CN112029877A - 一种多重pcr引物筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多重PCR引物筛选方法及应用，包括：S1、针对单个目的片段进行单重PCR反应；S2、每个目的片段选取一对引物，并将引物随机组合，每组3‑4对引物，分别进行小型多重PCR体系优化；S3、将步骤S2筛选得到的引物混合，进行总多重PCR，选取扩增效率高且无特异性扩增的引物。同时本发明还提供了利用上述筛选方法得到的一种13种呼吸道病原微生物多重PCR检测试剂盒，包括13对引物，具体如SEQ ID NO.1‑26所示。本发明的筛选方法可达到快速检测并筛选引物的目的，显著缩短了多重PCR体系的优化周期，降低了优化难度，且本发明的检测试剂盒可同时检测13种常见的呼吸道病原微生物，不仅降低了检测成本，节省检测时间，而且检测效率高，适合临床大规模使用。

Description

一种多重PCR引物筛选方法及应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种多重PCR引物筛选方法及应用。

背景技术

呼吸道感染来源极为复杂，包括病毒、细菌、支原体、衣原体等微生物，目前已知的与呼吸道感染有关的病原微生物包括：肺炎链球菌、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、流感嗜血杆菌、肺炎支原体和腺病毒等。

其中，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)可引起肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎等多种严重疾病，其中与细菌毒力密切相关LytA(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶)是首个在分子水平进行定性的细菌自溶酶，其存在于所有血清型的肺炎链球菌中，位于菌体细胞壁，具有较高的保守性，可促进细菌释放毒性物质对机体造成伤害。近几年，肺炎链球菌对于大环内酯类抗生素耐药严重，如携带ermB基因的肺炎链球菌通过编码的23rRNA甲基化酶致靶位改变，对大环内酯类耐药水平较高，又如携带mefA基因的菌株介导低水平的耐药，而同时携带有ermB和mefA基因的肺炎链球菌分离菌株，除了对大环内酯类药物具有高水平的耐药性外，还常常显示出多药耐药的特性。

副流感病毒(Parainfluenza virus，PIV)是一种单链RNA病毒，属于副黏病毒，会引起支气管炎、肺炎等疾病，其具有四种亚型，即PIV1-4，其中I型和II型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，I型是这种儿童喉气管支气管炎的主要原因，而II型次之。I型和II型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾病。III型经常导致肺炎和细支气管炎。IV型很难检出，可能是因为它很少导致严重的疾病。

流感病毒(Influenza virus)是正粘病毒科的代表种，主要通过空气中的飞沫、易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播，可分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等，其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可分为三类：甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)、乙型流感病毒(Influenza B virus，IBV)和丙型流感病毒(Influenza C virus，ICV)。

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)属副粘病毒科，该病经空气飞沫和密切接触传播，是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原，可引起间质性肺炎及毛细支气管炎。

流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，Hi)，是一种没有运动力的革兰氏阴性杆菌。它是于1892年由费佛博士在流行性感冒的瘟疫中发现。它一般都是好氧生物，但可以成长为兼性厌氧生物。大部份流感嗜血杆菌都是机会性感染细菌，即它们会在寄主体内生存而不引起任何疾病，但当某一些因素(如病毒感染或免疫力下降)出现后则会引发病症。

肺炎支原体(M.pneumonia，Mp)是人类支原体肺炎的病原体，其不同于普通的细菌和病毒，它比细菌小，却比病毒大，是能独立生活的最小微生物。支原体肺炎全年均可发病，以秋冬季多见。它由急性期患者的口、鼻分泌物经空气飞沫传播，引起呼吸道感染。其发病主要与室内活动增加及密切接触有关。

腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。衣壳里是线状双链DNA分子，约含4.7kb，两端各有长约100bp的反向重复序列。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染。

传统的用于呼吸道感染的检测方法有病原体分离培养法和免疫检测法，由于其操作过程繁琐、敏感度低及检测时间较长，无法满足快速诊断的要求。近年来，随着PCR技术的不断发展，其具有的高敏感度、高特异性、操作快速简便等优点，在呼吸道病原微生物检测中有着广阔的应用前景。但普通PCR的缺陷在于一个反应只可以对单一基因进行检测，多重PCR技术则可在一个反应中同时检测多个基因，以快速高效地检测出病原微生物。

