CN113667715A - 一种用于检测呼吸道样本中病原体dna文库的构建方法及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测呼吸道样本中病原体dna文库的构建方法及试剂盒 Download PDF

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CN113667715A CN202110920640.4A CN202110920640A CN113667715A CN 113667715 A CN113667715 A CN 113667715A CN 202110920640 A CN202110920640 A CN 202110920640A CN 113667715 A CN113667715 A CN 113667715A
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Abstract

本申请属于生物技术领域，涉及一种用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法及试剂盒，包括通过一步反应对DNA样本以及与所述DNA样本相对应的内标进行片段化处理，以实现对所述DNA样本及所述内标进行末端修复、磷酸化及加A，获得第一产物；将所述第一产物依次进行接头连接和第一次纯化处理，获得第二产物；对所述第二产物依次进行PCR富集和第二次纯化处理，获得用于检测下呼吸道样本中病原体DNA文库。本申请的DNA文库构建过程简便快捷，能够适用于较低起始量及较差质量的DNA建库；并添加有内标，以便后续生信分析结果的解读。

Description

一种用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法及试 剂盒
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法及试剂盒。
背景技术
中国医院各科室发生医院感染的比例存在明显差异，有研究指出，医院感染的易感染科室依次为外科ICU、血液科、急诊科、呼吸内科和神经内科。而感染患者的年龄呈V形分布，主要是小于两周岁的婴幼儿及60岁以上的老年患者。婴幼儿免疫系统尚未发育成熟，老年患者病情危重、免疫功能相对低下、侵入性操作较多、多伴基础疾病，因而这两个人群是目前医院感染的高危人群。
随着测序技术的发展，二代测序已经普遍成为一种临床辅助诊断的技术手段，如以往的全外显子，肿瘤，遗传病测序等技术手段，近年来，宏基因组测序已成为热点，市场上鲜少有针对宏基因组二代测序有效的建库试剂盒。市场上缺少适用于人痰液、支气管肺泡灌洗液等样本的文库构建的试剂盒。
对于建库步骤而言，市场上还有一大半的建库试剂流程是把片段化和末端修复分开做的，主要包括以下几个步骤：1、对DNA进行超声波片段化；2、对片段化产物进行磁珠纯化；3、对片段化纯化产物进行末端修复和加A；4、对加A产物进行接头连接；5、对连接产物进行磁珠纯化；6、对接头连接纯化产物进行富集；7、对富集产物进行磁珠分选或回收。以上步骤中包括三步纯化，建库步骤耗时比较长，多次磁珠纯化会不可避免地增加DNA样本的损耗，所以对DNA的总量和质量要求高。
目前市场上已有的片段化、末端修复和加A一步反应的试剂盒，都有不同程度的将模板量放大，不能真实反应样本中的核酸组成情况。
肺泡灌洗液、痰液等下呼吸道样本的宿主比例差异大，且存在大量的定植菌，现有试剂缺少内部标准品对结果进行归一化矫正，会影响后期数据分析的准确性。
由此可见，现有的建库步骤繁琐，在多次磁珠纯化上耗时长，对DNA的总量和质量要求高，片段化、末端修复和加A步骤无法一体化，或者可以一体化完成的又存在一定程度的模板量放大的情况。
发明内容
本申请实施例的目的在于提出一种文库构建的方法，DNA文库构建过程简便快捷，适用于较低起始量及较差质量的DNA建库过程。
为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种文库构建的方法，采用了如下所述的技术方案：
一种用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，包括下述步骤：
通过一步反应对DNA样本以及与所述DNA样本相对应的内标进行片段化处理，以实现对所述DNA样本及所述内标进行末端修复、磷酸化及加A，获得第一产物；
将所述第一产物依次进行接头连接及第一次纯化处理，获得第二产物；
对所述第二产物依次进行PCR富集及第二次纯化处理，获得用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库。
进一步的，所述片段化处理包括：将所述DNA样本、所述内标、反应液B及酶混合液C置于PCR管中，
其中，所述反应液B包含:
Tris-HCL的终浓度为250mM，PH值为7.5；
MgCl2的终浓度为50mM；
NaCl的终浓度为250mM；
DTT的终浓度为50mM；
Triton X-100的终浓度为0.75％；
ATP的终浓度为2.5mM；
dATP的终浓度为2.5mM；
dGTP的终浓度为2.5mM；
dCTP的终浓度为2.5mM；
dTTP的终浓度为2.5mM；
所述酶混合液C为Vvn endonuclease mutan、T7 endonuclease mutant和Taq DNApolymerase的混合溶液。
进一步的，所述片段化处理的反应条件为：
首先，在37℃下反应10～30分钟后；随后，在65℃下反应20～30分钟。
进一步的，所述DNA片段化处理时，包括：
