CN114350749A - 一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法，该方法包括样本前处理、样本破壁处理、样本核酸提取和样本核酸文库构建步骤，所述样本为无细胞体液样本，所述样本破壁处理是将样本置于匀浆机中进行3个循环的破壁处理。
Description
技术领域
本发明涉及宏基因组检测领域，具体涉及一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法。
背景技术
感染性疾病是世界范围内导致人类死亡的主要原因之一。传统的病原体检测方法主要受限于通量低，时间长，灵敏度低。新兴的宏基因组二代测序可一次性检测样本中的未知、罕见、不典型等所有病原体，提示耐药基因和毒力因子，且具有最高的阴性预测值，适用于疑难危重症病例病原体的快速诊断、新发和罕见病原体的发现，以及“排除”感染。
随着宏基因组测序技术的不断发展，其在临床疑难感染性疾病诊断方面的应用越来越广泛，广泛用于败血症、脑膜炎、脑炎等感染性疾病。其中对于血流感染患者，如果使用全血进行核酸提取及建库，虽然包括了最全面的病原信息，但是大量的人源基因会掩盖了极微量的病原微生物信息，同时游离短片段容易丢失，降低了有效病原体检出。如果用血浆中的游离核酸检测，虽然克服了全血样本中大量红细胞、血红素、白细胞干扰的检测，但是也会有部分血液细胞内病原微生物的丢失，这在一定程度上降低了准确性。对于其他无细胞体液样本(例如脑脊液)存在大量游离核酸和短片段，核酸含量一般很低，导致建库失败。目前市场上用于无细胞体液样本的检测方法，提取效率偏低，灵敏度不高，建库失败率高，并且常规破壁流程对无细胞体液样本的损耗较大，特别是病毒，急需针对这类样本的一整套检测流程。
因此，开发一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法，提高游离核酸和低浓度的核酸检测成功率，提高真菌和胞内菌检出同时，保证病毒完整性，对于宏基因组的检测具有重要意义。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述基于宏基因组测序的游离核酸建库方法包括样本前处理、样本破壁处理、样本核酸提取和样本核酸文库构建步骤，所述样本为无细胞体液样本，所述样本破壁处理是将样本置于匀浆机中进行3个循环的破壁处理。
优选地，所述无细胞体液样本为血浆或脑脊液。
优选地，当所述样本为血浆时，在进行样本前处理过程中在血浆样本中加入全血，且全血与血浆的体积比为1:50至3:50。
更优选地，所述全血与血浆的体积比为2:50。
优选地，样本核酸提取时，向样本中加入蛋白酶K进行孵育。
更优选地，所述蛋白酶K孵育温度为37℃，孵育时间为2h。
优选地，所述样本破壁处理时，将匀浆机的破壁循环参数设置为：6m/sec，60s on，5min off。
优选地，所述样本核酸文库构建针对不同无细胞体液样本，优化不同的低浓度核酸建库流程。转座酶建库适用于低浓度核酸样本，例如脑脊液等这类含有短片段，核酸含量低的样本，操作简单，建库成功率更高，耗时更短。但是转座酶建库不适用于片段短至100-200bp的样本，血浆游离核酸片段主要集中在100-200bp，因此采用酶切法建库。
进行宏基因组测序时即采用前述构建的样本文库进行上机测序。
下面对本发明作进一步说明：
在本发明中，待测样本可以选自无细胞体液(血浆、脑脊液)。
在本发明中是专门针对无细胞体液样本的整套检测流程，核心创新点包括样本特殊处理，游离核酸提取和低浓度核酸的建库方案等，提出了更完整，准确的一套检测方法。
本发明中，当样本为血浆时，通过加入上述少量体积的全血，既克服了全血样本中大量红细胞、人源背景、白细胞干扰，同时能弥补游离核酸部分病原体的损失。
本发明中，破壁循环数为3个循环，流程为：6m/sec，60s on，5min off，3cycs。经试验摸索后发现，上述破壁循环数能够尽可能降低游离核酸中脆弱病原体损耗，提高厚壁菌检出。