多重PCR(Multiplex PCR，M-PCR)是指在同一个PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其具有高效性、系统性和经济简便性的特点。然而在多重PCR体系的建立过程中会出现一些问题：(1)引物设计难度大：在同一反应温度下需兼顾所有引物均保持较高的扩增效率，减少非特异性扩增且引物间互不干扰；(2)优化效率低：先进行单重PCR反应，然后依次增加引物对，不断调整反应条件或更换引物；(3)PCR反应时间长：传统PCR反应为三步法，且多重PCR反应中由于有多个片段进行扩增，酶和dNTP的缺乏成为限制因素，因此需延长退火和延伸的时间以完成所有产物的合成，使得反应时间进一步拉长。

发明内容

本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种多重PCR引物筛选方法及应用，显著提高了筛选效率，缩短了多重PCR反应扩增引物的优化周期，同时还提供一种13种呼吸道病原微生物的多重PCR检测试剂盒，以同时检测13种常见的呼吸道病原微生物，增强了检测效率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种多重PCR引物筛选方法，所述方法包括：S1、针对单个目的片段进行单重PCR反应，选取扩增效率高且无特异性扩增的引物；S2、每个目的片段选取一对引物，并将引物随机组合，每组3-4对引物，分别进行小型多重PCR体系优化，选取扩增效率高且无特异性扩增的引物；S3、将步骤S2筛选得到的引物混合，进行总多重PCR，选取扩增效率高且无特异性扩增的引物。

进一步的，所述小型多重PCR和总多重PCR的反应程序为：(1)95℃反应10s，(2)65℃30s，循环步骤(1)和(2)30次，(3)最后65℃反应2min。

进一步的，步骤S1中单重PCR和步骤S2中小型多重PCR的反应体系为：10×buffer2μL，dNTP 1.6μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA聚合酶0.2μL，模板1μL，补水至总体积为20μL。

进一步的，步骤S3中总多重PCR的反应体系为：10×buffer 5μL，dNTP4μL，混合引物10μL，DNA聚合酶0.5μL，模板1μL，补水至总体积为50μL。

本发明还提供利用上述筛选方法得到的一种13种呼吸道病原微生物的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括用于13种呼吸道病原微生物特异基因的多重PCR扩增引物，所述扩增引物具体为：(1)用于扩增肺炎链球菌LytA基因的引物如SEQ ID NO.1-2所示，(2)用于扩增肺炎链球菌耐药基因mefA的引物如SEQ ID NO.3-4所示，(3)用于扩增肺炎链球菌耐药基因ermB的引物如SEQ ID NO.5-6所示，(4)用于扩增1型副流感病毒(PIV1)的引物如SEQID NO.7-8所示，(5)用于扩增2型副流感病毒(PIV2)的引物如SEQ ID NO.9-10所示，(6)用于扩增3型副流感病毒(PIV3)的引物如SEQ ID NO.11-12所示，(7)用于扩增4型副流感病毒(PIV4)的引物如SEQ ID NO.13-14所示，(8)用于扩增甲型流感病毒(IAV)的引物如SEQ IDNO.15-16所示，(9)用于扩增乙型流感病毒(IBV)的引物如SEQ ID NO.17-18所示，(10)用于扩增呼吸道合胞病毒(RSV)的引物如SEQ ID NO.19-20所示，(11)用于扩增流感嗜血杆菌(Hi)的引物如SEQ ID NO.21-22所示，(12)用于扩增肺炎支原体(Mp)的引物如SEQ IDNO.23-24所示，(13)用于扩增腺病毒(Adv)的引物如SEQ ID NO.25-26所示。

进一步的，所述引物的浓度为1～5μM。

进一步的，试剂盒中各引物的浓度分别为：(1)用于扩增LytA基因的引物浓度为3μM，(2)用于扩增mefA基因的引物浓度为2μM，(3)用于扩增ermB基因的引物浓度为1μM，(4)用于扩增1型副流感病毒的引物浓度为1.5μM，(5)用于扩增2型副流感病毒的引物浓度为1.5μM，(6)用于扩增3型副流感病毒的引物浓度为3μM，(7)用于扩增4型副流感病毒的引物浓度为1.5μM，(8)用于扩增甲型流感病毒的引物浓度为1μM，(9)用于扩增乙型流感病毒的引物浓度为1μM，(10)用于扩增呼吸道合胞病毒的引物浓度为1μM，(11)用于扩增流感嗜血杆菌的引物浓度为1μM，(12)用于扩增肺炎支原体的引物浓度为1.5μM，(13)用于扩增腺病毒的引物浓度为1μM。

进一步的，所述试剂盒中还包括：阳性对照品、阴性对照品、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应缓冲液和DEPC水。

