CN104141009B - 早期膀胱癌的多靶标检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明早期膀胱癌的多靶标检测方法，属于生物检测技术领域。包括下述步骤：(1)、提取患者尿液中所含的DNA；(2)、对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；(3)、通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测，以ALU‑C4作为内参基因；(4)、以步骤(3)中的CT值来判定患者是否为早期膀胱癌。本发明具有以下优点：采用多个生物标志物基因联合检测，在每个标志物的特异性都比较高的前提下，使用多个标志物联用的方式来提高检测的敏感性和特异性；根据多个生物标志物基因设计了特异性引物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及早期膀胱癌的多靶标检测方法。
背景技术
膀胱癌在全球发病率位列第五。在大多数情况下，约75％的患者处于Ta或T1期，即非肌肉浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC),而剩下的25％肿瘤处于肌肉入侵阶段T2-T4癌症(muscle invasive bladder cancer，MIBC)。约60％-70％的NMIBC肿瘤患者的切除后3年内复发[1-3]。复发病人中大部分会周期性复发而癌症级别不会进一步恶化，但约25％的病人会发展为MIBC。由于高复发率和恶化的风险，早诊断，早治疗，频繁的长期监测对于膀胱癌患者提高生存率十分重要。
传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，费用高且会给患者带来一定痛苦，其结果可能会受操作者主观判断而带来一定的误差；而细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34％左右)。因此无创检测，高灵敏高特异性是未来膀胱癌检测和监控手段发展的方向。
膀胱癌无创检测的关键在于寻找高灵敏高特异性生物标记物，目前这也是膀胱癌研究的一大热点，研究报道很多，目前已有部分标记物已在临床上使用，如下表(Cheung etal.BMC Medicine 2013,11:13)
膀胱癌像所有的癌症一样，是与相关的基因组上的改变相关的。在表观遗传学上的改变比如DNA甲基化和组蛋白修饰等也经常在肿瘤中被观察到。事实上,DNA甲基化已被证明与各种癌症包括膀胱癌的发展有关。DNA甲基化异常可通过影响染色质结构及癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤形成。因此，这种特定基因的DNA甲基化可以用来作为生物标志物对膀胱癌进行检测和监控。
甲基化特异性荧光定量PCR(Quantitative Methylation-specific PolymeraseChain Reaction，qMSP)的技术首先由Herman等于1996年描述。它利用DNA经亚硫酸氢钠处理后，甲基化和非甲基化DNA单链序列的差异来设计不同的PCR引物。MSP是目前最敏感的技术，能发现0.1％的甲基化DNA(～50pg)。
相比现有的在临床上使用的生物标记物，甲基化生物标记物具有高灵敏高特异性的特点。目前国内还没有通过检测甲基化生物标记物来做肿瘤相关专利技术。
发明内容
本发明的目的在于公开了早期膀胱癌的多靶标检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1、早期膀胱癌的多靶标检测方法，包括下述步骤：
(1)、提取患者尿液中所含的DNA；
(2)、对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；
(3)、通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测，以ALU-C4作为内参基因；
(4)、以步骤(3)中标志物基因的相对甲基化水平值与其检出限之间的大小判定患者是否为早期膀胱癌，当任何一个标志物基因的相对甲基化水平值高于其检出限，该患者为早期膀胱癌患者。
2、根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(1)中的DNA总量>500纳克，片段大小>10kb。
3、根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(3)中的针对ALU-C4的上游引物序列为SEQ No.1，下游引物序列为SEQ No.2；针对EOMES的上游引物序列为SEQ No.3，下游引物序列为SEQ No.4；针对GDF15的上游引物序列为SEQ No.5，下游引物序列为SEQ No.6；针对NID2的上游引物序列为SEQ No.7，下游引物序列为SEQ No.8；针对PCDH17的上游引物序列为SEQ No.9，下游引物序列为SEQ No.10；针对POU4F2的上游引物序列为SEQ No.11，下游引物序列为SEQ No.12；针对TCF21的上游引物序列为SEQ No.13，下游引物序列为SEQ No.14；针对ZNF154的上游引物序列为SEQ No.15，下游引物序列为SEQNo.16。
4、根据权利要求1或3所述的早期癌症的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(3)中针对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154和ALU-C4的引物联合使用。