本发明中，不同无细胞体液样本，采用不同的低浓度核酸建库流程。脑脊液采用转座酶法，血浆采用常规的酶切法。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明针对常规宏基因检测环节中不足，分别优化，提供了一套专门针对无细胞体液样本检测的建库方法及基于该文库的检测方法，包括标本前处理、游离核酸提取和低浓度核酸的建库方案；2)无细胞体液样本包括血浆、脑脊液等；3)对于血浆样本，常规宏基因检测直接采用全血或者血浆，2种方法均存在一定劣势，本发明通过在血浆中加入少量全血，既不会丢掉血液细胞内的病原微生物信息，又不会丢失游离核酸病原微生物；4)破壁流程：优化了专门针对无细胞体液样本的破壁流程(将破壁循环减少到3次)，提高真菌，胞内菌检出同时，降低了病毒的损耗，弥补了常规破壁流程对无细胞体液样本的病毒的损耗；6)提取流程：针对游离核酸提取采用蛋白酶K孵育37℃，2h，更能防止游离核酸降解；7)常规宏基因检测流程，脑脊液和血液一般采用相同建库流程。本发明针对不同无细胞体液样本类型，脑脊液和血液样本特点，分别采用不同的低浓度核酸建库流程。低浓度核酸的脑脊液样本采用转座酶建库，血浆游离核酸由于片段大小的限制，采用常规酶切法建库。
本发明以无细胞体液的样本作为检测对象，建立了一套完整的检测流程。通过改进样本前处理和提取流程，保证病原体核酸信息完整性。采用低浓度核酸的特殊建库流程，保证整套检测方法的稳定性和准确性。因此，本发明方法构建的样本核酸文库，能够准确、快速、灵敏的实现对无细胞体液样本感染病原体的鉴定，有效富集游离核酸，同时避免细胞内病原体丢失，并采用低浓度的核酸建库流程，提高检测成功率。
附图说明
图1为本发明方法和对比方案的血浆样品测序结果；
图2为本发明方法和对比方案的脑脊液样品测序结果；
图3为样本前处理时，本发明方法和对比方案中加入的全血与血浆的体积比的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
所述基于宏基因组测序的游离核酸建库方法包括如下步骤：
一、样本前处理
1.1血浆样本：将1000ul全血1600rpm离心10min,取500ul血浆转移至新的1.5mlEP管中，并在其中加入20ul全血。加入Bashing Bead Tube(破碎管)中，然后加入300ul 2xDNA/RNA Shield。
1.2脑脊液样本：取400uL样本加入Bashing Bead Tube(破碎管)，然后加入400ul2x DNA/RNA Shield。
二、破壁处理
将样本放置于FastPrep-24匀浆器中。以下述程序进行破碎，进行3个循环数的破壁。提高厚壁菌的检出。流程为：6m/sec，60s on，5min off，3cycs。
三、核酸提取(采用针对无细胞体液样本游离核酸的提取方法)
1.破碎后，12000rcf离心15min，以清除任何细胞碎片和沉淀。取上清200ul至2ML离心管中，加入200μl Quick-cfDNA/cfRNA消化缓冲液(Digestion Buffer)和10μl蛋白酶K，充分混合后。37℃孵育消化2h。
2.加400uLQuick-cfDNA/cfRNATM结合缓冲液(Binding Buffer)与消化后的样品结合，混合后加入1.2ML100％异丙醇，并充分混合。
3.取700uL混合物至配有Spin-AwayTM的收集管中，12,000x g离心30s，弃掉收集管，过滤柱转移至新的收集管。重复操作直至液体过完柱。
4.加入600μl RNA准备缓冲液，12,000x g离心30s，确保所有的液体完全通过Spin-AwayTM滤器。
5.将Spin-AwayTM过滤器转移到新的收集管，12,000x g离心2分钟以清除残留的缓冲液。然后弃掉收集管，将过滤器放置在1.5mlEP管。