在插入的DNA片段大小为100bp时；首先，37℃下反应25～30分钟后；随后，在65℃下反应20～30分钟；
在插入的DNA片段大小为150bp时；首先，37℃下反应15～25分钟后；随后，在65℃下反应20～30分钟；
在插入的的DNA片段大小为200～700bp时；首先，37℃下反应10～15分钟后；随后，在65℃下反应20～30分钟。
进一步的，所述通过一步反应对DNA样本以及与所述DNA样本相对应的内标进行片段化处理，以实现对所述DNA样本及所述内标进行末端修复、磷酸化及加A，获得第一产物的步骤包括：
所述内标加入的质量为对应的所述DNA样本的
Figure BDA0003207324550000031
进一步的，所述将所述第一产物进行接头连接步骤包括：
将所述第一产物、反应液D、反应液E和酶F加入PCR管中进行DNA片段连接反应，获得DNA片段连接样本；
其中，
所述反应液D包含:
Tris-HCL的终浓度为75mM，PH值为7.5；
MgCl2的终浓度为15mM；
DTT的终浓度为15mM；
ATP的终浓度为2.75mM；
PEG8000的终浓度为20％；
所述反应液E包含浓度为2uM的接头；
酶F为连接酶。
进一步的，所述将所述第一产物进行接头连接的反应条件为：
在20℃下反应30分钟。
进一步的，所述第一次纯化处理包括：
将磁珠分装至低吸附PCR管中；
将所述DNA片段连接样本加入PCR管中，通过DNA磁珠纯化，获得第二产物。
进一步的，所述第二产物PCR富集步骤包括：
将第二产物与反应液G、反应液H加入PCR管中进行离心反应，获得DNA扩增样本；
其中：
所述反应液G在一步反应的体系中包含反应缓冲液、四种dNTP、DNA聚合酶，所述四种dNTP为dATP、dGTP、dCTP和dTTP；
所述反应液H为浓度为15μM的扩增引物。
进一步的，所述第二产物进行PCR富集的反应条件依次为：
预变性处理：95℃反应3min；
变性处理：95℃反应20s；
退火处理：58℃反应20s；
延伸处理：72℃反应20s，持续10～14个循环流程；
完全延伸处理：72℃反应5min，4℃，保持温度不变。
进一步的，所述第二次纯化处理步骤包括：
将磁珠分装至低吸附PCR管中；
将所述DNA扩增样本加入PCR管中，通过磁珠纯化，获得所述用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库。
本申请还保护一种用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的试剂盒，包括组件A、组件B和组件C；
组件A为通过一步反应对DNA样本以及与所述DNA样本相对应的内标进行片段化处理，以实现对所述DNA样本及所述内标进行末端修复、磷酸化及加A，获得第一产物的试剂或试剂组合；
组件B为将所述第一产物依次进行接头连接及第一次纯化处理，获得第二产物的试剂或试剂组合；
组件C为对所述第二产物依次进行PCR富集及第二次纯化处理，获得用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的试剂盒。
本申请还保护以上任一所述的方法在测序中的应用。所述测序为高通量测序。
本申请还保护所述的试剂盒在测序中的应用。所述测序为高通量测序。
与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：
本发明提供的构建用于检测呼吸道病原体的DNA文库方法，建库过程简便快捷，纯化次数少，耗时短。实现片段化、末端修复、磷酸化和加A步骤的一体化，对DNA的总量和质量要求较低，适用于较低起始量及较差质量的DNA建库。
附图说明
为了更清楚地说明本申请中的方案，下面将对本申请实施例描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本申请的文库构建的方法的一个实施例的流程图；
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请；本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不限定本申请。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
继续参考图1，示出了根据本申请的文库构建的方法的一个实施例的流程图。所述的文库构建的方法，包括以下步骤：
S1：通过一步反应对DNA样本以及与所述DNA样本相对应的内标进行片段化处理，以实现对所述DNA样本及所述内标进行末端修复、磷酸化及加A，获得第一产物；
S2：将所述第一产物依次进行接头连接及第一次纯化处理，获得第二产物；
S3：对所述第二产物依次进行PCR富集及第二次纯化处理，获得用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库。
一、通过一步反应对所述DNA样本和与所述DNA样本相对应的内标进行片段化处理，以实现对DNA样本和内标片段化的同时，并且对DNA样本和内标进行末端修复、磷酸化和加A，获得所述第一产物。