本发明还提供了一种上述试剂盒在呼吸道病原微生物检测中的应用。

本发明还提供了一种多重PCR检测试剂盒，包括上述13种呼吸道病原微生物特异基因的多重PCR扩增引物中的至少2对引物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一种多重PCR引物的筛选方法，将单重PCR筛选得到的引物进行随机组合，先进行小型多重PCR体系优化再组合进行总多重PCR的体系优化，并且还提供了一种快速高效的PCR反应程序，可达到快速检测的目的，从而显著了缩短多重PCR体系的优化周期，降低了优化难度。

(2)本发明还提供了一种13种呼吸道病原微生物的多重PCR检测试剂盒，可同时检测13种常见的呼吸道病原微生物，不仅降低了检测成本，节省检测时间，而且检测效率高，适合临床大规模使用。

附图说明

图1为本发明实施例2中A组的单重PCR验证的电泳结果图，从左至右分别对应引物LytA-1，mefA-1，ermB-2以及Marker；

图2为本发明实施例2中B组的单重PCR验证的电泳结果图，从左至右分别对应引物PIV1-2，PIV2-2，PIV3-3和PIV4-4；

图3为本发明实施例2中C组的单重PCR验证的电泳结果图，从左至右分别对应引物IAV-4，IBV-2，RSV-3以及Marker；

图4为本发明实施例2中D组的小型多重PCR的电泳结果图；

图5为本发明实施例3中总多重PCR产物的单重PCR验证电泳结果图，其中从左至右分别对应引物LytA-1，mefA-1，ermB-2，PIV1-2，PIV2-2，PIV3-3，PIV4-4，IAV-4，IBV-2，RSV-3，Hi-3、Mp-1，Adv-2，Y(空白对照)以及Marker。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1单重PCR扩增

(1)引物设计：针对13种呼吸道病原微生物(肺炎链球菌LytA基因、肺炎链球菌耐药基因mefA、肺炎链球菌耐药基因ermB、PIV1、PIV2、PIV3、PIV4、IAV、IBV、RSV、Hi、Mp和Adv)的目的基因分别设计3对特异性引物，即共设计了至少39对引物。

引物设计要求为：TM值为65-70℃，长度18-30bp，GC％为40-70％，避免4个以上连续相同碱基出现。

引物设计完成后，在NCBI数据库进行BLAST保证其特异性，不符合要求的引物需重新设计。

(2)单重PCR扩增：用每对引物分别对其对应的质粒模板进行单重PCR扩增反应，其中13个质粒模板委托武汉金开瑞生物工程有限公司合成，PCR反应所使用的Taq酶和10xbuffer均为自产的，dNTP来源于Takara公司(货号：4030)，后续检测用的Trans2K DNAMarker以及6x DNA loading buffer均来源于北京全式金生物技术有限公司。

单重PCR反应的体系为：

反应体系(总体积)	20μL
		10x buffer	2μL
dNTP(2.5mM)	1.6μL
		Primer-F(10μM)	1μL
Primer-R(10μM)	1μL
		Taq酶	0.2μL
模板	1μL
		H<sub>2</sub>O	13.2μL

单重PCR反应的反应条件为：①95℃反应10s，②65℃30s，重复步骤①和②并循环30次，③最后65℃反应2min。将反应产物点样于1％琼脂糖凝胶中，于120V电泳20min，检测目的条带，选取扩增效率高，条带清晰无杂带的引物，进行后续的反应。

根据筛选得到的引物具体为，其中引物序列中的Y、N、M、R为简并碱基。

引物名称	序列
		LytA-1F	TGAAGCGGATTATCACTGGCGGAAAG
LytA-1R	TGAGTTGTCGAACCAGTACCAGTTGC
		mefA-1F	TTTTATACAATATGGGCAGGGCAAGC
mefA-1R	TCCTTTATTTTGCCGTAGTACAGCCAT
		ermB-2F	GGTAAAGGGCATTTAACGACGAAACT
ermB-2R	GGAACATCTGTGGTATGGCGGGTA
		PIV1-2F	AACAGGAATTGGCTCAGATATGCGAGAA
PIV1-2R	AGTCTCGACAACAATCTTTGGCCTATC
		PIV2-2F	CGGTAAATCCAGCGAACAGGC
PIV2-2R	TTGGTTCGGTTGGACTCATTTCTG
		PIV3-3F	TCAAGAAGTGCTGCCACAAAGAATAAC
PIV3-3R	CAACAATGATAGAGTTGACCATCCTCCT
		PIV4-4F	ATCAAGGACTCATTCTTGATGCAAA
PIV4-4R	GTGCATCTATACGAACACCTGCTCT
		IAV-4F	GAAAGATGAGYCTTYTAACCGAGGT
IAV-4R	TGGACAAANCGTCTACGCTGCAGTC
		IBV-2F	ACCAGGAAGGTGCCTTGATGACATA
IBV-2R	TAGCAACAAGCCTTCCACTCTGGTC
		RSV-3F	GTAATAACCAAATTAGCAGCAGGAGA
RSV-3R	CCTGMACCATAGGCATTCATAAACAA
		Hi-3F	GCATAACGCATAGGAGGGAAATG
Hi-3R	TGCCCACGGACCATACCAG
		Mp-1F	GCAGCGTGGTGTACTATGAGCAGT
Mp-1R	CATTTGGGGAGGTCCTTGTGAAT
		Adv-2F	CCCTTGGAAATGACCTCAGAACR
Adv-2R	AGGCTGCCCAGTTGCGAGA