6.将100μl DNase/RNase-Free水直接添加到Spin-AwayTM过滤器中。孵育3分钟，12,000x g离心离心30s。
7.在洗脱液中加入200μl无细胞回收缓冲液，吹打混匀。
8.加入450μl乙醇(95-100％)，吹打混匀。
9.将混合物转移到SpinTMIC柱中。12,000x g离心30s，丢弃收集管。
10.向柱中加入400μl RNA准备缓冲液。12,000x g离心30s，丢弃收集管。
11.向柱中加入700μl RNA Wash Buffer。12,000x g离心30s，丢弃收集管。
12.向柱中加入400μl RNAWash Buffer，12,000x g离心2分钟，确保洗涤缓冲液完全去除。然后弃掉收集管，将过滤器放置在1.5mlEP管。
向柱中加入15μl DNase/RNase-Free水，孵育2分钟，离心洗脱总游离核酸。
四、文库构建和上机测序：
1.血浆样本：采用酶切法建库
1.1片段化+末端修复+加A一步法：片段化和末端修复酶和核酸混合，37℃15min，72℃20min孵育。
1.2加接头：按照核酸投入量加入适量接头。
1.3扩增，文库质控和上机测序：文库扩增，qubit定量，质检合格文库上机测序。
2.脑脊液样本：采用转座酶法建库
2.1片段化+加接头一步法：转座酶和核酸混合,55℃孵育10min。
2.2 PCR和文库质控：文库扩增，qubit定量，质检合格文库上机测序。
对比例1
常规流程包括以下步骤：
一、样本前处理
1.1血浆样本：将1000ul全血1600rpm离心10min,取500ul血浆转移至新的1.5mlEP管中，加入300ul 1xDNA/RNA shield到500uL血浆，震荡混匀，加入80ul消化缓冲液(Digestion Buffer)和40ul蛋白酶K,55℃孵育30min。
1.2脑脊液：取400uL样本，向Bashing Bead Tube(破碎管)中加入400ul 2x DNA/RNA Shield。
二、破壁处理
将样本放置于FastPrep-24匀浆器中。以下述程序进行破碎，进行4个循环数的破壁。提高厚壁菌的检出。流程为：6m/sec，60s on，5min off，4cycs。
三、核酸提取(采用通用型样本的核酸提取方法)
1.破碎后，10000rcf离心2min，取上清400ul至装有400ul的DNA/RNA LysisBuffer的1.5mlEP管中；震荡混匀，离心。
2.将800ul混合液转移至配有Spin-Away过滤柱(黄色柱)的收集管中，10000rcf离心30s。弃掉收集管，过滤柱转移至新的收集管。
3.加入400ul DNA/RNA Prep Buffer，10000rcf离心30s。弃掉收集管，过滤柱转移至新的收集管。
4.加入700ul DNA/RNA Wash Buffer(使用之前加无水乙醇)，10000rcf离心30s。弃掉收集管，过滤柱转移至新的收集管。
5.加入400ul DNA/RNA Wash Buffer，10000rcf离心2min。弃掉收集管，过滤柱转移至已标记好的1.5mlEP管。(注意过滤柱不要粘有废液)
6.加入70ulddH2O，室温静置5min，8000rcf离心2min；-20°可保存一个月。
四、文库构建和上机测序(酶切法建库)：
1.片段化+末端修复+加A一步法：片段化和末端修复酶和核酸混合，37℃15min，72℃20min孵育。
2.加接头：按照核酸投入量加入适量接头。
3.扩增，文库质控和上机测序：文库扩增，qubit定量，质检合格文库上机测序。
实施例2
以血浆样本和脑脊液样本为例，将实施例1的本发明方法和对比例1中的传统方法进行比较，步骤如下：
一、样本前处理
将2ml全血样本均分为2份，分别取1000ul样本用于分离血浆，1600rpm离心10min,取500ul血浆转移至新的1.5mlEP管中，分别标记为S1，S2；
将0.8ml脑脊液样本均分为2份，分别取400ul样本，分别标记为S3，S4；