具体为：将DNA样本、对应的内标与反应液B、酶混合液C进行反应，其中，所述反应液B包含Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、MgCl2(氯化镁)、NaCl(氯化钠)、DTT(二硫苏糖醇)、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、ATP(三磷酸腺苷)、dATP(脱氧腺苷三磷酸)、dGTP(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)、dCTP(脱氧胞苷三磷酸)和dTTP(脱氧胸苷三磷酸)，其中，Tris-HCL的终浓度为250mM，PH值为7.5；MgCl2的终浓度为50mM；NaCl的终浓度为250mM；DTT的终浓度为50mM；Triton X-100的终浓度为0.75％；ATP的终浓度为2.5mM；dATP的终浓度为2.5mM；dGTP的终浓度为2.5mM；dCTP的终浓度为2.5mM；dTTP的终浓度为2.5mM；所述酶混合液C为Vvn endonuclease mutant(创伤弧菌核酸酶)、T7 endonuclease mutant(T7核酸内切酶)和Taq DNA polymerase(DNA聚合酶)的混合溶液。
在本实施例中，许多溶液都是预先配置成浓度较高的母液保存。在使用时，一般需要从母液中稀释。终浓度即为工作浓度，即实际使用反应液B时的浓度。其中，mM表示毫摩尔每升，例如，200mM＝0.200mol/L。其中，Vvn endonuclease mutant(创伤弧菌核酸酶)和T7endonuclease mutant(T7核酸内切酶)均为内切酶。
1、将反应液B和酶混合液C从-20℃冰箱取出。室温解冻反应液B后，颠倒混匀并短暂离心反应液B后备用。酶混合液C在冰上解冻，颠倒混匀并短暂离心酶混合液C后放在冰盒上备用。在PCR管中配制以下反应体系，如表1：
表1
组份 体积(μl)
加入(Input)DNA样本+内标 35
反应液B 10
酶混合液C 5
体积总计(Total) 50
其中，内标，指在定量分析中添加于检材内的一种适当的化合物纯品，其测得值是用来衡量建库、测序的过程和体系是否稳定，起到质控和矫正的作用。其具体的实现方式是对上机测序的数据进行生信分析统计，看内标中含有的已知基因的检出比率是否稳定来判别建库、测序的过程和体系是否稳定。本申请通过添加内标并设定内标加入的比例，其中，内标加入的比例是投入核酸(DNA样本)的1/1500，例如，加入30ngDNA样本和0.02ng内标。能够基于内标对建库、测序环节进行质控和对结果进行更好的矫正。
2、将该完成反应体系配置的PCR管进行轻微涡旋混匀，并且短暂离心。将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表2所示：
表2
Figure BDA0003207324550000081
片段化时间需按加入(Input)的DNA样本的质量及目标插入片段大小而定，如表3：
表3
预期插入片段大小 片段化时间
100bp 25-30min
150bp 15-25min
200-700bp 10-15min
需要说明的是：以上设定的片段化时间，为使用高质量的Hela细胞gDNA为模板测试所得。当使用高质量Hela细胞gDNA进行建库时，不同投入量相同反应时间，片段化产物分布范围差异不大，即分布范围基本一致，但主峰位置可能会略有差异。如加入的(Input)DNA样本的质量不佳或片段化大小不在预期范围，则可以2～5min的幅度上下调整该片段化时间。
二、所述将所述第一产物进行接头连接，纯化操作，获得第二产物的步骤包括：
将所述第一产物、反应液D、反应液E和酶F加入PCR管中进行DNA片段连接反应，获得DNA片段连接样本，其中，所述反应液D包含Tris-HCL、MgCl2(氯化镁)、DTT、ATP和PEG8000(聚乙二醇)，其中，Tris-HCL的终浓度为75mM，PH值为7.5；MgCl2的终浓度为15mM；DTT的终浓度为15mM；ATP的终浓度为2.75mM；PEG8000的终浓度为20％；所述反应液E包含浓度为2uM的接头X，酶F为连接酶。
1、接头连接的具体过程如下：
将反应液D、反应液E从-20℃冰箱取出，室温解冻，混匀短暂离心后备用；将酶F从-20℃冰箱取出，短暂离心后放冰盒上备用。
在片段化、末端修复、磷酸化、加A后的第一产物中依次添加以下各组分，如表4：
表4
Figure BDA0003207324550000091
Figure BDA0003207324550000101
轻微涡旋混匀，短暂离心；
将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序：
Figure BDA0003207324550000102
2、连接产物的第一次纯化的具体步骤为：
完成步骤1后，将DNA纯化磁珠提前30min从2～8℃冰箱取出，静置，使其温度平衡至室温；然后颠倒或旋涡振荡使DNA纯化磁珠充分混匀，将80μL磁珠分装至1.5mL低吸附离心管中；然后将步骤1的80μL连接产物(即DNA片段连接样本)加到磁珠中反复吹打混匀，需要提醒的是：混匀时吸头不要离开液面，以防止产生过多气泡；然后室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；然后将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清液。然后保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec(秒)，小心移除上清液。
重复下述步骤一次：保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。总计漂洗二次。
将样品瞬时离心5s，把样品置于磁力架上，用10μL的移液器把残留的上清彻底去干净，保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5-10min至磁珠表面无反光。然后将样品从磁力架上取出，加入22μl已经去除核酸酶的水(H2O)，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(≈5min)，小心吸取20μl上清液,作为第二产物，至一个新的PCR管中。
