CN109852694A - 一种ntrk3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，包括能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物对以及针对NTRK3基因启动子区的探针。本发明还公开了NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒在制备预测结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。本发明的NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒能准确检测出NTRK3基因启动子区甲基化程度；基于NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，本发明从基因甲基化角度提供一种评估结直肠癌患者预后的方法，经大样本临床试验，该评估方法能有效预测结直肠癌患者预后。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其是一种NTRK3基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及其应用。
背景技术
结直肠癌是世界十大恶性肿瘤之一，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前，临床上尚缺乏评估结直肠癌患者预后的方法。因此，建立预测患者预后的技术方法，对结直肠癌的诊疗有重大意义。
结直肠癌的发生和发展主要是基因突变和表观遗传修饰导致的，而表观遗传修饰最主要的方式是DNA甲基化，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因表达及基因组的稳定性中起着重要的作用，在结直肠癌的诊断、治疗和预后评估方面有非常重要的意义。发明人通过甲基化芯片、MSP、焦磷酸测序等方法发现和验证了结直肠癌组织中NTRK3启动子区异常甲基化，并在mRNA和蛋白质层面上证实了NTRK3启动子区异常甲基化会抑制NTRK3的表达。研究表明，NTRK3基因是一个抑癌基因，它可通过MAPK信号通路诱导凋亡。因此，NTRK3启动子区异常甲基化可能会阻碍NTRK3抑癌作用的发挥，进而促进结直肠癌的发生发展。进一步研究表明，NTRK3启动子区异常甲基化提示结直肠癌患者预后不良。然而，目前市场上缺乏能准确地检测NTRK3启动子区异常甲基化程度的试剂盒和方法。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能准确地检测NTRK3启动子区异常甲基化程度的试剂盒以及检测方法，并建立一种预测结直肠癌患者预后的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，所述试剂盒包括能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物对以及针对NTRK3基因启动子区的探针。
作为上述方案的进一步优化，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1和2所示。需要说明的是，引物对依据双重荧光定量甲基化特异性PCR设计，相比单一PCR效率更高。
作为上述方案的进一步优化，所述探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。应当说明的是，本发明的引物对和探针的碱基序列包括但不限于如SEQ ID NO.1～3所示的碱基序列，还应包括其它能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物以及能与NTRK3基因启动子区稳定结合的探针。优选地，针对NTRK3的探针的5’端连接有荧光基团FAM，3’端连接有淬灭基团MGBNFQ。
作为上述方案的进一步优化，所述试剂盒还包括针对内参基因的引物组和探针。
作为上述方案的进一步优化，所述内参基因为Alu-c4。
作为上述方案的进一步优化，所述引物组的碱基序列如SEQ ID NO.4和5所示，所述针对Alu-c4的探针的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。优选地，针对Alu-c4的探针的5’端连接有荧光基团VIC，3’端连接有淬灭基团MGBNFQ。
作为上述方案的进一步优化，所述试剂盒还包括亚硫酸氢盐。由此，亚硫酸氢盐处理基因组DNA后，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。
作为本发明的另一个方面，本发明提供了上述的检测试剂盒在制备预测结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。
作为本发明的又一个方面，本发明提供了上述的检测试剂盒与血清CA19-9的检测试剂的联合使用在制备预测结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。本申请的发明人经多次实验发现，NTRK3基因启动子区甲基化状态联合术前血清CA19-9水平能更详细、准确地评估结直肠癌患者预后。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明的NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒能准确检测出NTRK3基因启动子区甲基化程度；基于NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，本发明从基因甲基化角度提供一种评估结直肠癌患者预后的方法，经大样本临床试验，该评估方法能有效预测结直肠癌患者预后。
附图说明
图1为结直肠癌患者的生存时间与特异生存率的统计结果图；
图2是NTRK3基因启动子区甲基化和血清CA19-9水平对结直肠癌患者的特异生存率影响的统计结果图。
具体实施方式
目前临床上尚缺乏评估结直肠癌患者预后的方法，本发明提供一种能准确检测NTRK3基因启动子区甲基化程度的试剂盒，该试剂盒能用于评估结直肠癌预后，该试剂盒能特异检测出NTRK3基因启动子区甲基化程度；同时，通过大样本病例数据分析，发现了NTRK3基因启动子区甲基化状态与结直肠癌患者生存率的相关性。因此，本发明通过检测NTRK3基因启动子区甲基化程度来预测结直肠癌患者的预后，结果是可靠的。
在一些实施例中，本发明提供了与结直肠癌预后相关的检测试剂盒，其中包括用于扩增NTRK3基因启动子区甲基化DNA的引物(SEQ ID NO.1和2)以及相应的探针(SEQ IDNO.3)；在一些实施例中，本发明提供了检测NTRK3基因启动子区甲基化程度的试剂在制备评估结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本申请的实验方法均为常规方法。
实施例1
本发明的NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒的一种实施例，包括亚硫酸氢盐和能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物对以及针对NTRK3基因启动子区的探针，引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1和2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；