二、样品破壁、提取及制备
样本S1,S3参照本发明的步骤处理，将样本S2，S4参照对比例处理，4个样本均构建成合格的高通量(NGS)测序文库。
三、检测
将上述步骤2中的S1-S4样品同时上机测序，并采取同样的测序数据量，得到结果如图1和图2所示。
图1是血液样品测序结果：同样测序数据量下，经过本发明方法处理的S1样品得到的宏基因组DNA测序结果中病原微生物细菌(肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌)；病毒(人类疱疹病毒5型(CMV)、人类疱疹病毒4型(EBV)、人类疱疹病毒1型(HSV1))；真菌(黄曲霉、烟曲霉、马尔尼菲篮状菌、耶氏肺孢子菌)的检出比例均比对比方案S2提高约2.1-26.5倍。
图2是脑脊液样品测序结果：同样测序数据量下，经过本发明方法处理的S3样品得到的宏基因组DNA测序结果中病原微生物细菌(单核细胞增生李斯特菌、肺炎链球菌)；病毒(人类疱疹病毒5型(CMV)、人类疱疹病毒4型(EBV)、人类疱疹病毒1型(HSV1))；真菌(新生隐球菌)的检出比例均比对比方案S4提高约1.4-10倍。
说明本发明方法相比对比方案更适用于含有游离核酸的无细胞体液样本的检测。
实施例3当样本为血浆时，样本前处理加入全血和不加全血对血浆游离核酸的影响
一、样本前处理
将6ml全血样本均分为6份，取1000ul全血1600rpm离心10min,取500ul血浆转移至新的1.5mlEP管中，加入20ul全血,3个重复分别标记为A1、A2、A3；按照对比方案(不加全血)，3个重复分别标记为B1、B2、B3。
二、样品破壁、提取及制备
样本A1-A3,B1-B3除了样本前处理步骤不同，其余步骤按照实施例1的本发明方法的提取和建库流程进行处理,6个样本均构建成合格的高通量(NGS)测序文库。
三、检测
将上述步骤中的6样品同时上机测序，并采取同样的测序数据量，得到结果如表1。
表1样本前处理加入全血和不加全血(对比方案)对血浆游离核酸的影响
注：reads指高通量测序平台产生的序列数据，数值代表不同病原体检出标准化reads值，加粗为检测更高。
表1是血浆样品测序结果：同样测序数据量下，本发明方法A1-A3加入20ul全血方法处理，得到的宏基因组DNA测序结果中病原微生物:真菌(烟曲霉、耶式肺孢子菌)、细菌(铜绿假单胞菌、猪链球菌)、检出高于对比方案B1-B3。病毒(人类疱疹病毒5型(CMV)、人类疱疹病毒4型(EBV))、恙虫病东方体和对比方案相差不大。说明加入20ul全血方法能提高真菌和细菌检出，同时不丢失病毒等，更适用于游离核酸的检测。
实施例4不同破壁循环数优化测试
一、样本前处理
血浆样本：将4ml全血样本均分为4份，分别将1000ul全血1600rpm离心10min,取500ul血浆转移至新的1.5mlEP管中，并在其中加入20ul全血。加入Bashing Bead Tube(破碎管)中，然后加入300ul 2x DNA/RNA Shield。
二、破壁处理
将样本放置于FastPrep-24匀浆器中。按下述程序进行破碎，6m/sec，60s on，5minoff分别进行2、3、4、5个循环数的破壁。分别标记样本为P1、P2、P3、P4。
三、样品提取及制备。
样本P1-P4除了破壁处理不同，其余步骤按照本发明的提取和建库流程进行处理,4个样本均构建成合格的高通量(NGS)测序文库。
四、检测
将上述步骤中的P1-P4样品同时上机测序，并采取同样的测序数据量，得到结果如表2所示。
表2不同破壁循环数测试优化
| 病原体检出 | 样本编号 | 样本编号 | 样本编号 | 样本编号 |
| P1 | P2 | P3 | P4 | |
| 人类疱疹病毒5型(CMV) | 14 | 15 | 8 | 4 |
| 耶氏肺孢子菌 | 210 | 253 | 171 | 169 |
| 新生隐球菌 | 0 | 5 | 3 | 2 |