实施例2小型多重PCR扩增

根据目的片段的同源性，将13对引物分为四组，其中A组为：LytA-1，mefA-1和ermB-2；B组为PIV1-2，PIV2-2，PIV3-3和PIV4-4；C组为IAV-4，IBV-2和RSV-3；D组为Hi-3，Mp-1和Adv-2。将每组的三对或四对引物的正向引物和反向引物分别等体积混合，得到混合引物，同时根据分组将对应的模板等体积混合得到混合模板，按照以下反应体系进行小型多重PCR扩增：

反应体系(总体积)	20μL
		10x buffer	2μL
dNTP(2.5mM)	1.6μL
		Primer-F(10μM)	1μL
Primer-R(10μM)	1μL
		Taq酶	0.2μL
模板	1μL
		H<sub>2</sub>O	13.2μL

小型多重PCR反应的反应条件为：①95℃反应10s，②65℃30s，重复步骤①和②并循环30次，③最后65℃反应2min。将反应产物点样于1％琼脂糖凝胶中，于120V电泳20min，检测目的条带。

其中组A、组B和组C的扩增产物的片段大小相近，通过琼脂糖凝胶电泳难以区分，因此以扩增产物作为模板，分别选取单一的上述引物进行单重PCR验证，如果单重PCR能成功扩增出来，说明小型多重PCR的产物中存在目的片段，即小型多重PCR扩增成功。

组A-C以小型多重PCR的产物为模板进行的单重PCR扩增的反应体系和反应条件与实施例1相同，结果如附图1-3所示，组D的扩增产物片段大小存在一定差异，可通过电泳直接区分，其电泳图如附图4所示，根据附图1-4，以上述引物进行小型多重PCR时，均可成功扩增出目的片段且条带清晰，因此可用于后续的反应。

实施例3总多重PCR扩增

将实施例2中四组中的引物组合在一起，即把13组引物组合进行总多重PCR扩增。具体为：将13组引物的上下游引物各取1μL，混合并加水稀释至100μL作为混合引物，取10μL用于总多重PCR扩增，同时将13个质粒模板等体积混合作为混合模板，总多重PCR的反应体系具体为：

反应体系(总体积)	50μL
		10x buffer	5μL
dNTP(2.5mM)	4μL
		混合引物	10μL
Taq酶	0.5μL
		模板	1μL
H<sub>2</sub>O	29.5μL

总多重PCR反应的反应条件为：①95℃反应10s，②65℃30s，重复步骤①和②并循环30次，③最后65℃反应2min。由于目的条带的片段大小接近，采用常规琼脂糖凝胶电泳难以区分，因此以总多重PCR扩增产物作为模板，分别选取单一的上述引物进行单重PCR验证，如果单重PCR能成功扩增出片段，则说明总多重PCR的产物中存在目的片段，即总多重PCR扩增成功，其中单重PCR验证的反应体系和反应条件与实施例1相同。

确定最优组合后，对于条带较弱的产物，可适当提高该产物对应的引物浓度，然后再次进行PCR扩增，直至得到清晰单一无杂带的条带。最终得到的13对引物的浓度分别为：LytA-1 3μM，mefA-1 2μM，ermB-2 1μM，PIV1-2 1.5μM，PIV2-2 1.5μM，PIV3-3 3μM，PIV4-41.5μM，IAV-4 1μM，IBV-2 1μM，RSV-3 1μM，Hi-3 1μM，Mp-1 1.5μM，Adv-2 1μM。