试剂盒还包括针对内参基因Alu-c4的引物组和探针，引物组的碱基序列如SEQ IDNO.4和5所示，针对Alu-c4的探针的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，如下表1所示。
表1引物对和探针序列
本实施例的试剂盒检测待测样本的反应体系如下表2所示。
表2反应体系
本实施例的试剂盒检测待测样本的反应程序如下表3所示。
表3反应程序
本实施例的试剂盒包含上述表1的双重荧光定量甲基化特异性PCR引物对、探针；原装引物为粉末，使用时需配置成表2中浓度，现配现用。原装探针浓度为100uM，使用时需配置成表2中浓度，现配现用。
本实施例的试剂盒的检测原理为：
DNA甲基化程度可通过荧光定量甲基化特异性PCR来检测，首先用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。
如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。扩增过程在荧光定量PCR仪中完成，PCR仪输出Ct值，采用相对定量法，计算△Ct＝Ct目的基因–Ct内参基因，△△Ct＝△Ct样品-△Ct标准品，PMR＝2-△△ CtX100，PMR可表示甲基化程度。本试剂盒以双重荧光定量PCR仪为检测载体来设计试剂配比和剂量，双重荧光定量PCR比单一荧光定量PCR具有更高效率。
本实施例的试剂盒按照上述表2的反应体系和表3的反应程序，可以特异地检测出NTRK3基因启动子区甲基化程度，根据发现的NTRK3基因启动子区甲基化状态和结直肠癌特异生存期的相关性，准确地预测结直肠癌患者预后。
实施例2
本发明的NTRK3基因启动子区甲基化程度检测方法的一种实施例，采用实施例1的试剂盒，包括如下步骤：
S1：从肿瘤组织中提取DNA；
S2：对步骤S1中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；
S3：按照实施例1中反应体系，把引物对、探针、试剂与S2中得到的DNA进行混合；
S4：双重荧光定量甲基化特异性PCR扩增S3中得到的混合物，并采集数据；
S5：分析S4中得到的数据，计算出样品甲基化程度PMR。
实施例3
收集229例结直肠癌患者肿瘤组织样品及病例资料，使用实施例1的试剂盒，按照实施例2的操作步骤，测定样品甲基化程度，并分析其与预后的关系；PMR＜5％定义为非甲基化，PMR≥5％定义为甲基化。
结果如图1所示，使用Graphpad prism软件采用Kaplan-Meier法评估结直肠癌特异生存期并绘制生存曲线，log-rank检验P＝0.008。COX回归分析P＝0.03，HR＝9.244,95％CI＝(1.237,69.062)。可见，患者NTRK3异常甲基化与预后不良具有一定的相关性。
实施例4
血清CA19-9是一个公认的肿瘤标志物，在部分结直肠癌患者中血清CA19-9会异常升高，可辅助结直肠癌的诊断、治疗及预后评估。收集实施例3中229例结直肠癌患者肿瘤组织样品、术前血清样品及病例资料，使用实施例1的试剂盒，按照实施例2的操作步骤，测定肿瘤组织样品甲基化程度，采用化学发光微粒子免疫法检测血清CA19-9水平，并分析NTRK3基因启动子区甲基化状态联合术前血清CA19-9水平的预后价值。发明人发现NTRK3基因启动子区甲基化状态联合术前血清CA19-9水平可更详细地评估结直肠癌患者预后。
使用Graphpad prism软件采用Kaplan-Meier法评估上述结直肠癌患者特异生存期并绘制生存曲线，结果如图2所示，log-rank检验P＝0.002；多因素COX回归分析P＝0.004，HR＝4.689,95％CI＝(1.628,4.689)。可见，NTRK3非甲基化患者预后良好，NTRK3异常甲基化和CA19-9水平正常患者预后中等，NTRK3异常甲基化和CA19-9水平异常升高患者预后不良。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第六医院
<120> 一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及其应用
<130> 2019
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggcgttcgc gatggt 16
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
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acctttaaaa cgccgaacga t 21
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<212> DNA
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ttagacgttg aaggattttg ta 22
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ggttaggtat agtggtttat atttgtaatt ttagta 36
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<212> DNA
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<400> 5
attaactaaa ctaatcttaa actcctaacc tca 33
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cctaccttaa cctccc 16
Claims (9)
1.一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物对以及针对NTRK3基因启动子区的探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1和2所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对内参基因的引物组和探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为Alu-c4。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组的碱基序列如SEQ ID NO.4和5所示，所述针对Alu-c4的探针的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括亚硫酸氢盐。
8.权利要求1～7任一项所述的检测试剂盒在制备预测结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。
9.权利要求1～7任一项所述的检测试剂盒与血清CA19-9的检测试剂的联合使用在制备预测结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。
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