| 鸟分枝杆菌复合群 | 22 | 35 | 30 | 31 |
| 结核分枝杆菌 | 5 | 15 | 14 | 14 |
| 恙虫病东方体 | 31 | 50 | 45 | 44 |
| 鲍曼不动杆菌 | 38202 | 38901 | 38789 | 38468 |
| 铜绿假单胞菌 | 1163 | 1175 | 1115 | 937 |
注：reads指高通量测序平台产生的序列数据，数值代表不同病原体检出标准化reads值，加粗为检测更高。
同样测序数据量下，经过P2处理样品得到的宏基因组DNA测序结果中病原微生物病毒(人类疱疹病毒5型(CMV))；真菌和胞内菌(耶氏肺孢子菌、新生隐球菌、鸟分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌)；恙虫病东方体的检出比例均比其他方法高。细菌(鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌)检出相差不大。说明3个循环数是最优条件。
实施例5样本前处理时，在血浆样本中加入的全血与血浆的体积比
一、样本前处理
血浆样本：将3ml全血样本均分为3份，将1000ul全血1600rpm离心10min,取500ul血浆转移至新的1.5mlEP管中，并在其中加入少量全血。加入全血与血浆的体积比为1:50、2:50、3:50。即分别加入10ul、20ul、30ul全血，分别标记样本为D1、D2、D3。
二、样品破壁、提取及制备
样本D1、D2、D3除了样本前处理步骤不同，其余步骤按照实施例1的本发明方法的提取和建库流程进行处理,3个样本均构建成合格的高通量(NGS)测序文库。
三、检测
将上述步骤中的3样品同时上机测序，并采取同样的测序数据量，得到结果如图3。
图3是全血与血浆的体积比结果：同样测序数据量下，D1-D3得到的宏基因组DNA测序结果如下:对于细菌(结核分枝杆菌)、真菌(烟曲霉、耶氏肺泡子菌)，D1检出的标准化read数最少，D2和D3相差不大，都多于D1；随着全血体积加入量的增加，人源背景也相应增高，导致病毒(人类疱疹病毒1型(HSV1)、人类疱疹病毒5型(CMV)、人类疱疹病毒4型(EBV))检出标准化read数相应减少,即D1最多，其次是D2，D3检出最少。基于尽可能降低人源背景，同时保证各类病原体检出的原则，综合评估后，全血与血浆的体积比为2:50是最优条件。
实施例6样本提取时，蛋白酶K的不同孵育条件比对
一、样本前处理
将3ml全血样本均分为3份，分别取1000ul样本用于分离血浆，1600rpm离心10min,取500ul血浆转移至新的1.5mlEP管中，分别标记为S1、S2、S3
将1.2ml脑脊液样本均分为3份，分别取400ul样本，分别标记为D1、D2、D3；二、样品破壁、提取及制备
样本S1-3、D1-2按照实施例1的本发明方法的破壁和提取流程进行处理,加入200μlQuick-cfDNA/cfRNA消化缓冲液(Digestion Buffer)和10μl蛋白酶K，充分混合后。S1、S2、S3和D1、D2、D3分别按照37℃孵育消化2h、37℃孵育消化1h、55℃孵育消化30min进行反应。
6个样本均构建成合格的高通量(NGS)测序文库。
三、检测
将上述步骤中的6样品同时上机测序，并采取同样的测序数据量，得到结果如表3、4。
表3血液样本蛋白酶K的不同孵育条件比对
注：reads指高通量测序平台产生的序列数据，数值代表不同病原体检出标准化reads值，加粗为检测更高。
表4脑脊液样本蛋白酶K的不同孵育条件比对
| 病原体检出 | 样本编号 | 样本编号 | 样本编号 |
| D1 | D2 | D3 | |
| 细小脲原体 | 286 | 134 | 231 |
| 新生隐球菌 | 4 | 0 | 2 |
| 人类疱疹病毒1型(HSV1) | 11 | 3 | 6 |
| 人类疱疹病毒3型(VZV) | 23 | 10 | 18 |