三、所述对所述第二产物依次进行PCR富集及第二次纯化处理，获得用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的步骤包括：
将第二产物与反应液G、反应液H加入PCR管中进行离心反应，获得DNA扩增样本，其中，所述反应液G在一步反应的体系中包含反应缓冲液、4种dNTP(即dATP,dGTP,dTTP,dCTP)、DNA聚合酶；所述反应液H为浓度为15μM的扩增引物。其中，扩增引物为特异性碱基序列，具体的扩增引物的序列可以选用本领域中常用的扩增引物的序列。反应缓冲液包括镁离子，Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，二甲基亚砜，甘油，Tween20/40(吐温20或吐温40),D-(+)海藻糖二水，四甲基氯化铵，DTT(二硫苏糖醇)。
1、文库扩增(即PCR富集)的具体步骤为：
从-20℃冰箱取出反应液G、反应液H，将反应液G放于冰上解冻20min，反应液H室温解冻20min，混合均匀并短暂离心备用，向步骤二的2的具有第二产物(即连接产物)的PCT管中依次添加以下各组分：
组份 体积(μl)
第二产物(连接产物) 20
反应液G 25
反应液H 5
Total(总计) 50
轻微涡旋混匀，并短暂离心；然后按如下程序在热循环仪中运行扩增：
Figure BDA0003207324550000111
Figure BDA0003207324550000121
需要说明的是：建库的核酸(DNA样本)投入量在10ng以下时，X＝14；核酸投入量在10～30ng时，X＝12；核酸投入量在30～50ng时，X＝10。
2、扩增产物片段分选(即第二次纯化)的具体步骤为：
将DNA纯化磁珠提前30min从2～8℃冰箱取出，静置，使其温度平衡至室温；然后颠倒或涡旋振荡使DNA纯化磁珠充分混匀，将85μL DNA纯化磁珠分装至1.5mL低吸附离心管中；然后将经过PCR富集操作的50μL PCR产物(即DNA扩增样本)补水至100μL，并加到磁珠中反复吹打混匀，其中，需要注意的是：混匀时吸头不要离开液面，防止产生过多气泡；
室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；然后将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，取上清至含40μL DNA纯化磁珠的低吸附离心管中；然后室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；然后将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；然后保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清液；
重复一次步骤：保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。总计漂洗二次；
样品瞬时离心5sec，把样品置于磁力架上，用10μL的移液器把残留的上清彻底去干净，保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5～10min至磁珠表面无反光；然后将样品从磁力架上取出，加入22μl去核酸酶H2O，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(≈5min)，小心吸取20μl上清至一个新的1.5ml的EP管中。
本申请具有如下优点：通过DNA片段化、末端修复、磷酸化以及加A一步完成的体系,且过程中不会导致模板量放大。根据QPCR结果或者下机数据结果中可知，本申请具有高特异性的扩增体系、有效文库含量高。建库过程中在每个样本中加入内标，用于建库、测序环节的质控，对结果起到矫正的作用。本申请末端修复后不需要进行磁珠纯化，缩短了建库的时间和降低了成本。本申请构建用于检测呼吸道样本中病原体的DNA文库的方法及试剂盒适用于对呼吸道样本中病原体的检测。
应该理解的是，虽然附图的流程图中的各个步骤按照箭头的指示依次显示，但是这些步骤并不是必然按照箭头指示的顺序依次执行。除非本文中有明确的说明，这些步骤的执行并没有严格的顺序限制，其可以以其他的顺序执行。而且，附图的流程图中的至少一部分步骤可以包括多个子步骤或者多个阶段，这些子步骤或者阶段并不必然是在同一时刻执行完成，而是可以在不同的时刻执行，其执行顺序也不必然是依次进行，而是可以与其他步骤或者其他步骤的子步骤或者阶段的至少一部分轮流或者交替地执行。
显然，以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，附图中给出了本申请的较佳实施例，但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现，相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来而言，其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本申请专利保护范围之内。

Claims (12)

1.一种用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：
通过一步反应对DNA样本以及与所述DNA样本相对应的内标进行片段化处理，以实现对所述DNA样本及所述内标进行末端修复、磷酸化及加A，获得第一产物；
