系统的弓形虫感染,既往有关这方面的研究均是应用血清学的方法检测弓形虫IgG或/及IgM抗体得出的结论,认为女性生殖系统的弓形虫感染是女性不孕症、盆腔炎、子宫功能失调性出血及宫外孕的病因之一,因为上述疾病患者弓形虫感染率明显高于对照组,经统计学分析有显著意义,说明两者间有一定的因果关系。目前常用的实验室的检测方法主要有病毒分离培养、血清学检测及核酸检测等方法。由于Elisa法检测灵敏度低，假阳性高；病毒分离培养费时费力，并且存在一定的危险性。近年来运用荧光PCR技术检测的病毒种类越来越多，对于荧光PCR检测病毒来说，引物的设计至关重要，直接影响检测结果的特异性。通过针对病毒的特意序列设计高特异性的taqman探针及引物，能够极大的保证检测结果的特异性。然而现有的试剂盒在针对疱疹病毒检测、巨细胞病毒检测和弓形虫检测时，均采取单独检测的方式，只能在一个反应管中检测一种病毒或真菌，并且现有的试剂盒大多存在特异性差，灵敏性低等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种病毒真菌三联核酸检测试剂盒，旨在解决上述技术问题。

为实现上述目的，本发明提出的一种病毒真菌三联核酸检测试剂盒包括如下组分：MIX反应液1、MIX反应液2、阳性对照以及阴性对照，所述MIX反应液2包括一条检测疱疹病毒的第一探针、一条检测巨细胞病毒的第二探针以及一条检测弓形虫的第三探针。

在一实施例中，所述MIX反应液2包括第一组分、第二组分以及第三组分，所述第一组分包括一对检测疱疹病毒的第一引物和一条检测疱疹病毒的所述第一探针，所述第二组分包括一对检测巨细胞病毒的第二引物和一条检测巨细胞病毒的所述第二探针，所述第三组分包括一对检测弓形虫的第三引物和一条检测弓形虫的所述第三探针。

在一实施例中，所述序列表如下表所示：

在一实施例中，所述第一引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，第一探针的碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

在一实施例中，所述第二引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，第二探针的碱基序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

在一实施例中，所述第三引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，第三探针的碱基序列如序列表SEQ ID NO.9所示。

在一实施例中，所述第一探针、第二探针和所述第三探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭。

在一实施例中，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、VIC、ROX中的任意一种，所述荧光淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1中的任意一种，所述第一探针、第二探针和第三探针中的所述荧光报告基团均不同。

在一实施例中，所述MIX反应液1包括Taq启动酶，10X缓冲液，25mMMgCL₂和10mMdNTPs，所述阳性对照为含有目的检测片段的重组质粒溶液，所述阴性对照为无菌水。

另外，本发明还提供一种采用如上所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

S1、试剂准备：

S11、取出试剂盒中的MIX反应液1，在室温下融化并混匀，低速瞬间离心，取出试剂盒中的MIX反应液2，低速瞬间离心，置于冰上备用；

S12、确定反应数N，反应数N至少比检测样本数多2，并按照10μL×N的MIX反应液1，3μL×N的反应液二以及4μL×N的ddH₂O配置反应体系；

S13、将上述混合液震荡混匀，瞬时离心5秒，按17μL/管分装至PCR管中；

S2、样本制备：

S21、取3μL待测样本，阳性对照、阴性对照，分别加入到已分装的反应混合液中。盖紧PCR反应管盖，瞬时低速离心。将PCR反应管上机检测；

S3、PCR扩增检测：

S31、设定循环参数；

S32、根据待测样本的Ct值读取样本检测结果。

另外，本发明还提供一种根据如上所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒的应用，所述试剂盒用于体外检测疱疹病毒、巨细胞病毒以及弓形虫。

本发明的试剂盒采用多重荧光定量PCR技术，设计疱疹病毒，巨细胞病毒和弓形虫特异性探针及引物，在同一个反应体系中实现同时检测疱疹病毒，巨细胞病毒和弓形虫。设计的引物和探针在NCBI的GeneBank数据库进行比对，检测探针和引物的特异性。

本试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为1.5-3小时，并且在同一反应体系中能够实现同时检测疱疹病毒/巨细胞病毒/弓形虫。PCR荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物及反应液后，可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。