同样测序数据量下，经过S1-S3处理样品得到的宏基因组DNA测序结果中病原微生物病毒(人类疱疹病毒1型(HSV1)、人类疱疹病毒5型(CMV)、人类疱疹病毒6B型)；真菌(黄曲霉、烟曲霉)；细菌(铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌)检出比例均比其他方法高。
同样测序数据量下，经过D1-D3处理样品得到的宏基因组DNA测序结果中病原微生物细小脲原体、真菌(新生隐球菌)；病毒(人类疱疹病毒1型(HSV1、人类疱疹病毒3型(VZV))检出比例均比其他方法高。
说明37℃孵育消化2h是最优条件。
实施例7对于脑脊液样本，本发明方法(转座酶法)和对比方案(常规法)文库浓度比对
一、样本前处理
脑脊液样本：9个脑脊液样本C1-C9，每个取800uL样本，均分成2份，400ul一份。
二、样品破壁、提取及制备
样本C1-C9按照本发明的前处理和提取流程进行处理，每个样本分别采用2种建库方法，并且按照不同投入量0.5ng、1ng、10ng进行建库。共构建18个高通量(NGS)测序文库。
三、检测
分别对18个文库进行Qubit(Qubit 3.0Fluorometer)文库浓度测定，得到结果如表3。
表5转座酶法和常规法文库浓度比对
注：数值代表文库浓度(ng/ul)，检测阈值为1ng/ul。
表5是脑脊液样本文库浓度结果：在10ng建库投入量时，样本C1-C9采用2种建库方法，文库浓度相差不大；在1ng建库投入量时，转座酶文库浓度高于常规法；在0.1ng建库投入量时，常规法文库浓度低于阈值，建库失败，而转座酶均能建库成功。基于尽可能使用较少的核酸投入量，同时不降低检出性能的目的，转座酶法按照1ng核酸投入量建库。
说明针对脑脊液样本，转座酶法按照1ng核酸投入量建库，对于低浓度核酸有较好的检测能力。
Claims (10)
1.一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法，其特征在于，所述方法包括样本前处理、样本破壁处理、样本核酸提取和样本核酸文库构建步骤；所述样本为无细胞体液样本；所述样本破壁处理是将样本置于匀浆机中进行3个循环的破壁处理。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无细胞体液样本为血浆或脑脊液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，样本前处理时，当所述样本为血浆时，在血浆样本中加入全血，且全血与血浆的体积比为1:50至3:50。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全血与血浆的体积比为2:50。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，样本核酸提取时，向样本中加入蛋白酶K进行孵育。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶K孵育温度为37℃，孵育时间为2h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本破壁处理时，将匀浆机的破壁循环参数设置为：6m/sec，60s on，5min off。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当样本为血浆时，所述样本文库构建采用酶切法。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当样本为脑脊液时，所述样本文库构建采用转座酶法。
10.一种宏基因组测序方法，其特征在于，所述方法是采用权利要求1至9任一项所构建的样本文库进行上机测序。
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