将所述第一产物依次进行接头连接及第一次纯化处理，获得第二产物；
对所述第二产物依次进行PCR富集及第二次纯化处理，获得用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库。
2.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述片段化处理包括：将所述DNA样本、所述内标、反应液B及酶混合液C置于PCR管中，
其中，所述反应液B包含:
Tris-HCL的终浓度为250mM，PH值为7.5；
MgCl2的终浓度为50mM；
NaCl的终浓度为250mM；
DTT的终浓度为50mM；
Triton X-100的终浓度为0.75％；
ATP的终浓度为2.5mM；
dATP的终浓度为2.5mM；
dGTP的终浓度为2.5mM；
dCTP的终浓度为2.5mM；
dTTP的终浓度为2.5mM；
所述酶混合液C为Vvn endonuclease mutan、T7 endonuclease mutant和Taq DNApolymerase的混合溶液。
3.根据权利要求2所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述片段化处理的反应条件为：
首先，在37℃下反应10～30分钟后；随后，在65℃下反应20～30分钟。
4.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述DNA片段化处理时，包括：
在插入的DNA片段大小为100bp时；首先，37℃下反应25～30分钟后；随后，在65℃下反应20～30分钟；
在插入的DNA片段大小为150bp时；首先，37℃下反应15～25分钟后；随后，在65℃下反应20～30分钟；
在插入的的DNA片段大小为200～700bp时；首先，37℃下反应10～15分钟后；随后，在65℃下反应20～30分钟。
5.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述通过一步反应对DNA样本以及与所述DNA样本相对应的内标进行片段化处理，以实现对所述DNA样本及所述内标进行末端修复、磷酸化及加A，获得第一产物的步骤包括：
所述内标加入的质量为对应的所述DNA样本的
Figure FDA0003207324540000021
6.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述将所述第一产物进行接头连接步骤包括：
将所述第一产物、反应液D、反应液E和酶F加入PCR管中进行DNA片段连接反应，获得DNA片段连接样本；
其中，
所述反应液D包含:
Tris-HCL的终浓度为75mM，PH值为7.5；
MgCl2的终浓度为15mM；
DTT的终浓度为15mM；
ATP的终浓度为2.75mM；
PEG8000的终浓度为20％；
所述反应液E包含浓度为2uM的接头；
酶F为连接酶。
7.根据权利要求6所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述将所述第一产物进行接头连接的反应条件为：
在20℃下反应30分钟。
8.根据权利要求6所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述第一次纯化处理包括：
将磁珠分装至低吸附PCR管中；
将所述DNA片段连接样本加入PCR管中，通过DNA磁珠纯化，获得第二产物。
9.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述第二产物PCR富集步骤包括：
将第二产物与反应液G、反应液H加入PCR管中进行离心反应，获得DNA扩增样本；
其中：
所述反应液G在一步反应的体系中包含反应缓冲液、四种dNTP、DNA聚合酶，所述四种dNTP为dATP、dGTP、dCTP和dTTP；
所述反应液H为浓度为15μM的扩增引物。
10.根据权利要求9所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述第二产物进行PCR富集的反应条件依次为：
预变性处理：95℃反应3min；
变性处理：95℃反应20s；
退火处理：58℃反应20s；
延伸处理：72℃反应20s，持续10～14个循环流程；
完全延伸处理：72℃反应5min，4℃，保持温度不变。
11.根据权利要求9所述的用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的构建方法，其特征在于，所述第二次纯化处理步骤包括：
将磁珠分装至低吸附PCR管中；
将所述DNA扩增样本加入PCR管中，通过磁珠纯化，获得所述用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库。
12.一种用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的试剂盒，其特征在于，包括组件A、组件B和组件C；
组件A为通过一步反应对DNA样本以及与所述DNA样本相对应的内标进行片段化处理，以实现对所述DNA样本及所述内标进行末端修复、磷酸化及加A，获得第一产物的试剂或试剂组合；
组件B为将所述第一产物依次进行接头连接及第一次纯化处理，获得第二产物的试剂或试剂组合；
组件C为对所述第二产物依次进行PCR富集及第二次纯化处理，获得用于检测呼吸道样本中病原体DNA文库的试剂盒。
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