总多重PCR扩增的单重PCR验证结果如附图5所示，根据结果发现，全部13种病原微生物的目的片段均成功扩增并被检测到，即说明上述13组引物组合得到的体系可用于检测这13种病原微生物，并用于制备13种呼吸道病原微生物的多重PCR检测试剂盒。本发明的引物设计原则规范了高特异性、高效引物的标准，确保各对引物的最适条件较为统一，同时采用本发明所述的筛选优化方法以及设计的PCR程序，可大大提高优化效率，缩短检测时间，同时保证了多重PCR扩增体系较高的扩增效率，本次13对多重PCR体系的优化中，从引物设计完成到体系确定，使用上述优化方法花费了大概半个月的时间，即较为高效的完成了筛选优化工作。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多重PCR引物筛选方法，其特征在于，所述方法包括：S1、针对单个目的片段进行单重PCR反应，选取扩增效率高且无特异性扩增的引物；S2、每个目的片段选取一对引物，并将引物随机组合，每组3-4对引物，分别进行小型多重PCR体系优化，选取扩增效率高且无特异性扩增的引物；S3、将步骤S2筛选得到的引物混合，进行总多重PCR，选取扩增效率高且无特异性扩增的引物。

2.根据权利要求1所述的一种多重PCR引物筛选方法，其特征在于，所述小型多重PCR和总多重PCR的反应程序为：(1)95℃反应10s，(2)65℃30s，循环步骤(1)和(2)30次，(3)最后65℃反应2min。

3.根据权利要求1所述的一种多重PCR引物筛选方法，其特征在于，步骤S1中单重PCR和步骤S2中小型多重PCR的反应体系为：10×buffer2μL，dNTP 1.6μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA聚合酶0.2μL，模板1μL，补水至总体积为20μL。

4.根据权利要求1所述的一种多重PCR引物筛选方法，其特征在于，步骤S3中总多重PCR的反应体系为：10×buffer 5μL，dNTP 4μL，混合引物10μL，DNA聚合酶0.5μL，模板1μL，补水至总体积为50μL。

5.一种如权利要求1所述的筛选方法得到的13种呼吸道病原微生物的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于13种呼吸道病原微生物特异基因的多重PCR扩增引物，所述引物具体为：(1)用于扩增肺炎链球菌LytA基因的引物如SEQ ID NO.1-2所示，(2)用于扩增肺炎链球菌耐药基因mefA的引物如SEQ ID NO.3-4所示，(3)用于扩增肺炎链球菌耐药基因ermB的引物如SEQ ID NO.5-6所示，(4)用于扩增1型副流感病毒的引物如SEQ IDNO.7-8所示，(5)用于扩增2型副流感病毒的引物如SEQ ID NO.9-10所示，(6)用于扩增3型副流感病毒的引物如SEQ ID NO.11-12所示，(7)用于扩增4型副流感病毒的引物如SEQ IDNO.13-14所示，(8)用于扩增甲型流感病毒的引物如SEQ ID NO.15-16所示，(9)用于扩增乙型流感病毒的引物如SEQ ID NO.17-18所示，(10)用于扩增呼吸道合胞病毒的引物如SEQID NO.19-20所示，(11)用于扩增流感嗜血杆菌的引物如SEQ ID NO.21-22所示，(12)用于扩增肺炎支原体的引物如SEQ ID NO.23-24所示，(13)用于扩增腺病毒的引物如SEQ IDNO.25-26所示。

6.根据权利要求5所述的13种呼吸道病原微生物的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为1～5μM。

7.根据权利要求6所述的13种呼吸道病原微生物的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，其中各引物的浓度分别为：(1)用于扩增LytA基因的引物浓度为3μM，(2)用于扩增mefA基因的引物浓度为2μM，(3)用于扩增ermB基因的引物浓度为1μM，(4)用于扩增1型副流感病毒的引物浓度为1.5μM，(5)用于扩增2型副流感病毒的引物浓度为1.5μM，(6)用于扩增3型副流感病毒的引物浓度为3μM，(7)用于扩增4型副流感病毒的引物浓度为1.5μM，(8)用于扩增甲型流感病毒的引物浓度为1μM，(9)用于扩增乙型流感病毒的引物浓度为1μM，(10)用于扩增呼吸道合胞病毒的引物浓度为1μM，(11)用于扩增流感嗜血杆菌的引物浓度为1μM，(12)用于扩增肺炎支原体的引物浓度为1.5μM，(13)用于扩增腺病毒的引物浓度为1μM。

8.根据权利要求5所述的13种呼吸道病原微生物的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：阳性对照品、阴性对照品、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应缓冲液和DEPC水。

9.如权利要求5所述的试剂盒在呼吸道病原微生物检测中的应用。

10.一种多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求5所述的13种呼吸道病原微生物特异基因的多重PCR扩增引物中的至少2对引物。

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