能够在同一个反应体系中同时检测疱疹病毒/巨细胞病毒/弓形虫，解决了现有产品只能在一个反应管中检测一种病毒或真菌的问题。本发明还具有灵敏度高，可重复性强，操作简便，检测结果快速客观等优点，在临床诊断，疾病预防监测等领域具有极大的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例的试剂盒用在包括疱疹病毒，巨细胞病毒弓形虫在内的30种不同的阴道微生物的扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的病毒真菌三联核酸检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

实施例1、试剂盒的制备

本实施例的序列如下：

其中，X1，X2和X3为荧光报告基团，Y1，Y2和Y3为荧光淬灭基团。

本实施例的检测试剂盒包括如下组分(25人份)：

实施例2

1、试剂准备

1.1、取出试剂盒中的MIX反应液1，在室温下融化并混匀，低速瞬间离心。取出试剂盒中的MIX反应液2，低速瞬间离心，置于冰上备用。

1.2、确定反应数N：根据检测样本数计算所需反应数，如样本数为n，则反应数N＝(待鉴样本数n+阴性质控1+阳性质控1)，按下表配置反应体系。

反应体系配置

1.3、反应体系分管：准备相应数量的PCR反应管，将上述混合液震荡混匀，瞬时离心5秒，按17μL/管分装至PCR管中。

2、样本制备

2.1、待测样本提取采用商品化的DNA提取试剂盒。具体操作按照核酸提取试剂盒说明书进行操作。

2.2、取3μL待测样本，阳性对照、阴性对照，分别加入到已分装的反应混合液中。盖紧PCR反应管盖，瞬时低速离心。将PCR反应管上机检测。

3、PCR扩增检测

3.1、将PCR反应管放置于荧光定量PCR仪扩增检测，本发明中采用的仪器以雅睿MA6000荧光定量PCR仪为例。

3.2、循环参数设定：

4、实验有效性判定

在本实施例中，本产品中HSV基因报告荧光为FAM，CMV基因报告荧光为VIC，弓形虫基因报告荧光为CY5。

(1)阳性质控：

FAM通道有典型S型扩增曲线且Ct值≤38。

VIC通道有典型S型扩增曲线且Ct值≤38。

CY5通道有典型S型扩增曲线且Ct值≤38。

(2)阴性质控：

FAM通道，VIC通道以及CY5获得的Ct大于≥40或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

(3)只有满足1条件，实验有效，否则无效。

5、检验结果的判定

以雅瑞MA6000为例：反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节基线的start值，end值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3-15，end值可以在5-20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击所有荧光检查自动获得分析结果，在Report窗口读取检测结果。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种病毒真菌三联核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分：MIX反应液1、MIX反应液2、阳性对照以及阴性对照，所述MIX反应液2包括一条检测疱疹病毒的第一探针、一条检测巨细胞病毒的第二探针以及一条检测弓形虫的第三探针。

2.根据权利要求1所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒，其特征在于，所述MIX反应液2包括第一组分、第二组分以及第三组分，所述第一组分包括一对检测疱疹病毒的第一引物和一条检测疱疹病毒的所述第一探针，所述第二组分包括一对检测巨细胞病毒的第二引物和一条检测巨细胞病毒的所述第二探针，所述第三组分包括一对检测弓形虫的第三引物和一条检测弓形虫的所述第三探针。

3.根据权利要求2所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，第一探针的碱基序列如序列表SEQ IDNO.3所示。

4.根据权利要求2所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第二引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，第二探针的碱基序列如序列表SEQ IDNO.6所示。

5.根据权利要求2所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第三引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，第三探针的碱基序列如序列表SEQ IDNO.9所示。

6.根据权利要求2所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一探针、第二探针和所述第三探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭。

7.根据权利要求6所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、VIC、ROX中的任意一种，所述荧光淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1中的任意一种，所述第一探针、第二探针和所述第三探针中的所述荧光报告基团均不同。

8.根据权利要求1-7任一项所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒，其特征在于，所述MIX反应液1包括Taq启动酶，10X缓冲液，25mMMgCL₂和10mMdNTPs，所述阳性对照为含有目的检测片段的重组质粒溶液，所述阴性对照为无菌水。

9.一种采用权利要求1-8任一项所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

S1、试剂准备：

S2、样本制备：

S21、取3μL待测样本，阳性对照、阴性对照，分别加入到已分装的反应混合液中，盖紧PCR反应管盖，瞬时低速离心，将PCR反应管上机检测；

S3、PCR扩增检测：

S31、设定循环参数；

S32、根据待测样本的Ct值读取样本检测结果。

10.一种根据权利要求1-8任一项所述的病毒真菌三联核酸检测试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于体外检测疱疹病毒、巨细胞病毒以及弓形虫。