5、根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(4)的具体过程为：
(a)、用针对ALU-C4、EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的每对引物纯化后的qPCR产物制作标准曲线，做出每对引物的标准曲线；通过标准曲线定出每个基因的实际甲基化的拷贝数；
(b)、将(a)得到的每个拷贝数代入公式一，计算出每一个标志物基因的相对甲基化水平值；
公式一：相对甲基化水平值＝[(gene/ALU)sample/(gene/ALU)Standard]×1000
(c)、步骤(b)所得的标志物基因的相对甲基化水平值高于对应标志物基因的检出限判定为阳性，等于或低于检出限判定为阴性；任一标志物基因为阳性则判定该患者为早期膀胱癌患者。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的检测方法在检测过程中采用多个生物标志物基因联合检测，在每个标志物的特异性都比较高的前提下，使用多个标志物联用的方式来提高检测的敏感性和特异性。
2、本发明的检测方法根据多个生物标志物基因设计了特异性引物。
3、本专利采用尿液作为检测样本，无创伤，取样方便。
4、检测时间短，从采样到结果输出可在1天内完成。
附图说明：
1、图1为ALU-C4的标准曲线；
2、图2为EOMES的标准曲线；
3、图3为GDF15的标准曲线；
4、图4为NID2的标准曲线；
5、图5为PCDH17的标准曲线；
6、图6为POU4F2的标准曲线；
7、图7为TCF21的标准曲线；
8、图8为ZNF154的标准曲线；
9、图9为EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的相对甲基化水平。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明早期癌症的多靶标检测方法作进一步的说明。
实施例1：早期癌症的多靶标检测方法：
一、样本来源：
对30个膀胱癌患者和30个正常人的尿液4个尿路炎症尿液DNA样本进行了检测。膀胱癌患者样本来自于深圳市第二人民医院泌尿外科，正常人样本来自于自愿者尿液样本，样本信息见表1所示，
表1 64例样本信息
二、DNA的提取及检测：
1、DNA提取：
取得尿液样本后按照体积比尿液:保存液＝4:1加入尿液保存液，混匀后迅速冻存在-20度或-80度。需提取时，温浴至尿液澄清，用低温离心机4℃，800g离心15min后，去上清，留沉淀进行提取。
采用天根微量样品基因组DNA提取试剂盒(DP316)对沉淀物进行DNA提取，提取流程参照试剂盒说明书。
2、样品检测：
(1)、浓度检测方法：Qubit Fluorometer
检测方法按照Quant-it dsDNA HS Assay Kit的说明书中步骤进行。
注意每天第一次使用Qubit时，需要先配制标准曲线，且要用2ul standard2#作为阳性对照，检验标准曲线的准确性，只有当standard2#检测的浓度在下面范围内标准曲线才能使用。
Qubit HS阳性对照(standard2#)检测浓度范围：9.5-10.5ng/ul
(2)、样品完整性检测方法：琼脂糖凝胶电泳
根据Qubit定量的浓度，取约50ng的DNA，与3ul的溴酚蓝混合，补水至10ul后，全部加入到1％琼脂糖检测胶的胶孔中，样品应同时包括两条分子量标准：λ-HindШdigest(上样量2μl)及D2000(上样量6μl)，分别上样在样品两次。电泳条件：电压150V电泳40min。将电泳完成的胶块置于Tanon凝胶成像仪中拍照保存。拍照时注意胶图背景较暗，胶孔要清晰。
选择DNA总量>500纳克，片段大小>10kb的样本进行后续qMSP检测。
三、qMSP检测：
1、对DNA总量>500纳克，片段大小>10kb的样本进行Bisulfite处理：
Bisulfite处理的样本起始量为200ng，具体实验方法和注意事项根据ZYMORESEARCH的EZ DNA Methylation-GoldTM Kit的说明书进行操作，纯化时用20uL的M-Elution Buffer洗脱DNA。
Bisulfite反应体系见表2：
表2 Bisulfite反应体系
| 试剂 | 使用量μl |
| CT Conversion Reagent(需配置) | 130ul |
| DNA模板 | 200ng |
| Naclease-Free Water | 补足150ul |
| Total | 150ul |
备注：Bisulfite反应体系中的CT Conversion Reagent需按试剂盒说明书配置，试剂加入次序不可更改，配置好的试剂可存放1周，超过1周最好重新配置。
反应条件见表3：
表3 Bisulfite反应条件
| 98℃ | 10min |
| 65℃ | 2.5hour |
| 4℃ | hold |
所用仪器：96-Well GeneAmp PCR System 9700
2、对经Bisulfite处理的DNA样本进行qMSP(甲基化特异性荧光定量PCR)：
(1)引物：挑选8对甲基化检测的引物(见表4)
表4 甲基化检测的引物
(2)、qPCR反应体系：
按表5中的组份配制qPCR反应液，反应液配制在冰上进行，在配置qPCR体系时，应将各引物、染料、样品颠倒混匀，短暂离心后使用。每个样本均做表4中8对引物的检测。
表5 qPCR的反应体系
备注：除了DNA模板外，其它试剂配置成一管Mix，DNA模板单独待Mix分装到96孔板之后再单独加入。
(3)、分装：
将96孔光学反应板置于基座上。将配好Mix加到各反应管孔中，每孔加入18μl，同一个样品要加在相邻的两列。DNA模板的加入：一个样品的DNA模板的两个重复需加在同一行，保持同一行的DNA模板是相同的。
用光学封口膜(泛特津)封闭反应板，2000rpm离心2min。
上StepOnePlusTM Real-Time PCR System检测并分析结果
四、结果分析：
步骤1：用8个基因ALU-C4、EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的每对引物纯化后的qPCR产物制作标准曲线，做出每对引物的标准曲线，标准曲线分别如图1-8所示；标准曲线和每个基因的实际甲基化的拷贝数参考Changsoo Lee，et al.，Absoluteand relative QPCR quantification of plasmid copy number inEscherichiacoli.Journal of Biotechnology 123(2006)273–280。
通过标准曲线定出每个基因的实际甲基化的拷贝数。
步骤2：相对甲基化水平计算：
将步骤1得到的每个拷贝数代入以下公式，计算出相对甲基化水平值。
相对甲基化水平值＝[(gene/ALU)sample/(gene/ALU)Standard]×1000
步骤3：根据34个正常样本中各基因的最大相对甲基化水平值确定各基因的检出限：
表6 各基因的检出限
| 基因 | EOMES | GDF15 | NID2 | PCDH17 | POU4F2 | TCF21 | ZNF154 |
| 相对甲基化水平值的检出限 | 242.59 | 6.24 | 95.25 | 1599.58 | 91.78 | 170.92 | 427.99 |
步骤4：结果判定：
步骤2所得的相对甲基化水平值高于检出限判定为阳性，等于或低于检出限判定为阴性。综合7个gene的结果，其中有1个gene结果为阳性则判定为膀胱癌。
检测结果如表7所示：
表7 CT值检测结果
综合7个biomarker的检测结果，按照如下公式计算得到灵敏度和特异性：
灵敏度＝检测结果为阳性的膀胱癌样本数/总的膀胱癌样本数；
特异性＝检测结果为阴性的非膀胱癌样本数/总的非膀胱癌样本数；
结果如表8所示在30个膀胱癌患者、30个正常人和4例尿路炎症尿液样本中特异性100％，灵敏度83.33％。
表8 7个biomarker的特异性和灵敏度
在本发明中选择7个基因的甲基化区域作为生物标记物，进行早期膀胱癌检测，特异性可达100％，灵敏度可高达80％以上；在每个标志物的特异性都比较高的前提下，使用多个标志物联用的方式来提高检测的敏感性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (4)
1.用于检测多个标志物基因的试剂在制备用于检测早期膀胱癌试剂的应用，包括下述步骤：
(1)、提取膀胱癌患者尿液中所含的DNA；
(2)、对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；
(3)、通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测，以ALU-C4作为内参基因；
(4)、在膀胱癌患者中步骤(3)所述的七个标志物基因中至少一个标志物基因的相对甲基化水平值高于其检出限；
所述步骤(3)中的针对ALU-C4的上游引物序列为SEQ No.1，下游引物序列为SEQ No.2；针对EOMES的上游引物序列为SEQ No.3，下游引物序列为SEQ No.4；针对GDF15的上游引物序列为SEQ No.5，下游引物序列为SEQ No.6；针对NID2的上游引物序列为SEQ No.7，下游引物序列为SEQ No.8；针对PCDH17的上游引物序列为SEQ No.9，下游引物序列为SEQ No.10；针对POU4F2的上游引物序列为SEQ No.11，下游引物序列为SEQ No.12；针对TCF21的上游引物序列为SEQ No.13，下游引物序列为SEQ No.14；针对ZNF154的上游引物序列为SEQNo.15，下游引物序列为SEQ No.16。
2.根据权利要求1所述的用于检测多个标志物基因的试剂在制备用于检测早期膀胱癌试剂的应用，其特征在于，步骤(1)中的DNA总量>500纳克，片段大小>10kb。
3.根据权利要求1所述的用于检测多个标志物基因的试剂在制备用于检测早期膀胱癌试剂的应用，其特征在于，步骤(3)中针对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154和ALU-C4的引物联合使用。
4.根据权利要求1所述的用于检测多个标志物基因的试剂在制备用于检测早期膀胱癌试剂的应用，其特征在于，步骤(4)的具体过程为：
(a)、用8个基因ALU-C4、EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的每对引物纯化后的qPCR产物制作标准曲线，做出每对引物的标准曲线；通过标准曲线定出每个基因的实际甲基化的拷贝数；
(b)、将(a)得到的每个拷贝数代入公式一，计算出每一个标志物基因的相对甲基化水平值；
公式一：相对甲基化水平值＝[(gene/ALU)sample/(gene/ALU)Standard]×1000
(c)、步骤(b)所得的标志物基因的相对甲基化水平值高于对应标志物基因的检出限判定为阳性，等于或低于检出限判定为阴性；在膀胱癌患者中至少一个标志物基因为阳性。
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